KR20140084113A - 암 치료 및 식품 관련 화합물을 포함하는 의학 분야에서 양친매성 또는 소수성 분자를 위한 나노입자, 제조 방법 및 담체로의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스테롤 및 퀼라자 산과 퀼라자 사포닌으로부터 선택된 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)로부터 유래된 성분을 포함하는, 나노입자에 관한 것이며, 상기 나노입자는 인지질을 포함하지 않는다. 또한, 상기 나노입자를 포함하는 조성물 및 특히 백신에서 보조제(adjuvant)로서, 양친매성 또는 소수성 분자용 담체로서 그리고 암 치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
또한, 상기 인지질이 없는(phospholipid-free) 나노입자의 제조 방법, 암 치료 방법 및 상기 암 치료 방법의 적용성을 평가하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

암 치료 및 식품 관련 화합물을 포함하는 의학 분야에서 양친매성 또는 소수성 분자를 위한 나노입자, 제조 방법 및 담체로의 용도{NANOPARTICLES, PROCESS FOR PREPARATION AND USE THEREOF AS CARRIER FOR AMPHIPATIC OF HYDRPHOBIC MOLECULES IN FIELDS OF MEDICINE INCLUDING CANCER TREATMENT AND FOOD RELATED COMPOUNDS}
본 발명은 스테롤 및 퀼라자 산과 퀼라자 사포닌으로부터 선택된 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)로부터 유래된 성분을 포함하는 나노입자에 관한 것이며, 이 나노입자는 필수 성분으로서 인지질을 포함하지 않는다. 또한, 상기 나노입자를 포함하는 조성물 및 특히 백신에서 보조제로서, 그리고 암 치료제로서, 특히 암 치료 및 식품 관련 화합물에 대한 의학 분야에서 양친매성 또는 소수성 분자용 담체로서 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 인지질이 없는(phospholipid-free) 나노입자의 제조 방법, 암 치료 방법 및 상기 암 치료 방법의 적용성을 평가하기 위한 방법 및 몸에 이들의 흡수를 촉진시키기 위해 물에 용해되는 식품 관련 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
선행기술(PRIOR ART)
면역 자극 복합체(Immune Stimulating Complex : ISCOM)는 6 nm 직경을 갖는 육각형 고리(hexagonal rings)를 형성하기 위해 콜레스테롤과 견고히 연결된 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina) 나무로부터 유래된 사포닌에 의해 구성된 40 nm 입자이다. 제 3 성분은 지질, 예를 들어, 40 nm 구(spheres)를 형성하기 위해 상기 고리를 붙이는(glue) 포스파티딜 콜린(phosphatidyle choline)이다. 이러한 입자는 특이적인 백신 항원과 함께 혼합되어 사용되거나, 백신 항원과 분리되어 동시 투여되는 보조입자로서 사용된다. 상기 이스콤(ISCOM) 입자는 Lovgren & Morein에 의해 기재된 방법과 EP 0 436 620뿐만 아니라 WO2004/004762의 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 이스콤(ISCOM)과 이스콤(ISCOM) 매트릭스가 갖는 한 가지 문제점은 이들의 복잡한 제조 기술이다. 또한, 예를 들어, 패신저(passenger)인 분자/화합물을 삽입하거나 약물 및 백신 효과를 얻기 위한 담체/전달 시스템으로서, 또는 표적화 장치(targeting device)로서 이것을 사용할 때 문제가 발생될 수 있다.
백신은 표면 구조(surface structures)에 대한 항체 및 T 세포 반응 양쪽 모두를 포함하는 면역반응을 촉진시키는 미생물 전체 또는 서브유니트(subunits)를 대개 기반으로 한다. 그렇지 않으면, 상기 백신 항원은 서브유니트, 즉, 대부분 표면 단백질이나, 또한 내부/세포내 단백질 또는 심지어 세포 벡터에서 발현되는 비-구조적 단백질이다. 표면 단백질 및 탄수화물 항원은 대개 항체 반응을 불러 일으킬 수 있는 이들의 능력에 대해 평가되며, 또한 세포독성 T-세포 반응을 제외한 T-세포 반응에 대해 매개된 세포들을 유도하기도 한다. 항체는 감염성 물질(infecting agents)의 내부 단백질과 상호작용하지 않으므로 감염시에 면역 보호를 조절하지 않을 수 있기 때문에, 내부 및 비-구조적 단백질은 세포독성 T-세포를 포함하는 T 세포 반응을 일으키는 백신 항원으로서 사용된다. 대조적으로, 보조 T(T-helper) 세포 및 세포독성 T-세포를 포함하는 세포 매개성 면역은 감염된 세포, 즉, 감염 시점 후의 세포를 사멸시킬 수 있다. 상기 이스콤(ISCOM) 기술의 제형 및 제품은 근접할 수 있는 항원(accessible antigens), 즉, 표면 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시키는 데 사용될 수 있으며, 상기 항원은 Morein et al 2007 3 및 WO2011/005183에서 준비된 백신에 대항하거나 유래된 항원의 붕괴, 즉 내부 항원에 의해 나타난다.. 또한 어떤 백신 항원은 rDNA 기술에 의해 제조될 수 있고 많은 경우에 Lovgren & Morein 2 에 의해 기술된 바와 같이 또한 합성적으로 제조될 수 있다. 상기 이스콤(ISCOM) 기술은 US 2006/0121065, EP1539231A1, WO2004/004762 및 WO2005/002620를 포함하는 다수의 특허 출원에 기재되어 있다.
