TW202038905A - 具有疫苗佐劑效應之絲狀奈米粒子 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於絲狀(亦即線狀)奈米粒子，其包含固醇及衍生自莫利納皂樹(Quillaja saponaria Molina)之選自皂樹酸(quillaja acid)及皂樹(quillaja)皂苷之組分。更特定言之，本發明係關於一種該等線狀奈米粒子在疫苗及藥物遞送或吸附系統系統中之用途、其生產方法及其用途(諸如用作疫苗佐劑及用於癌症療法中)。

Description

具有疫苗佐劑效應之絲狀奈米粒子
本發明係關於絲狀或線狀奈米粒子，其包含固醇及三萜皂苷(諸如衍生自莫利納皂樹(Quillaja saponaria Molina)之選自皂樹(quillaja)皂苷之組分)。更特定言之，本發明係關於一種該等絲狀奈米粒子於疫苗、癌症療法及藥物遞送中之用途、其生產方法及其用途(諸如作為疫苗佐劑用於人類及獸醫用途)。
疫苗需要最佳佐劑(包括免疫增強劑及遞送系統)以在動物及人類中提供長期保護免受傳染性疾病折磨。油乳液、脂多醣、聚合物、皂苷、脂質體、細胞介素、免疫刺激複合物(ISCOM)、弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)、弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)、明礬、細菌毒素等係正在研究中或已經在許可疫苗中實施之常見佐劑。皂苷基佐劑具有刺激細胞介導之免疫系統以及增強抗體產生之能力並具有佐劑活性僅需要低劑量之優點。
ISCOM-基質係亦包含磷脂之系統中由於皂樹皂苷與膽固醇膽之間的相互作用所產生的一系列結構上定義為球形、空心、籠狀之自組裝奈米粒子(40至60 nm，如利用動態光散射(DLS)所觀察到)。其等展現測得的ζ-電位為約-30 mV之負靜電荷。ISCOM-基質與抗原之組合稱為ISCOM。據信皂樹皂苷(及可能是具有三萜核心之所有皂苷)對膽固醇具有高親和力，此誘導ISCOM-基質之結構化及穩定化。
由於ISCOM在就尺寸及形狀方面模擬病毒顆粒，因此已廣泛探索ISCOM之抗原傳遞(Barr，1998)。ISCOM高免疫反應主要與展現強免疫刺激活性之QS(皂樹)皂苷(特別是醯化組分(諸如QS-21))之存在有關(Boyaka等人，2001)。此與ISCOM之特定性質組合提供總體佐劑效應，且據報導可誘導體液及細胞免疫反應(Sun等人，2009)。
製造ISCOM所面臨的最大挑戰與膽固醇在水相中之「溶解」有關，因為該分子基本上不溶於水。形成ISCOM之基本思想係將膽固醇以混合膠束之形式或經整合至由助洗劑(co-detergent)或磷脂形成的囊泡中提供至主體溶劑。添加皂樹皂苷之膠束溶液會導致膽固醇分子再分佈至皂苷膠束中，並該等分子會再組織成特徵性ISCOM顆粒。然而，該製程實際上會產生在就群體均勻性及顆粒數量方面之可變的結果。因此，需要多個下游純化步驟以藉由離心、超過濾、切向流或透析來消除聚集或殘留膽固醇及磷脂(例如磷脂醯膽鹼)。此類技術必然在生產製程期間造成材料損失。對ISCOM之大規模生產更不利的是使用醫藥級磷脂(及有時是助洗劑)，此進一步增加製造成本。昂貴半合成膽固醇(來自非動物源)之損失亦導致生產成本飆升。總之，產率及損失之此等變化成為大規模生產可負擔得起的皂苷基佐劑奈米粒子之嚴重障礙。
Morein等人藉由發現一種可產生所謂的「G3」皂苷基奈米粒子之新穎的無磷脂製備方法，解決與ISCOM生產相關的一些調配問題，此描述於例如國際專利申請案WO2013051994及WO2014163558中。然而，不幸的是，由於所獲得的產物顯示異質且可變之粒度分佈，因此該等製備方法亦被證明難以以商業規模實施，且本發明的發明者現已證實實際上產生形態不同於描述於該兩個專利申請案中之形態之顆粒。
本發明者已嘗試擴大描述於WO2013051994及WO2014163558中之程序的規模進行深入研究，但意識到描述於該等專利申請案中並在電子顯微照片上以~20 nm圓形斑點出現之「G3」奈米粒子不能藉由遵循該等申請案中之說明再現。當不僅藉由如在該兩個專利申請案中所採用的透射電子顯微鏡(TEM)，而且藉由動態光散射(DLS)及原子力顯微鏡(AFM)分析所獲得的產物時，首先實現此點。問題的簡單之處在於所主張的20 nm顆粒僅藉由TEM分析可見，而利用DLS或AFM則不可見。
分析技術在其方法方面及在其分析前樣品製備方面顯著不同。在TEM中，將幾微升之膠體溶液(含在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中)沉積至金屬網格上且在經濺射造影劑之前於真空下乾燥並用電子束觀察。高電子密度(高分子密度)之區域被視為在2D平面中之投影。在AFM中，將幾微升之樣品沉積至原子平坦基板(剛切下的雲母片)上，乾燥並用僅幾奈米厚的共振AFM尖端進行掃描。所生成的影像給出基板之表面之拓撲及表面上之顆粒以3D出現的位置。特定言之，可測量顆粒之厚度。在DLS中，樣品按原樣(亦即，不干燥)進行分析，溶解於磷酸鹽緩衝液中，並給出粒度分佈之統計描述。在AFM成像中，「G3」顆粒以不同尺寸及形狀之異質群體出現，有時是球形，有時是沿一個軸伸長(蠕蟲狀)，尺寸長達幾百奈米長，且僅4 nm至10 nm厚，切勿規則直徑在20 nm至30 nm之間的均勻球形。在DLS中，平均尺寸分佈始終在50 nm至60 nm之範圍內，而不是如WO2013051994及WO2014163558中所主張的20 nm。因此，本發明者推測在WO2013051994及WO2014163558中在TEM中觀察到的~20 nm之「G3」顆粒是否可歸因於樣品製備中之偽影。藉由不包含膽固醇或皂苷但僅含磷酸鹽緩衝液之TEM分析樣品而證實此點，該樣品產生的TEM影像實際上與揭示於WO2013051994中之「G3」顆粒之圖1A相同，參見圖 1 。此證明如該兩個專利申請案中所述的直徑為約20 nm之「G3」奈米粒子(參見例如WO2013051994之圖1A)實際上是在樣品蒸發時自緩衝系統沉澱，或藉由與金屬基板格柵相互作用而形成(磷酸鹽離子對金屬表面具有親和力)之磷酸鹽鹽類晶體或聚集物。對單獨相同緩衝系統或沉積於碳基板格柵而非金屬格柵上之緩衝系統中皂苷-膽固醇顆粒(真正「G3」顆粒)之對照觀察從未得出專利申請案中所報告的直徑為~20 nm之盤狀結構，證明其人造本質。藉由DLS，未看到此類顆粒，因為磷酸鹽鹽類在分析條件下溶解。
本發明之發明者決定更緊密地研究描述於WO2013051994及WO2014163558中之「G3顆粒」之性質及/或形態，因為該等製劑畢竟證實生物學效應，例如，在不同接種實驗中。為此目的，進行如WO2013051994中所揭示的原始程序5次並藉由DLS分析所得的顆粒。結果係原始程序為單個實驗提供具有異質粒度分佈之顆粒(參見圖2)及此外實驗之間的可變性很大。結論是此種缺乏均質性對於商業佐劑係不可接受的。
因此，仍需要開發可用作藥品之載劑/遞送顆粒及用作疫苗佐劑之皂苷基奈米粒子之可靠且可擴展之程序。
本發明之發明者現已發現，藉由改變一些關鍵反應參數；特別是藉由在高溫下培養顆粒並在初始製備中調整皂苷與膽固醇間的比率，可顯著改變藉由如WO2013051994中所揭示的原始製造程序獲得的顆粒之形態及尺寸分佈。與描繪於圖 2 (其顯示不同表觀尺寸之兩種或更多種類型之顆粒)之DLS圖中之顆粒對比，根據本發明方法生產的顆粒在藉由DLS測量時具有均勻尺寸(單分散，參見圖 4 )。
因此，在本發明之第一態樣中，因此提供包含膽固醇及三萜皂苷之奈米粒子，諸如來自莫利納皂樹之組分，諸如Quil A® 或自其分離之組分，諸如流份QS-7、QS-8、QS-17、QS-18及QS-21，或來自巴西皂樹(Quillaja brasiliensis )之組分，諸如流份QB-90，其特徵在於該等奈米粒子為線狀(絲狀)。此後，此等奈米粒子在本申請案全文中稱為「NanoQuil F70」顆粒
在第二態樣中，本發明提供一種用於生產第一態樣之NanoQuil F70奈米粒子之方法，該方法包括以下步驟： a) 藉由從非膽固醇含在選自一或多種C1 -C6 醇、C2 -C6 酮、C1 -C3 羧酸之C1 -C6 烷基酯、及線性或環狀C4 -C8 醚之有機溶劑中之非水溶液移除溶劑，在反應容器之內表面及/或在位於該反應容器中之水不溶性、多孔製品之表面上製備膽固醇層， b) 添加水性反應介質，該介質可為一或多種鹽之溶液、緩衝溶液或無鹽蒸餾水，較佳是預熱至70℃±5℃， c) 添加三萜皂苷(諸如皂樹皂苷)之溶液至1 mg/ml至10 mg/mL之最終濃度以產生10:1至20:1，較佳16:1(w/w)皂苷:膽固醇之最終比率， d) 在70℃±5℃下加熱反應混合物約一小時， e) 使該反應混合物冷卻至4℃±2℃過夜，分離所形成的顆粒並例如藉由尺寸排除層析(SEC)移除過量的皂苷。
藉由根據本發明第二態樣之方法製備的「NanoQuil F70」奈米粒子實質上不同於先前技術，包括描述於WO2013051994及WO2014163558中之所謂的「G3」奈米粒子，尤其是當藉由DLS分析測量時其之形態(線狀(絲狀)形狀相對於圓形/球形)及顆粒分散(均勻相對於不均勻)之獨特組合。
將如WO2013051994中所揭示的程序之方法步驟與本發明之方法步驟進行比較，明顯的是，限定第二態樣之NanoQuil F70奈米粒子之結構特性係由於對製造程序之修改，參見描述於WO2013051994及WO2014163558中之程序。
根據本發明之奈米粒子可作為一種或幾種化合物之遞送系統例如用於藥品，包括用於治療癌症及營養相關化合物之藥品，其中該另外物質提供另外功能及互補作用方式。
在第三態樣中，NanoQuil F70奈米粒子及包含其之組合物可按原樣用作諸如藥品，視需要呈進一步包含醫藥上可接受之緩衝劑、稀釋劑、賦形劑、添加劑、佐劑及/或載劑之醫藥組合物。
可選自抗原、佐劑、靶向分子、醫藥化合物及營養物之兩性及疏水性分子可經整合至根據本發明之奈米粒子中，或與其混合成組合物。或者，將不同化合物併入至單獨奈米粒子中。
該醫藥組合物可用作佐劑，例如，與疫苗組合使用，與季節性流感病毒疫苗組合使用，與大流行性流感疫苗組合使用或與緊急疫苗(諸如針對生物武器之疫苗)組合使用。
因此，如上所述，本發明亦關於包含根據本發明之NanoQuil F70顆粒(特別是作為佐劑)之醫藥疫苗調配物。
本發明亦關於一種用於治療或預防由生物體引起或併發的疾病之方法，該方法包括對有此需要的人投與根據本發明之醫藥疫苗調配物。
此外，本發明關於一種用於治療癌症(包括實體腫瘤)之方法，該方法包括對有此需要的患者投與醫藥有效量之根據本發明之NanoQuil F70奈米粒子或包含其之組合物。
此外，本發明亦關於NanoQuil F70奈米粒子或包含其之組合物，其係用於治療癌症，包括對有此需要的患者投與醫藥有效量之NanoQuil F70奈米粒子或包含其之組合物。
上文提及的G3顆粒及本發明之NanoQuil F70奈米粒子二者對各種類型之癌細胞之治療效應被認為是由於該等奈米粒子藉由終止有絲分裂週期而將癌細胞轉化為凋亡細胞之能力引起的。
