JP6050822B2 - ナノ粒子、ナノ粒子の調製のための処理、および癌治療および食品関連化合物を含む医療分野における両親媒性分子または疎水性分子ための担体としてのナノ粒子の使用 - Google Patents

Description

本発明は、ステロールと、キラヤ酸とキラヤサポニンとから選択されたキラヤサポナリアモリナに由来する成分とを含むナノ粒子であって、必須成分としてリン脂質を含有しないナノ粒子に関する。本発明はまた、ナノ粒子を含む組成物に関し、特にワクチンにおけるアジュバントとしてナノ粒子の使用、癌の治療のための薬剤としてのナノ粒子の使用、医療分野における両親媒性分子または疎水性分子のための、特に癌の治療のためのおよび食品関連化合物のための担体としてのナノ粒子の使用に関する。さらに、本発明は、リン脂質を含有しないナノ粒子を製造するための方法、癌の治療のための方法、癌を治療する方法の適用性を評価するための方法、および身体による取り込みを促進するために、食品関連化合物を水溶性にする方法に関する。

免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）は、直径６ｎｍの６員環を形成するように、コレステロールと強く関連する木キラヤサポナリアモリナからのサポニンからなる４０ｎｍの粒子である。第３の成分は、脂質、例えば、４０ｎｍの球を形成するように環を接着するホスファチジルコリンである。この粒子は、粒子に組み込まれた特定のワクチン抗原と共に使用され、または別個の粒子内にワクチン抗原と同時投与した抗原なしのアジュバント粒子として使用される。ＩＳＣＯＭ粒子は、ＬｏｅｖｇｒｅｎおよびＭｏｒｅｉｎによって特許文献１および特許文献２に記載された方法を用いて製造することができる。

ＩＳＣＯＭ及びＩＳＣＯＭマトリックスの問題の１つは、その複雑な生産技術である。それはまた、担体／送達システムとして用いるのに問題を提起する。例えば分子／化合物をパッセンジャーとして組み込むのに、薬理学的およびワクチン効果のための相補効果を達成するのに、または標的デバイスとして用いるのに問題を提起する。

ワクチンは、表面構造に対する抗体応答およびＴ細胞応答の両方を含む免疫応答を促進する微生物全体またはサブユニットに主に基づいている。あるいは、ワクチン抗原はサブユニット、すなわち最も多くは表面タンパク質であり、また内部の／細胞内タンパク質または細胞ベクターにて発現している非構造タンパク質さえである。表面タンパク質および炭水化物抗原は、抗体応答を惹起する能力についてたびたび評価されるが、それがＴ細胞応答を含む細胞媒介応答を誘発することを排除しないが、多くの場合、細胞障害性応答は含まれない。抗体は、感染剤の内部タンパク質と相互作用しない、したがって、感染の時点で免疫防御を媒介することができないため、内部および非構造タンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞応答を惹起するためのワクチン抗原として使用される。対照的に、Ｔ‐ヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含む細胞性免疫は、感染細胞を殺傷することができる、つまり感染の時点の後に感染細胞を殺傷することができる。ＩＳＣＯＭ技術の製剤および製品は、アクセス可能な抗原、すなわち表面抗原および、ワクチンが調製された薬剤の破壊（内部抗原）によって明らかになった抗体の免疫原性を高めるために使用される（Ｍｏｒｅｉｎら２００７^３およびＷＯ２０１１／００５１８３参照）。任意のワクチン抗原はまた、ｒＤＮＡ技術によって製造することができ、多くの場合、ＬｏｅｖｇｒｅおよびＭｏｒｅｉｎ^２に記載されているように、合成的に製造することもできる。ＩＳＣＯＭ技術は、特許文献３、特許文献４、特許文献２、および特許文献５を含む多くの特許出願に記載されている。

アジュバントは、一般に、ワクチン製剤に含まれる抗原の免疫応答のレベルおよび品質を向上させるように使用される。しかしながら、保護ワクチンについてニーズが満たされていないものが支配的であり、かつ以下の（新しい）理由により免疫保護がエスケープした多くの感染性病原体がある。
・エスケープ変異体（ヒトインフルエンザウイルス、ニワトリにおけるコロナウイルス（伝染性気管支炎ウィルス［ＩＢＲ］）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）
・抗原決定基を明らかにしない
・アクセス不能に隠れている（黄色ブドウ球菌[ＳＡ]、ストレプトコッカスエクイ）
・ヒトにおけるインフルエンザウイルスによって代表される微生物における他の抗原決定基、ミンクにおいてパルボウイルスが引き起こすａｌｕｔｉｏｎ病、ヒトにおけるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）
・病気を悪化させる免疫応答を誘導する（パルボウイルス［ａｌｕｔｉｏｎ病］ミンク）
・多くのほぼ無数の変異体を有する病原菌の種に対して意図されたワクチンが、難しく／高価であり、代わりに例えばヒトにおけるＨＩＶおよびＣ型肝炎に対して十分にカバーするワクチンなどを製造することをより経済的にする。いくつかの、さらに株変異体、例えば様々なカプセル抗原を有する炭水化物変異体（複合ワクチン例えばインフルエンザ菌、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｕｓ ｍｉｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、肺炎球菌肺炎、および黄色ブドウ球菌）と同じ数の株変異体からの最大２３のワクチン成分を必要とする多くのワクチンがまた周知である。
・様々なグラム陽性球菌、例えば動物におけるブドウ球菌に対して他のニーズが満たされていないことが支配的であり、特に、馬（Ｓｔｒ．Ｅｑｕｉ，Ｓｔｒ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）および牛（Ｓｔｒ．ａｇａｌａｃｔｉ，Ｓｔｒ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉ ａｎｄ Ｓｔｒ．Ｕｂｅｒｉｓ）における黄色ブドウ球菌、連鎖球菌種によって引き起こされる、反芻動物における乳腺炎から守るワクチンに対する必要性がある。
・抗原原罪（インフルエンザ）または担体誘導エピトープ抑制抗原（ＣＩＥＳ）
・高速複製薬、例えばヒトの免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ワクチンによって誘導されたものを含む今後の新しい亜種による宿主のエスケープ免疫保護機構を複雑にする
・ＤＮＡおよびＲＮＡワクチンは、多くの場合、アジュバントを欠く

このように、例えば、今後の状況、例えば流行病およびさらによりパンデミックをもたらす状況を満足させるために、またはエスケープ変異の悪影響を回避することによってワクチンの保護価値を保持する可能性を向上させるために、または変異によるエスケープによって失われた免疫性を補償するために、または感染中の変異により生じる変異体に対する免疫保護を高めるために、ワクチンの容量を増やすニーズが満たされていない。この理由のため、新たな粒状ワクチンアジュバントは、特定の病原体から保護するために必要な免疫学的プロファイルに対する免疫応答の操作を適応させるような柔軟性を必要とするかもしれない。

癌は、手術、放射線照射や医薬品つまり細胞増殖抑制剤を含む様々な方法で治療される。一般的に細胞増殖抑制剤による医療処置は、深刻な副作用を引き起こし、放射線療法は、しばしば深刻な副作用を引き起こす。したがって、患者が十分に我慢できる医療処置のニーズが満たされていない。Ｈｕらによる特許文献６は、コレステロール、ホスファチジルコリンおよびキラヤサポニン画分ＡＳＡＰ（アシルサポニン、ＱＳ２１またはＱＨＣに相当）またはＤＳＡＰ（デスアシル‐サポニン、ＱＳ７またはＱＨＡに相当）を含むナノ粒子を記載する。ＫＧＩおよびＢＢＥと名付けられたこれらの粒子は、Ｈｕらによる特許文献７および特許文献８における発明「Ｋｉｌｌｃａｎ，Ｎｅｗ Ｕｓｅ」に記載されたのと同様の起源を有する正常細胞を殺傷するよりも、３０倍から４０倍低い濃度で癌細胞を殺傷することを記載している。これらの粒子は、ＩＳＣＯＭおよびＩＳＣＯＭマトリックスについて記載されたものと同様の製造の複雑性を有する。

水における溶解性が、ワクチン／アジュバントの分野および抗癌薬を含む薬物送達の分野における使用を含めて実現することができなかったために、多くの潜在的な医薬品を開発することができなかった。このような潜在的な医薬品を棚から取り出し、水に可溶させることができたなら、これらのいくつかの潜在的な医薬品は、医療市場を豊かにするだろう。

ＥＰ ０ ４３６６２０ ＷＯ ２００４／００４７６２ ＵＳ ２００６／０１２１０６５ ＥＰ １５９３２３１Ａ１ ＷＯ ２００５／００２６２０ ＷＯ ２００８／０６３１２９ ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５８７８ ＷＯ ２００８／０６３１２９

本発明者らは、抗癌製薬として、医薬品の担体／送達粒子として、および市販のアジュバントワクチン製剤の欠点を補うことができるアジュバントとして使用される新しい形態のナノ粒子の必要性を特定した。

ＩＳＣＯＭ技術の問題点は、キラヤ成分、コレステロールおよび第３の成分、例えばホスファチジルコリンの界面活性剤可溶化に基づいて、例えば限外濾過、接線流、透析または遠心分離技術を用いて粒子を製剤化するための手順が複雑なことである。ＬｏｅｖｇｒｅｎおよびＭｏｒｅｉｎ ^２によって記載されるこれらすべて技術は、製造工程中に材料損失を生じさせる。

さらに、ＩＳＣＯＭ技術は、他の疎水性分子または両親媒性分子の組み込みには容易には適していない。なぜなら、これまでに開発された方法は、このような化合物の強い傾向により水中に安定した複合体（自己組織化）を自発的に形成することを可能にするからである。例えば、ミセルは、例えば疎水性相互作用によってＩＳＣＯＭ製剤に組み込まれない。

本発明は、ステロールおよび少なくとも１のサポニンを含むリン脂質を含有しないナノ粒子に関する。

本発明とは対照的に、リポソームと、ＩＳＣＯＭと、ＩＳＣＯＭマトリクスと、ｐｏｓｉｎｔｒｏｓと、およびワクチンの有効性を高めるためのアジュバント製剤、ワクチン製剤、および癌治療のための製剤を含む医薬品において調製および使用される様々な種類のリポソームといった脂質含有粒子は、リン脂質、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ステアリルアミン等のような脂質を含む。

本発明にかかるナノ粒子はまた、１つまたはいくつかの化合物、例えば癌治療に用いられるナノ粒子および栄養関連化合物に用いられるナノ粒子（追加的な物質は、追加機能および相補的作用モードを提供する）を含む薬品のための化合物の送達システムとして使用することができる。

本発明にかかるナノ粒子の利点は、病原体の新しい変異体、例えば上記した今後のパンデミックを網羅するために、アジュバントとして広い用途を含む従来技術の製剤の代替品として本発明にかかるナノ粒子を評価するに値する。

本発明は、蒸発技術により、実質的に損失なく、容易な製造プロセスを提供する。本発明は、ＩＳＣＯＭまたはＩＳＣＯＭマトリックス（上記参照）の製造について記載した技術の使用を排除しない。

本発明の態様は、独立請求項に記載されている。好適な実施形態は、従属請求項に記載されている。

電子顕微鏡（ＥＭ）は、１：１：０．５のモル比でコレステロール、ＱＨＣおよびジテルペノイドを含むナノ粒子を示す。当該粒子は、本発明にかかる約１７〜２０ｎｍの平均直径を有する。これは、図１Ｂに示すように、約４０ｎｍのＩＳＣＯＭ粒子とは明らかに異なっている。ジテルペノイドを有しない本発明にかかる粒子は、同じ形態を有する。 電子顕微鏡は、１：１：０．５のモル比でコレステロール、ＱＨＣおよびホスファチジルコリンを含むナノ粒子のようなＩＳＣＯＭを示す。粒子を、設計Ｃにしたがって実施例１に記載されたものと同様の技術を用いて、記載されるように準備した。実施例１は、約４０ｎｍの直径を有する。形態および大きさは、図１Ａに示すように、本発明にかかるナノ粒子のものとは明らかに異なる。 Ｕ９３７細胞で試験したＱＨＣをともに含有するＧ３ナノ粒子とＫＧＩナノ粒子との癌細胞殺傷能力の比較。Ｇ３およびＫＧＩは、モデル腫瘍細胞（Ｐ＝０．８４２２）に対して実質的に同様の抗癌細胞殺傷効果を有する。 ＩＬ‐８を産生するようにＵ９３７腫瘍細胞を誘導するＫＧＩとＧ３との比較は、双方の粒子が、癌細胞の分化を示す（Ｐ＞０．０５）サイトカインを産生するように癌細胞を誘導する同様の能力を有することを示す。 ステビアは、ＢＢＥやＫＧＩに比べて、ＩＬ‐１２Ｂ、ＩＬ‐６およびＩＬ‐１αの最強誘導因子である。 Ｇ３に組み込まれた場合、ＤＴは、正常ヒトＤＣのサイトカインＩＬ‐１２遺伝子発現をアップレギュレートする。 Ｇ３粒子は、ＫＧＩ粒子と同様の大きさで、Ｕ９３７細胞の細胞内ＴＫ産生に影響を与える（各製剤‐濃度の組み合わせにおけるバーは、左から右へ２４、４８、７２、９６および１２０時間の時点を示す）。 Ｇ３、ＤＴが組み込まれたＧ３（Ｇ３‐ＤＴ）および非粒子状（ｎｏｎ‐ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）ＱＨＣの滴定曲線がＨＬ‐６０ＡＭＬ細胞において読み取られる。Ｇ３およびＧ３‐ＤＴ製剤は、遊離した（ｆｒｅｅ）非粒子状ＱＨＣよりも効率的にＡＭＬ細胞を殺傷する。 Ｇ３およびシタラビンのＨＬ‐６０ＡＭＬ細胞に対する単独効果および併用効果は、シタラビンを有意に高める。 Ｇ３は、ＨＬ‐６０ＡＭＬ癌細胞に対するダウノルビシンの殺傷能力を高める。 Ｇ３、ＤＴが組み込まれたＧ３（Ｇ３‐ＤＴ）およびＱＨＣのＰＣ‐３前立腺癌細胞に対する滴定曲線。 Ｇ３およびドセタキセルのＰＣ‐３前立腺癌細胞に対する単独効果および併用効果。Ｇ３は、ドセタキセルの癌細胞殺傷効果を有意に高める。 Ｇ３は、ＰＣ‐３前立腺癌細胞に対するカバジタキセルの殺傷効果を高める。 ＡＣＨＮ腎臓癌細胞に対する滴定曲線は、固形癌細胞を殺傷することにおいて、ＱＨＡを用いて製剤化されたＧ３が、ＱＨＡを用いて製剤化されたＧ３よりもより強力である（Ｐ＜０．０１）ことを示している。 免疫化スケジュール実験計画（Ｃ５６Ｂｌ６マウス、６匹／群、２００μｌ／一回分、ｓ．ｃ．２回の免疫、４週間の間隔を開けて）群１（アビスコ対照群（Ａｂｉｓｃｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ））：インフルエンザ１μＧ＋ＩＳＣＯＭ‐５μｇ群２（Ｇ３‐高用量）：インフルエンザ１μｇ＋Ｇ３‐５μｇ群３（Ｇ３‐中用量）：インフルエンザ１μｇ＋Ｇ３‐２．５μｇ群４（Ｇ３‐低用量）：インフルエンザ１μｇ＋Ｇ３‐１μｇ群５（ＤＴを有するＧ３）：インフルエンザ１μｇ＋Ｇ３‐２．５μｇ群６（非アジュバント、抗原対照群）：インフルエンザ１μｇ群７（非免疫対照群）評価抗体応答のための血液。増殖試験、ＩＬ‐４、ＩＦＮ‐γを含む細胞性免疫のための剖検における脾臓細胞。 マウス血清のＨＩ抗体応答は、１回目の免疫の３週間後に測定した。 マウス血清のＨＩ抗体応答は、２回目の免疫の４週間後に測定した。 マウス脾臓細胞のサイトカイン応答は、２回目の免疫の４週間後に測定した。 Ｇ３／ＶＬＸ４０製剤（右列）は、高い癌細胞（Ｕ９３７）殺傷効果を有する。対照的に、ＶＬＸ４０単独（左列）は、Ｇ３／ＶＬＸ４０製剤の高い溶解性を示す低い癌細胞殺傷効果を有し、ＶＬＸ４０‐ＤＭＳＯ製剤の低い癌細胞殺傷効果を有する。 ＶＬＸ４０ＤＭＳＯ製剤（左列）は、沈殿物中に高い抗癌活性を有する。対照的に、Ｇ３‐ＶＬＸ４０製剤（右列）のわずかな沈殿物は、抗癌細胞活性が本質的に水相に位置していたことを示す低い抗癌細胞活性を有していた。定義