일반적으로 보조제(adjuvants)는 상기 백신 제형에 포함된 상기 항원들의 면역 반응의 수준(level) 및 질을 증진시키는 데 사용된다. 그러나, 미충족 욕구가 보호(protective) 백신에 대하여 우세하고 면역 보호가 하기에 의해 벗어나게 되는 다수의 감염 물질들이 있다;
Figure pct00001
회피 돌연변이체(escape mutants) (인간 인플루엔자 바이러스, 닭의 코로나 바이러스[전염성 기관지염 바이러스(infectious bronchitis virus : IBR)], C형 간염 바이러스(hepatitis C virus : HCV)
Figure pct00002
시현 항원결정부위(revealing antigenic determinants) 아님
Figure pct00003
접근할 수 없는-숨겨진(Inaccessible-hidden) [황색포도상구균 (staphylococcus aureus : SA), 말연쇄상 구균(streptococcus equi)
Figure pct00004
사람의 인플루엔자 바이러스, 밍크(mink) 내 알루샨 병(alution disease)을 일으키는 파보바이러스, 사람의 C형 간염 바이러스에 따른 예시화된 미생물의 다른 항원결정부위(antigenic determinant)에 의한 면역성 우성(dominance).
Figure pct00005
병을 악화시키는 유도 면역 반응 (파보 바이러스[알루샨 병] 밍크)
Figure pct00006
거의 무수한 변종을 많이 갖는 병원균의 종을 위해 의도된 백신은 어려운/너무 비용이 많이 드는 것을 대안으로 더 경제적이게 만들어, 예를 들어, 사람의 HIV와 C형 간염을 충분하게 커버하는(covering) 백신을 생산하는 것이다. 또한, 계통 변종(strain variants), 예를 들어, 다양한 캡슐 항원을 가지는 탄수화물 변종[결합(conjugate) 백신, 예를 들어, 헤모필루스(Haemophilus) 인플루엔자, 수막구균성수막염(Meningococus meningitides), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumonia), 스트렙토코커스 피오게네스(Streeptococcus pyogenes), 뉴모코쿠스 폐렴(Pneumococcus pneumonie) 및 또한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)]의 동일한 수로부터 23 개 백신 성분까지 많은 여러 가지가 필요한 다수의 백신이 있다는 것은 잘 알려져 있다.
Figure pct00007
다른 미충족 욕구(Other unmet needs)는 다양한 그램 양성구균(Gramm+ cocci), 예를 들어, 동물의 황색 포도상 구균 종에 대해 우세하며, 바람직하게는 필요성은 말에서(Str. Equi, Str. Zooepidemicus), 소에서(Str. agalacti, Str. dysgalacti 및 Str. Uberis) 황색 포도상 구균(S aureus), 연쇄상 구균 종(Streptococcus spp)에 대항해서 발생하는 반추 동물의 유방염에 대한 보호 백신에 대해 요구된다.
Figure pct00008
안티제닉신(antigenic sin) (FLU) 또는 담체 유도 에피토프 억제 항원(carrier induced epitope suppression antigen : CIES)
Figure pct00009
빠른 복제 에이젠트(replicating agents), 예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)는 백신에 의해 유도되는 것들을 포함하여 새로 다가올 변종들에 의한 상기 호스트(host)의 회피 면역 보호 메커니즘을 복잡하게 한다.
Figure pct00010
DNA 및 RNA 백신은 많은 경우에 보조제(adjuvants)가 부족하다.
따라서, 예를 들어, 유행성(epidemics) 및 심지어 범유행성(pandermics)까지 초래하는 다가오는 상황을 충족시키기 위하여 또는 회피 돌연변이(escape mutation)의 부정적 효과를 피함으로써 백신의 보호 가치(value)를 유지할 가능성을 향상시키기 위해 또는 돌연변이에 의해 이탈함에 따른 면역성 상실을 보상하기 위해, 또는 상기 감염 중에 돌연변이 때문에 다가오는(upcoming) 변종 면역 보호를 향상시키기 위해 백신의 능력(capacity)을 증가시킬 미충족 욕구가 있다. 그래서, 또한 신규 미립자(particulate) 백신 보조제(adjuvants)는 특정 병원체에 대한 보호에 필요한 면역학적 프로파일(immunological profile)에 대응하여 면역 반응의 조정(steering)에 맞추기 위해 유연성(flexibility)이 요구될 수 있다.
암은 수술, 방사선 조사를 포함하는 다양한 방법 및 약품, 즉, 세포 증식 억제 약물(cytostatic drugs)에 의해 치료된다. 일반적으로 상기 세포 증식 억제 약물에 의한 의학적 치료는 종종 심각한 부작용을 일으키는 방사선 조사 요법과 같은 심각한 부작용을 일으킨다. 따라서, 환자에 의해 잘 견딜 수 있는 의학적 치료를 하기 위한 미충족 욕구가 있다. 국제 특허 공개 WO2008/063129 및 Hu et al. 1 은 콜레스테롤, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 퀼라자 사포닌 분획 ASAP[아실-사포닌(acyl-saponin), QS 21 또는 QHC에 해당] 또는 DSAP[데실-사포닌(desacyl-saponin), QS 7 또는 QHA에 해당]를 포함하는 나노입자를 기재한다. KGI 및 BBE 라는 이름의 이러한 입자들은 특허 출원 PCT/SE 2007/050878 및 WO2008/063129 및 Hu et al. 1 에서 발명 "Killcan, New Use"에서 기재된 바와 같이, 이들이 유사한 기원의 정상 세포를 사멸시키는 것보다 30 ~ 40 배 낮은 농도에서 암 세포를 사멸시키는 것이 기재되어 있다. 이러한 입자들은 이스콤(ISCOM) 및 이스콤(ISCOM) 매트릭스에 대해 기재된 것과 유사한 제조 복잡성(complexity)을 가진다.