NanoQuil F70奈米粒子或包含其之組合物可非經腸投與。如本文所用，術語「非經腸」包括皮下注射、輸注技術之靜脈內、肌肉內、皮內注射、電穿孔(EP)、就無針注射而言–噴射注射、基因槍、生物噴射器(biljector)以及口服、氣霧劑投藥。
本發明亦關於一種用於評估根據本發明針對個別患者治療癌症之方法之適用性的方法，包括 ● 使來自該患者之癌細胞與根據本發明之NanoQuil F70奈米粒子或包含此類奈米粒子之醫藥組合物活體外接觸， ● 測量指示該等奈米粒子或藥物組合物對該等癌細胞之治療效應之至少一種效應； 其中，若該等奈米粒子或醫藥組合物顯示指示對該等癌細胞之治療效應之顯著效應，則該方法被評估為適用於該個別患者。
定義 除非另外具體指出，否則本說明書中的所有術語及詞語應被解釋為具有相關技術中通常賦予其之含義。為了清楚起見，以下定義一些術語。
疫苗調配物係預防性使用並改良/增強對/抗一或多種特定疾病之保護性免疫力之醫藥調配物。
當對與疾病有關之組分具有特異性之抗原包含於本發明之調配物中時，或特別是用於癌症治療，該抗原存在於癌症/腫瘤中時，根據本發明之治療性疫苗可用於治愈或治療該疾病。疫苗包含在所治療個體中引起免疫反應之「抗原」及視需要之經添加至疫苗以改良免疫反應之稱為「佐劑」或「免疫刺激劑」之物質。
因此，「抗原」係疫苗中之活性特異性部分且可為整個微生物，諸如病毒或細菌，從而導致疫苗旨在改良免疫力之疾病。其亦可為該微生物之一部分次單元，諸如蛋白質(次單元)(蛋白質之一部分)，從病原微生物分離之蛋白質或藉由rDNA技術生產或合成生產之通常被稱為肽之蛋白質。肽具有比蛋白質更少之胺基酸且一般沒有有序的3D結構折疊。
「佐劑」係增強對預防性或治療性疫苗之抗原部分之免疫反應之程度及/或品質之疫苗成分。具體實施方式
本發明者已發現，令人驚訝的是，克服所觀察到的根據WO2013051994之程序製備的顆粒之異質性(當藉由動態光散射DLS分析時)可藉由在高溫下培養顆粒並調整初始製備中皂苷與膽固醇之間的比率來克服。其他製程參數(諸如膽固醇膜之表面積及厚度及溶劑極性)亦可起作用。藉由根據本發明之程序生產的「NanoQuil F70」顆粒之形態與藉由揭示於WO2013051994中之程序生產的表觀盤狀「G-3」顆粒之形態之不同之處在於根據本發明之NanoQuil F70顆粒為絲狀「線狀」，且可顯示為開放形狀(亦即，蠕蟲-或麵條狀)或封閉形狀/圓形(與WO2013051994中之表觀盤狀形式相反)，參見圖3A及B。與例如ISCOM及ISCOM基質佐劑調配物相反，根據本發明之NanoQuil F70奈米粒子沒有用磷脂或助洗劑(諸如MEGA-10)調配，且不包含磷脂或助洗劑(諸如MEGA-10)。
在本發明之第一態樣中，因此提供包含膽固醇及三萜皂苷之奈米粒子(「NanoQuil F70」)，諸如來自莫利納皂樹之組分，諸如Quil A® 或自其分離之組分，諸如流份QS-7、QS-8、QS-17、QS-18及QS-21，或來自巴西皂樹之組分，諸如流份QB-90，其特徵在於該等奈米粒子為線狀(絲狀)。
如上所述，已藉由TEM分析發現根據第一態樣之奈米粒子以兩種分離形式存在，二者均具有特徵性線狀(絲狀)形狀。一種形式係開放式的，亦即蠕蟲狀或麵條狀，另一種形式係封閉、且實質上圓形的。根據下文描述的方法生產的奈米粒子通常包含兩種形式。
在一個實施例中，NanoQuil F70奈米粒子可因此包含兩種形式： ● 形式A，由封閉、實質上圓形之奈米粒子組成，及 ● 形式B，由開放式蠕蟲狀奈米粒子組成。
形式A:形式B之比率係受所採用的反應溶劑之性質及/或所採用的反應溶劑之pH以及其他參數的影響。
在另一個實施例中，該形式A及形式B之混合物具有20:80至45:55，諸如30:70至40:60，諸如約35:65之比率。
在另一個實施例中，該形式A及B之混合物具有5:95至10:90之比率。
在一個實施例中，根據第一態樣之奈米粒子實質上僅由一種形式組成，亦即，該等奈米粒子包含至少約95%之形式A或形式B。
在另一個實施例中，形式A之實質上圓形奈米粒子具有10至15 nm之半徑及形式B之開放式奈米粒子具有35至45 nm之長度，該兩個值均藉由TEM測量。
在一個實施例中，絲直徑或厚度係在4至8 nm之間，較佳是5至7 nm，諸如5.8 ± 0.8 nm。
在另一個實施例中，形式A之實質上圓形奈米粒子具有65至120 nm，諸如70至80 nm，諸如80至90 nm或諸如85至120 nm之周長。
在另一個實施例中，形式A之實質上圓形奈米粒子具有75 ± 7 nm之周長。
在另一個實施例中，形式A之實質上圓形奈米粒子具有103.5 ± 17 nm之周長。
在另一個實施例中，皂樹皂苷與膽固醇間之比率為12∶1至18∶1，諸如14∶1至17∶1，較佳16∶1。
根據本發明第一態樣之NanoQuil F70奈米粒子實質上不同於先前技術，包括描述於WO2013051994及WO2014163558中之所謂的「G3」奈米粒子，尤其是其之形態(絲狀/線狀相對於盤狀)及顆粒分散(均勻相對於不均勻)之獨特組合。
線狀奈米粒子在藥物遞送系統領域引起相當大的興趣。在由B. Karagoz等人「Polymerization-Induced Self-Assembly (PISA) – control over the morphology of nanoparticles for drug delivery applications」，Polym. Chem.，2014記錄的研究中，顯示將圓柱狀及蠕蟲狀奈米粒子在遞送藥物至乳癌細胞時，其致命性是傳統球形奈米粒子的七倍，但對健康細胞之毒性卻不大。
此等結果在由Elizabeth Hinde等人，「Pair correlation microscopy reveals the role of nanoparticle shape in intracellular transport and site of drug release」，Nature Nanotechnology 第12卷，第81–89頁 (2017)記錄的另一研究中得到證實。Hinde等人證實具有不同形狀但表面化學性相同之聚合物奈米粒子以不同速率移動越過各種細胞障壁，最終界定藥物釋放之位置。該小組測量空心膠束、囊泡、桿及蠕蟲如何進入細胞及其是否從內體系統逃逸並藉由核孔複合物進入至細胞核。桿及蠕蟲(但不是膠束及囊泡)藉由被動擴散進入核。例如利用核定位訊號來改良核進入，導致核內部更多多柔比星(doxorubicin)釋放並與更大細胞毒性相關。因此，小組的結果證實，藥物跨越主要細胞障壁(核包絡)之遞送對於多柔比星效率很重要並可藉由適宜形狀之奈米粒子來達成。
在本發明之第二態樣中，提供第一態樣之絲狀(線狀)NanoQuil F70顆粒之生產方法，該方法包括以下步驟： a) 藉由從非膽固醇含在選自一或多種C1 -C6 醇、C2 -C6 酮、C1 -C3 羧酸之C1 -C6 烷基酯、及線性或環狀C4 -C8 醚之有機溶劑中之非水溶液移除溶劑，在反應容器之內表面及/或在位於該反應容器中之水不溶性、多孔製品之表面上製備膽固醇層， b) 添加水性反應介質，該介質可為一或多種鹽之溶液、緩衝溶液或無鹽蒸餾水，較佳是預熱至70℃±5℃， c) 添加三萜皂苷(諸如皂樹皂苷)之溶液至1 mg/ml至10 mg/mL之最終濃度以產生10:1至20:1，較佳16:1(w/w)皂苷:膽固醇之最終比率， d) 在70℃±5℃下加熱反應混合物約一小時， e) 使該反應混合物冷卻至4℃±2℃過夜，分離所形成的顆粒並例如藉由尺寸排除層析(SEC)移除過量的皂苷。
關於第二態樣的點a)，技術人員應明瞭在水不溶性膽固醇與水溶性皂苷之間達成緊密接觸以便生產本發明之NanoQuil F70顆粒的重要性。此需要產生膽固醇之大、溶劑可及表面。在本發明之一個實施例中，此係藉由在反應容器(可於隨後添加皂苷溶液至該反應容器中)之內表面上製備及/或沉積儘可能薄的膽固醇層來進行。
或者，在另一個實施例中，膽固醇層可經製備及/或沉積在可與皂苷溶液接觸之水不溶性多孔製品之表面上。在上述兩個實施例中，膽固醇層實際上可藉由蒸發膽固醇含在適宜有機溶劑中之溶液來製備或沉積。
最後，在本發明之一個不同實施例中，亦可在連續流微反應器中達成水不溶性膽固醇與水溶性皂苷之間的緊密接觸，在該微反應器處，膽固醇及皂苷之個別溶液在高速且高湍流下混合。
技術人員應明瞭，術語「反應容器」係指適於根據第一態樣之製程中之單元操作並與其兼容之任何種類及尺寸之容器、試管、桶、燒瓶、壺、箱或容器。反應容器可方便地選自尋常實驗室設備，諸如試管、離心管、單頸或多頸圓底或梨形燒瓶等，其通常係由玻璃或適宜之耐溶劑聚合物製成。用於擴大規模及生產目的之反應容器可選自中試規模及生產規模之反應器，其可為內襯玻璃的或由不銹鋼或其他合金製成。
技術人員將進一步明瞭術語「水不溶性多孔製品」意指具有開孔結構及適宜形狀(諸如中空纖維)且由適宜之水不溶性多孔材料(諸如多孔玻璃、氣凝膠及其他無機凝膠、多孔氧化鋁、氧化鋯或二氧化矽顆粒、金屬泡沫及多孔聚合物)製成之適宜尺寸的任何製品。
技術人員將進一步明瞭從膽固醇溶液移除溶劑可方便地藉由溶液之蒸發進行。此包括在攪拌反應容器之內容物的同時施加適度真空，視需要利用加熱。該攪拌可藉由旋轉反應容器或藉由在反應容器內部施加內部攪拌器(諸如攪拌棒或槳式攪拌器)來進行。
或者，從膽固醇溶液移除溶劑可藉由使空氣流、氬氣流或氮氣流進入至反應容器中，視需要在攪拌其中的內容物的同時進行。
無論移除溶劑的方法如何，該移除會在反應容器之內部及/或多孔製品之表面上沉積具有可變厚度及粗糙度之膽固醇層。
關於第二態樣的點b)，NanoQuil F70奈米粒子係根據以上NanoQuil F70生產方案使用以下4種不同水性反應介質來生產：蒸餾水(D.W.)、鹽水溶液(0.85% NaCl含在D.W.中)、乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)及PBS(pH 7.4)。
在此等調配物中，藉由DLS觀察到粒度(流體動力學直徑)差異：調配於PBS中之NanoQuil F70具有最大尺寸(約42 nm)，其次是調配在生理鹽水中之NanoQuil F70(約35 nm)。調配在乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)及蒸餾水中之NanoQuil F70顆粒之粒度分別為約25及24 nm(參見圖3C)。
藉由DLS分析，給出的顆粒直徑係流體動力學直徑。流體動力學直徑(或斯托克斯(Stokes)直徑)係以與分析物相同的速率擴散之等效硬球之直徑，亦即，具有與所測量顆粒相同的平移擴散係數之球體之直徑，假設水化層圍繞著顆粒。因此測量的是溶液中顆粒之迴轉半徑。此不會提供有關在「靜態」條件下粒子形態之資訊；然而，此可藉由TEM進行評估。