本明細書中の全ての用語や単語は、特に断らない限り、通常は、関連技術分野において与えられた意味を持つものとして解釈されるものとする。明瞭にするために、いくつかの用語を以下に定義する。

ワクチン製剤は、１つ以上の特定の疾患に対して予防的に使用され、かつ防御免疫を強化／改善する医薬製剤である。疾患に接続された成分に対して特異な抗原が本発明による製剤中に含まれている場合、または癌治療にとって特有であるが、抗原が癌／腫瘍中に存在する場合には、本発明にかかる治療ワクチンが疾患を治癒するために使用することができる。ワクチンは、処置される被験体において免疫応答を誘発する「抗原」、および任意に「アジュバント」と呼ばれる免疫応答を改善するためにワクチンに添加される物質を含む。

したがって、「抗原」とは、ワクチンにおける活性特異部分であり、ウィルスや細菌といった微生物全体であり得、ワクチンが免疫を改善することを意図している疾患を引き起こす。抗原はまた、前記微生物の一部、サブユニットであり得、例えばタンパク質（サブユニット）、タンパク質の一部、病原性微生物から単離された、またはｒＤＮＡ技術によって作製もしくは合成的に産生され、その後よくペプチドと呼ばれるいずれかのたんぱく質であり得る。ペプチドは、タンパク質よりもアミノ酸が少ない。

「アジュバント」は、予防または治療用ワクチンの抗原部分に対する免疫応答のレベルおよび／または質を向上させるワクチン成分である。栄養関連化合物は、味を良くする化合物であるビタミン健康活性物質を含む栄養物に関連する任意の化合物である。

本発明は、ステロールと、キラヤ酸およびキラヤサポニンから選択されたキラヤサポナリアモリナからの成分とを含むナノ粒子に関連し、上記ナノ粒子は、リン脂質を含有しないことを特徴とする。

技術革新によって生じた粒子は、大きさに関してＩＳＣＯＭとは異なっており、ここで、本発明にかかる粒子は４０ｎｍ未満であり、およそ〜２０ｎｍである。一方ＩＳＣＯＭは、〜４０ｎｍである。したがって、本発明のナノ粒子は、１０〜４０ｎｍ、好ましくは１２から３５ｎｍまたは１５〜２５ｎｍの範囲の直径を有し得る。大きさは、コレステロールおよびキラヤ分子（ｑｕｉｌｌａｊａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）以外の組み込まれた他の分子の負荷にある程度依存する。

ステロールは、コレステロール、コレスタノール、コプロスタノール、植物ステロール、例えばスチグマステロール、シトステロール、菌類ステリン、例えばエルゴステロールから選択することができ、好ましくは、コレステロールおよびビタミンＤ３、または任意の疎水性化合物である。疎水性化合物は、ミセルの水中に懸濁液を含む水に可溶する反応性基と共有結合的に反応するように水に曝露している。
キラヤサポニン、またはキラヤ酸とも呼ばれる共通のトリテルペノイド骨格を有するキラヤサポニン画分を使用してもよい。これまでに４形態（ｆｏｒｍ）のキラヤ酸が記載されている。キラヤサポニンは、例えばＨｕらによって記載されるように、アシル基すなわちアシルサポニン（ＡＳＡＰ）を有する、またはアシル鎖すなわちデスアシル‐サポニン（ＤＳＡＰ）を有しない多くの糖を有する鎖を形成する。

サポニンは、親水性であり得、Ｑｕｉｌ Ａの画分４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、特にＥＰ ０ ３６３２ ２７９ Ｂ２に記載されている画分７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、およびＱｕｉｌ Ａの画分Ａつまり粗（ｃｒｕｄｅ）ＱｕｉｌＡから選択することができる。

サポニンは、加工されていないまたは原料のままの、つまり画分されていないＱｕｉｌ Ａの抽出物であり得、Ｑｕｉｌ Ａは、サポニンの混合物、またはその半精製された形態、例えばキラヤパウダー抽出物（Ｂｅｒｇｈａｕｓｅｎ、ＵＳＡ）キラヤウルトラパウダーＱＰ ＵＦ３００、キラヤウルトラパウダーＱＰ ＵＦ１０００、またはＶａｘ‐Ｓａｐ（３つすべてがチリのＮａｔｕｒａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓから）、もしくは、チリのＰｒｏｄａｌｙｓａ、Ｓａｎｔｉａｇｏからのものを含む。精製されたサポニン画分ＣおよびＢを単独でまたは組み合わせて一緒に使用してもよい。ＢおよびＣの画分は、ＷＯ ９６／１１７１１に記載されており、Ｂ３、Ｂ４およびＢ４ｂの画分は、ＥＰ ０ ４３６ ６２０に記載されている。画分ＱＡ１‐２２は、ＥＰ０３６３２２７９Ｂ２、Ｑ‐ＶＡＣ（Ｎｏｒ‐Ｆｅｅｄ，デンマーク）、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ Ｓｐｉｋｏｓｉｄｅ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ，ウプサラ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ，７５１８３、ウプサラ、スウェーデン）に記載されている。

サポニンは、疎水性サポニンであり得、脂肪酸を含有するサポニンから選択することができる。脂肪酸は、例えば、キラヤサポナリアモリナ、例えばＱｕｉｌ Ａの画分ＣおよびＢ、または画分ＡおよびＢと、ＥＰ ０ ３６３２ ２７９ Ｂ２に記載されている１５、１６、１７、１８、１９、１０、２１と、特にここに適している画分１７、１８との間の領域のからの画分からのサポニンのトリテルペノイドアグリコンの４位に含まれる。好ましくは、キラヤサポニン画分ＱＨＡ、ＱＨＢおよび／またはＱＨＣが使用され得る。

コレステロールとキラヤサポニンとの比は、１：１０から１０：１であり得、好ましくは１：２から２：１であり得る。

本発明にかかるナノ粒子は、少なくとも１つの両親媒性分子または疎水性分子を含むことができる。両親媒性分子または疎水性分子は、抗原、アジュバント、標的分子、医薬化合物、および食品関連化合物から選択することができる。

抗原は、ＥＰＣ特許出願０ １０９ ９４２に記載されるような両親媒性基または疎水性基を有する任意の抗原であってもよく、またはｒＤＮＡ発現による疎水性領域を有するようにレンダリングされ、細胞によって産生されるかもしくは化学的に合成されてもよい。アジュバントは、例えばキラヤサポナリアモリナから得られるものといった両親媒性基または疎水性基を有する任意のアジュバントであってもよい。

１つ以上の化合物分子は、相補的機能のために、例えばターゲットデバイスとして、ＥＰ９６００６４７‐３（ＰＣＴ／ＳＥ９７／００２８９）に記載される免疫調節機能のためのワクチンの使用における抗原または相補的抗原として、または抗癌剤または栄養効果を含む医薬品としてＧ３の中に組み込むことができる。Ｇ３粒子に組み込むために、分子は疎水性ドメインまたはＧ３粒子に静電結合している必要性がある。疎水性部分を有していない化合物は、ＥＰ１８００５６４において同様の粒子について記載されるようなＧ３粒子への組み込みの前または後に、このような分子を有する分子に結合することができる。

任意のアジュバントは、例えばキラヤサポナリアモリナからの合成または半合成のキラヤサポニンまたはサポニン画分もしくは誘導体、脂質Ａまたはその誘導体もしくはその合成バージョン、細胞壁骨格を含むように自然にまたは合成的に取り込むことができるが、上記のアジュバント化合物に限定されない。チリのＪａｖｉｅｒ Ｓａｉｎｔｓ、Ｐｒｏｄａｌｙｓａ、Ｓａｎｔｉａｇｏによって供給されるジテルペノイド（ＤＴ）は、アジュバントおよび栄養（ステビアからの甘味剤）として用いることができる。ジテルペノイド（ＤＴ）は、本発明にかかるナノ粒子に組み込まれたことにより、１７ｎｍの典型的な小さなナノ粒子になる。

ガングリオシドＧＭ１であるコレラ毒素の受容体を含む細胞結合成分に結合する脂質含有受容体と、フコース（ｆｕｃｏｓｅｄ）血液型抗原とを用いることができる。細胞結合成分はまた、粘液標的分子として機能することができる。含む複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）のための技術は、例えばＷＯ９７／３０７２８に記載されており、抗癌治療のために、およびワクチンの使用のために、その両方に対して当該技術をＧ３粒子に適用することができる。キラヤサポナリアモリナの任意のサブフラグメントは、独立してまたは様々な組み合わせにおいて使用することができる。疎水性の尾／領域が供給される受容体は、所望される相補的性質（例えば異なる癌細胞殺傷モード）（例えば癌細胞を標的とし、細胞殺傷効果を有するモノクローナル抗体）を供給するように、発明した粒子へ分子を捕捉することが意図されており、担体搬送オプションの１つである。

このように、ナノ粒子に組み込むことができる他の成分としては、Ｆｃ受容体または黄色ブドウ球菌のたんぱく質ＡのＤＤといった抗体またはモノクローナル抗体の受容体を含む抗癌剤を含む医薬品である（ＷＯ２０１１／００５１８３）。

本発明によって開示されたナノ粒子の製造方法は、ＩＳＣＯＭより簡単であり、疎水性分子および両親媒性分子を組み込むことにより適している。したがって、本発明のナノ粒子は、ワクチン抗原、抗癌治療のための薬物ならびにあらゆる種類の薬物の送達に適したナノ粒子である。本明細書に記載されるように製造された粒子はまた、他の分子（例えば薬やワクチン抗原）を連結する共有結合に用いられる、またはＭｏｒｅｉｎ等によるＷＯ２００４／００４７６２に記載されるように静電結合、レクチン結合に用いられる組み込まれた両親媒性分子（例えば、ステアリルアミン等の脂質）によって補充することができる。

粒子は、癌細胞の表面抗原、ウィルス表面抗原およびインフルエンザ抗原といった癌標的分子をさらに含んでもよい。

Ｍｏｒｅｉｎ等によってもともとＥＰ ２４２３８０に記載されているように、疎水性相互作用によって微生物膜からの表面分子を組み込むことができる。他の分子、例えばｒＤＮＡ技術によって産生されたまたは合成的に産生された他の分子は、ＷＯ２００２／０８０９８１およびＷＯ２００４／０３０６９６に記載されるように組み込むことができる。
このような標的分子は、インフルエンザや、気道（例えば、Ｌｙｃｋｅらによって記載されるように、肺癌の標的形態またはＣＴＡ１ＤＤがＫＧＩまたはＢＢＥ製剤に組み込まれたコレラ毒素のＡサブユニットのＡ１の部分である）に親和性を有する呼吸器合胞体ウィルスといったウィルスからのエンベロープタンパク質を含む。ＣＴＡ１ＤＤは、３つの主要な成分であって、各々が相補効果に寄与するように合理的に設計されている。ＣＴＡ１は、Ａ２およびＢサブユニットから分離することによって、非毒性に変換されたコレラ毒素の酵素的に活性なサブユニットである。黄色ブドウ球菌由来のたんぱく質ＡからのＤＤに融合することは、Ｂ細胞を標的とする。より一般的には、モノおよびポリクローナル抗体は、ＥＰ ０ １０９ ９４２ Ｂ１、ＥＰ ０ ２４２ ３８０ Ｂ１およびＥＰ ０ １８０ ５６４ Ｂ１に記載されるように粒子に組み込むことができる。

本発明はまた、１つ以上のナノ粒子を含む組成物に関する。組成物は、各々が異なるナノ粒子に組み込まれた異なるキラヤサポニン画分を含むことができる。

このように、２つの異なるサポニン画分は、１つのＧ３粒子において結合された複合体であり得、少なくとも２つの異なるサポニン画分のもう一方は、粒子を含む別の物理的に異なる脂質において結合された複合体である。

異なるサポニンは、それぞれ親水性サポニンおよび疎水性サポニンであり得る。粒子は、少なくとも画分Ｃまたは少なくとも画分Ｂ、もしくは少なくともＱｕｉｌ Ａの画分Ｃと画分Ｂとの間の任意の画分、およびＱｕｉｌ Ａの少なくとも他の画分を含むことができる。したがって、１つの粒子は、画分Ｃのみ、Ｑｕｉｌ Ａの画分Ｃおよび少なくとも１つの他の画分、Ｑｕｉｌ Ａの画分Ｃおよび１つ以上の画分、Ｑｕｉｌ Ａの画分Ｃおよび画分Ａ、粗Ｑｕｉｌ Ａを含むことができる。該粒子は、画分Ｂのみ；Ｑｕｉｌ Ａの画分Ｂおよび少なくとも１の他の画分；Ｑｕｉｌ Ａの画分Ｂおよび１またはそれ以上の画分；Ｑｕｉｌ Ａの画分Ｂおよび画分Ａも含み得る。上記の画分混合物は、異なる脂質粒子または同じ脂質粒子中に存在し得る。

このように、物理的に異なる粒子に親水性および疎水性サポニンを含む粒子を含有する脂質の混合物を使用することができる。

一実施形態によれば、ＱｕｉｌＡの画分Ａは、免疫調節活性を有する少なくとも１つの他のアジュバントとともにナノ粒子に組み込むことができる。

別の実施形態よれば、少なくとも１つの他のアジュバントは、自由な形態で存在するか、アジュバント組成物の製造のための別の分離したナノ粒子に組み込まれている。

少なくとも１つの他のアジュバントは、Ｑｕｉｌ Ａサポニンといったサポニンであってもよい。

画分Ａは、それ自身によって使用される場合には用量において毒性があるかもしれない他のアジュバントの使用を容易にし、効率的であり、免疫応答と免疫調節活性とを含む相乗効果を得ることができる。