백신/보조제(adjuvant) 및 항암제를 포함하는 약물 전달의 분야에서의 이들의 사용을 포함하여 물에서의 용해성이 성취될 수 없기 때문에 많은 잠재적 약품이 개발될 수 없다. 이러한 잠재적 의약품이 선반(shelf)으로부터 꺼내져 물 중 용해될 수 있게 한다면, 이들의 일부가 의료 시장을 향상시킬 것이다.
본 발명은 항암성 약품(anticancer pharmaceuticals), 약품을 위한 담체/전달 입자로서 및 상업적으로 이용할 수 있는 보조제(adjuvant)-백신 제형의 결점에 대해 보상할 수 있는 보조제(adjuvant)로서 사용되는 나노입자의 신규 형태에 대한 필요성을 확인하였다.
상기 이스콤(ISCOM) 기술이 가지는 문제점은 상기 퀼라자 성분, 콜레스테롤 및 제 3 성분, 예를 들어, 포스파티딜 콜린의 세제 가용화(solubilisation)를 기반으로 하는 입자를 제형화하기 위해 복잡한 절차, 예를 들어, 한외여과(ultra filtration), 접선유동(tangential flew), 투석, 원심분리법 기술 등을 이용하는 것이다. Lovgren & Morein 2 에 기재되는 모든 이러한 기술들은 상기 제조 공정 중에 물질(material)의 손실을 일으킨다.
또한, 지금까지 개발된 방법이 이러한 화합물의 강한 경향이 물에서 안정한 착물(자기조립)을 자발적으로 형성할 수 있게, 예를 들어, 미셀은 상기 이스콤(ISCOM) 제형에, 예를 들어, 소수성 상호 작용에 의해 통합되지 않게 하기 때문에 상기 이스콤(ISCOM) 기술은 다른 소수성 또는 양친매성 분자의 통합을 용이하게 하는 데 적합하지 않다.
본 발명은 스테롤 및 적어도 하나의 사포닌을 포함하는 인지질 없는 나노입자에 관한 것이다.
본 발명과 대조적으로, 리포좀과 같은 입자를 함유한 지질, 이스콤(ISCOM), 이스콤 매트릭스(ISCOM MATRIX), 포스인트로스(posintros) 및 제조 및 백신의 효능을 향상시키기 위해 보조제(adjuvant) 제형을 포함하는 약품 및 백신 제형 및 암치료를 위한 제형의 용도를 위한 다양한 종의 리포좀은 인지질(phospholipids), 예를 들어, 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 스테아릴아민(stearylamin) 등과 같은 지질을 함유한다.
또한 본 발명에 따른 상기 나노입자는 하나 또는 여러 개의 화합물, 예를 들어, 암치료용으로 사용되는 화합물 및 추가 물질은 추가 기능 및 동작(action)의 보완 모드(complementary modes)를 제공하는 영양 관련 화합물을 포함하는 약품을 위한 전달 시스템으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자의 장점은 이들이 신규 병원균의 변종, 예를 들어, 상술된 다가오는 유행병(pandemics)을 커버하기(cover) 위해 보조제(adjuvants)로서 폭넓은 응용을 포함하는 선행 기술 제형에 대한 대체(replacements)로서 가치가 있다.
본 발명은 증발(evaporation) 기술 때문에 거의 손실없이 용이한 제조 공정을 제공한다. 이것은 이스콤(ISCOMs) 또는 이스콤 매트릭스의 제조에 대해 기재한 바와 같은 기술(상기 참조)의 사용을 배제하지 않는다.
본 발명의 측면(aspect)은 독립항에 기재되어 있다. 바람직한 구현예는 종속항에 기재되어 있다.
본 발명은 스테롤 및 퀼라자 산과 퀼라자 사포닌으로부터 선택된 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)로부터 유래된 성분을 포함하는 나노입자에 관한 것이며, 이 나노입자는 필수 성분으로서 인지질을 포함하지 않는다. 또한, 상기 나노입자를 포함하는 조성물 및 특히 백신에서 보조제로서, 그리고 암 치료제로서, 특히 암 치료 및 식품 관련 화합물에 대한 의학 분야에서 양친매성 또는 소수성 분자용 담체로서 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 인지질이 없는(phospholipid-free) 나노입자의 제조 방법, 암 치료 방법 및 상기 암 치료 방법의 적용성을 평가하기 위한 방법 및 몸에 이들의 흡수를 촉진시키기 위해 물에 용해되는 식품 관련 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1a. 전자 현미경(EM)은 몰비율 1:1:0.5의 콜레스테롤, QHC, 및 디테르페노이드(diterpenoid)를 포함하는 나노입자를 보여준다. 상기 입자들은 본 발명에 따른 약 17-20 nm의 평균 직경을 가진다. 도 1b에 도시된 바와 같이 약 40 nm의 이스콤(ISCOM) 입자와 명백하게 상이하다.