使用TEM分析，發現在以上點b)下使用不同水性反應介質亦會導致顆粒形態之其他差異。從下表可以看出，產生於不同介質中之開放式奈米粒子與封閉式奈米粒子之比率(形式A:形式B)係不同的。對於PBS緩衝液，該比率為約8:92 A:B，但對於蒸餾水及乙酸鹽緩衝液，該比率為約40:60。所有值均藉由TEM影像分析測量。
NanoQuil F70 樣品 圓形 形式 A 周長 (nm) 開放式 形式 B 長度 (nm)
H2 O pH ~5.2 39.7% 75.7±7.4 60.3% 43.9
(R=12 nm)
NaCl 150 mM pH ~5.2 待進行
乙酸鈉10 mM pH 4.6 35.4% 74.7±7.3 64.6% 44.1
(R=11.9 nm)
PBS pH 7.4 8.3% 103.5±17.8 91.7% 61.1
(R=16.5 nm)
因此，NanoQuil F70顆粒形態可藉由改變製程參數來微調，此係優於先前技術程序的一大優勢。申請人設想各種類型之顆粒及組成比率將找到各自的用途。
因此，在一個實施例中，在點b)下添加的水性反應介質係緩衝液，諸如乙酸鹽或PBS緩衝液。在另一個實施例中，在點b)下添加的水性反應介質係一或多種鹽之溶液，諸如鹽水(0.85% NaCl含在蒸餾水中)。在又另一個實施例中，在點b)下添加的水性反應介質係無鹽蒸餾水。在一個較佳實施例中，在點b)下添加的水性反應介質係pH為~4.6之乙酸鹽緩衝液。
在另一個實施例中，用於NanoQuil F70顆粒之製造製程係在介於4至5之間的pH下進行。在另一個實施例中，用於NanoQuil F70顆粒之製造製程係在介於5至6之間的pH下進行。在另一個實施例中，用於NanoQuil F70顆粒之製造製程係在介於6至7之間的pH下進行。在另一個實施例中，用於NanoQuil F70顆粒之製造製程係在介於7至8之間的pH下進行。
關於第二態樣的點c)，Quil A(或另一皂樹流份)之添加係較佳使用濃度為約1 mg/ml之水溶液進行。添加足夠量之此種溶液以產生10:1至20:1之最終比率，較佳16:1 (w/w)皂苷: 膽固醇之最終比率。
在根據第二態樣之製程的點d)下加熱所得反應混合物係本發明之基本特徵，其相對於WO2013051994之顆粒顯示改變所產生的顆粒之形態及粒度分佈，如上所述。
因此，在一個較佳實施例中，將根據第一態樣之製程的點d)下之所得反應混合物加熱至70℃±5℃約一小時。技術人員應明瞭，儘管加熱係本發明之基本特徵，但精確反應溫度、加熱之時間、加熱之速率及加熱及隨後冷卻期間之溫度曲線，特別是當將生產方法縮放至新規模時，係全部需要分析及最佳化之參數。分析及最佳化製程參數係技術人員極瞭解的任務，並被視作係要進行的例行任務，其不需要發明技術。
關於第二態樣的點e)，本發明之NanoQuil F70顆粒之最終分離包括純化步驟。包括該步驟是因為根據本發明第二態樣之由於調配皂素與膽固醇之製程所產生之「原始」NanoQuil F70顆粒永遠不會完全不含殘留皂苷膠束，並因此NanoQuil F70粗產物可包含批次間不同量之游離皂苷膠束。最終之純化步驟將批次間之可變性降低至可接受之程度，此將在以下進行論述。
來自皂樹物種之皂苷，諸如QuilA-來自莫利納皂樹之部分純化之皂苷之商業混合物-與許多其他皂苷一樣，當呈含在水性緩衝液中之膠束遞送時，對生物膜具有固有溶解活性(Kensil, C. R.等人(1991)。莫利納皂樹皮之具有佐劑活性之皂苷之分離及表徵。The Journal of Immunology，146(2)，431-437；Oda, K.等人(2000)。衍生自藥用及食用植物之47種皂苷之佐劑及溶血活性。Biological Chemistry，381(1)，67-74)。以該形式，皂樹皂苷當作為疫苗佐劑進行注射時會誘導不良急性發炎症候群，此乃因其有效的細胞膜溶解效應(一種導致細胞破壞或溶解之反應)。
具有親水性及親脂性部分之皂苷分子之結構為此等分子提供顯著去污效應。
注射後，皂素分子按原樣與細胞膜上的膽固醇及磷脂相互作用，藉此充當清潔劑。如下文實驗部分中所述，該效應係在對羊紅細胞進行的溶血檢定中定量。
皂苷之溶劑效應導致與接種物周圍的組織發生溶解反應。因此，使用皂素作為疫苗佐劑之劑量推薦必須反映達成良好免疫刺激效應之平衡，亦不會在註射部位引起臨床上顯著之不良反應(以潰瘍、壞死等形式)。然而，此在施用此等佐劑時針對劑量賦予一些限制。
在製備NanoQuil F-70以及其他含皂苷顆粒佐劑時，可能會存在過量之游離皂苷，該游離皂苷在該情況下無法藉由併入至具有膽固醇之NanoQuil F70複合物中而固定。
如上文所述，該游離皂苷仍將具有在周圍組織中誘導溶解反應之能力。為皂苷基佐劑在疫苗接種中被接受，其膜溶解潛力需要儘可能低而不影響皂苷之免疫增強效應。為此目的，必需進行NanoQuil F70奈米粒子之純化步驟以確保可接受之產物。
申請人已發現，凝膠過濾(在以下中稱為尺寸排除層析，SEC)令人滿意地從粗產物移除過量的皂苷。此外，SEC方法易於擴展至工業生產規模。
凝膠過濾(亦稱為尺寸排除層析，SEC)在分子通過包裝在管柱中之凝膠過濾介質時根據尺寸差異分離該等分子。不同於離子交換或親和力層析，分子不結合至層析介質，因此緩衝液組合物不會直接影響解析(峰之間的分離度)。因此，凝膠過濾之一個顯著優勢係條件可經改變以適合樣品類型或進一步純化、分析或儲藏之要求而不改變分離。
在一個實施例中，殘留皂苷之移除係使用例如Sephacryl 300或技術人員將能夠在沒有創造性努力下選擇的另一凝膠過濾介質來進行。SEC方法能夠從平均尺寸為~5 nm之殘留皂苷膠束分離平均尺寸為20至50 nm(取決於反應介質之流體動力學直徑)之NanoQuil F70顆粒並藉此獲得溶解效應高度減小之產物。
過量皂苷之移除對NanoQuil F70奈米粒子之溶血活性之影響充分記錄於下文實驗部分中，並可藉由將「原始」奈米粒子與SEC純化顆粒之溶血效應進行比較來輕易地證實，參見圖9及10。
所分析的NanoQuil F70奈米粒子(其包含複雜QuilA)之溶血效應最有效地以「QuilA當量」呈現。與QuilA本身相比，未純化之(原始)NanoQuil F70在1 mg/mL之等效QuilA濃度下引起溶血效應。在2 mg/mL之未純化之NanoQuil F70下，溶血效應類似於0.2 mg/mL游離QuilA之溶血效應。因此，可認為該製劑之溶血效應相對於QuilA本身降低約10x。
經Sephacryl 300-HR純化之NanoQuil F70不顯示任何溶血效應直到2 mg/mL之等效QuilA濃度。在4 mg/mL下，經純化之NanoQuil F70展現溶血效應低於或類似於由0.1 mg/mL游離QuilA或1 mg/mL未純化之NanoQuil F70引起之溶血效應。因此，可認為經純化之NanoQuil F70奈米粒子之溶血效應相對於QuilA本身降低至少40x，或相對於原始NanoQuil F70降低約4x。
NanoQuil F70顆粒之SEC純化之該效應(溶解效應之降低)令人驚訝地高，且此外從治療角度來看極重要，因為其提高可安全地註射多少含皂苷佐劑之上限而同時不會增加局部反應原性。因此，使用NanoQuil F70顆粒作為佐劑可使得可誘導給定注射之更高免疫反應。
在本發明之一個較佳實施例中，與相同皂苷(諸如QuilA，呈純淨、非複雜形式)誘導之溶血效應相比，含皂苷NanoQuil F70奈米粒子誘導之溶血效應降低至少20x，諸如20x、30x或40x，藉助於針對原始(或粗製)NanoQuil F70奈米粒子進行的凝膠過濾技術(諸如，尺寸排除層析(SEC))。
將如WO2013051994中所揭示的程序之方法步驟與本發明之方法步驟進行比較，明顯的是，限定第二態樣之NanoQuil F70奈米粒子之結構特性係製造製程之修改之直接結果。
因此，在一個特定實施例中，根據本發明之第一態樣之奈米粒子可藉由根據第二態樣之方法獲得。
除了其用作疫苗佐劑之用法之外，根據本發明之NanoQuil F70奈米粒子亦可作為遞送系統用於一種或幾種化合物，例如用於藥品，包括用於治療癌症及營養相關化合物之藥品，其中該另外物質提供另外功能及互補作用方式。
在第三態樣中，NanoQuil F70奈米粒子及包含其之組合物可按原樣用作諸如藥品，視需要呈進一步包含醫藥上可接受之緩衝劑、稀釋劑、賦形劑、添加劑、佐劑及/或載劑之醫藥組合物。
適宜之醫藥上可接受之載劑及/或稀釋劑包括任何及所有習知溶劑、分散介質、填充劑、固體載劑、水溶液、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、及類似者。此類介質及試劑於醫藥活性物質之用途係此項技術中熟知的，並描述於(以實例說明之)Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company, Pennsylvania，USA中。除非任何習知介質或試劑與活性成分不相容，否則可考慮將其用於本發明之藥物組合物中。補充活性成分亦可併入至組合物中。
本發明亦包括醫藥組合物，其進一步包含至少一種醫藥活性化合物，諸如抗癌劑、鉑配位化合物、紫杉烷(taxane)化合物、喜樹鹼化合物、抗腫瘤長春花生物鹼、抗腫瘤核苷衍生物、氮芥或亞硝基脲烷基化劑、抗腫瘤蒽環黴素(anthracycline)衍生物、曲妥珠單抗(trastzumab)及抗腫瘤鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物、莫利納皂樹及其亞片段、抗體或單株抗體之受體(諸如Fc受體)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )之蛋白質A之DD、用於治療癌症之藥劑，諸如選自由阿糖胞苷(Cytarabin)、道諾黴素(Daunorubicin)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、駝瑞賽爾(Toricsel)及曲貝替定(Trabectidin)組成之群之藥劑，該等活性化合物可經整合至奈米粒子中或與組合物混合。
其他抗癌劑較佳係選自鉑配位化合物、紫杉烷化合物、喜樹鹼化合物、抗腫瘤長春花生物鹼、抗腫瘤核苷衍生物、氮芥或亞硝基脲烷基化劑、抗腫瘤蒽環黴素衍生物、曲妥珠單抗及抗腫瘤鬼臼毒素衍生物。
術語「鉑配位化合物」在本文中用於表示提供呈離子形式之鉑之任何腫瘤細胞生長抑制鉑配位化合物。較佳之鉑配位化合物包括順鉑、卡鉑(carboplatin)、氯化氯(二伸乙基三胺)-鉑(II)；二氯(伸乙基二胺)-鉑(II)；二胺(1,1-環丁烷二羧根基)-鉑(II)(卡鉑)；螺鉑；伊羅夫文(iproplatin)；二胺(2-乙基丙二酸基)-鉑(II)；(1,2-二胺基環己烷)丙二酸基鉑(II)；(4-羧基鄰苯二甲酸-1,2-二胺基環己烷)鉑(II)；(1,2-二胺基環己烷)-(異檸檬酸基)鉑(II)；(1,2-二胺基環己烷)-順-(丙酮酸基)鉑(II)；(1,2-二胺基環己烷)-草酸基鉑(II)；奧馬鉑(ormaplatin)及四鉑(tetraplatin)。