本発明にかかる組成物は、任意の重量比においてＱｕｉｌ Ａからのアジュバント画分Ａと少なくとも１つの他のアジュバントとを含むことができる。アジュバントの総重量に対して、ＱｕｉｌＡの画分Ａは、好ましくは２〜９９，９重量％、好ましくは５〜９０重量％、特に５０〜９０重量％である。例えばＡｌ（ＯＨ）_３、オイルアジュバントおよびブロックポリマーについては、Ｑｕｉｌ Ａの画分Ａの量は、実質的により少なくてもよい。

１つの好適なｉｓｃｏｍ組成物の１つは、Ｑｕｉｌ ＡのＡ画分とＱｕｉｌ ＡのフラグメントＣおよび／またはＢ画分および／または他の画分または誘導体（本明細書中、以下、非Ａ Ｑｕｉｌ Ａ画分と称する）の総重量に対して、Ｑｕｉｌ ＡのフラグメントＡを５０〜９９．９％、非Ａ Ｑｕｉｌ Ａ画分を０．１〜５０％含有する。特に、組成物は、Ｑｕｉｌ ＡのＡ画分および非Ａ画分の総重量に対してＱｕｉｌ ＡのフラグメントＡを７０〜９９．９％および非Ａ Ｑｕｉｌ Ａ画分を０．１〜３０％、好ましくはＱｕｉｌ ＡのフラグメントＡを７５〜９９．９％および非Ａ Ｑｕｉｌ Ａ画分を０．１〜２５％、特にＱｕｉｌ ＡのフラグメントＡを８０〜９９．９％および非Ａ Ｑｕｉｌ Ａ画分の０．１〜２０％を含有する。最も好ましい組成物はＱｕｉｌ ＡのＡ画分および非Ａ画分の総重量に対してＱｕｉｌ ＡのフラグメントＡを９１〜９９．１％および非Ａ Ｑｕｉｌ Ａ画分を０．１〜９％含有し、特に、Ｑｕｉｌ ＡのＡ画分および非Ａ画分の総重量に対してＱｕｉｌ ＡのフラグメントＡを９８．０〜９９．９％および非Ａ Ｑｕｉｌ Ａ画分を０．１〜２．０％含有する。

ナノ粒子およびナノ粒子を含む組成物は、薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、賦形剤、添加剤、アジュバントおよび／または担体をさらに含む医薬組成物において任意に医薬として使用することができる。

好適な薬学的に許容される担体および／または希釈剤には、任意のおよび全ての従来の溶媒、分散媒、充填剤、固体担体、水性溶液、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体（培地）および薬剤の使用は、当技術分野で周知であり、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに一例として記載されている。任意の従来の媒体（培地）または薬剤が活性成分と不適合であることを除いては、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が考えられる。補助的な活性成分も組成物に組み込むことができる。

本発明はまた、抗癌剤、白金配位化合物、タキサン化合物、カンプトテシン化合物、抗腫瘍ビンカアルカロイド、抗腫瘍ヌクレオシド誘導体、ナイトロジェンマスタードまたはニトロソ尿素剤、抗腫瘍アントラサイクリン誘導体、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）、抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体、キラヤサポナリアモリナおよびそのおよびサブフラグメント、Ｆｃ受容体または黄色ブドウ球菌のたんぱく質ＡのＤＤといった抗体またはモノクローナル抗体の受容体、シタラビン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、トーリセル（Ｔｏｒｉｃｓｅｌ）、トラベクテジン（Ｔｒａｂｅｃｔｉｄｉｎ）からなる群から選択される薬剤といった癌を治療するための薬剤といった少なくとも１つの薬学的に活性な化合物をさらに含む医薬組成物を含む。前記活性化合物は、ナノ粒子に組み込まれまたは組成物と混合し得る

さらなる抗癌剤は、好ましくは、即ち白金配位化合物、タキサン化合物、カンプトテシン化合物、抗腫瘍ビンカアルカロイド、抗腫瘍ヌクレオシド誘導体、ナイトロジェンマスタードまたはニトロソウレアアルキル化剤、抗腫瘍アントラサイクリン誘導体、トランスツズマブおよび抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体から選択される。

用語「白金配位化合物」は、本明細書においては、イオンの形態で白金を提供する白金配位化合物を阻害する任意の腫瘍細胞増殖を示すために用いられる。好適な白金配位化合物としては、シスプラチン、カルボプラチン、クロロ（ジエチレントリアミン）‐白金（ＩＩ）塩化物；ジクロロ（エチレンジアミン）‐白金（ＩＩ）；ジアミン（１，１‐シクロブタンジカルボキシラト）‐白金（ＩＩ）（カルボプラチン）；スピロプラチン；イプロプラチン；ジアミン（２‐エチルマレイミド（ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ））‐白金（ＩＩ）；（１，２‐ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）；（４‐カルゴキシフタロ（ｃａｒｂｏｘｙｐｈｔｈａｌｏ））（１，２‐ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）；（１，２‐ジアミノシクロヘキサン）‐（イソクエン酸（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｏ））白金（ＩＩ）；（１，２‐ジアミノシクロヘキサン）‐シス‐（ビルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｏ））白金（ＩＩ）；および（１，２‐ジアミノシクロヘキサン）‐オキサラト‐白金（ＩＩ）；オルマプラチンおよびテトラプラチンが挙げられる。

シスプラチンは、例えば、水、滅菌生理食塩水または他の適切な媒体（培地）で構成される粉末としてＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商品名プラチノール（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）もとで、市販されている。他の白金配位化合物およびそれらの医薬組成物は、市販されているおよび／または従来の技術によって調製することができる。

タキサン化合物は、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから商品名タキソール（Ｔａｘｏｌ）のもとで販売されているものでもよく、ドセタキセルは、Ｒｈｏｎｅ‐Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒｅから商品名Ｔａｘｏｔｅｒのもとで市販されている。両方の化合物および他のタキサン化合物は、例えば、ＥＰ２５３７３８、ＥＰ２５３７３９およびＷＯ９２／０９５８９に記載されるような従来のやり方、またはそれに類似する処理によって調製することができる。Ｃａｒｂａｚｉｔａｘｅｌは、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒから入手可能である。

カンプトテシン化合物は、イリノテカンおよびトポテカンを含む。イリノテカンは、例えば、Ｒｈｏｎｅ‐Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒから商品名Ｃａｍｐｔｏのもとで市販されており、例えば、欧州特許明細書第１３７１４５号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。トポテカンは、例えば、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍから商品名Ｈｙｃａｍｔｉｎのもとで市販されており、例えば、欧州特許明細書第３２１１２２号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。他のカンプトテシン化合物は、例えば、イリノテカンおよびトポテカンについて上記に記載したのと類似する方法によって、従来のやり方で調製することができる。

抗腫瘍ビンカアルカロイドは、上記において言及したビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンを含む。ビンブラスチンは、例えば、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏから商品名Ｖｅｌｂａｎのもとで注射用硫酸塩として市販されており、例えば、ドイツ特許明細書第２１２４０２３号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。ビンクリスチンは、例えば、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏから商品名Ｏｎｃｏｖｉｎのもとで注射用硫酸塩として市販されており、例えば、ドイツ特許明細書第２１２４０２３号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。ビノレルビンは、例えば、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅから商品名Ｎａｖｅｌｂｉｎｅのもとで注射用酒石酸塩として市販されており、例えば、米国特許明細書第４３０７１００号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。他の抗腫瘍ビンカアルカロイドは、例えば、ビンブラスチン（ｖｉｎｏｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン、ビノレルビンについて上記に記載したものと類似する処理によって従来のやり方で調整することができる。

抗腫瘍ヌクレオシド誘導体は、上記において言及した５‐フルオロウラシル、ゲムシタビンおよびカペシタビンを含む。５‐フルオロウラシルは、広く市販されており、例えば、米国特許第２８０２００５号に記載されるように調製することができる。ゲムシタビンは、例えばＥｌｉ Ｌｉｌｌｙから商品名Ｇｅｍｚａｒのもとで市販されており、例えば、欧州特許明細書第１２２７０７号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。

カペシタビンは、例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ‐Ｌａ Ｒｏｃｈｅから商品名Ｘｅｌｏｄａのもとで市販されており、例えば、欧州特許明細書第６９８６１１号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。他の抗腫瘍ヌクレオシド誘導体は、例えば、カペシタビンおよびゲムシタビンについて上記に記載したものと類似する処理によって、従来のやり方で調製することができる。

ナイトロジェンマスタード化合物は、シクロホスファミドおよびクロラムブシルを含む。シクロホスファミドは、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから商品名Ｃｙｔｏｘａｎのもとで市販されており、例えば、英国特許明細書第１２３５０２２号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。クロラムブシルは、例えば、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｃｏｍから商品名Ｌｅｕｋｅｒａｎのもとで市販されており、例えば、米国特許明細書第３０４６３０１号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。本発明にしたがって使用される好適はニトロソウレア化合物としては、上記において言及したカルムスチンおよびロムスチンを含む。カルムスチンは、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから商品名ＢｉＣＮＵのもとで市販されており、例えば、欧州特許明細書第９０２０１５号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。ロムスチンは、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから商品名ＣｅｅＮＵのもとで市販されており、例えば、米国特許明細書第４３７７６８７号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。

抗腫瘍アントラサイクリン誘導体は、上記において言及したダウノルビシン、ドキソルビシンおよびイダルビシンを含む。ダウノルビシンは、例えば、Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから商品名Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅのもとで塩酸塩として市販されており、例えば、米国特許明細書第４０２０２７０号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。

ドキソルビシンは、例えば、Ａｓｔｒａから塩酸塩として市販されており、例えば、米国特許明細書第３８０３１２４号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。イダルビシンは、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎから商品名Ｉｄａｍｙｃｉｎのもとで市販されており、例えば、米国特許明細書第４０４６８７８号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。他の抗腫瘍アントラサイクリン誘導体は、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシンおよびイダルビシンについて上記に記載したものと類似する処理によって、従来のやり方で調製することができる。

トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）は、Ｇｅｎｅｔｅｃｈから商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのもとで市販されており、米国特許明細書第５８２１３３７号またはＰＣＴ特許明細書ＷＯ９４／０４６７９またはＷＯ９２／２２６５３に記載されるように得ることができる。

抗腫瘍、抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体は、エトポシドおよびテニポシドを含む。エトポシドは、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから商品名ＶｅＰｅｓｉｄのもとで市販されており、例えば、欧州特許明細書第１１１０５８号に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。テニポシドは、例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂから商品名Ｖｕｍｏｎのもとで市販されており、例えば、ＰＣＴ特許明細書ＷＯ９３／０２０９４に記載されるように、またはそれに類似する処理によって調製することができる。他の抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体は、例えば、エトポシドおよびテニポシドについて上記に記載したものと類似する処理によって、従来のやり方で調製することができる。

粗形態のサポニンまたはそれの画分は、例えば抗癌剤として、自由な形態、つまり脂質含有粒子に組み込まれない形態で使用することができる。これらの抗癌化合物は、リポソーム、イスコムおよび／またはイスコムマトリックスならびにｐｏｓｉｎｔｒｏｓといった脂質含有粒子と混合、脂質含有粒子に結合、または脂質含有粒子に組み込まれてもよい。組み込まれる際には抗癌化合物は疎水性であると好適である。そうでない場合には、疎水性基はＥＰ２４２３８０に記載されるようにそれらへ結合することができる。

非疎水性化合物、特にタンパク質またはペプチドは、それらに疎水性基を結合させることにより、疎水性にすることができる。

非疎水性化合物と結合させることができる疎水性基は、好ましくは炭素数１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の直鎖、分岐鎖、飽和、または不飽和の脂肪族鎖、または疎水性アミノ酸またはペプチド、または他の疎水性構造、例えばステロイドである。疎水性構造の長さは、タンパク質の大きさと性質に適合させる。一例として、１０‐１５アミノ酸のペプチド（口蹄疫ウイルス）は、アミノまたはカルボキシ末端に２個のチロシンを適切に伴うことが挙げられる。分子量７０，０００ダルトンのタンパク質は、約２０個の疎水性アミノ酸を必要とする。検査は実験的に行われる。すなわち、ある者は、特にＴｒｐ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌから選択される（特にＴｙｒ）１〜２０アミノ酸、好ましくは１、２、３、４、５アミノ酸を有するペプチド；コレステロール誘導体、例えば、コリン酸、ウルソデソキシコリン酸を用いる。

これら疎水性基は、非疎水性タンパク質または化合物と結合することができる基、例えば、カルボキシル‐、アミノ‐、ジスルフィド‐、ヒドロキシル‐、スロヒドリル‐およびカルボニル基、例えば、アルデヒド基と結合する必要がある。

結合することができる疎水性基は、好ましくは、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、およびＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓを含むペプチド、好ましくはオクタナル（Ｏｃｔａｎａｌ）およびＴｙｒ．Ｔｙｒ．Ｔｙｒ‐Ｃｙｓ、‐Ａｓｐ、または‐Ｇｌｕのカルボキシル、アルデヒド、アミノ、ヒドロキシル、およびジスルフィド誘導体から選択される。結合することができる基を有する疎水性基は、溶解する物質に応じて、例えば上記可溶化剤および界面活性剤、または塩酸、酢酸、６７容量％の酢酸、苛性液（ｃａｕｓｔｉｃ ｌｉｑｕｏｒ）、アンモニアの助けを借りて水に溶解する必要がある。次に、ｐＨを物質を沈殿させずに中性へと調整するが、疎水性基を結合させるタンパク質を変性させるｐＨ値にならないように確認する。脂質は可溶性を増大させ得る。

疎水性分子は、分子比１０：１〜０．１：１、好ましくは１：１で非疎水性化合物に加えることができる。

結合分子としてカルボキシル基を有する疎水性基は、水溶性カルボジイミドまたは合成無水物を介してタンパク質と結合することができる。第１の場合は、カルボキシル基をｐＨ５でカルボジイミドで活性化し、高ホスフェート含有量の緩衝液（ｐＨ８）に溶解したタンパク質と混合する。後者の場合は、カルボキシ化合物を、チオキサンまたはアセトニトリル中のトリエチルアミンの存在下でイソブチルクロロホルメートと反応させ、得られた無水物をｐＨ８〜９でタンパク質に加える。ヒドラジンを有するカルボキシル基をヒドラジドに変換し、これと該タンパク質中のペリオデート酸化糖単位中のアルデヒドおよびケトンがともになってヒドラゾン結合を得ることもできる。

亜硝酸を有するアミノ基を低温でジアゾニウム塩に変換し、Ｔｙｒ、ＨｉｓおよびＬｙｓとアゾ結合を得ることができる。スクシン酸無水物を有する水酸基をヘミスクシネート誘導体に変換し、これをカルボキシル基として結合させることができる。アルデヒド基をタンパク質中のアミノ基と反応させてシッフ塩基とすることができる。いくつかのカップリング基および方法が記載されている^{６．７．８}。

そのように製造した疎水性基を受け取ったタンパク質、ペプチド、または化合物は、ａ）に記載のごとくグリコシドと複合結合する（ｃｏｍｐｌｅｘ‐ｂｏｎｄｅｄ）が、ここでは細胞断片を除去するための精製工程を省略することができる。