도 1b. 전자 현미경(EM)은 몰비율 1:1:0.5의 콜레스테롤, QHC, 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcholin)을 포함하는 입자와 같은 이스콤(ISCOM)을 보여준다. 상기 입자들은 약 40 nm의 직경을 가지는 실시예 1의 디자인 C에 따른 실시예 1에서 기재된 것과 유사한 기술을 이용하여 기재된 바와 같이 제조되었다. 형태(morphology)와 크기는 도 1a에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 나노입자의 형태와 크기들과 명백하게 상이하다.
도 2. U937세포에 대해 시험된 QHC를 함유하는 모든 G3 및 KGI 나노입자 사이에 암 세포 사멸 능력(killing capacity)의 비교. G3 및 KGI는 모델 종양 세포에 대한 동일한 항암 세포(anti-cancer cell) 사멸 효과를 거의 가진다 (P=0.8422).
도 3. IL-8을 생산하기 위해 U937 종양 세포를 유도하는 KGI와 G3의 비교로서, 두 입자가 암 세포 분화(P> 0.05)를 나타내는 사이토카인(cytokine)을 생산하기 위해 암 세포를 유도하는 유사한 능력을 가지고 있음을 보여준다.
도 4a. 스테비아(Stevia)는 BBE 또는 KGI에 비해 IL-12B, IL-6, 및 IL-1α의 가장 강력한 유도 물질(inducer)이다.
도 4b. G3에 혼입(incorporated)될 때 DT는, 정상 인간 DCs의 사이토카인(cytokine) IL-12 유전자 발현을 상향 조절한다(up-regulates).
도 5. G3 입자는 KGI 입자와 유사한 크기에서 U937 세포의 세포 내 TK 생산에 영향을 준다(각각의 제형-농축 조합 바가 좌측에서 우측으로 24, 48, 72, 96 그리고 120 시간 동안의 시점을 나타냄).
도 6. G3, DT 혼입된 G3(G3-DT) 및 비-입상(non-particulate) QHC의 적정 곡선은 HL-60 AML 세포에서 나타난다. 상기 G3 및 G3-DT 제형은 프리(free) 비-입상 QHC 보다 더 효율적으로 AML 세포를 사멸시킨다.
도 7. HL-60 AML 세포에 대한 G3 및 시타라빈(cytarabine)의 독립형(stand alone) 및 조합 효과. G3는 상기 시타라빈을 현저하게 향상시킨다.
도 8. G3는 HL-60 AML 암 세포에 대한 다우노루비신(daunorubicin)의 사멸 능력을 향상시킨다.
도 9. G3, DT 혼입된 G3(G3-DT) 및 PC-3 전립선 암 세포에 대한 QHC의 적정 곡선.
도 10. G3 및 PC-3 전립선 암 세포에 대한 도세탁셀(docetaxel)의 독립형(stand alone) 및 조합 효과. 상기 G3는 도세탁셀의 암 세포 사멸 효과를 현저하게 향상시킨다.

도 11. G3는 PC-3 전립선 암 세포에 대한 카바지탁셀(cabazitaxel)의 사멸 효과를 크게 향상시킨다.
도 12. ACHN 신장 암 세포에 대한 적정 곡선은 QHA를 이용하여 제형화된 G3가 고형 암 세포를 사멸시키는데 QHA를 이용하여 제형화된 G3보다 더 강함(P<0.01)을 보여준다.
도 13a. 접종 스케쥴(Immunization schedule)
실험 설계(Experimental design)[C56Bl6 마우스，6 마우스/군, 200 ㎕/용량, s.c. 2차 접종(two immunizations), 4 주 간격(weeks apart)]
1군 (아비스코 대조군: Abisco Control): 인플루엔자 1 ㎍ + 이스콤(ISCOM) -5 ㎍
2군 (G3-고용량): 인플루엔자 1 ㎍ + G3 - 5 ㎍
3군 (G3-중용량): 인플루엔자 1 ㎍ + G3 - 2.5 ㎍
4군 (G3-저용량): 인플루엔자 1 ㎍ + G3 - 1 ㎍
5군 (DT를 포함하는 G3): 인플루엔자 1 ㎍ + G3 - 2.5 ㎍
6군 (비-보조제: Non-adjuvanted, 항원 대조군): 인플루엔자 1 ㎍
7군 (비면역성 대조군 : Non-immunized Control)
평가(Evaluation)
항체 반응에 대한 혈액. 증식 시험, IL-4, IFN-γ 을 포함하는 세포 매개 면역에 대한 부검에서 비장(Spleen) 세포.
도 13b. 마우스 혈청의 HI 항체 반응은 1차 예방 접종 3 주 후에 측정되었다.
도 13c. 마우스 혈청의 HI 항체 반응은 2차 예방 접종 4 주 후에 측정되었다.
도 13d. 마우스 비장세포의 사이토카인 반응은 2차 예방 접종 4 주 후에 측정되었다.
도 14a. 상기 G3/VLX40 제형(오른쪽 컬럼)은 높은 암 세포 (U937) 사멸 효과를 가진다. VLX40 단독(왼쪽 컬럼)과 대조하여, G3/VLX40 제형의 높은 용해도(solubility)를 나타내는 낮은 암 세포 사멸 효과 및 VLX40-DMSO 제형의 낮은 암세포 사멸 효과를 가졌다.
도 14b. VLX40 DMSO 제형(왼쪽 컬럼)은 침전물에서 높은 항암 활성을 가지고 있다. G3-VLX40(오른쪽 컬럼) 제형의 불충분한 침전물(scanty precipitate)과 대조하여, 상기 항암 세포 활성은 본질적으로 수상(water phase)에 배치되었음을 나타내는 낮은 항암 세포 활성을 가졌다.