順鉑可以例如商標名稱Platinol從Bristol Myers Squibb Corporation商購，呈粉末，適於用水、無菌鹽水或其他適宜媒劑復水。其他鉑配位化合物及其藥物組合物可商購及/或可藉由習知技術來製備。
紫杉烷化合物包括例如來自Bristol Myers Squibb之紫杉酚、來自Rhone-Poulenc Rorer之多烯紫杉醇(多西紫杉醇(Taxotere))及來自Sanofi Pasteur之卡巴他賽(Carbazitaxel)。其他紫杉烷化合物可以例如如EP 253738, EP 253739及WO 92/09589中所述的習知方式或藉由類似於其之製程來製備。
喜樹鹼化合物包括伊立諾替康(irinotecan)及拓樸替康(topotecan)。伊立諾替康可例如以商標名稱Campto從Rhone-Poulenc Rorer商購且可例如如歐洲專利說明書第137145號中所述或藉由類似於其之製程來製備。拓樸替康可例如以商標名稱Hycamtin從SmithKline Beecham商購且可例如如歐洲專利說明書第321122號中所述或藉由類似於其之製程來製備。其他喜樹鹼化合物可以習知方式製備，例如藉由類似於以上針對於伊立諾替康及拓樸替康所述之製程之製程來製備。
抗腫瘤長春花生物鹼包括以上提及的長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞濱(vinorelbine)。長春花鹼可例如以商標名稱Velban從Eli Lilly and Co呈注射用硫酸鹽商購，且可例如如德國專利說明書第2124023號中所述或藉由類似於其之製程來製備。長春新鹼可例如以商標名稱Oncovin從Eli Lilly and Co呈注射用硫酸鹽商購，且可例如如以上德國專利說明書第2124023號中所述或藉由類似於其之製程來製備。長春瑞濱可例如以商標名稱Navelbine從Glaxo Wellcome呈注射用酒石酸鹽商購且可例如如美國專利說明書第4307100號中所述或藉由類似於其之製程來製備。其他抗腫瘤長春花生物鹼可以習知方式(例如藉由類似於以上針對長春花鹼、長春新鹼及長春瑞濱所述之其等製程之製程)來製備。
抗腫瘤核苷衍生物包括以上提及的5-氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)及卡培他濱(capecitabine)。5-氟尿嘧啶係可廣泛商購的，並可例如如美國專利第2802005號中所述來製備。吉西他濱可例如以商標名稱Gemzar從Eli Lilly商購且可例如如歐洲專利說明書第122707號中所述或藉由類似於其之製程來製備。
卡培他濱可例如以商標名稱Xeloda從Hoffman-La Roche商購且可例如如歐洲專利說明書第698611號中所述或藉由類似於其之製程來製備。其他抗腫瘤核苷衍生物可以習知方式(例如藉由類似於以上針對卡培他濱及吉西他濱所述之製程之製程)來製備。
氮芥化合物包括環磷醯胺及苯丁酸氮芥(chlorambucil)。環磷醯胺可例如以商標名稱Cytoxan從Bristol-Myers Squibb商購且可例如如U.K.專利說明書第1235022號中所述或藉由類似於其之製程來製備。苯丁酸氮芥可例如以商標名稱Leukeran從Glaxo Welcome商購且可例如如美國專利說明書第3046301號中所述或藉由類似於其之製程來製備。用於根據本發明之用途之較佳亞硝基脲化合物包括以上提及的卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine)。卡莫司汀可例如以商標名稱BiCNU從Bristol-Myers Squibb商購且可例如如歐洲專利說明書第902015號中所述或藉由類似於其之製程來製備。洛莫司汀可例如以商標名稱CeeNU從Bristol-Myers Squibb商購且可例如如美國專利說明書第4377687號中所述或藉由類似於其之製程來製備。
抗腫瘤蒽環黴素衍生物包括以上提及的道諾黴素、多柔比星(doxorubicin)及伊達比星(idarubicin)。道諾黴素可例如以商標名稱Cerubidine從Bedford Laboratories呈鹽酸鹽商購且可例如如美國專利說明書第4020270號中所述或藉由類似於其之製程來製備。
多柔比星可例如從Astra呈鹽酸鹽商購且可例如如美國專利說明書第3803124號中所述或藉由類似於其之製程來製備。伊達比星可例如以商標名稱Idamycin從Pharmacia & Upjohn呈鹽酸鹽商購，並可例如如美國專利說明書第4046878號中所述或藉由類似於其之製程來製備。其他抗腫瘤蒽環黴素衍生物可以習知方式(例如藉由類似於以上針對道諾黴素、多柔比星及伊達比星所述之製程之製程)來製備。
曲妥珠單抗可以商標名稱Herceptin從Genentech商購並可如美國專利說明書第5821337或PCT專利說明書WO 94/04679及WO 92/22653中所述來獲得。
抗腫瘤鬼臼毒素衍生物包括依託泊苷及替尼泊苷。依託泊苷可例如以商標名稱VePesid從Bristol-Myers Squibb商購且可例如如歐洲專利說明書第111058號中所述或藉由類似於其之製程來製備。替尼泊苷可例如以商標名稱Vumon從Bristol-Myers Squibb商購且可例如如PCT專利說明書第WO 93/02094號中所述或藉由類似於其之製程來製備。其他抗腫瘤鬼臼毒素衍生物可以習知方式(例如藉由類似於以上針對依託泊苷及替尼泊苷所述之製程之製程)來製備。
因此，抗癌藥物可例如選自：1. 多官能烷基化劑： 亞硝基脲、芥末(氮芥)、甲磺酸酯(白消安(Busulphan))、伸乙亞胺2. 其他烷基化藥物： 丙卡巴肼(Procarbazine)(甲基苄肼(Matulane))、達卡巴嗪(Dacarbazine)(DTIC)、六甲蜜胺(克瘤靈(Hexalen))、順鉑(Cisplatin)(順鉑(Platinol))3. 抗代謝物： 抗葉酸化合物(甲胺喋呤)、胺基酸拮抗劑(氮絲胺酸(Azaserine))4. 嘌呤拮抗劑： 巰基嘌呤(6-MP)、硫鳥嘌呤(6-TG)、磷酸氟達拉濱(Fludarabine Phosphate)、克拉屈濱(Cladribine)(祿斯得停(Leustatin))、噴托他丁(Pentostatin)(噴司他丁(Nipent))5. 嘧啶拮抗劑： 氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(ARA-C)、阿札胞苷(Azacitidine)6. 植物生物鹼： 長春花鹼(長春花鹼(Velban))、長春新鹼(長春鹼(Oncovin))、依託泊苷(VP-16，VePe-sid)、替尼泊苷(衛萌(Vumon))、拓樸替康(癌康定(Hycamtin))、伊立諾替康(開普拓(Camptosar))、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多烯紫杉醇(多西紫杉醇)7. 抗生素： 蒽環黴素、多柔比星(阿黴素、魯比斯(Rubex)、多西爾(Doxil))、道諾黴素(脂質體柔紅黴素(DaunoXome))、放線菌素(Dactinomycin)(更生黴素(Cosmegen))、愛達比星(Idarubincin)(伊達比星(Idamycin))、普卡黴素(Plicamycin)(光輝黴素(Mithramycin))、絲裂黴素(自自力黴素(Mutamycin))、博來黴素(Bleomycin)(博來黴素(Blenoxane))8. 單株抗體， 9. 激素劑： 他莫昔芬(Tamoxifen)(諾瓦得士(Nolvadex))、氟他胺(Flutamide)(歐樂新(Eulexin))、促性腺激素釋放激素促效劑(亮丙瑞林(Leuprolide)及戈舍瑞林(Goserelin)諾雷得(Zoladex))、芳香酶抑制劑、胺魯米特(Aminoglutethimide)、阿那曲唑(Anastrozole)(安美達(Arimidex))，10. 其他抗癌藥物 安吖啶(Amsacrine)、羥基脲(Hydrea)、天冬醯胺酸酶(El-spar)、米托蒽醌(Mitoxantrone)(諾肖林(Novantrone))、米托坦(Mitotane)、視黃酸衍生物、骨髓生長因子、阿米福汀(Amifostine)。
可選自抗原、佐劑、靶向分子、醫藥化合物及營養物之兩性及疏水性分子可經整合至根據本發明之NanoQuil F70奈米粒子中，或與其混合成組合物。根據本發明之組合物亦可包含併入至單獨奈米粒子中之不同兩親及疏水性分子。
包含本發明之NanoQuil F70奈米粒子之醫藥組合物可如上所述用作疫苗佐劑，例如，與正在開發或已經在許可疫苗中實施之疫苗組合使用，與季節性流感病毒疫苗組合使用，與大流行性流感疫苗組合使用或與緊急疫苗(諸如針對生物武器之疫苗)組合使用，或用作藥物遞送系統中之組分。因此，本發明之NanoQuil F70奈米粒子可用作用於人類及獸醫用途之疫苗中之佐劑。
因此，如上所述，本發明亦關於包含根據本發明之NanoQuil F70顆粒(且特別是作為佐劑)之醫藥疫苗調配物(諸如人類或獸醫疫苗)。
在一個較佳實施例中，包含QS-21皂苷之NanoQuil F70顆粒特別適合用作人類疫苗中之佐劑。在另一個較佳實施例中，包含QuilA皂苷之NanoQuil F70顆粒特別適合用作獸醫疫苗中之佐劑。
在另一個實施例中，該醫藥組合物進一步包含二萜，諸如一或多種甜菊醇糖苷。
本發明亦關於一種用於治療或預防由生物體引起或併發的疾病之方法，該方法包括對有此需要的人投與根據本發明之醫藥疫苗調配物。