開示した疎水性基を有する親水性タンパク質は、タンパク質を静かに変性させることにより、すなわち、約２．５の低ｐＨ、３Ｍ尿素、または７０℃以上の高温で疎水性基を利用しやすくすることにより疎水性にすることができる。そのようなタンパク質は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥであり得る。免疫グロブリンを抗イデオタイプ抗体として用いることができる。タンパク質は、（ｂ）に記載のごとくタンパク質として精製され、次いで（ａ）に記載のごとくグリコシドと複合結合するが、細胞断片を除去するための精製工程は省略される。

疎水性分子または両親媒性分子はまた、ホスファチジン酸の誘導体、すなわちレシチン、セファリン、イノシトールリン脂質、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０の炭素原子を有するスフィンゴシン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンといったグリセロールホスフェートの誘導体といったリン脂質から選択することもできる。

抗原、アジュバント、標的分子、医薬化合物および栄養物から選択することができるすべての上記の両親媒性分子および疎水性分子は、ナノ粒子に組み込むことができ、または組成物にそれとともに混合することができる。

医薬組成物は、アジュバント、例えば開発中のワクチンと組み合わせて使用され、季節性インフルエンザウイルスワクチンと組み合わせて使用され、パンデミックインフルエンザワクチンと組み合わせて使用され、または緊急ワクチン例えば生物兵器に対するワクチンと組み合わせて使用されるアジュバンドとして使用することができる。

このように、本発明はまた、上記したように、Ｇ３粒子を含有する医薬ワクチン製剤に関する。

本発明はまた、生物に起因するまたは生物によって悪化する疾病を治療または予防するための方法であって、医薬ワクチン製剤を必要とする人に本発明にかかる医薬ワクチン製剤を投与することを包含する方法に関する。

さらに、本発明は、癌の治療のための方法であって、本発明にかかる薬学的に有効な量のナノ粒子または組成物を、それを必要とする患者に投与することを包含する方法に関する。一実施形態によれば、前記癌は白血病である。

医薬組成物は、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、適切な分散または湿潤剤および上記した懸濁剤を用いて公知の技術にしたがって製剤化することができる。無菌注射用製剤は、例えば１，３‐ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来用いられている。このために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の薄い（ｂｌａｎｄ）不揮発性油が用いられ得る。また、オレイン酸といった脂肪酸は、注射剤の調製における使用を見出す。

溶液または懸濁液はまた、以下のアジュバントのうちの少なくとも１つを含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒といった無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンといった抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムといった抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸といったキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩といった緩衝液；塩化ナトリウムまたはデキストロースといった張性調節剤。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量容器に封入することができる。

一般的な処方の化合物は、非経口的に投与することができる。本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下注射、注入技術の静脈内、筋肉内、皮内注射、エレクトロポレーション（ＥＰ）、針なし注射については、ジェット式注射、遺伝子銃、ｂｉｌｊｅｃｔｏｒならびに経口、エアロゾル投与を含む。経口使用については、例えば、タンパク質Ａ由来の化合物ＣＴＡ１ＤＤをＥｌｉａｓｓｏｎらが記載するように使用することができる。タンパク質Ａ由来の化合物ＣＴＡ１ＤＤは、特に腸管の粘膜免疫の誘導のために、ならびに潜在的に、特にＢ細胞リンパ腫の癌に対して、Ｂ細胞が有用な治療細胞を標的とする特徴を有する。

一般的に、本発明の脂質含有粒子は、薬学的に有効な量で投与される。実際に投与される粒子の量は、治療される状態、投与の選択ルート、投与される実際の化合物、年齢、体重、および個々の患者の応答、患者の症状の重症度などを含む関連する状況に照らし、一般的には医師によって決定される。

本発明にかかるナノ粒子は、任意の微生物に対して任意のワクチンにおけるアジュバントとして使用することができる。それはは、鳥などの任意の動物、ヒトなどの哺乳動物、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマなどの家畜に対して使用することができる。一実施形態によれば、本発明は、動物の連鎖球菌およびウマのインフルエンザに対するワクチンにおいてアジュバントとして使用される。

ヒト用の用量は、含まれる他の化合物に応じて異なり得る。治療期間を考慮して、投与量は、１日あたり、＜５０μｇから１ｍｇ以上の範囲であってもよい。

本発明はまた、個々の患者への本発明にかかる癌の治療のための方法の適用性を評価するための方法に関し、当該方法は、
・前記患者からの癌細胞を、インビトロで請求項１〜７のいずれか１つに記載のナノ粒子または請求項８または９に記載の医薬組成物と接触させる工程と、
・前記癌細胞に対する前記ナノ粒子または医薬組成物の治療効果を示す少なくとも１つの効果を測定する工程と
を包含し、
請求項１０または１１に記載の方法は、前記ナノ粒子または医薬組成物が前記癌細胞に対する治療効果を示す有意な効果を示す場合には前記個々の患者に適用可能なものとして評価される。

治療効果の指標は、遺伝子のダウンレギュレーションによって読み取ることができる。この遺伝子のダウンレギュレーションは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、サイクリン、または細胞周期および複製（ＣＤＫ２，ＣＤＫ６およびＣｙｃｌｉｎｅＤ１）のチェックポイントの通過を促進する他の分子として細胞周期レギュレーションにおいて、または
チミジンキナーゼ（ＴＫ）のダウンレギュレーションおよび細胞分化を促進する分子、例えば細胞周期からの出口も示すＩＬ‐８、ＦＯＸＣ１およびＨＤＡＣ５のアップレギュレーションにおいて重要である。レギュレーション因子は例であり、より多くの、すなわち制限を結論付けない多くの例がある。

本発明はまた、リン脂質を含有しないナノ粒子の製造するための方法に関し、当該方法は、
ａ）疎水性表面またはリポソームの懸濁液を提供する工程と、
ｂ）前記疎水性表面または前記リポソームの懸濁液を、ステロールの溶液、好ましくはコレステロールが有機溶媒または界面活性剤中にモノマーとして溶解した溶液と接触させる工程と、
ｃ）前記溶媒または界面活性剤を除去して前記表面にステロール膜を形成する工程と、
ｄ）キラヤサポニンミセルの水溶液を提供する工程と、
ｅ）サポニンミセルを含む前記水溶液を前記ステロール膜に添加する工程とを包含し、前記サポニンと前記ステロールと間に複合体が形成され、前記複合体は前記水溶液中に懸濁される。

疎水性表面は、瓶、浴槽、いくつかの層表面、ビーズ、例えばラテックスビーズ、ネットまたは３次元ネット、もしくは多孔質材料で表面であり得る。また、脂質膜に組み込まれた成分を有するとリポソームであってもよい。

リポソームは、記述されるように様々な技術にしたがって、かつ異なる組成で構築することができる（例えばＲｅｖｉｅｗ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｈａｍｍａｄ Ｒｉａｚ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｕｎｊａｂ，Ｌａｈｏｒｅ，Ｐａｋｉｓｔａｎ Ｐａｋｉｓｔａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．１９（１），Ｊａｎｕａｒｙ １９９６，ｐｐ．６５‐７７参照）。リポソームはまた、リポソーム膜内に組み込まれたウイルスタンパク質を含有するビロソームとして構成され得る。リポソームは、水溶液中に存在し得る。デバイスは、例えば列でパックされ得る。

サポニンおよびステロールは、ナノ粒子ついて上記したものであり得る。

溶媒は、下記のサイト上で見つけることができるいずれの溶媒であってもよい。ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏrｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｒｇａｎｉｃ＿ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｏｒ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ。好ましくは、クロロホルム、エタノールまたはａｃｅｔｏｎｉｒｔｒｉｌである。溶媒の性質は、ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔｓに記載されている。溶媒の選択は、溶解する分子の性質に依存している。異なるタイプの溶媒は、主に、極性および非極性にしたがって分類される。非極性溶媒は、例えば、ヘキサン（ｈａｘａｎｅ）、クロロホルムおよびジエチルエーテルである。３５と６５との間の沸点で蒸発することができ、蒸発により除去を促進するので、上記のものは有用である。極性非プロトン性溶媒は、製薬分子、例えばジチメルスルホキシド、アセトニトリルの可溶化によく使用される。後者は沸点が低いので、興味深い。極性プロトン性溶媒もまた、他の溶媒との組み合わせにおいて特に有用である。エタノール、メタノールは、沸点が低く、酢酸は、沸点が高い。低沸点は、蒸発法にとって特に重要である。可溶化は、２つ以上の溶媒を用いて行うことができる。上記溶媒は一例であり、Ｇ３製剤を形成するために、技術革新において使用されるおそらくさらに所望される特性を有する多くのものが存在する。

使用可能な例は、非イオン性、イオン性、すなわちカチオン性またはアニオン性や、双性イオン性界面活性剤、例えばツィタージェントまたは過剰に使用される没食子酸に基づく界面活性剤などとしてである。好適な非イオン性界面活性剤の典型的な例としては、Ｎ‐アルカノイル‐Ｎ‐アルキル‐グルカミン、ポリグリコールエステル、および脂肪族またはａｒａｌｙｌｐｈａｔｉｃ酸およびアルコールを有するポリグリコールエーテルである。これらの例としては、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）ｘＯＨ、略式Ｃｎ Ｅｘを有するアルキルポリオキシエチレンエーテルと、アルキル基とポリオキシエチレン鎖（略記Ｃｎ Ｐｈｉ．Ｅｘ）との間のフェニル環を含有するアルキルフェニルポリオキシエチレンエーテルと、トリトンＸ‐１００＝ｔｅｒｔＣ_８Ｅ_９６（ポリエチレンオキサイドのオクチルフェノールエーテル）、アシルポリオキシエチレンエーテル：アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（略記ＣｎソルビタンＥｘ）、例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、．β‐Ｄ‐アルキルグルコシド、例えば．β‐Ｄ‐グルコシドがある。適切なイオン性界面活性剤の典型的な例としては、例えばコール酸、デスオキシコール、コール酸塩、ＣＴＡＢ（セチルトリアンモニウムブロマイド）といった没食子酸界面活性剤（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）がある。例えばタウロデオキシコール酸（ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｏｈｏｌａｔｅ）、グリコデオキシ、グリココールといった共役界面活性剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）さえ使用することができる。他の可能な可溶化剤としては、リゾレシチン、合成リゾリン脂質（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｉｌｉｐｉｄ）がある。上記界面活性剤の混合物であっても使用することができる。透析法を使用する際に界面活性剤は長すぎない時間で透析可能でなければならない。

いくつかの界面活性物質がマトリックス形成を大幅に促進する。これらには、極性頭部基および非極性脂肪族鎖、例えばホスファチジルコリン（負に帯電した）とホスファチジルエタノールアミン（正に帯電した）を有する内因性の生体膜脂質が挙げられる。

一実施形態によれば、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ‐１００、Ｔｗｅｅｎ‐２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ、ＮＰ‐４０、デオキシコール酸、ＭＥＧＡ‐１０、およびオクチルグリコシドであり得る。ＭＥＧＡ‐１０およびオクチルグリコシドは、透析によって除去することができる。他については、他の技術は、上述したように、例えば遠心分離法、カラムクロマトグラフィーを使用することができる。

水溶性剤は、沸点の低い有機溶剤を使用して蒸発させることによって、または透析によって、もしくはＥＰＣ特許第０ １０９ ９４２号に記載されるように透析、クロマトグラフィー、濾過、接線流によって除去され得る。

サポニンミセルの水溶液は、製造者から提供される凍結または噴霧乾燥粉末を添加することによって得ることができる。サポニンまたはサポニン画分は、通常、原液、例えば１０ｍｇ／ｍｌの水として保たれるが、その濃度に限定されず、ＣＭＣすなわち臨界ミセル濃度より大きい最終濃度で脂質膜を囲む水に添加される。例えば３０ｍｇ／ｌの正確な数字は、キラヤ製品に依存する。サポニンは、キラヤパウダー抽出物（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｐｏｗｄｅｒ Ｅｘｔｒａｃｔ）として得られ、粗キラヤ抽出物（Ｂｅｒｇｈａｕｓｅｎ、米国）、キラヤウルトラパウダー（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｕｌｔｒａ Ｐｏｗｄｅｒ）ＱＰ ＵＰ ３００、キラヤウルトラパウダーＱＰ ＵＰ １０００またはＶａｘ‐Ｓａｐ非画分キラヤサポニン製品、ＱＨＡ、ＱＨＣ画分（３つすべてがチリのＮａｔｕｒａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）、またはチリのＰｒｏｄａｌｙｓａ、Ｓａｎｔｉａｇｏから得ることができる。

本発明は、新しい製造方法を使用ことであり、疎水性表面に付着したステロールの人工膜を工程ａ）〜ｃ）において製造する。キラヤサポニン製品の水溶性ミセルと、キラヤミセルや人工膜中の要素との間の化学結合（共有結合）とは、革新的な水溶性のナノ粒子複合体すなわちＧ３としての水溶性複合体に人工膜成分を抽出する。この複合体は、化学（共有）結合によって一緒に保持されるので、水ｐｇａｓｅにおいて親水性部分を一緒に維持し、結合し、成分間の疎水性相互作用は、複合体の中心に残っている。膜は、界面活性剤または有機溶媒であり得る水溶性剤を有する有機溶液から形成される。

人工膜に組み込まれる疎水性分子および両親媒性分子が、工程ｂ）においてステロールとともに有機溶剤または界面活性剤を用いて可溶化し、有機溶媒の蒸発によって水相に転移される。溶媒に依存して、それは、沸点が水より低い場合には蒸発によって、または透析によって、もしくはＩＳＣＯＭの形成について記載される同様の類似の技術によって除去される。したがって、溶媒の除去は、粒子の形成の一部でなく、粒子の形成の一部ではない人工膜を形成するためである。人工膜の形成が完成した後に、人工膜の周囲に水が存在する。この水相に、水に懸濁（溶解）したキラヤミセルが添加され、人工膜が水相において抽出され、キラヤミセルが新しいＧ３製剤に再編成される。組成物は、水中の粒子懸濁液に人工膜を完全に溶解するように容易に調整することができる。この組成物は、共有結合を伴っており、それ故に革新的粒子が形成されるという構築の観点からミセルとは異なる。

工程ｆ）およびｇ）においては、キラヤ製品の水溶性ミセルの形態は、水相に最終製品を得るように相互作用することが可能である。この工程における第１の相互作用は、キラヤミセルと、人工膜中のステロールとの間の共有結合であり、第２の相互作用は、キラヤトリテルペノイド骨格とステロールとの間である。適当な比率の下で、人工膜内のすべての成分は、１７ｎｍから４０ｎｍまでの大きさで変化する新しいナノ粒子を形成する水溶性のキラヤミセルに組み込まれる。脂質、例えばリン脂質が人工膜中に存在する場合にはより大きい大きさが得られる。実施例２、４、９、１４、１５、１６は、ＤＴ、ブスルファン、ロスコビチン、ｖｉｖｏｌｕｘ４０およびビタミンＤ３を含む様々な種類の親油性分子が、本発明にしたがって組み込まれていることを示す。