정의( Definitions )
본 명세서의 모든 용어 및 단어는 특별히 달리 언급하지 않는 한 일반적으로 관련 분야에서 이들에게 주어진 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 명확성을 위해, 몇 가지 용어는 하기에 정의된다.
백신 제형은 예방학적으로 사용되고 하나 이상의 특정 질환에 대한 보호 면역성을 향상/개선하는 약제학적 제형이다. 질환과 관련된 성분에 대해 항원 특이성이 본 발명에 따른 제형에 포함될 때 또는 암 치료에 대해 특정함으로써 상기 항원이 암/종양에 존재할 때, 본 발명에 따른 치료 백신은 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 백신은 치료된 피험자(subject)의 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 "항원"을 포함하고, 임의로, 면역 반응을 향상시키기 위해 백신에 첨가된 물질을 "보조제 (adjuvant)"라고 부른다.
따라서,"항원"은 백신에서 활성적이고 특이적인 부분이고, 상기 백신이 면역성을 증가시키는 것을 목표로 한 질환을 발생시키는 바이러스 또는 박테리아와 같은 전체 미생물일 수 있다. 또한, 단백질의 단백질 일부(서브-유니트), 병원성 미생물로부터 분리되거나 재조합 DNA 기법에 의해 생성된 또는 합성적으로 생성된 이후 흔히 펩타이드라고 불리는 단백질과 같은 상기 미생물 서브유니트(subunit)의 일부일 수 있다. 펩타이드는 단백질보다 더 적은 아미노산을 갖는다.
"보조제(adjuvant)"는 예방 또는 치료용 백신의 항원 일부에 대한 면역 반응의 수준 및/또는 품질을 향상시키는 백신 성분(constituent)이다.
영양 관련 화합물은 건강 활성 물질의 맛을 개선시키는 화합물인 비타민류를 포함하는 임의의 영양 관련된 화합물이다.
발명의 상세한 설명( DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION )
본 발명은 스테롤 및 퀼라자 산과 퀼라자 사포닌으로부터 선택된 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)로부터 유래된 성분을 포함하는, 나노입자에 관한 것이며, 상기 나노입자는 인지질을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
상기 혁신(innovation)에 의한 결과로 수득된 입자는 크기에 관해서 이스콤(ISCOM)과 상이하며, 본 발명에 따른 입자는 40 nm 미만, 약 ~20 nm이며, 반면 이스콤(ISCOM)은 ~40 nm이다. 따라서, 본 발명의 나노입자는 10-40 나노미터, 바람직하게 12-35 나노미터 또는 15-25 나노미터를 범위로 하는 직경을 갖는다. 상기 크기는 콜레스테롤 및 상기 퀼라자 분자보다 통합된 다른 분자의 하중(load)에 크기 의존적일 것이다.
상기 스테롤은 콜레스테롤, 콜레스타놀(cholestanol), 코프로스타놀(coprostanol), 파이토스테롤(phytosterols), 예를 들어, 스티그마스테롤 시토스테롤(stigmasteroll sitosterol), 마이코스테롤(mycosterols), 예를 들어, 에르고스테롤(ergosterol), 바람직하게 콜레스테롤 및 비타민 D3 또는 미셀의 물 중 현탁액을 포함하는 수용성의 반응성 군과 공유적으로 반응하기 위하여 물 중 노출되는 것인 임의의 소수성 화합물로부터 선택될 수 있다.
퀼라자 사포닌 또는 퀼라자 산이라 불리우는 보통 트리테르페노이드(triterpenoid)
의 뼈대(skeleton)를 포함하는 퀼라자 산의 임의의 분획(fractions)이 또한 사용될 수 있다. 지금까지 기재된 퀼라자 산의 4가지 형태가 있다. 퀼라자 사포닌은, 예를 들어, Hu et al. 1 에서 기재된 바와 같이 아실기, 즉, 아실-사포닌(ASAP)과 함께 또는 아실 사슬(chain)기를 포함하지 않는, 즉, 디아실-사포닌(DSAP)과 함께 다수의 당을 가진 사슬을 형성한다.
상기 사포닌은 친수성일 수 있고, Quil A의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15 분획, 특히, EP 0 3632 279 B2에 기재된 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 14 분획, Quil A 의 분획 A 또는 미정제(crude) Quil A로부터 선택될 수 있다.
상기 사포닌은 사포닌의 혼합물 또는 퀼라자 분말 추출물(Berghausen, USA), 퀼라자 울트라 분말(Quillaja Ultra Powder) QP UF 300, 퀼라자 울트라 분말(Quillaja Ultra Powder) QP UF 1000 또는 Vax-Sap (자연 반응으로부터 3 개 모두, 칠레 또는 칠레 산티아고 Prodalysa 유래)와 같은 이들의 반 정제된(semi purified) 형태를 포함하는 미정제 또는 미가공(raw), 또는 Quil A의 미분획 추출물(non-fractionated extract)일 수 있다. 상기 정제된 사포닌 분획 C 및 B는 단독 또는 조합해서 사용될 수 있다. 상기 B 및 C 분획은 WO 96/11711에 기재되고, 상기 B3, B4 및 B4b 분획은 EP 0 436 620에 기재되었다. 상기 분획 QA1-22는 EP 0 3632 279 B2, Q-VAC (Nor-Feed, AS Denmark), Quillaja Saponaria Molina Spikoside (Isconova AB, Uppsala Science Park, 751 83, Uppsala, Sweden)에 기재되었다.