此外，本發明關於一種用於治療癌症之方法，該方法包括對有此需要的患者投與醫藥有效量之根據本發明奈米粒子或組合物。根據一個實施例，該癌症係白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳癌、前列腺癌、腎癌、胰臟癌、卵巢癌、腦癌、子宮頸癌、肺癌、肝癌、腎癌、口腔癌、血液癌症。癌症可位於腎上腺(腎上腺癌、腎上腺腺癌、腎上腺皮質癌)；肛門，肛門癌(肛門鱗狀細胞癌)；膀胱癌(膀胱鱗狀細胞癌)、膀胱癌(膀胱過渡性細胞癌)；血液，瀰散性血管內凝血、低鈉血症、中性粒細胞敗血症、腫瘤溶解症候群；骨，內軟骨瘤(軟骨瘤，歐利氏病(Ollier's disease))、尤因氏肉瘤(Ewings Sarcoma)、骨肉瘤(成骨肉瘤)、轉移至骨、骨癌(軟骨軟骨肉瘤)；骨髓，慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤、前骨髓細胞白血病(PML)、脊髓發育不良症候群(MDS)、慢性淋巴球白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)；腦，腦癌(腦多形性神經膠質母細胞瘤)、腦腫瘤(腦膠質瘤)、腦淋巴瘤、神經管胚細胞瘤/原始神經外胚層母細胞瘤(PNET)[神經管胚細胞瘤/原始神經外胚層母細胞瘤(PNET)]、腦膜腦瘤、神經母細胞瘤、腦原始神經外胚層母細胞瘤(PNET)、腦轉移、聽覺神經瘤、腦腫瘤(腦星形細胞瘤)；乳房，乳癌(乳房之癌)、乳癌(乳房發炎性癌)、男性乳癌(男性乳腺癌)、乳癌(浸潤性乳腺癌)[浸潤性乳腺癌(乳癌)]、乳癌(浸潤前小葉癌；原位小葉癌；LCIS)[浸潤前小葉癌(原位小葉癌；LCIS；乳癌)]、乳癌(浸潤前導管癌；原位導管癌；DCIS)[浸潤前導管癌(原位導管癌；DCIS；乳癌)]；盲腸，腸癌(盲腸腺癌)；子宮頸，子宮頸癌(子宮頸鱗狀細胞癌)；結腸直腸、結腸癌(結腸腺癌)、直腸癌(直腸腺癌)、頭頸、扁桃體癌(扁桃體淋巴瘤)、喉頭癌(喉癌，喉頭鱗狀細胞癌)、咽癌(咽鱗狀細胞癌)、舌癌(舌鱗狀細胞癌)、咽喉癌(扁桃體鱗狀細胞癌)、口腔癌(口底鱗狀細胞癌)；腎臟，腎癌(腎細胞癌；RCC)；肝臟，肝癌(肝細胞癌)、轉移至肝臟；肺，肺癌(肺大細胞癌)、胸腔積液、肺癌(肺腺癌)、小細胞肺癌(肺癌)、非小細胞肺癌(NSCLC)、胸膜惡性間皮瘤、肺癌(肺鱗狀細胞癌)；淋巴系統；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤；非霍奇金氏淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、腦淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、淋巴母細胞淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤)、MALT淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴結邊緣區B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤、小淋巴球淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)；肌肉，膽管癌(膽管癌，膽道癌)、肌肉平滑肌肉瘤、肌肉橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤；食道，食道癌(食道鱗狀細胞癌)、食道癌(食道腺癌)；卵巢，卵巢癌(卵巢腺癌)；胰臟，胰腺癌(胰腺腺癌)、胰神經內分泌腫瘤(PNET)；陰莖，陰莖癌(陰莖鱗狀細胞癌)、佩羅尼氏病(Peyronie's Disease)；垂體腺，垂體腺癌(垂體腺癌)、異常抗利尿激素分泌症候群(SIADH)[異常抗利尿激素分泌症候群(SIADH)]；前列腺，前列腺癌(前列腺神經內分泌癌)、前列腺癌(前列腺腺癌)；皮膚，皮膚癌(皮膚基底細胞癌)、皮膚癌(皮膚鱗狀細胞癌)、默克爾細胞癌(Merkel Cell Carcinoma)(MCC)、皮膚癌(惡性皮膚黑色素瘤)、痣(良性色素病灶、良性黑色素細胞病灶、黑色素細胞痣、痣細胞痣)；小腸，小腸癌(小腸淋巴瘤)、小腸癌(小腸腺癌)；脊髓，脊髓膠質瘤、脊髓腦膜瘤、脊髓之轉移、脊髓星形細胞瘤(腫瘤)、脊髓癌(脊髓淋巴瘤)；胃，佐林格-埃里森症候群(Zollinger-Ellison Syndrome)(胃泌素瘤)、胃淋巴瘤(Lymphoma of the Stomach)(胃淋巴瘤(Gastric Lymphoma))、胃癌(胃腺癌)；睾丸，睾丸癌(睾丸精細胞瘤)、睾丸癌(睾丸畸胎瘤)；甲狀腺，甲狀腺癌(甲狀腺濾泡細胞)、甲狀腺髓質細胞、甲狀腺乳頭狀細胞、甲狀腺癌(甲狀腺間變性)；子宮，妊娠滋養細胞疾病(葡萄胎妊娠)[葡萄胎妊娠(妊娠滋養細胞疾病，GTD)]、子宮癌(子宮內膜腺癌)；外陰，外陰癌(外陰鱗狀細胞癌)；其他癌症，原發性未知腫瘤(TUP)、慢性疼痛症候群、類癌腫瘤及類癌症候群、神經內分泌腫瘤；其他癌症疾病、慢性疾病之貧血、癌症疼痛、手術失敗症候群(FBSS)、HIV AIDS(人類免疫缺陷病毒&獲得性免疫缺陷症候群)、腎臟疾病-慢性腎衰竭、營養不良、耳毒性、淤斑皮膚紫癜、前列腺癌上皮內贅瘤(PIN)。
在下文實例部分中給出NanoQuil F70奈米粒子於癌細胞上之效應之實例。
醫藥組合物可呈無菌可注射水性或油性懸浮液之形式。該懸浮液可根據已知技術使用以上已提及的其等適宜分散劑或濕潤劑及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為含在無毒非經腸上可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液，例如諸如含在1,3-丁二醇中之溶液。可接受之媒劑及溶劑當中可使用的是水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、不揮發油通常用作溶劑或懸浮介質。基於此目的，可使用任何無刺激性不揮發油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸(諸如油酸)可用於製備可注射劑中。
該等溶液或懸浮液亦可包含以下佐劑中之至少一者：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑、抗菌劑(諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯)、抗氧化劑(諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)、螯合劑(諸如乙二胺四乙酸)、緩衝劑(諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽)、及用於調整張性之試劑(諸如氯化鈉或右旋糖)。可將非經腸製劑密封於由玻璃或塑料製成的安瓿、丟棄式針筒或多劑量容器中。
一般而言，本發明之NanoQuil F70顆粒係以醫藥有效量投與。實際投與的顆粒的量將通常由醫師根據相關情況來確定，包括欲治療之病情、所選擇之投藥途徑、所投與之實際化合物、個體患者之年齡、體重及反應、患者症狀之嚴重度、及類似者。
根據本發明之奈米粒子可在針對任何微生物之任何疫苗中用作佐劑。其可用於任何動物，諸如鳥類、哺乳動物(諸如人類)、家畜(諸如貓、狗、羊、山羊、豬、牛及馬)。根據一個實施例，本發明係用作針對於動物鏈球菌及馬流行性感冒之疫苗中之佐劑。
在下文實例部分中給出用作疫苗佐劑之NanoQuil F70奈米粒子之效應之實例。
用於人類及獸醫用途之劑量可根據所包含的其他化合物改變。有鑑於治療之持續時間，劑量可在＜50 µg至1 mg或更多/天之範圍內。
實例實例 1 –使用PBS或乙酸鹽緩衝液作為反應介質生產初始NanoQuil F70奈米粒子 材料 ● 植物膽固醇。批次SCOL 129-2。材料代碼：C1231，Sigma-Aldrich。 ● Quil A儲液100 mg/mL，Brenntag Biosector A/S。 ● PBS緩衝液pH7.4、或乙酸鹽2至10 mM緩衝液 pH 4.6。 ● 蒸餾水。 ● 鹽水溶液(0.85% NaCl含在蒸餾水中)。 ● 丙酮，Ph.Eur.≥ 99.5%。 ● 50 mL Cellstar管 ● 氣泵。Eheim 200，型號3702010。 ● 具有智慧控制之恆溫振蕩器及塊體恆溫器。MKR13 ，來自Hettich Lab Technology，The Netherlands。 ● Sorvall ST16R離心機，Thermo Scientific。 ● LaminAir通風罩，Holten。Thermo Fisher Scientific。 ● 真空過濾，1000 mL，SFCA，0.22 µM滅菌，VWR歐洲製品編號514-1058。 ● 移液器及吸頭(經滅菌)。 程序 1. 稱取植物衍生之膽固醇3.125 mg/管x5管=15.625 mg。 2. 添加5 mL丙酮至該膽固醇，使用渦旋完全溶解 3. 將該膽固醇溶液分裝成1 mL/管。 4. 在旋轉管的同時經由將空氣泵入該管中來蒸發丙酮，以便將該膽固醇均勻地沉積在試管之V底部。 5. 添加70℃溫水性反應介質(50 mL/管)：蒸餾水、鹽水溶液(0.85% NaCl)、乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)或PBS緩衝液(pH 7.4)。 6. 添加500 µL/管之100 mg/mL Quil A儲液以得到1 mg/mL Quil A溶液。 7. 在MKR13(參見材料)上於70℃下培養60 min。 8. 在4℃下直接冷卻降溫。 9. 在4℃下儲藏過夜。 10. 以4696 x G離心45min。 11. 使已組併在一起的上清液濾過0.22 µM過濾器。
實例 2 –再現性測試 為評估概述於上文實例1中之程序之再現性，於2018年7月18日、19日及20日連續三天三次生產NanoQuil F70奈米粒子。以5至50 mL Falcon管/批(250 mL)調配此等三批(測試-1、-2及-3)NanoQuil F70並在70℃下培養1小時，其名稱為NanoQuil F70(在70°C下之調配)。作為一個非限制性實例，可如下簡化調配方案： ● 稱取15.625 mg植物膽固醇。 ● 添加5 mL丙酮至該膽固醇，完全溶解。 ● 將該膽固醇溶液1 mL/管分裝於5至50 mL Falcon管中。 ●在旋轉管的同時藉由將空氣泵入該管中來蒸發丙酮，以便將該膽固醇均勻地沉積在各管之V底部。 ● 添加70℃ PBS，50 mL/管。 ● 添加500 µL/管 100 mg/mL Quil A儲液以得到1 mg/mL Quil A溶液。 ● 在70℃下培養60 min。 ● 在4℃下直接冷卻降溫。 ● 在4℃下儲藏過夜。 ● 以4696xg離心45min。 ● 使已組併在一起的上清液濾過0.22 µM過濾器。 ● 在4℃下儲藏結果及論述 1. 產物中Quil A之回收 使用地衣酚(Orcinol)測試(亦稱為比阿耳氏測試(Bial's test))測量所生產的NanoQuil F70奈米粒子之Quil A含量。結果如下所示：
Figure 02_image001
對於該三個測試批次，Quil A回收率很高，分別為91.5%、93.8%及98.3%，亦即，均高於90%。
2. 粒度 藉由動態光散射(DLS)分析測得的三種調配物之平均粒度分別為46.32±1.48 nm、40.07±0.98 nm及42.20±0.74 nm，參見圖 5 。以下顯示DLS測量之圖形概述。
Figure 02_image003
3.溶血效應之減少 該三批之溶血減少率相當相似：測試-1為31%，測試-2為29%及測試-3為31%(以下條形圖)。此可認為是達成藉由調配Quil A於F70中副作用減少之相似程度，亦即，降低副作用之高度再現性。然而，觀察到，所有測試批次均誘導溶血，其程度對於疫苗佐劑而言是無法接受地高。
Figure 02_image005