ＩＳＣＯＭマトリックスは、工程ｂ）において、ステロールを含む懸濁液に少なくとも１つのリン脂質を添加することによって、新たな方法を用いて製造することができる。

リン脂質は、ホスファチジン酸の誘導体といったグリセロールホスフェートの誘導体、つまりレシチン、セファリン、イノシトールリン脂質、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０の炭素原子を有するスフィンゴシン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンから選択することができる。

疎水性成分は、工程ｂ）において、つまり脂質およびステロールも含む人工膜に組み込まれ得る。

工程ｄ）において、水溶性形態つまりミセル形態のサポニンは、人工膜を覆っている水相に添加される。

本発明のナノ粒子は、ＩＳＣＯＭマトリックスを置き換える。なぜなら、本発明のナノ粒子は、製造するのにより簡単でより経済的だからである。なぜなら、本発明にかかるナノ粒子は、２つの成分すなわちキラヤサポニンとコレステロールとに基づいており、ＩＳＣＯＭ粒子形成とは対照的に、３つの成分すなわちキラヤサポニン、コレステロールおよび第３の成分のリン脂質、例えばホスファチジルコリンを含む。キラヤ成分は、界面活性剤または有機溶媒を用いて可溶化される必要はない。本発明にかかる新たな生産技術はたくましく、敏感なバランスが克服される。したがって、新しい方法は、第４、第５またはそれ以上、すなわち他の疎水性分子または両親媒性分子の組み込みについて、ＩＳＣＯＭマトリックス技術よりもより適切である。なぜなら、これまでに開発された方法は、そのような化合物の強い傾向により、水例えばミセル中に自然に安定した複合体（自己集合）を形成することを可能にするので、したがって、疎水性相互作用によってＩＳＣＯＭマトリックス製剤に組み込まれない。それ故にＩＳＣＯＭマトリックス技術は、一般的な送達システムとして開発される欠点を有するが、本発明は、このような欠点を有していない。

本明細書に記載のすべての刊行物は、ここに参照として組み込まれる。以下の非限定的な実施例によって本発明を説明する。
実施例
材料と方法
化学物質と化合物

コレステロール（Ｃ８６６７）、ホスファチジルコリン（ＰＣ，Ｐ‐５７６３）およびクロロホルム（２８８３０６）は、全てのＳｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデンから購入した。画分Ａ（ＱＨＡ）とキラヤサポニンの画分Ｃ（ＱＨＣ）は、すべてＩＳＣＯＮＯＶＡ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデンから購入する。ジテルペノイド（ＤＴ）すなわちステビアは、Ｐｒｏｄａｌｙｓａ Ｌｔｄａ．、チリから購入した。ビタミンＤ３は、Ｍｉｖａ Ｎｕｔｒｉ‐ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ、上海、中国から市販で入手した。
細胞株

ヒトマクロファージ（Ｍφ）細胞株Ｕ９３７（多くの場合、生物学や癌研究のモデル細胞株として使用されている）と、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株ＨＬ‐６０とを、培地ＲＰＭＩ‐１６４０において増殖させた。ヒト前立腺腺癌ＰＣ‐３をＨＡＭのＦ‐１２ＫおよびＲＰＭＩ‐１６４０の５０／５０混合物中で培養した。すべての細胞は、ウプサラ大学の臨床薬理学部門から好意で供給された。すべての媒体は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１００ ＩＥ／ｍｌのペニシリンで補充した（これらすべてはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ，Ｓｔ Ｌｏｕｓ，ＭＯ，米国から）。全ての細胞株を、５％のＣＯ_２を含む加湿空気中において３７℃でインキュベートした。
ヒト樹状細胞（ＤＣ）

未成熟ヒトＤＣは、３Ｈ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ウプサラ、スウェーデンから購入した。

５０００‐２０，０００細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルμタイタープレート内の細胞を、５％のＣＯ_２を含む加湿雰囲気中において３７℃で７２時間、シリアル希釈Ｇ３、ＫＧＩ、および同量のＱＨＣを含むキラヤサポニン製品に曝露した。Ｕ９３７細胞については、一組の細胞が製剤の細胞殺傷効果を測定するために、蛍光ミクロ培養細胞毒性アッセイ（ＦＭＣＡ）に対して直接的に使用された。他の組の細胞については、上清がサイトカインＩＬ‐８判定のために１５０μＬ／ウェルを採取された。
癌細胞殺傷効果の測定

ＦＭＣＡ法は、無傷の形質膜を有する細胞によって、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）の加水分解からフルオレセインに発生する蛍光の測定に基づいている。３日間の上述のインキュベーション後、培地を吸引により除去した。ＰＢＳで１回洗浄した後、生理緩衝液（１０μｇ／ｍｌ）中に溶解した１００μｌ／ウェルのＦＤＡを添加した。プレートを４５分間インキュベートし、各ウェルから発生する蛍光を９６ウェル走査蛍光光度計で測定した。蛍光は、ウェル中の無傷な細胞の数に比例する。成功した分析の品質基準は、対照群ウェルにおいて平均ブランク値の５倍より大きい蛍光シグナルを含み、対照群ウェルにおいて３０％未満の平均変動係数（ＣＶ）を有していた。
Ｇ３製剤用いて刺激されたＵ９３７細胞についてのサイトカインＩＬ‐８判定

ヒトＩＬ‐８の検出のためのＥＬＩＳＡが、製造業者の指示（Ｈｕｍａｎ ＩＬ‐８ ＥＬＩＳＡ、カタログＮｏ．Ｓ８０００Ｃ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ５５４１３，ＵＳＡ）にしたがって実施された。簡単に言うと、５０μｌの再構成された標準のヒトＩＬ‐８と、上清とを三重ウェルの各ウェルに添加し、プレートを数回穏やかにタップしてよく混合した。次いで、プレートを接着プレートカバーで覆い、室温（ＲＴ、２０〜２５℃）で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、５０μｌ／ウェルのビオチン化抗体試薬（抗ヒトＩＬ‐８）添加した。プレートを接着プレートカバーで再び覆い、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン‐ＨＲＰ溶液を塗布した。プレートを接着プレートカバーで再び覆い、ＲＴで３０分間インキュベートした。プレート内の内容物を廃棄し、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに分注した。酵素呈色反応を３０分間、暗所でＲＴで発達させた。反応は、１００μｌ／ウェルの停止溶液を添加することによって停止した。吸光度を４５０ｎｍおよび５５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。マイクロプレート内の光の不完全性を補正するために、４５０ｎｍの値から５５０ｎｍを引く。次いで、標準曲線を生成し、未知の試料におけるヒトＩＬ‐８の量を計算するように使用した。標準曲線は、横（Ｘ）軸に、対応する濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対する縦（Ｙ）軸の各標準濃度について得られた平均吸光度をプロットすることによって作成された。
Ｇ３製剤によって刺激されたヒト単球のサイトカインＩＬ‐１２遺伝子発現

Ｇ３、ＤＴ、ＤＴが組み込まれたＧ３によって処理したＤＣのサイトカインＩＬ‐１２遺伝子発現を遺伝子アレイによる細胞対照群と比較した。簡単に述べると、正常なヒト単球は、同じ濃度の同じ粒子中の１０μｇ／ｍｌのＧ３、１００μｇ／ｍｌのＤＴ、およびこれらの２つの組み合わせに、６時間曝露し、その後、ＲＮＡが製造業者取扱説明書（ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉｋｉｔ）にしたがって単離された。「ウプサラ Ａｒｒａｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ウプサラ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ウプサラ‐Ｓｗｅｄｅｎ」において、逆転写を介してＲＮＡサンプルを標識されたｃＤＮＡに変換し、様々なサンプルから定量的なデータを未処理細胞と比較する（Ａｍｂｉｏｎ ＷＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ）ことによって、ＲＮＡ発現解析がなされた。
チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性
ＴＫ活性をＢｉｏｖｉｃａ（ウプサラ、スウェーデン）から入手したキットを用いて判定した。簡単に述べると、様々な時点でＫＧＩまたはＧ３製剤に曝露させた後、０．１〜１×１０^６細胞／ｍｌの濃度の１００μｌの細胞懸濁液をエッペンドルフ管に移し、２００gで１０分間、遠心分離した。細胞ペレットを１００μlの冷ＰＢＳに再懸濁し、２〜３回凍結／解凍した。５分間最大速度で遠心分離した後、次いで、細胞を回収した。細胞間ＴＫ活性は、製造業者のプロトコルにしたがって測定された。
ビタミンＤ３の検出
Ｇ３粒子に組み込まれたコレカルシフェロール（ビタミンＤ３）を有するサンプルが、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのリエゾン自動機器（Ｌｉａｉｓｏｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で分析された。アッセイ（ＤｉａＳｏｒｉｎ Ｌｉａｉｓｏｎ）は、２５‐ＨＯ‐Ｄ３を測定するように設計されているが、非ヒドロキシル化ビタミンＤ３と約１％の交差反応性を有する。
インフルエンザウイルス株とワクチン

非アジュバントワクチンとしてのヒトインフルエンザウイルスを、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｂ）をワクチンの調製、血清学的試験およびリンパ球の再刺激において抗原として使用した。ウィルスを、ＶＥＲＯ細胞上で培養し、デオキシコール酸塩を用いて分割した。それは、製造業者によって好意で供給された。収穫後、ウィルスを精製し、不活化し、分割し、３０μｇタンパク質／ｍｌの濃度で再懸濁した。用量は、図１に示すように１μgのウィルス抗原とおよび様々な量のアジュバントを含有していた。
ワクチン接種

動物施設（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）にて宿主されたＣ５６Ｂ１６マウスを二回首に皮下免疫した。詳細については、実施例１２を参照のこと。
赤血球凝集（ＨＡ）試験

クエン酸溶液に収集された鶏赤血球（ＲＢＣ）を、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２を用いて３回洗浄し、０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中に０．５％の濃度で再懸濁した。ＨＡ試験が４℃で１時間、Ｕ型マイクロプレートにおいて行われた。
赤血球凝集抑制（ＨＩ）試験

血清サンプルを、３０％懸濁液の鶏ＲＢＣとともに室温（ＲＴ℃）で１時間（ｈ）インキュベートした。吸収後、混合物を５００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集した。
た。最終的な血清希釈１：５だった。ＨＩ試験をＶ型マイクロプレートおよびＨＡ‐１６ユニット／５０μlを用いて行った。血清試料２５μlを等量のＰＢＳ‐ＢＳＡを用いて２倍に希釈した。希釈した血清を、２５μlのウィルス懸濁液とともにＲＴ℃で１時間、インキュベートし、その後、混合物を４℃で１時間、インキュベートした。赤血球凝集を１００％阻害する最高血清希釈が、サンプルの抗体値と考えられた。
リンパ球の調製

脾臓リンパ球（脾臓細胞）を可能な限り無菌的に得た。免疫されたマウスおよび非免疫化マウスを、３週間後のワクチン再接種に頸椎脱臼により採血し、屠殺した。脾臓を取り出し、その後注意深くほぐし、無菌のステンレス鋼メッシュを通過させ、ピペットを用いてトリシン有するＥＭＥＭで洗い流した。細胞を、５００×ｇの遠心分離手段を用いて、トリシン有するＥＭＥＭで２回洗浄した。次いで、ペレットを、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０μｇのゲンタマイシン／ｍｌ、２ｍＭ１ Ｌ‐グルタミン、３．８１ｇ Ｈｅｐｅｓ／Ｌおよび５×１０^‐５Ｍβ‐メルカプトエタノール（培養液）で補充したＦ‐ＤＭＥＭ培地に再懸濁した。細胞生存率を、トリパンブルー色素排除試験により評価（アッセイ）した。
酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）

サイトカインを分泌する脾臓細胞の数え挙げを、ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２またはＩＬ‐４のための市販のＥＬＩＳＰＯＴ‐キットを用いて行った。キットは、Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、スウェーデンから購入した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、Ｍａｂｔｅｃｈが推奨する指示にしたがって、使用した。

各サイトカインについては、１００μｌの培養液当たり２×１０^５の濃度の脾細胞を８つの異なるウェルにピペットした。４つの複製は、インフルエンザウイルス抗原の４．５μgの赤血球凝集素を含有する５０μlの培養培地が与えられた。残りの４ウェルは、１００μlの培養液のみを受けた。プレートを、３７℃で１８時間、加湿ボックス内でインキュベートし、その後、細胞を廃棄し、ウェルを洗浄した。スポットを、Ｍａｂｔｅｃｈが記載した手順にしたがって成長させた。要するに、プレートを、１００μlのビオチン化モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）抗ＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２またはＩＬ‐４でＲＴ℃で２時間、インキュベートした。次いで、プレートを丁寧にすすぎ、その後ＨＲＰＯ共役ストレプトアビジンを用いてＲＴ℃で１時間、インキュベートした。さらなる洗浄サイクルの後、プレートを、ＲＴ℃で約１５分間、基質を用いてインキュベートし、または別のスポットが出現するインキュベートした。水道水でプレートを洗浄し反応を停止させた。最後に、プレートを乾燥させた後、スポットの数をＥＬＩＳＰＯＴカウンターを用いてカウントした。
データ分析と統計

用量反応データを、計算されたＳＩ値とソフトウェアプログラムＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）を用いて分析した。データは、平均値±ＳＥ値として提示される。いくつかの手段間の統計的推論は、群手段のＴｕｋｅｙの多重比較事後検定を用いて一方向ＡＮＯＶＡにより実施し、２つの手段の比較については、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍのＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ‐ｔｅｓｔにより実施した。

Ｐａｒｔ Ｉ．製剤化および特性化
実施例１

本実施例では、Ｇ３ナノ粒子の製剤化が記載されている。実験の設定工程２、ＡおよびＢ（下記参照）においては、コレステロール対キラヤサポニンのＱＨＣ画分（ＩＳＣＯＮＯＶＡ ＡＢ，ウプサラ，スウェーデンから、ＷＯ２００８／０６３１２９を参照）の割合の影響が調査されている。工程Ｃにおいては、リン脂質を添加する効果が粒子の製剤化について調査されている。
実験の設定

工程１においては、界面活性剤または有機溶媒において可溶化を必要とする人工コレステロール膜が形成されている。この実験では、コレステロール（Ｃ８６６７，Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデン）の溶媒としてクロロホルム（２８８３０６，Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデン）を使用して、１００ｍｇ／ｍｌの原液を生成した。エッペンドルフ管に、５０μlのクロロホルム中に希釈した原液からのコレステロールの２μlを添加し、その後、１／２ｍｌの水をコレステロール溶液の上に重層した。クロロホルムを、針付き注射器よって生成された空気の流れによって蒸発させた。コレステロールの可視層が管の壁において見られた。
工程２において

１／２ｍｌの水を１ｍｌの新鮮な水と置き換え、１０μlのＱＨＣ原液（水中１００ｍｇ／ｍｌ）を水に追加した。その後、３７℃で一晩インキュベートした。壁から消失した膜および透明な水溶液が見られる。
・Ａ．工程１に記載されたように処理された２μＬのコレステロール原液と、工程２の１０μlのＱＨＣとを用いて、１：１のモル比を与えるこのＧ３製剤を生成した。
・Ｂ．別のモル比もまた、つまり２モルのコレステロール対１モルのＱＨＣを用いた。それ以外は、実験はＡと同じであった。
・Ｃ．１モルのコレステロールおよび１モルのホスファチジルコリン（Ｐ‐５７６３は、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｗｅｄｅｎ ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，スウェーデンからのものである）の比率を用いて工程１において膜を形成する。工程２では、２モルのＱＨＣを使用した。
結果