상기 사포닌은 소수성 사포닌일 수 있고, 지방산, 예를 들어, Quil A의 분획 C 및 B 또는 분획 A 및 B 사이의 영역으로부터 분획과 같은 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)로부터 상기 사포닌의 트리테르노이드 아클리콘의 4-위치의 지방산을 함유하는 사포닌으로부터 선택될 수 있고, EP 0 3632 279 B2에서 기재된 분획 15, 16, 17, 18, 19, 10 및 21, 특히, 분획 17 및 18이 본원에서 적합하다. 바람직하게 퀼라자 사포닌 분획 QHA, QHB 및/또는 QHC가 사용될 수 있다.
콜레스테롤 및 퀼라자 사포닌 사이의 비율은 1:10 내지 10:1, 바람직하게 1:2 내지 2:1일 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자는 적어도 하나의 양친매성 또는 소수성 분자를 추가 포함할 수 있으며, 이것은 항원, 보조제(adjuvant), 표적화 분자(targeting molecule), 약제학적 화합물(pharmaceutical compound) 및 식품 관련 화합물로부터 선택될 수 있다.
상기 항원은 EPC-특허 출원 0 109　942에서 기재된 바와 같이, 양친매성 또는 소수성 기(groups)를 갖는, 또는 재조합 DNA 발현에 의해 소수성 영역(region)을 가지게 하거나 세포에 의해 생산되거나 화학적으로 합성된 임의의 항원일 수 있다. 상기 보조제(adjuvant)는 퀼라자 사포나리아 몰리나로부터 수득되는 이들과 같은 양친매성 또는 소수성 기를 갖는 임의의 보조제(adjuvant)일 수 있다.
하나 이상의 화합물 분자는 상보적 기능을 위해, 예를 들어, 표적 장치(targeting device)로서, 또는 EP 9600647-3(PCT/SE97/00289에서 기재된 면역 조절 기능(immune modulatory functions)에 대한 백신의 용도에 있어 항원 또는 상보적(complementary) 항원으로서, 또는 항암 또는 영양 효과(nutritional effects)를 포함하는 약제로서 G3로 혼입(incorporated)될 수 있다. G3 입자에 혼입되기 위해서 상기 분자는 소수성 도메인(domains)을 필요로 하거나, 상기 G3 입자에 부착되는 정전기적 성질이어야 한다. 소수성 부분(portions)을 갖고 있지 않은 화합물은 EP 1800564에서 유사한 입자에 대해 기재된 바와 같이 상기 G3 입자에 혼입 전이나 후에 이러한 분자를 갖는 분자에 결합될 수 있다.
임의의 보조제(adjuvant)는 합성 또는 반-합성 퀼라자(quillaja) 사포닌 또는 사포닌 분획 또는 퀼라자 사포나리아 몰리나 유래의 이들의 유도체, 지질 또는 이들의 유도체 또는 합성 버전(versions), 세포벽 뼈대(skeleton)를 포함하는 천연 물 또는 합성물과 같이 혼입될 수 있으나, 언급된 보조제(adjuvant) 화합물에 제한되지 않는다. 칠레 산티아고 Prodalysa의 Javier Saints에 의해 제공된 디테르페노이드(Diterpenoid, DT)는, 보조제(adjuvant) 및 (스테비아 감미제로부터) 영양제로서 사용될 수 있다. 상기 디테르페노이드(DT)는 17 ㎚의 전형적인 작은 나노입자의 결과로 수득된 본 발명에 따른 나노입자에 통합되었다.
강글리오시드(ganglioside) GM1인 콜레라 독소(cholera toxin)의 수용체를 포함하여 세포-결합 성분(components)에 결합하는 지질-함유 수용체 및 푸코스된 혈액형(fucosed blood group) 항원이 사용될 수 있다. 또한, 상기 세포-결합 성분은 점액 표적화 분자(targeting molecule)로서 기능할 수 있다. 예를 들어, WO97/30728에 기재되고 착물을 포함하는 기술은 항암 치료와 백신 용도에 대해 모두 G3 입자에 적용될 수 있다. 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)의 임의의 서브프래그먼트(subfragment)은 단독으로 또는 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
원하는 상보적 특성, 예를 들어, 암세포 살상의 상이한 모드, 예를 들어, 둘 다 암세포를 표적화하고 또한 세포 사멸 효과를 가지는 단일 클론 항체를 제공하기 위해 발명된 입자에 분자를 캡처하려고(capturing) 의도된 소수성 꼬리(tail)/영역(region)을 공급한 수용체는 하나의 담체-전달 옵션(carrier-delivery option)이다.
따라서, 상기 나노입자에 통합될 수 있는 다른 성분은 Fc 수용체 또는 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A의 DD와 같은 항체 또는 단일 클론 항체에 대한 수용체를 포함하는 항암제를 포함하는 약제이다(WO2011/005183).
본 발명에 따라 개시된 나노입자의 제조 방법은 이스콤(ISCOM)의 경우보다 간단하며 소수성 및 양친매성 분자를 혼입(incorporate)하는데 적합하다. 따라서, 상기 독창적인 나노입자는 백신 항원의 전달, 어떤 종류의 약물에 대해서 뿐만 아니라 항암 치료를 위한 약물을 위해 적합한 나노입자이다. 또한 본원에서 기재된 바와 같이 제조된 입자는 공유 결합하는(covalently linking) 다른 분자, 예를 들어, 약물 또는 백신 항원 또는 정전기적 결합, Morein etc. 3 및 WO2004/004762에 기재된 바와 같은 렉틴 결합에 사용되기 위하여 통합된 양친매성 분자(스테아릴아민 등과 같은 지질)로 보충될 수 있다.