4.在其他反應介質中生產的NanoQuil F70奈米粒子 NanoQuil F70奈米粒子係使用4種不同溶劑根據NanoQuil F70方案來生產：蒸餾水(D.W.)、鹽水溶液(0.85% NaCl含在D.W.中)、乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)及PBS(pH 7.4)。在此等調配物中，藉由DLS觀察到粒度(流體動力學直徑)差異：調配於PBS中之NanoQuil F70具有最大尺寸(約42 nm)，其次是調配在生理鹽水中之NanoQuil F70(約35 nm)。調配在乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)及蒸餾水中之NanoQuil F70顆粒之粒度分別為約25及24 nm(參見以下條形圖)。
Figure 02_image007
實例 3 -用Sephacryl S300-HR層析對初始NanoQuil F70顆粒進行尺寸分離 為從NanoQuil F70顆粒移除易於增加細胞溶解之游離(未摻入之)皂苷，藉由尺寸排除層析(SEC)純化粗製NanoQuil F70產物。
將13 mL體積之Sephacryl S300-HR(GE Healthcare Life Sciences)置於PD-10濾筒中並用PBS緩衝液或乙酸鹽緩衝液平衡。將根據上文實例1生產的1 mL體積之初始NanoQuil F70顆粒負載於管柱頂部上並允許以重力滲透穿過Sephacryl材料。收集1 mL流份，使用RP-HPLC分析其皂苷及膽固醇含量，以及測試其溶血活性。
NanoQuil F70 SEC流份之RP-HPLC HPLC係用作偵測及定量S300-HR流份中皂苷及膽固醇之手段。總皂苷及膽固醇含量表示為來自HPLC帶電氣溶膠偵測器(CAD)之訊號積分並繪製為S300-HR溶離體積之函數。如同尼羅紅(Nile Red)螢光偵測方法(參見下文)，S300-HR層析圖顯示皂苷之集中在6至7 mL及9至10 mL之兩個峰，及膽固醇主要與在6至7 mL之峰相關，如針對NanoQuil顆粒所預期到的。
方法： 使用短層析圖，在Kromasil C4管柱上分析來自NanoQuil F70 SEC分餾之100 µL的每種S300HR流份。以下條形圖顯示對應於皂苷峰及膽固醇峰總和之S300HR流份之積分CAD訊號。
Figure 02_image009
尼羅紅螢光分析 用螢光團尼羅紅分析S300-HR SEC流份(45 µL流份+5 µL尼羅紅 @10 µM，用於螢光讀數)顯示皂苷之分佈，參見以下條形圖。尼羅紅(NR)螢光係藉由極性分子(諸如水)淬滅，並因此在水性環境中僅顯示弱螢光。然而，當尼羅紅與非極性分子(諸如皂苷之三萜核心)相互作用或併入至膠束結構中時，其熒光會提高幾個數量級。尼羅紅係用作示蹤劑以監測S300-HR流份中游離QuilA皂苷或NanoQuil顆粒之存在。
Figure 02_image011
S300-HR層析圖顯示集中在流份6 mL(對應於NanoQuil顆粒(藉由TEM確認))及集中在9 mL(對應於QuilA膠束)之兩個峰。
流份6 & 7 mL(未顯示)之NR螢光光譜展現NanoQuil之典型藍移(其指示與膽固醇之相互作用)，且最大發射在570 nm，而流份9 & 10 mL展現QuilA膠束之典型光譜，且最大發射在620 nm。
NanoQuil F70 SEC流份之溶血檢定
將來自NanoQuil F70 SEC分餾之120 µL體積的各流份添加至經抗凝血劑處理之480 µL經稀釋新鮮羊血。NanoQuil F70 SEC流份之稀釋倍數係5倍，而羊血係在具有EDTA 2 mM之PBS緩衝液中稀釋12.5倍。在37℃下培養45 min後，藉由離心沉澱細胞並藉由在415及540 nm之吸光度測量釋放於上清液中之血紅蛋白的量。溶血活性表示為在540 nm之吸光度值之函數並相對於QuilA皂苷之校準範圍(0.4 mg/mL至1.0 mg/mL)。
Figure 02_image013
溶血最多之S300-HR流份(亦即，9 mL及10 mL)係包含游離QuilA之流份。包含NanoQuil F70之流份6 mL及7 mL在檢定之條件下未顯示溶血效應。
此亦可以「等效物QuilA」表示，參見以下條形圖：
Figure 02_image015
另一方面，初始NanoQuil F70產物在1 mg/mL等效物QuilA及以上確實顯示溶血效應。
Figure 02_image017
結果 圖 6 顯示用於定量分析NanoQuil F70奈米粒子之典型RP-HPLC層析圖。對於固定量之1 mg/mL之QuilA皂苷，外加0.1 mg/mL至0.8 mg/mL之膽固醇在該濃度範圍內產生線性反應，此可用於校準及評估未知流份中之膽固醇含量(NanoQuil F70之SEC流份)。
藉由HPLC分析從13 mL Sephacryl S300-HR濾筒以6 mL溶離並含有純化的NanoQuil F70之流份。使用在20 mL與32 mL之間的訊號積分(以圖6中水平灰色條表示)來定量流份中之皂苷。在39 mL之訊號積分用於定量膽固醇。
在對NanoQuil F70進行SEC分餾並藉由RP-HPLC進行定量分析後，圖 7 清楚地顯示NanoQuil F70顆粒首先被溶離，在流份5 mL至8 mL中同時發現QuilA皂苷及膽固醇，而殘留的不含膽固醇之QuilA皂苷係在9 mL至12 mL之後續流份中被溶離。該結果與SEC分餾之工作方式一致，其中顆粒越大，其等越少滲透至Sephacryl珠粒之聚合物網柵中；因此，其等越早從管柱溶離。NanoQuil F70顆粒具有20至50 nm(取決於反應介質)之流體動力學直徑，而QuilA皂苷膠束具有約5 nm之直徑。NanoQuil顆粒及QuilA皂苷膠束之分離亦與Sephacryl S300-HR之分餾範圍一致。僅將QuilA皂苷負載至SEC管柱上之對照實驗顯示QuilA皂苷在相同條件下以流份8至11 mL溶離。此證實當注射NanoQuil F70(圖 7 )時，在流份5至8 mL中發現的QuilA皂苷確實與膽固醇有關。流份5至8 mL中該材料之TEM照片證實NanoQuil F70顆粒之同一性。SEC分餾亦顯示在該批次中游離QuilA皂苷膠束(無可偵測之膽固醇)的量佔初始NanoQuil F70產物中QuilA皂苷總量的約50%。最終，在初始NanoQuil F70產物中測得的初始膽固醇/QuilA皂苷比率為3%，而在5 ml至8 mL之經組合之SEC流份中，發現初始比率為13%。
將1 mL體積的4.2 mg/mL QuilA之NanoQuil F70負載至Sephacryl S300-HR管柱上並收集1 mL流份以用於HPLC定量分析。顯示包含可偵測量之QuilA(4 mL至13 mL)之SEC流份。NanoQuil F70及QuilA顯示為參考。
測量每個SEC流份之溶血活性並與1 mg/mL之QuilA皂苷參考以及1 mg/mL QuilA之NanoQuil F70初始產物進行比較。不同樣品之溶血活性表示為在540 nm下之吸光度值，該值與釋放於細胞外介質中之血紅蛋白的量直接相關。圖 8 清楚地顯示，僅針對SEC流份9至11 mL觀察到溶血活性，其中基本上發現游離QuilA膠束。在流份5至8 mL中未記錄溶血活性，其中溶離經純化之NanoQuil(關於參考，參見圖7)。此證實在SEC流份中溶離之物質之同一性，因為已知游離QuilA 皂苷膠束具有顯著溶血活性，例如圖8中1 mg/mL之QuilA參考。結果亦顯示流份6 mL中之包含約12%膽固醇/QuilA(w/w)之經純化之NanoQuil F70未顯示顯著溶血活性(圖8)，因此證明膽固醇係直接併入至QuilA皂苷膠束中，使用根據本揭示內容之方案，且此導致NanoQuil F70，亦導致對QuilA皂苷之溶血效應之強力抑制。
結論 證明使用Sephacryl S300-HR珠粒進行尺寸排除層析可成功地自殘留游離QuilA皂苷膠束分離NanoQuil F70顆粒。藉由RP-HPLC及UV-吸光度偵測對SEC流份進行定量分析，可測定膽固醇/QuilA皂苷比率，並證實每個流份中材料之同一性(NanoQuil F70或游離QuilA皂苷)。包含游離QuilA皂苷之流份顯示顯著溶血效應，而包含經純化之NanoQuil F70之流份不顯示任何溶血效應。最後，顯示與包含類似量之游離QuilA相比，甚至包含約50% QuilA皂苷作為游離殘留皂苷膠束之初始NanoQuil F70樣品僅呈現有限溶血活性。此證實使用本發明中之方案直接用膽固醇調配QuilA皂苷之有效性，以便顯著降低QuilA皂苷之固有細胞膜溶解活性。
實例 4 - NanoQuil F70之輔佐效應 該研究之目的係欲比較NanoQuil F-70顆粒與描述於WO2013051994及WO2014163558中之G3顆粒之疫苗佐劑效應。研究概述： ■抗原 ：抗原x，10 ug/免疫接種 ■佐劑 ：G3-VAX(Adjuvaq-V100，#150609)或NanoQuil(#70，180326)，5 ug/免疫接種 ■動物 ：雌性BALB/c小鼠，8隻/組 ■免疫接種： 總共3次s.c.免疫接種，每第4週一次 ■樣品 ：上一次免疫接種後2週收集血清 ■分析 ：ELISA(山羊抗小鼠IgG/血清/TWIN-抗原/ST-HRP/TM)結果以圖形方式顯示於圖 11 中。 結論 ■ 在G3-VAX與NanoQuil之間沒有發現顯著差異。 ■ 然而，NanoQuil F-70似乎比G3產生略更有效之ab反應及更少之變異。
實例 5 -NanoQuil F70對U937-1癌細胞之凋亡效應 實驗目的 該實驗之目的係欲探討NanoQuil F70對癌細胞系U937-1之凋亡效應。U937細胞係最初從男性患者之組織細胞淋巴瘤分離的模型細胞系且特徵為人類急性骨髓性白血病(AML)細胞系。設備 ● 無菌層流罩，Biowizard Golden Line Ergosilence，Kojair ● 渦旋，IKA MS3 basic ● 培養箱，Forma Steri-Cycle CO2培養箱，TermoFisher Scientific ● 冰箱 ● 離心機；Allergra X-22R，Beckman Coulter ● 顯微鏡 ● Bürker室 ● 分光光度計(Labsystems Multiskan RC，型號351)材料 ● 如藉由上文所述的方法獲得的NanoQuil F70顆粒 ● U937-1細胞由Prof. Kenneth Nilsson(Rudbeck實驗室，Uppsala University，Uppsala，Sweden)友情提供。 ● RPMI 1640(產品代碼：992605；批次16-8082；SVA，Uppsala)，其包含最終濃度為10%之胎牛血清(Sigma Aldrich)、PeSt(60 µg/ml青黴素；50 µg/ml鏈黴素(Cat. No. 992450，SVA，Uppsala)及2 mM L-麩醯胺酸(Cat. No.992005，SVA，Uppsala) ● 細胞培養板，96孔。產品代碼：83.3924.500，批次：4025001，SARSTEDT ● 磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) pH 5.9-6.0，來自美國國務院(substrate department)，Uppsala University Hospital。 ● AlamarBlue® 細胞存活率試劑10X，即用型溶液 ● 蒸餾H2 O ● 細胞培養燒瓶，Corning® 細胞培養燒瓶，表面積75 cm2 ，Cat. No：CLS430641-100EA，Sigma Aldrich ● FINNTIP 300 µl(VWR，613-2614) ● 吸移管吸頭1000 µl FINNTIP，Cat. No: 613-4485，VWR ● 96孔V形底部的板(Nunc，Denmark) ● 臺盼藍(Trypan Blue)，Cat. No：T8154，批號RNBD3142，Sigma ● 試劑儲槽100 ml，Cat. No：89094-656，批次：96817，VWR安全指示 皂苷可引起眼睛及呼吸道刺激，且某些人的皮膚接觸會發炎。 ● 穿戴手套以避免皮膚與皂素等接觸 ● 在通風櫥(hood)中操作以避免吸入氯仿實驗裝置 在PBS pH 7.4中製備濃度從1000 μg/ml降至0.32 μg/ml(1:5稀釋)之NanoQuil F70顆粒之連續稀釋液。細胞上之最終濃度為細胞上之100 μg/ml至0.032 μg/ml。使用PBS以用於空白細胞對照。方法 存活率測試 ● 將培養基中之U937-1細胞倒入至falcon管中 ● 以200g離心該等細胞5至10分鐘 ● 倒出該細胞培養基 ● 將該等細胞再懸浮在經預熱之新培養基中 ● 計數該等細胞並藉由臺盼藍染色確定存活率(存活率應為≥90%) ● 將細胞濃度調整至0.11x106 個細胞/mL ● 將該等細胞以≈20 000個細胞/孔(180 μl)之細胞密度接種於96孔微量滴定板中 ● 添加NanoQuil F70調配物至該等孔(20 µl)(在未處理之對照細胞中使用PBS) ● 在培養時間期間，在37℃下，將該板置於包含5% CO2 之潮濕氣氛中 ● 66小時後，添加20 µl阿爾新藍(Alamar blue)，並藉由分光光度法在570及620 nm下每小時測量螢光(或吸光度)訊號6小時(總共72小時)。結果 先前已顯示調配成奈米粒子之皂樹皂苷之QS-21流份誘導幾種癌細胞系之凋亡，如WO2013051994及WO2014163558中所述。藉由阿爾新藍檢定測得的本文所測試的NanoQuil F70顆粒對單核細胞系U937-1之凋亡效應顯示培養3天後EC50在0.15 mg/ml與0.25 mg/ml之間。
圖 1A. WO2013051994之圖1A的複本，WO2013051994被描述為「電子顯微鏡(EM))顯示包含莫耳比率為1:1:0.5之膽固醇、QHC及雙萜之奈米粒子。根據本發明，該等顆粒之平均直徑為約17至20 nm」。
圖 1B. 不含膽固醇或皂苷但僅含磷酸鹽緩衝液之樣品之電子顯微術。在與圖1A相似的樣品製備後，該TEM照片上捕獲的20 nm「奈米粒子」僅為磷酸鹽類，其會在所需的磷酸鹽緩衝液蒸發期間沉澱。
圖 2. 根據描述於WO201305199中之程序生產的3個批次之DLS粒度分析。可看出，該等顆粒包含至少兩種主要流份。
圖 3A 及 B. 使用PBS(圖3A)或蒸餾水(圖3B)中任一者作為水性反應介質且在70℃下培養約一小時時間之根據本發明之NanoQuil F70顆粒之透射電子顯微術。TEM照片顯示不管反應介質如何，所產生的F70顆粒具有絲狀(線狀)形狀，亦即，相比WO2013051994之所謂的盤狀奈米粒子之形態完全不同的形態。
圖 3C. 顯示根據以上NanoQuil F70生產方案，使用4種不同水性反應介質：蒸餾水(D.W.)、鹽水溶液(0.85% NaCl含在D.W.中)、乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)及PBS(pH 7.4)生產的NanoQuil F70奈米粒子的條形圖。
在此等調配物中，藉由DLS觀察到粒度(流體動力學直徑)差異：調配於PBS中之NanoQuil F70具有最大尺寸(約42 nm)，其次是調配在生理鹽水中之NanoQuil F70(約35 nm)。調配在乙酸鹽緩衝液(pH 4.6)及蒸餾水中之NanoQuil F70顆粒之粒度分別為約25及24 nm。
圖 4. 現藉由DLS分析與圖3A中TEM分析相同的顆粒之粒度分佈。此顯示當在PBS中製備時，根據本發明之顆粒以42.2 nm ±1.0 nm之平均流體動力學直徑單分散。對於在PBS以外的其他介質中產生的顆粒，參見圖3C。
圖 5. 在藉由SEC純化之前，在PBS中製備的NanoQuil F70之三個批次之動態光散射(DLS)分析。
圖 6 ：在Sephacryl S300-HR上經SEC純化之NanoQuil F70的RP-HPLC層析圖。藉由HPLC分析從13 mL Sephacryl S300-HR濾筒以6 mL溶離並含有純化的NanoQuil F70之流份。將訊號在20 mL與32 mL之間之積分(灰色條)用於定量流份中之皂苷。訊號在39 mL之積分用於定量膽固醇。
圖 7 ：SEC流份中收集到的QuilA(淺灰色)及膽固醇(深灰色)之相對量。將1 mL體積之NanoQuil F70以4.2 mg/mL QuilA負載至Sephacryl S300-HR管柱上並收集1 mL流份以用於HPLC定量分析。顯示包含可偵測量之QuilA之SEC流份(4 mL至13 mL)。NanoQuil F70及QuilA顯示為參考。
圖 8 ：NanoQuil F70之sephacryl S300-HR SEC流份之溶血效應。
圖 9 僅用QuilA進行的溶血分析。該圖顯示自紅細胞(RBC)釋放之血紅蛋白隨RBC稀釋變化。
在該檢定中，在0.4 mg/mL下，QuilA顯示出完全溶血潛力。從0.3 mg/mL向下觀察到溶血效應降低。
方法：將20 µL QuilA添加至在PBS中從0.9x稀釋至0.1x之180 µL新鮮羊血液中。在37℃下培養混合物45 min，並將細胞以500 xg粒化5 min。藉由測量在580 nm下之吸光度來測量上清液中之血紅蛋白。
圖 10A 及 B 使用NanoQuil F70顆粒之溶血檢定。該圖顯示自紅細胞(RBC)釋放之血紅蛋白隨RBC稀釋變化。測試方法如圖9。
圖 10A ：與單獨QuilA(圖9)相比，未純化的(原始)NanoQuil F70在1 mg/mL之等效QuilA濃度下顯示溶血效應。在2 mg/mL原始NanoQuil F70下，溶血效應類似於0.2 mg/mL游離QuilA誘導之溶血效應。
圖 10B ：S300-HR純化的NanoQuil F70不顯示溶血效應直到等效QuilA濃度為2 mg/mL。在4 mg/mL純化的NanoQuil F70下，溶血效應低於或類似於0.1 mg/mL游離QuilA或1 mg/mL原始NanoQuil F70引起之溶血效應。
圖 11 ：NanoQuil F70顆粒與G3顆粒之佐劑效應之比較。在G3-VAX與NanoQuil顆粒之間沒有發現顯著差異。然而，NanoQuil F70似乎產生比G3略更有效之ab反應及更少之變異。

Claims (15)

  1. 一種奈米粒子，其包含膽固醇及三萜皂苷(諸如來自莫利納皂樹(Quillaja saponaria Molina)之組分，諸如Quil A® 或自其分離之選自流份QS-7、QS-8、QS-17、QS-18及QS-21之組分)，其中皂樹(quillaja)皂苷與膽固醇之間的比率為10:1至20:1且其中該等奈米粒子為線狀(絲狀)。
  2. 如請求項1之奈米粒子，其中該等線狀奈米粒子具有在4至8 nm之間之絲直徑(或厚度)。
  3. 如請求項1或2之奈米粒子，其包括兩種形式： 形式A，由半徑在10至15 nm之間的封閉式、基本上為圓形之奈米粒子組成，及 B型，由長度為35至45 nm之開放式、蠕蟲狀奈米粒子組成。
  4. 如請求項3之奈米粒子，其中該混合物中形式A與形式B之比率為20:80至45:55，諸如30:70至40:60，諸如約35:65。
  5. 如請求項1或2之奈米粒子，其中皂樹皂苷與膽固醇間之比率為12:1至18:1，諸如14:1至17:1，較佳16:1。
  6. 如請求項1或2之奈米粒子，其進一步包含至少一種兩性或疏水性分子，該分子選自抗原、佐劑、靶向分子、醫藥化合物及食品相關化合物。
  7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之一或多種奈米粒子，視需要進一步包含醫藥上可接受之緩衝劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或載劑。
  8. 如請求項7之醫藥組合物，其進一步包含至少一種醫藥活性化合物，諸如抗癌藥物、鉑配位化合物、紫杉烷(taxane)化合物、喜樹鹼化合物、抗腫瘤長春花生物鹼(vinca alkaloids)、抗腫瘤核苷衍生物、氮芥或亞硝基脲烷基化劑、抗腫瘤蒽環黴素(anthracycline)衍生物、曲妥珠單抗(trastzumab)及抗腫瘤鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物、抗代謝物、類固醇、雷帕黴素(rapamycin)之哺乳動物靶標之抑制劑(mTOR)、用於治療癌症之藥劑，諸如選自由阿糖胞苷(Cytarabin)、道諾黴素(Daunorubicin)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、駝瑞賽爾(Toricsel)及曲貝替定(Trabectidin)組成之群之藥劑，該活性化合物可經整合至奈米粒子中或與組合物混合。
  9. 如請求項1或2之奈米粒子或如請求項7及8中任一項之組合物，其係視需要經調配成醫藥組合物，該醫藥組合物進一步包含用於治療癌症(諸如白血病)之醫藥上可接受之緩衝劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及/或載劑。
  10. 一種用於生產如請求項1至6中任一項之奈米粒子之方法，該方法包括以下步驟： a. 藉由將非膽固醇含在有機溶劑中之非水溶液的溶劑移除，在反應容器之內表面及/或在位於該反應容器中之水不溶性、多孔製品之表面上製備膽固醇層，該有機溶劑係選自一或多種C1 -C6 醇、C2 -C6 酮、C1 -C3 羧酸之C1 -C6 烷基酯、及線性或環狀C4 -C8 醚， b. 添加水性反應介質，該介質可為一或多種鹽之溶液、緩衝溶液或無鹽蒸餾水，較佳是預熱至70℃±5℃， c. 添加三萜皂苷(諸如來自莫利納皂樹之組分，諸如Quil A® 或自其分離之選自流份QS-7、QS-8、QS-17、QS-18及QS-21之組分)之溶液至最終濃度為1 mg/ml至10 mg/mL以產生10:1至20:1，較佳16:1(w/w)皂苷:膽固醇之最終比率， d. 在70℃±5℃下加熱該反應混合物約一小時， e. 使該反應混合物冷卻至4℃±2℃過夜，分離所形成的顆粒並例如藉由尺寸排除層析(SEC)移除過量的皂苷。