Ａ．蒸発させた後、均一な大きさを有する１７ｎｍの粒子が電子顕微鏡（ＥＭ）（図１Ａ参照）と勾配遠心分離とによって特徴づけられ達成された。Ｇ３懸濁液は、透明な溶液として可視化される。

Ｂ．蒸発させた後、約１７ｎｍ（図示せず）の培地直径を有するやや広い大きさ範囲の粒子が、ＥＭにおいて観察された。すなわち１７ｎｍの粒子もまた、２モルのコレステロールおよび１モルのキラヤサポニンの範囲内で作成された。

Ｃ．生成物は、約４０ｎｍの直径（図１Ｂ）を有するＩＳＣＯＭ粒子の生成物のような形態を有する。したがって、ホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｃｈｏｌｉｎｅ）を有する形態は、ホスファチジルコリンを有しない本発明であるＧ３にかかるナノ粒子の形態とは完全に異なっている。また、本発明にかかるナノ粒子は、ＬｏｅｖｇｒｅｎおよびＭｏｒｅｉｎ^１が主張するようにＩＳＣＯＭ製剤に不可欠なホスファチジルコリンを含むリン脂質の組み込みの優れた基盤であるこということも結論付けることができる。
結論と考察

１キラヤに対する１コレステロールのモル比で、小さな（１７ｎｍ）ナノ粒子が形成される。コレステロールの高い比率、つまり２コレステロール対１キラヤ以上のモル比の場合には、より大きな粒子が現れる。留意すべきことは、工程１においてその他の親油性成分を含ませることによって、粒子の大きさが変化する、つまり粒子の負荷が大きさ影響を与える。この場合、大きさの範囲が１７から４０ｎｍの間で記録されたが、その範囲を限定するものではない。特に重要なことは、ＥＭにおいて、粒子の凝集が見られず、むしろ粒子がお互いから十分に分散していた。

親油性物質を水溶性にするための不可欠なかつ新たな概念が、この２工程の手順である。脂質膜、例えば疎水性固体支持体を有しないが水相の遊離懸濁液中に存在するリポソームを形成する様々なやり方がある。第２の工程は、水溶性Ｇ３粒子を先ず介して水相に膜を抽出する。

留意すべきことは、本発明にかかるナノ粒子を形成するための手順は、例えばＩＳＣＯＭ製剤を作るために現在使用されている方法よりもしっかりしており、かつはるかに単純である。（ＬｏｅｖｇｒｅｎおよびＭｏｒｅｉｎ、上記参照）。とりわけ、蒸発が用いられた場合には、粒子製剤に用いられる材料、つまり言及したケースのＱＨＣまたはコレステロールにおけるキラヤサポニンがほとんど損失せず、リン脂質を必要としない、それにより、製造コストをさらに削減する。興味深いことは、本発明にかかるナノ粒子は、ＩＳＣＯＭの形成のための基盤として使用することができる。

界面活性剤が可溶化するために使用される場合には、界面活性剤の除去はＬｏｅｖｇｒｅｎおよびＭｏｒｅｉｎ^２によって記載されているように、例えば透析、カラムクロマトグラフィー、超遠心分離または接線流によって、行わなければならない。疎水性表面を有するビーズ（例えばラテックスビーズ）を使用することがより実用的であり得る。したがって、２つの工程の手順は、負荷に応じて形態が変化し得るナノ粒子を製剤化する革新的な堅固な方法である。

さらに、工程１において膜を形成するこの方法は、工程２において水溶性のＧ３粒子を親油性分子に組み込むための一般的な方法である。
実施例２

本実施例は、両親媒性の性質を有する分子を、実施例１に記載されるような技術によって、Ｇ３粒子に組み込むことができることを示している。留意すべきことは、注射部位において希釈し、その後部位から送達されるがゆえに、投与した後にミセルが崩壊するので、Ｇ３は水に自然に溶解する。故に、バイオアベイラビリティが低くかつ弱い。したがって、Ｇ３の安定した複合体が重要である。
実験の設定

実験の設定は、疎水性分子のジテルペノイド（ＤＴ）もまた、実施例１に記載されたコレステロールと同時に可溶化していることを除いて、本質的に実施例１の場合と同じである。Ｑｕｉｌ Ａの画分Ｃ（ＱＨＣ）およびコレステロールとともにＤＴ分子が、実施例１と同様の２つの工程を用いてＧ３粒子中に取り込まれた。つまり、工程１について記載された１コレステロール：０．５ＤＴのモル比で１μｌのＤＴ（原液として９９％エタノール中で１００μｇ／ｍｌ）を可溶化した。工程２においては、ＱＨＣは、実施例１のコレステロールと１：１のモル比を有するように添加された。
結果

組み込まれたＤＴを有するＧ３粒子は、図１Ａに示したＤＴを有しないＧ３粒子と同じ形態を有する。工程１においては、膜は、工程２において消えた管の壁において可視化した。工程２からの水の溶液は、透明からわずかに乳白色であり、堆積物は検出されなかった。
結論

ミセル形態の両親媒性分子のジテルペノイド（ＤＴ）は、使用した溶媒により成功裏に崩壊し、工程２において、本発明にかかるナノ粒子に組み込まれることにより、１７ｎｍの標準的なＧ３のナノ粒子になる。したがって、両親媒性分子のための担体／送達システムとして、本発明にかかるＧ３ナノ粒子を使用する能力が示される。必要な構成を有する両親媒性分子は、個人への投与後にかなり不安定なミセルを形成する。これにより、しばしばバイオアベイラビリティが低くなる。実施例４においては、このＧ３‐ＤＴ粒子が生物活性であることが示されている。本発明にかかるナノ粒子の送達粒子としての免疫増強能力や有用性をさらに証明するために、かつ、例えば細胞膜における受容体を介する細胞との相互作用による生物学的作用を増強するために、パリ条約優先年度中にさらなる研究が行われる。詳細については、参照により本明細書に組み込まれたＨｕら^３を参照のこと。免疫増強および癌細胞殺傷効果を含む相補的特性を有する他の分子を取り込むことによって、免疫増強および癌細胞殺傷効果が潜在的かつ実質的に広がる。
実施例３

癌細胞を殺傷するＧ３の能力を、リンパ系腫瘍細胞を表すＵ９３７モデルに対してインビトロで試験した。
実験の設定

Ｇ３粒子を、「材料と方法」に記載されるようにコレステロールとＱＨＣとを様々な重量比またはモル比で配合した。様々な製剤をインキュベートし、「材料と方法」に記載されるようにＦＭＣＡ方法によって染色し、読み取った後癌細胞殺傷効果を測定した。
結果

実施例１に記載されるように、かつＥＭ結果（実施例１および図１Ａ参照）による形態から結論付けられるように、１コレステロール対５ＱＨＣの重量比、つまり１コレステロール対１ＱＨＣのモル比を有するようにＧ３粒子を形成した。Ｇ３粒子のＵ９３７癌細胞殺傷効果は、ＫＧＩ粒子（図２）と同じ大きさであった。これは、Ｇ３製剤中に組み込まれたときに活性成分ＱＨＣが維持されたことを示す。ＫＧＩは、以前からＵ９３７癌細胞を殺傷することが知られている（ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５０８７８）。
実施例４

本実施例は、実施例１および２において記載したような技術によって、両親媒性分子ＤＴをＧ３粒子に組み込むことができることを示している。

ＤＴは、ジテルペン、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ｂｅｒｔｏｎｉ^４ から生産されたステビオシドである。ＤＴは、公表されたように^１１免疫学的特性を含む多くの興味深い医学的特性を有するので、我々は、ＤＴを使用した。この化合物の１つの問題は、我々が実験したように、ＤＴは、インビボでバイオアベイラビリティが低いので、例えばナノ粒子において送達システムが必要となる。

ＩＬ‐８を産生するように癌細胞Ｕ９３７を誘導するＤＣの容量は、免疫学的効果を調査するために行われましたが、さらに重要なことは、ＤＣが、制御不能な癌細胞の増殖を停止するために重要である、癌を分化に導くことができることをこのサイトカインを用いて示すように行われた。さらに、ＩＬ‐１２を含むヒトＤＣのサイトカインを誘導するＤＴの能力を試験した。これらの試験は、ＤＴがＱｕｉｌ Ａに対して重要な相補的な免疫学的効果を有し、それ故にＧ３粒子に組み込まれることが有用であることを強調するように行われた。ＤＴは、Ｐｒｏｄａｌｙｓａ ＬＴＤＡ、Ｓａｎｔｉａｇｏ、チリから供給された。ここでは、「材料と方法」に記載されるように調製したヒト樹状細胞（ＤＣ）を使用した。
実験の設定

Ｕ９３７細胞を、１００μg／ｍｌから始め、６つの工程について５倍の希釈によって、３７℃で４８時間、ＫＧＩまたはＧ３製剤を用いてインキュベートした。次いで、「材料と方法」に記載されるように、上清を回収し、ＩＬ‐８の検出のために使用した。

遺伝子発現の測定のために、ＢＢＥ、ＫＧＩ、ステビア、およびＢＢＥと組み合わせたステビア、またはＫＧＩ（図４Ａ）ならびにステビアが組み込まれたＧ３もしくはステビアが組み込まれていないＧ３を用いてヒトＤＣをインキュベートした。「材料と方法」に記載されるように、処理したＤＣからの様々なサイトカイン遺伝子の発現は、ｍＲＮＡアレイ解析によって行われた。
結果

Ｇ３粒子は、同レベルのＩＬ‐８を産生するようにＵ９３７癌細胞を誘導した。このＩＬ‐８は、癌細胞の分化マーカーであり、ＫＧＩ（図３）によって誘導されるにことにより産生される。

図４Ａは、ＤＴが高レベルのＩＬ‐１２、ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐６を誘導し、これらは、製剤ＫＧＩおよびＢＢＥのようなＩＳＣＯＭにより誘導されたものであることを示している。

ＤＴが組み込まれたＧ３粒子は、高レベルのＩＬ‐１２を誘導し、一方、ＤＴが組み込まれていないＧ３粒子は、検出可能なレベルのＩＬ‐１２を誘導しなかった（図４Ｂ）。
考察と結論

ＤＴは、Ｇ３に対して相補的な性質を有する。ＩＬ‐８を産生するようにＵ９３７癌細胞を誘導する能力は、免疫増強を示し得る。さらに重要なことは、我々が示したように（補足する原稿準備中）、Ｇ３単体は、分化し、ＫＧＩのように増殖を停止するように癌細胞を導くことができる。Ｇ３単独に対する相補的な効果は、ＤＴが潜在的にＩＬ‐１２を誘導し、このことは、特にＩＦＮの産生のためにＴｈ１型の応答を誘導するために重要であり、ＩＦＮは、特定の腫瘍に対して抗癌効果を有することを示す。免疫学的観点から、免疫系によって認識される腫瘍抗原が存在する場合には、ＩＬ‐１２は、腫瘍の拒絶のために重要である。ＩＬ‐１２はまた、ウィルス感染に対する免疫防御のために重要である。ＤＴがＧ３に込みこまれて、Ｇ３が担体／送達粒子として機能し、それにより、投与後の粒子形態における安定性を増し、その結果としてＧ３のバイオアベイラビリティを増大させることを記録することは大変興味深い。ＤＴ単体が水中でミセル形態である。個体の体内に投与されたミセル形成は崩壊する。なぜなら、投与部位における希釈が、その後その部位から送達されるにつれて低下するからである。Ｇ３粒子は、他の力によって一緒に保持されており、例えばＥＭ研究（公表されていない）によって記録された注射後も崩壊しない。本実施例では、Ｇ３の発明が両親媒性分子のための担体として機能していることを強調している。
実施例５

Ｇ３粒子によるチミジンキナーゼ（ＴＫ）活性の阻害は、癌細胞の制御不能な複製を防止し、その後の工程が細胞をプログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスへ操縦するために不可欠な特性である。

癌細胞の複製を阻害するＧ３粒子の１つのメカニズムを探るために、Ｕ９３７細胞上のＴＫ酵素の阻害を測定することにより評価した。Ｇ３粒子または抗癌治療のために使用される任意の他のキラヤ製剤が単独でまたは他の抗癌製剤と組み合わせて腫瘍患者を治療するのに有用であるかどうか評価するために、癌細胞複製の阻害を示すＴＫ酵素活性の阻害を用いる以外に、この作用モードが使用される。そのような試験は、オーダーメイド医療として定義される分野における臨床サンプルに対してＴＫ作用モードの阻害を用いて、抗癌剤の感受性を測定するようにキットにおいて使用することができる。
実験レイアウト

Ｕ９３７細胞を、同量のＧ３またはＫＧＩに曝露した。様々な時点において、「材料と方法」に記載されるように処置した細胞を回収し、細胞間のＴＫ活性を測定した。
結果

Ｇ３粒子は、ＫＧＩ（図５）が阻害する同じ大きさの細胞間のＴＫの活動を実質的に阻害する。
結論

ＴＫ活性の阻害は、癌細胞が複製しなくなることを示す。したがって、細胞レベルにおけるＴＫ活性の阻害は、患者サンプルからの癌細胞の薬物、つまりＧ３粒子に対する感受性を測定するように用いられる。これは、オーダーメイド医療への道を開く。我々の知る限りでは、ＴＫ活性は、癌患者からの血清ＴＫの検出のために、または患者からの他の疾患の徴候の検出のために非特異的なテストとして使用されてきた。患者からの癌細胞に直接それを使用することが我々の革新技術である（１００％の特異性、つまり癌細胞のみが使用される）。これは、癌細胞殺傷特性とともに、応答しない患者への使用を避けることによって、臨床的使用に対して、Ｇ３粒子がより実現可能になる。

Ｐａｒｔ ＩＩ．抗癌剤としてのＧ３
実施例６

本実施例は、Ｇ３およびＧ３を有するＤＴ（Ｇ３‐ＤＴ）が、非粒状形態のＧ３の有効成分ＱＨＣ（ＱＨＣ）よりも非固形ヒト腫瘍（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞）をより効率的に殺傷することを示す。
実験の設定

実施例１および２で記載したように製剤されたナノ粒子Ｇ３およびＧ３ＤＴを、癌細胞殺傷効果について有効成分ＱＨＣ形態と比較した。サンプルは、１００μｇ／ｍlから始まり、６段階で連続的に５倍に希釈し、ＨＬ‐６０ＡＭＬ細胞を用いて３日間、インキュベートした。次いで、細胞を、ＦＭＣＡ法により染色し、読み取った。
結果

Ｇ３（ＩＣ_５０＝３．１４４μｇ／ｍl）およびＧ３‐ＤＴ（ＩＣ_５０＝３．１２μｇ／ｍｌ）は、ＱＨＣ（ＩＣ_５０＝８．４７３μｇ／ｍｌ）よりもより効率的にＡＭＬ細胞の増殖を阻害した（図６）。
結論と考察