상기 입자는 암 세포, 바이러스 표면 항원 및 인플루엔자 항원으로부터 표면 항원과 같은 암 표적화 분자(targeting molecules)를 추가 포함할 수 있다.
미생물 막의 표면 분자는 Morein et al 3 및 EP 242380에서 원래 기재된 바와 같이 소수성 상호작용에 의해 혼입될 수 있다. 다른 분자, 예를 들어, 재조합 기술에 의해 제조된 또는 합성 제조된 다른 분자는 WO 2002/080981 및 WO 2004/030696에서 기재된 바와 같이 혼입될 수 있다.
이러한 표적화 분자(targeting molecules)는 인플루엔자 및 호흡기도(respiratory tract), 예를 들어, 폐암의 표적 유형(forms)에 친화성을 갖는 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial viruses)와 같은 바이러스로부터 유래된 엔벨롭 단백질(envelop proteins)을 포함하거나, 또는 Lycke et al 4 에 의해 기재된 바와 같이 CTA1DD가 KGI 또는 BBE 제형에 혼입된 콜레라 독소의 A 서브 유니트의 A1 부분이 된다. CTA1DD는 합리적으로 각각 상보적인 효과에 기여하는 3 개의 주요 성분으로 고안된다. CTA1은 상기 A2 및 B 서브유니트로부터 분리에 의해 비-독성으로 변환되는 콜레라 독소의 효소적 활성 서브유니트이다. 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 DD에 융합하는 것은 B 세포를 표적으로 하는 것이다. 보다 일반적으로, 모노 및 폴리 클론 항체는 EP 0 109 942 B1, EP 0 242 380 B1 및 EP 0 180 564 B1에서 기재된 바와 같이 상기 입자 내로 혼입될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 나노입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 상이한 나노입자 내에 각각 혼입된 상이한 퀼라자 사포닌 분획을 포함할 수 있다.
따라서, 두 개의 상이한 사포닌 분획은 하나의 G3 입자에 결합된(bound) 착물일 수 있고 상기 적어도 두 개의 상이한 사포닌 분획(들) 중 다른 하나(들)는 다른 물리적으로 상이한 액체 함유 입자(들)일 수 있다.
상기 상이한 사포닌은 각각 친수성 및 소수성 사포닌일 수 있다. 상기 입자는 적어도 분획 C 또는 적어도 분획 B 또는 Quil A의 분획 C와 B 사이의 적어도 하나의 임의의 분획 또는 Quil A의 적어도 하나의 다른 분획을 함유할 수 있다. 따라서 하나의 입자는 분획 C 만; 분획 C 및 Quil A의 적어도 하나의 다른 분획; 분획 C 및 Quil A의 하나 이상의 다른 분획; 분획 C 및 Quil A의 분획 A; 미정제 Quil A를 함유할 수 있다. 또한, 상기 입자는 분획 B 만; 분획 B 및 Quil A의 적어도 하나의 다른 분획; 분획 B 및 Quil A의 하나 이상의 다른 분획; 분획 B 및 Quil A의 분획 A를 함유할 수 있다. 또한, 상기 분획의 조합은 상이한 지질 입자 또는 동일한 지질 입자일 수 있다.
따라서, 물리적으로 상이한 입자의 친수성 및 소수성 사포닌을 포함하는 입자를 함유하는 지질의 혼합물이 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 Quil A의 분획은 면역 증강 활성(immunomodulating activity)을 갖는 적어도 하나의 다른 보조제(adjuvant)와 함께 나노입자에 통합될 수 있다.
다른 일 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 다른 보조제(adjuvant)는 자유형(in free form)으로 존재할 수 있거나 또는 보조제(adjuvant) 조성물의 제조를 위한 다른 별개의 나노입자에 통합될 수 있다.
상기 적어도 하나의 다른 보조제(adjuvant)는 Quil A 사포닌과 같은 사포닌일 수 있다.
분획 A는 단독으로 사용되어 용량에 독성이 있을 때 다른 보조제(adjuvant)의 사용을 용이하게 할 수 있고, 이것은 효율적이고 면역 반응의 증대를 포함하는 상승 효과 및 면역 증강 활성이 얻어질 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 Quil A로부터 보조제(adjuvant) 분획 A 및 임의의 중량비(any weight ratios)의 적어도 하나의 다른 보조제(adjuvant)를 포함할 수 있다. 바람직하게 Quil A의 분획 A는 보조제(adjuvants)의 총량에 따라 계산된 2-99.9 중량%, 바람직하게 5-90 중량% 및 특히 50-90 중량%이다. 예를 들어, Al(OH)3 의 경우, 오일 보조제(adjuvants) 및 블록 중합체, Quil A의 분획 A의 양은 실질적으로 낮을 수 있다.