  11. 如請求項10之方法，其中該有機溶劑係乙醇及/或丙酮。
  12. 如請求項10或11中任一項之方法，其中該有機溶劑係藉由蒸發移除。
  13. 如請求項10或11中任一項之方法，其中該水性反應介質係乙酸鹽緩衝液。
  14. 如請求項10或11中任一項之方法，其中該水性反應介質係PBS緩衝液。
  15. 如請求項10或11中任一項之方法，其中移除過量皂苷係在適宜凝膠過濾介質(諸如例如Sephacryl S300-HR)上藉由尺寸排除層析(SEC)進行。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112691188A (zh) * 2020-10-06 2021-04-23 江苏艾洛特医药研究院有限公司 一种纳米化肿瘤疫苗的制备方法
KR20230023348A (ko) 2021-08-10 2023-02-17 주식회사 엘지에너지솔루션 전극 조립체
CN116077639A (zh) * 2023-01-05 2023-05-09 国药中生生物技术研究院有限公司 雷公藤红素或其可药用衍生物在制备疫苗佐剂中的用途

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2802005A (en) 1957-08-06 S-eluorourace
US3046301A (en) 1959-10-29 1962-07-24 Burroughs Wellcome Co Method of making chlorambucil
US3803124A (en) 1968-04-12 1974-04-09 Farmaceutici It Soc Process for the preparation of adriamycin and adriamycinone and adriamycin derivatives
GB1235022A (en) 1969-06-04 1971-06-09 Laeaeke Ag A new method for the production of cyclophosphamide
DE2124023C3 (de) 1970-05-27 1980-07-10 Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R.T., Budapest Verfahren zur selektiven Gewinnung von Vinblastin, Vinleurosin und Vincristin oder von deren Sulfaten
US4020270A (en) 1974-05-02 1977-04-26 Societa' Farmaceutici Italia S.P.A. L-lyxohex-1-enopyranose derivative
GB1467383A (en) 1974-06-12 1977-03-16 Farmaceutici Italia Daunomycin analogues
US4307100A (en) 1978-08-24 1981-12-22 Agence Nationale De Valorisation De La Recherche (Anvar) Nor bis-indole compounds usable as medicaments
DE2845574A1 (de) 1978-10-19 1980-04-24 Deutsches Krebsforsch Durch heterocyclische ringe oder alkylreste substituierte analoga von ccnu und verfahren zu deren herstellung
DE3374317D1 (en) 1982-11-26 1987-12-10 Nippon Kayaku Kk Process for producing 4'-demethyl-epipodophyllotoxin-beta-d-ethylidene-glucoside and acyl-derivative thereof
US4526988A (en) 1983-03-10 1985-07-02 Eli Lilly And Company Difluoro antivirals and intermediate therefor
JPS6019790A (ja) 1983-07-14 1985-01-31 Yakult Honsha Co Ltd 新規なカンプトテシン誘導体
FR2601676B1 (fr) 1986-07-17 1988-09-23 Rhone Poulenc Sante Procede de preparation du taxol et du desacetyl-10 taxol
FR2601675B1 (fr) 1986-07-17 1988-09-23 Rhone Poulenc Sante Derives du taxol, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US5004758A (en) 1987-12-01 1991-04-02 Smithkline Beecham Corporation Water soluble camptothecin analogs useful for inhibiting the growth of animal tumor cells
MX9102128A (es) 1990-11-23 1992-07-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Derivados de taxano,procedimiento para su preparacion y composicion farmaceutica que los contiene
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
IT1250692B (it) 1991-07-23 1995-04-21 Procedimento per la preparazione di demetilepipodofillotossina- beta-d-glucosidi.
US5476932A (en) 1994-08-26 1995-12-19 Hoffmann-La Roche Inc. Process for producing N4-acyl-5'-deoxy-5-fluorocytidine derivatives
GB9719426D0 (en) 1997-09-13 1997-11-12 Johnson Matthey Plc Novel process
GB0323965D0 (en) * 2003-10-13 2003-11-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic compositions
GB0411411D0 (en) * 2004-05-21 2004-06-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
DK2094278T3 (en) * 2006-11-20 2017-07-24 Duecom USE OF LIPID-CONTAINING PARTICLES INCLUDING QUILLAJA SAPONINS FOR CANCER TREATMENT
RU2446822C2 (ru) * 2010-04-19 2012-04-10 Федеральное Государственное Автономное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования "Дальневосточный Федеральный Университет" (Двфу) Иммуностимулирующий комплекс, способ его получения и применение
AR082846A1 (es) 2011-07-07 2013-01-16 Consejo Nac Invest Cient Tec Una formulacion que promueve la polinizacion dirigida de abejas meliferas hacia cultivos de girasol
PL2750683T3 (pl) * 2011-10-03 2018-10-31 Mx Adjuvac Ab Nanocząsteczki, sposób ich otrzymywania i ich zastosowanie jako nośnik dla związków amfipatycznych cząsteczek hydrofobowych w dziedzinach medycyny włączając leczenie raka i związki powiązane z żywnością
UY34506A (es) * 2012-12-10 2014-06-30 Fernando Amaury Ferreira Chiesa Adyuvante de vacunación, preparación y vacunas que lo contienen
WO2014163558A1 (en) 2013-04-01 2014-10-09 Moreinx Ab Nanoparticles, composed of sterol and saponin from quillaja saponaria molina process for preparation and use thereof as carrier for amphipatic of hydrphobic molecules in fields of medicine including cancer treatment and food related compounds
CN105169386B (zh) * 2015-07-29 2018-06-19 浙江大学 一种新型通用型基质疫苗佐剂及其制备方法和用途

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Publication number Publication date
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CA3123475A1 (en) 2020-06-25

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