本質的に、Ｇ３は、非粒子状ＱＨＣと比較して、より強力な癌細胞殺傷効果を有する。ＤＴをＧ３粒子に組み込み、Ｇ３‐ＤＴを形成することは、ＱＨＣまたはＤＴなしのＧ３と比較して癌細胞殺傷効果を高める。ＤＴ単独では、癌細胞殺傷効果を有していない（図示せず）。非粒子状ＱＨＣは、粒子形態により消される局所反応を起こす。ＡＭＬ癌細胞を殺傷する際のＧ３‐ＤＴの付加効果は、有益な用量の低減をも伴う。
実施例７

シタラビンは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用される市販の細胞増殖抑制剤である。本実施例は、シタラビンの癌細胞殺傷効果を高めるようにＧ３の能力を探るために設定された。
実験の設定

ＨＬ‐６０ＡＭＬ細胞を、図７に示すように、予め決められた濃度のＧ３とシタラビンとを別々に、およびこれら２つの組合せを３日間、曝露した。その後、細胞を、ＦＭＣＡ法により染色し、癌細胞殺傷効果を読み取った。
結果

３日間インキュベートした後、Ｇ３またはシタラビン単独では、それぞれ５％未満および５５％未満の細胞を殺傷した。それらが組み合わされた場合、殺傷率は約７５％に有意に（Ｐ＜０．０１）上昇した（図７）。
結論と考察

Ｇ３粒子は、ＨＬ‐６０ＡＭＬ細胞に対するシタラビンの殺傷効果を有意に高める。細胞増殖抑制剤シタラビンによる治療は、患者に対して不快感による副作用を引き起こす。Ｇ３粒子は、実質的に非毒性であるので、Ｇ３とシタラビンとの組合せの治療はまた、有効性を増大させる可能性を有し、シタラビンの用量を少なくすることにより副作用を減らす。
実施例８

本実施例では、Ｇ３は非固形腫瘍、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞に対する市販の細胞増殖抑制癌治療剤ダウノルビシンの癌細胞殺傷効果を付加したことを示している。
実験の設定

ＨＬ‐６０ＡＭＬ細胞は、１０００ｎｍから開始し、増加するダウノルビシンの濃度と組み合わせて固定濃度の（１μｍ）のＧ３に曝露し、３日間インキュベートした。その後、細胞を、ＦＭＣＡ法により染色し、読み取った。
結果

Ｇ３は、ダウノルビシン単独と比べて、ダウノルビシンの癌細胞殺傷効果を有意（Ｐ＜０．０００１）に高める（図８）。
結論と考察

Ｇ３粒子は、ＨＬ‐６０ＡＭＬ細胞に対するダウノルビシンの殺傷効果を相乗的に高める。Ｇ３粒子は、実質的に非毒性であるので、細胞増殖抑制剤のダウノルビシンの用量は、より良い治療効果を伴うＧ３との併用療法でかなり減少する可能性が高く、低副作用であるので、ダウノルビシンに敏感な患者においても、治療をより長い間継続することができる。
実施例９

本実施例は、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ‐３に代表される固形腫瘍に対するＧ３と、ＤＴが組み込まれたＧ３（Ｇ３ＤＴ）との効果を比較するように設計された。
実験の設定

Ｇ３およびＧ３ＤＴを、非粒子状ＱＨＣと比較した。サンプルは、１００μｇ／ｍlの濃度から始まり、６段階で連続的に５倍に希釈し、ＰＣ‐３前立腺癌細胞を用いて３日間、インキュベートした。次いで、細胞を、ＦＭＣＡ法により染色し、読み取った。
結果

Ｇ３粒子（ＩＣ_５０＝２．７５μｇ／ｍl）およびＧＴが組み込まれたＧ３‐ＤＴ（ＩＣ_５０＝１．６６２μｇ／ｍｌ）は、同様の有効成分ＱＨＣ（ＩＣ_５０＝３．３８８μｇ／ｍｌ）単独よりも、より潜在的に前立腺癌細胞の増殖を阻害した（図９）。
結論と考察

本質的に、本実施例では、Ｇ３は、ＰＣ‐３前立腺癌細胞に対して、ＱＨＣと同様の殺傷効果を有した。ＤＴを粒子に組み込む、つまりＧ３‐ＤＴによって、ＡＭＬ細胞と同様にＧ３の癌細胞殺傷効果を高める。ＤＴ単独手では、癌細胞殺傷効果を有しないことが知られている。ＰＣ‐３癌細胞を殺傷するのにここに付加された効果は、Ｇ３の効果を高め、かつ若しあれば副作用の減少をも伴う。留意すべきことは、非粒状形態のＱＨＣは、インビトロでは比較的効率的であるが、インビボではＱＨＣは、注射部位に留り、それにより、バイオアベイラビリティを低くし、局所的副作用をもたらす。
実施例１０

本実施例は、ＰＣ‐３前立腺癌細胞に代表される固形腫瘍に対する、Ｇ３と市販薬ドセタキセルとの併用効果を示す。
実験の設定

ＰＣ‐３細胞を、グラフに示すように、予め決められた濃度のＧ３とドセタキセルとを別々に、およびこれら２つの組合せを３日間、曝露した。その後、細胞を、ＦＭＣＡ法により染色し、読み取った。
結果

Ｇ３またはドセタキセルの癌細胞殺傷効果は、単独では、それぞれ３５％および２％よりわずかに大きく細胞を殺傷した。これら２つの薬物を組み合わせた場合、殺傷率は約７５％に有意に（Ｐ＜０．０１）上昇した（図１０）。
結論と考察

Ｇ３粒子は、前立腺ＰＣ‐３癌細胞に対する増殖抑制性ドセタキセルの癌細胞殺傷効果を有意に高め、Ｇ３粒子が実質的に非毒性であることに鑑みると、有効性を増大させ、細胞増殖抑制剤の用量を減少させ、副作用を減少させることを伴う。
実施例１１

本実施例は、固形腫瘍のヒト前立腺癌ＰＣ‐３細胞に対する、Ｇ３と最近の特許が取得された市販の細胞増殖抑制剤カバジタキセルとの併用効果を調査するように設計された。
実験の設定

ＰＣ‐３前立腺癌細胞は、１００μｍから開始し、増加するカバジタキセルの濃度と組み合わせて固定濃度の（１μｍ）のＧ３に曝露し、３日間インキュベートした。その後、細胞を、ＦＭＣＡ法により染色し、読み取った。
結果

カバジタキセル単独では、Ｇ３がＩＣ_５０＝２５．５４μＭで、ＰＣ‐３癌細胞を殺傷した。Ｇ３と組み合わせたカバジタキセルの癌細胞殺傷効果（ＩＣ_５０＝０．０００２３μＭ）は、有意に（Ｐ＜０００１）高まった（図１１）。
結論と考察

Ｇ３粒子は、ＰＣ‐３前立腺癌細胞に対するカバジタキセルの殺傷効果を有意にかつ相乗的に高め、Ｇ３粒子が実質的に非毒性であることに鑑みると、より良い有効性、低減副作用の可能性および長期治療の可能性を伴う。
実施例１２

本実施例は、ここにおいてＡＣＨＮ腎臓癌細胞株によって代表される固形腫瘍を殺傷する際に別の重要なキラヤサポニン画分ＱＨＡを用いて製剤化されたＧ３粒子の能力を調査するように設計された。なぜなら、この画分を用いて製剤化されたＤｕｅｃｏｍ粒子は、画分Ｃ（ＱＨＣ）を用いて製剤化されたＤｕｅｃｏｍ粒子よりも、より強い殺傷能力を有することが以前観察された。
実験レイアウト

ＱＨＡおよびＱＨＣを用いて製剤化されたＧ３は、１００μｇ／ｍｌから０．０３２μg／ｍｌまで６段階で５倍に希釈し、ＡＣＨＮ腎癌細胞を用いて、３７℃で３日間インキュベートした。細胞生存は、ＦＭＣＡ法により判定した。
結果

ＱＨＡを用いて製剤化したＧ３は、ＱＨＣを用いて製剤化したＧ３よりも、ＡＣＨＮ腎臓癌細胞をより有意に（Ｐ＜０．０１）殺傷する（図１２）。
結論と考察

この結果は、ＱＨＡおよびＱＨＣを用いて製剤化したＤｕｅｃｏｍ粒子による以前の観察と事実上同一である、つまりＱＨＣとの製剤化は、非固形腫瘍をより選択的に殺傷し、一方ＱＨＡとの製剤化は、非固形腫瘍をよりもより多くの固形腫瘍を好適に殺傷する。Ｇ３製剤のこのタイプの特異的腫瘍殺傷特性は、別のカテゴリにおける正常な細胞を殺傷することを避けるために、Ｄｕｅｃｏｍ粒子に対して利用することができた。

Ｐａｒｔ ＩＩＩ．アジュバントとしてのＧ３
実施例１３

Ｇ３粒子を全ウィルスに対するアジュバントとする動物試験

ＩＳＣＯと比較して、Ｇ３のアジュバント効果をＣ５７ＢＬ／６マウスでの動物試験で評価した。崩壊および不活性化インフルエンザウイルスを、実験においてモデル抗原として使用した。
実験レイアウト

４週間間隔で２回免疫した群ごとの６匹のマウスは、１回目の免疫の３週間後、および２回目の免疫の４週間後に血液サンプルを採取した（次ページの図式説明を参照）。「材料と方法」に記載したように、剖検時つまり２回目の免疫の４週間後に、サイトカイン産生について脾臓細胞を分析した。理解を容易にするために、動物の群が図１３Ａに示されている。
結果

Ｇ３およびＩＳＣＯＭは、用量に依存する形で１回目の免疫化後に検出可能なレベルのＨＩ抗体を誘導した。２回目の免疫後、ＨＩ抗体のレベルは、これも用量に依存する形であるがＧ３アジュバント添加製剤に対してかなりを増加した（クリアブースト効果）。ＩＳＣＯＭ、Ｇ３およびＤＴが組み込まれたＧ３アジュバンド添加製剤は、アジュバント無添加の市販ワクチンよりも、より高いレベルのＨＩ抗体を誘導した。つまり、同等以上のレベルのＨＩ応答が、１回目（図１３Ａ）の免疫と２回目（図１３Ｂ）の免疫後の２つの時点においてＧ３およびＩＳＣＯＭで免疫した動物間で記録された。

剖検時つまり２回目の免疫の４週間後に、Ｇ３およびＩＳＣＯＭ製剤で免疫した動物間のスプリットウィルスを用いてインビトロで再刺激し後に、同等またはそれ以上の高いレベルのＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐４応答が脾臓細胞において検出された（図１３Ｃ）。
結論

Ｇ３およびＩＳＣＯＭ製剤によって誘導される抗体性免疫および細胞性免疫の両方は、定性的に同じである、つまりＧ３製剤、すなわちＧ３およびＧ３ＤＴはアジュバントとしてＩＳＣＯＭを置き換えることができる。

Ｐａｒｔ ＩＶ．薬物送達システムとしてのＧ３
実施例１４

ＶＬＸ４０は、癌を治療するための有望な薬剤であると考えられていた。前臨床試験において動物への投与に適するようにＶＬＸ４０を製剤化することができず、その結果、患者においてはその後の試験が行われなかったので、市場への研究は中止された。その理由は、ＶＬＸ４０は、水に可溶しなかったからである。可溶は、身体に取り込むのに必要である。この実験は、Ｇ３技術が問題を解決し、ＶＬＸ４０を水に可溶させることができるかどうかを確認するように設計された。
実験の設定

・ＶＬＸ４０を、最初に２０ｍＭの濃度を得るために有機溶媒ＤＭＳＯ（５．８６６４ｍｇの／ｍｌ、推奨される最高濃度）に溶解し、原液として指定した。

・１００□ｇ／ｍｌの濃度のＶＬＸ４０を、水中のＶＬＸ４０の対照群として、つまり実質的に非水溶性製剤として使用した。

・８．５μｌのＶＬＸ４０原液を、５００μｌの水を含むエッペンドルフ浴槽内において５０μｌのクロロホルムと混合して、人工脂質膜を形成した（実施例１参照）。第２の工程において、１０μｌのＱｕｉｌ Ａ（原液として水中に１００ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。これが実施例１に記載されるのと実質的に同じように形成されるＧ３‐ＶＬＸ４０製剤である。
上記のように同じ濃度から連続的に希釈した後、ＶＬＸ４０‐ＤＭＳＯ対照群（２）およびＧ３‐ＶＬＸ４０懸濁液／溶液（３）を収集し、Ｕ９３７‐ＧＴＢ細胞に対して試験を行い、ＩＣ５０を回帰曲線から計算した。
結果

原液（１）が追加された水は、目に見える堆積物または沈殿物を生じさせた（つまり先の試験より予想通り）。したがって、ＶＬＸ４０は、制御管（２）からの水に溶解しなかった。透明な溶液／懸濁液のＧ３‐ＶＬＸ４０粒子（３）の製剤が電子顕微鏡によって確認された。Ｇ３‐ＶＬＸ４０製剤を含む管から沈殿物がなかったか、またはきわめてわずかな沈殿物があっただけだった。

様々な製剤を、機能について、つまりＵ９３７細胞の癌細胞殺傷効果（「材料と方法」参照）のためのバイオアッセイにおいて試験した。ＶＬＸ４０／ＤＭＳＯ（２）水相は、抗癌作用が低い（ＩＣ５０として表される）、これは、ＶＬＸ４０／ＤＭＳＯ混合物のほんのごく一部が水に溶解していることを意味する（図１４Ａ）。

これに対し、図１４Ａに示すように、Ｇ３ＶＬＸ‐４０粒子製剤（３）の水相は、抗癌細胞活性が高かった。

沈降した非水溶性部分もまた、癌細胞の殺傷効果についてインビトロで試験した。高い癌細胞殺傷効果が、水不溶性の沈殿物におけるＶＬＸ４０／ＤＭＳＯ（２）で記録され、Ｇ３‐ＶＬＸ４０製剤の水不溶性がわずかである沈殿物は、癌細胞殺傷効果が低かった（図１４Ｂ）。
これらの実験を３回繰り返した。
結論と考察

約５０〜１００μｇのＶＬＸ４０を、２ｍｇのＧ３が１ｍｌの容量の水においてキラヤ成分として測定されるように溶解した。Ｇ３粒子の濃度は、Ｇ３粒子の濃度を増加させることによって増加させることができ、例えば１０ｍｇ／ｍｌのＧ３製剤が透明な溶液内に存在し得ることに留意されたい。また、Ｇ３粒子の組成を変更することにより、より多くのＶＬＸ４０の組み込みを容易にすることができる。本実施例では、Ｇ３技術なしでは患者に達することができなかった臨床使用のための薬剤の製剤化を容易にする未解決の要求をＧ３粒子が満足させていることを明らかに示している。なぜなら、薬は、既存の技術では水溶性にすることができなかったからである。
実施例１５

本実施例は、薬物送達システムとしてＧ３粒子は、別の２つの非水溶性抗癌剤ブスルファンおよびロスコビチンを容易に組み込むことができ、それらを水溶性にすることを示している。
実験の設定

２μｌのブスルファン（ＤＭＳＯ中に５０ｍｇ／ｍｌ）または１μlのロスコビチン（クロロホルム中に１００ｍｇ／ｍｌ）を２μlのコレステロール（クロロホルム中に１００ｍｇ／ｍｌ）とともに、実施例１の工程１に記載される方法を用いて、それぞれブスルファンまたはロスコビチンを有する脂質膜を形成するように使用した。その後、ＱＨＣ：コレステロール：ブスルファン／ロスコビチン＝１：１：０．５のモル比を与えるように、１０μのＬＱＨＣ（水中に１００ｍｇ／ｍｌ）を実施例１における工程２に添加した。
結果

化合物、すなわちブスルファンおよびロスコビチンの両方に対して、透明な溶液を可視化した、つまり不溶性の薬物によって引き起こされる水相における堆積物や濁りは、これらを水溶性のＧ３粒子に組み込むことによって排除された。
考察

本実施例は、実施例１３と同様に、非水溶性の親油性薬／分子を、Ｇ３粒子に組み込むことによって水溶性にする一般的なプラットフォームとしてのＧ３の能力を重ねて示す。抗癌薬物候補の約４０％が水溶性ではなく、それ故にさらに市販の製品に展開することができないことを考慮すると、我々の発明は大幅にこの状況を改善することができる。
実施例１６

本実施例では、親油性ビタミンつまりビタミンＤ３を水溶性にするためにＧ３ナノ粒子に組み込むことができるかどうかを研究した。親油性ビタミンをクロロホルムに溶解し、実施例１に記載したようにＧ３粒子に組み込んだ。詳細については「材料と方法」を参照のこと。
実験の設定

Ｇ３粒子を、脂質膜を形成するように５０％コレステロールと５０％のビタミンＤ３を用いて形成した。Ｑｕｉｌ Ａを水相に添加して、Ｇ３粒子を生成した（詳細については、実施例１を参照）。水中の１００％のコレステロールおよび１００％のビタミンＤ３を、対照群として用いた。ビタミンＤ３がＧ３粒子に組み込まれたサンプルを、Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｉａＳｏｒｉｎ リエゾン自動機器（Ｌｉａｉｓｏｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）にて分析した。
結果

工程２で回収された水相は、透明な溶液で、沈殿物は検出されなかった。キラヤＱＨＣ画分製剤よりも非画分キラヤ（９５０ｎｍｏｌ／Ｌ）に基づくＧ３‐ビタミンＤ３製剤において、より多くのビタミンＤ３、つまり５５ｎｍｏｌ／Ｌが検出された。希釈実験では、ビタミンＤ３の濃度は読み出しにおいては線形的であり、均一な粒子の懸濁である、つまり、図１に示されるように凝集が他のＧ３粒子と一致しない。比較すると、わずか微量のビタミンＤ３が、ビタミンＤ３対照群において検出され、ビタミンＤ３は、コレステロール対照群において存在しなかった。
結論と考察

ビタミンＤ３は、経口または非経口経路によって脂質の形態で体内に取り込まれにくい必須のビタミンである。したがって、水溶性形態は、これらの経路による取り込みを容易にする。本実験において、ビタミンＤ３は、非画分キラヤサポニンおよびキラヤサポニンのＱＨＣ画分を有するＧ３ナノ粒子に組み込まれていることを示す。重要なのは、希釈実験の線形読み出しは、一般的にＧ３粒子について電子顕微鏡によって明らかにされた粒子の均一な分散を示す。食品について、例えばビールおよび他の種類の食品もふくむ飲料において非画分キラヤサポニンは十分に受容され、使用されている（図１参照）。したがって、このビタミンを送達するために、Ｇ３の製剤化のより経済的な代替手段は、Ｇ３の製剤化のための基盤としての非画分キラヤである。この実験では、より多くのりＤ３が、ＱＨＣサポニン画分を有するＧ３粒子よりも、非画分キラヤサポニンを有するＧ３に組み込まれた。
参照
^１ Ｋｅｆｅｉ Ｈｕ， Ｓａｉｄｅｈ Ｂｅｒｅｎｊｉａｎ， Ｒｏｌｆ Ｌａｒｓｓｏｎ， Ｊｏａｃｈｉｍ Ｇｕｌｌｂｏ， Ｐｅｔｅｒ Ｎｙｇｒｅｎ， Ｔａｎｊａ Ｌｏｅｖｇｒｅｎ， Ｂｒｏｒ Ｍｏｒｅｉｎ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｊａｎｕａｒｙ ２０１０ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１０：５ Ｐａｇｅｓ ５１‐６２
^２ Ｌｏｅｖｇｒｅｎ ＆ Ｍｏｒｅｉｎ （２０００） ＩＳＣＯＭ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌ ４２： ２３９‐２５８， Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｔ．Ｏ Ｏ’Ｈａｇｅｎ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Iｎｃ．， Ｔｉｔａｗａ， Ｎ．Ｊ．
^３ Ｍｏｒｅｉｎ Ｂ， Ｈｕ Ｋ， Ｌｏｖｇｒｅｎ Ｋ ａｎｄ Ｄ’Ｈｏｎｄｔ Ｅ． Ｎｅｗ ＩＳＣＯＭｓ ｍｅｅｔ ｕｎｓｅｔｔｌｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｍａｎｄｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｅｄ． ｂｙ Ｓｉｎｇｈ Ｍ． Ａ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｈｏｂｏｋｅｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ． ２００７， ｐ １９１‐２２２．
^４ Ｌｙｃｋｅ， Ｎ． Ｆｒｏｍ ｔｏｘｉｎ ｔｏ ａｄｊｕｖａｎｔ： Ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ， ＣＴＡ１‐ＤＤ／ＩＳＣＯＭ． Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００４， ６（１）， ２３‐３２， ａｎｄ ｂｙ Ｍｏｗａｔ ｅｔ ａｌ． （２００１）
^５ Ｍｏｗａｔ， Ａ．Ｍ．， Ｄｏｎａｃｈｉｅ， Ａ．Ｍ．， Ｊａｇｅｗａｌｌｌ， Ｓ．， Ｓｃｈｏｎ， Ｋ．， Ｌｏｗｅｎａｄｌｅｒ， Ｂ．， Ｄａｌｓｇａａｒｄ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． ＣＴＡ１‐ＤＤ‐ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ： ａ ｎｏｖｅｌ， ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｎａｎｏｇｒａｍ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１， １６７（６）， ３３９８‐３４０５
^６ Ｂｌａｉｒ ＡＨ， Ｇｈｏｓｅ ＴＩ． Ｌｉｎｋａｇｅ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８３ Ａｐｒ ２９；５９（２）： １２９‐４３．
^７ Ｇｈｏｓｅ ＴＩ， Ｂｌａｉｒ ＡＨ， Ｋｕｌｋａｒｎｉ ＰＮ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｌｉｎｋｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８３；９３：２８０‐３３３．
^８ Ｄａｖｉｓ ＭＴ， Ｐｒｅｓｔｏｎ ＪＦ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ‐ｍｏｌｅｃｕｌａｒ‐ｗｅｉｇｈｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｗｉｔｈ ｍｉｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ． Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８１ Ｓｅｐ １５；１１６（２）：４０２‐７．
^９ Ｅｌｉａｓｓｏｎ ＤＧ， Ｅｌ Ｂａｋｋｏｕｒｉ Ｋ， Ｓｃｈｏｎ Ｋ， Ｒａｍｎｅ Ａ， Ｆｅｓｔｊｅｎｓ Ｅ， Ｌｏｗｅｎａｄｌｅｒ Ｂ， Ｆｉｅｒｓ Ｗ． Ｓａｅｌｅｎｓ Ｘ， Ｌｙｃｋｅ Ｎ．ＣＴＡ１‐Ｍ２ｅ‐ＤＤ： ａ ｎｏｖｅｌ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｖａｃｃｉｎｅ． ２００８ Ｆｅｂ ２６；２６（９）： １２４３‐５２． Ｅｐｕｂ ２００８ Ｊａｎ １０．
^１０ Ａ． Ｅｓｍａｔ Ａｂｏｕ‐Ａｒａｂ， Ａｚｚａ Ａｂｏｕ‐Ａｒａｂ ａｎｄ Ｍ．Ｆｅｒｉａｌ Ａｂｕ−Ｓａｌｅｍ， Ｐｈｙｓｉｃｏ‐ｃｈｍｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｓｗｅｅｔｅｎｅｒｓ ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ｂｅｒｔｏｎｉ， Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ４ （５） ｐｐ ２６９‐２８１， Ｍａｙ ２０１０．
^１１Ｃｈａｉｗａｔ Ｂｏｏｎｋａｅｗｗａｎｔ， Ｃｈａｉｖａｔ Ｔｏｓｋｕｌｋａｏ， ａｎｄ Ｍｏｌｖｉｂｈａ Ｖｏｎｇｓａｋｕｌ． Ａｎｔｉ‐Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ Ｓｔｅｖｉｏｌ ｏｎ ＴＨＰ‐１ Ｃｅｌｌｓ， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２００６， ５４， ７８５７８９ ７）
^１３ Ｋｅｒｓｔｅｎ， Ｇ．Ｆ．Ａ．， Ｓｐｉｅｋｓｔｒａ， Ａ．， Ｂｅｕｖｅｒｙ， Ｅ．Ｃ． ａｎｄ Ｃｒｏｍｅｌｉｎ Ｄ．Ｊ．Ａ． （１９９１） Ｏｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｓａｐｏｎｉｎ ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ （ＩＳＣＯＭｓ）． ＢＢＡ １０６２， １６５‐１７１．

Claims (24)

1. ステロールと、キラヤ酸およびキラヤサポニンから選択されるキラヤサポナリアモリナからの成分とを含むナノ粒子であって、
   リン脂質を含有せず、
   １５〜２５ナノメートルの範囲の粒径を有することを特徴とする水溶性ナノ粒子。
2. ステロールはコレステロールである、請求項１に記載の水溶性ナノ粒子。
3. キラヤサポナリアモリナからの成分は、キラヤサポニンであり、好ましくはキラヤサポニン画分ＱＨＡ、ＱＨＢおよび／またはＱＨＣである、請求項１または２に記載の水溶性ナノ粒子。
4. コレステロールとキラヤサポニンとの比は、１：１０〜１０：１である、請求項１〜３のいずれかに記載の水溶性ナノ粒子。
5. コレステロールとキラヤサポニンとの比は、１:２〜２：１である、請求項１〜３のいずれかに記載の水溶性ナノ粒子。
6. 少なくとも１つの両親媒性または疎水性分子をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の水溶性ナノ粒子。
7. 前記両親媒性または疎水性分子は、抗原、アジュバント、標的分子、医薬化合物および食品関連化合物から選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項６に記載の水溶性ナノ粒子。
8. 前記両親媒性または疎水性分子はジテルペンである、請求項７に記載の水溶性ナノ粒子。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載の１つ以上の水溶性ナノ粒子を含む組成物。
10. 異なるキラヤサポニン画分はそれぞれ、異なるナノ粒子に組み込まれる、請求項９に記載の組成物。
11. 薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよび／または担体をさらに含む医薬組成物において任意に医薬として使用される、請求項１〜８のいずれか１つに記載の水溶性ナノ粒子または請求項９または１０に記載の組成物。
12. アジュバントとして使用される請求項１１に記載の組成物。
13. ワクチンと組み合わせて使用される、請求項１２に記載の医薬アジュバント製剤。
14. 癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜８のいずれかに記載の水溶性ナノ粒子、又は請求項９または１０に記載の組成物の使用。
15. リン脂質を含有しない水溶性ナノ粒子を製造するための方法であって、前記方法は、
    ａ）疎水性表面またはリポソームの懸濁液を提供する工程と、
    ｂ）前記疎水性表面または前記リポソームの懸濁液を、ステロールの溶液、好ましくはコレステロールが有機溶媒または界面活性剤中にモノマーとして溶解した溶液と接触させる工程と、
    ｃ）有機溶媒または界面活性剤を除去して前記表面にステロール膜を形成する工程と、
    ｄ）キラヤサポニンミセルの水溶液を提供する工程と、
    ｅ）サポニンミセルを含む水溶液を前記ステロール膜に添加する工程と
    を包含し、
    サポニンとステロールとの間には複合体が形成され、前記複合体は前記水溶液中に懸濁される、方法。
16. 両親媒性または疎水性分子が添加されることによってさらに特徴付けられる、請求項１５に記載の方法。
17. 前記両親媒性または疎水性分子はジテルペンである、請求項１６に記載の方法。
18. アジュバントとしての、ワクチンと組み合わせたアジュバントとしての、あるいは癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法によって製造される水溶性ナノ粒子の使用。
19. 個々の患者への請求項１４または１８に記載の使用の適用性を評価するための方法であって、
    ・前記患者からの癌細胞を、インビトロで請求項１〜８のいずれか１つに記載の水溶性ナノ粒子と接触させる工程と、
    ・前記癌細胞に対する前記水溶性ナノ粒子の治療効果を示す少なくとも１つの効果を測定する工程と
    を包含し、
    請求項１２に記載の組成物は、前記水溶性ナノ粒子が前記癌細胞に対する治療効果を示す有意な効果を示す場合には前記個々の患者に適用可能なものとして評価される、方法。
20. 個々の患者への請求項１４または１８に記載の使用の適用性を評価するための方法であって、
    ・前記患者からの癌細胞を、インビトロで請求項１〜８のいずれか１つに記載の水溶性ナノ粒子と接触させる工程と、
    ・前記癌細胞に対する前記水溶性ナノ粒子の治療効果を示す少なくとも１つの効果を測定する工程と
    を包含し、
    請求項１３に記載の医薬アジュバント製剤は、前記水溶性ナノ粒子が前記癌細胞に対する治療効果を示す有意な効果を示す場合には前記個々の患者に適用可能なものとして評価される、方法。
21. 個々の患者への請求項１４または１８に記載の使用の適用性を評価するための方法であって、
    ・前記患者からの癌細胞を、インビトロで請求項９または１０に記載の組成物と接触させる工程と、
    ・前記癌細胞に対する前記組成物の治療効果を示す少なくとも１つの効果を測定する工程と
    を包含し、
    請求項１２に記載の組成物は、前記組成物が前記癌細胞に対する治療効果を示す有意な効果を示す場合には前記個々の患者に適用可能なものとして評価される、方法。
22. 個々の患者への請求項１４または１８に記載の使用の適用性を評価するための方法であって、
    ・前記患者からの癌細胞を、インビトロで請求項９または１０に記載の組成物と接触させる工程と、
    ・前記癌細胞に対する前記組成物の治療効果を示す少なくとも１つの効果を測定する工程と
    を包含し、
    請求項１３に記載の医薬アジュバント製剤は、前記組成物が前記癌細胞に対する治療効果を示す有意な効果を示す場合には前記個々の患者に適用可能なものとして評価される、方法。
23. 請求項１〜８のいずれかに記載の水溶性ナノ粒子を含むワクチン。
24. 請求項１〜８のいずれかに記載の水溶性ナノ粒子を含む抗癌剤。