하나의 바람직한 이스콤(ISCOM) 조성물은 분획 A 및 비-A Quil A 분획(non-A Quil A fractions)의 총 중량에 따라 계산된 Quil A의 프래그먼트(fragment) A의 50-99.9% 및 프래그먼트 C 및/또는 분획 B 및/또는 Quil A의 다른 분획 또는 유도체(이하, 비-Quil A 분획)의 0.1-50%를 포함한다. 특히 상기 조성물은 분획 A 및 비-A Quil A 분획(non-A Quil A fractions)의 총 중량에 따라 계산된 Quil A의 프래그먼트 A의 70-99.9% 와 비-Quil A 분획의 0.1-30%, 바람직하게 Quil A의 프래그먼트 A의 75-99.9%와 비-Quil A 분획의 0.1-25% 및 특히 Quil A의 프래그먼트 A의 의 80-99.9% 및 비-Quil A 분획의 0.1-20%를 포함한다. 가장 바람직한 조성물은 분획 A 및 비-A Quil A 분획(non-A Quil A fractions)의 총 중량에 따라 계산된 Quil A의 프래그먼트 A의 91-99.1%와 비-A Quil A 분획의 0.1-9%, 특히 분획 A 및 비-A Quil A 분획(non-A Quil A fractions)의 총 중량에 따라 계산된 분획 A의 98.0-99.9%와 비-A Quil A 분획의 0.1-2.0%를 포함한다.
상기 나노입자 및 상기 나노입자를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 완충제(pharmaceutically acceptable buffers), 희석제(diluents), 부형제(excipients), 첨가제(additives), 보조제(adjuvants), 및/또는 담체(carriers)를 더 포함하는 약제학적 조성물에서 선택적으로 약제학적으로 사용될 수 있다.
약제학적으로 적합하고 허용가능한 담체 및/또는 희석제는 임의의 그리고 모든 통상적 용매, 분산매(dispersion media), 충전제(fillers), 고체 담체(solid carriers), 수용액, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제(isotonic and absorption delaying agents) 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매체(media) 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예로서, 이는 미국 펜실베이니아의 맥 출판사의 레밍턴의 제약 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences) 제 18 판에서 기재된다. 임의의 통상적 매체(media) 또는 제제에 관한 한 활성 성분과 양립할 수 없는 것을 제외하고, 본 발명의 약제학적 조성물의 이의 용도는 고려된다. 또한, 추가 활성 성분(Supplementary active ingredients)은 상기 조성물에 혼입될 수 있다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 항암제와 같은 약제학적 활성 화합물, 백금 배위 화합물(platinum coordination compounds), 탁산(taxane) 화합물, 캄프토테신(camptothecin) 화합물, 항-종양 빈카 알칼로이드(anti-tumour vinca alkaloids), 항-종양 뉴클레오시드 유도체(anti-tumour nucleoside derivatives), 질소 머스타드(nitrogen mustard) 또는 니트로소우레아 알킬화제(nitrosourea alkylating agents), 항-종양 안트라사이클린 유도체(anti-tumour anthracycline derivatives), 트라스투즈맙(trastzumab) 및 항-종양 포도필로톡신 유도체(anti-tumour podophyllotoxin derivatives), 퀼라자 사포나리아 몰리나 및 이의 서브 프래그먼트(sub fragments), Fc 수용체 또는 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A의 DD와 같은 항체 또는 단일클론 항체에 대한 수용체, 시타라빈(Cytarabin), 다우노루비신(Daunorubicin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 카바지탁셀(Cabazitaxel), 토리셀(Toricsel) 및 트라벡터딘(Trabectidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제제와 같은 암 치료제를 추가 포함하는 약제학적 조성물을 포함하며, 이 활성 화합물은 상기 나노입자에 통합될 수 있거나 또는 상기 조성물과 혼합될 수 있다.
또한 추가 항암제는, 즉, 백금 배위 화합물(platinum coordination compounds), 탁산(taxane) 화합물, 캄프토테신(camptothecin) 화합물, 항-종양 빈카 알칼로이드(anti-tumour vinca alkaloids), 항-종양 뉴클레오시드 유도체(anti-tumour nucleoside derivatives), 질소 머스타드(nitrogen mustard) 또는 니트로소우레아 알킬화제(nitrosourea alkylating agents), 항-종양 안트라사이클린 유도체(anti-tumour anthracycline derivatives), 트라스투즈맙(trastzumab) 및 항-종양 포도필로톡신 유도체(anti-tumour podophyllotoxin derivatives)로부터 바람직하게 선택된다.
상기 용어 "백금 배위 화합물(platinum coordination compounds)"은 이온의 형태로 백금을 제공하여 임의의 종양 세포 성장을 억제하는 백금 배위 화합물을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 바람직한 백금 배위 화합물은 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 클로로(디에틸렌트리아민)-백금 (II) 클로라이드 [chloro(diethylenetriamine)-platinum (II) chloride] ; 디클로로(에틸렌디아민)-백금 (II) [dichloro(ethylenediamine)-platinum (II)] ; 디아민 (1,1-시클로부탄디카르복시레이토)-백금 (II) (카르보플라틴) [diamine (1,1-cyclobutanedicarboxylato)-platinum(II)(carboplatin)] ; 스피로플라틴(spiroplatin) ; 이프로플라틴(iproplatin) ; 디아민 (2-에틸말로네이토) 백금 (II) [diamine (2-ethylmalonato)-platinum (II)] ; (1,2- 디아미노 시클로헥산) 말로네이토백금 (II) [(1,2-diaminocyclohexane) malonatoplatinum (II)] ; (4-카르복시프탈로) (1,2-디아미노시클로헥산) 백금 (II) [(4-carboxyphthalo) (1,2-diaminocyclohexane) platinum (II)] ; (1,2-디아미노시클로헥산)-(이소시트라토) 백금 (II) [(1,2-diaminocyclohexane)-(isocitrato) platinum (II)] ; (1,2-디아미노시클로헥산)-시스-(피루베이토) 백금 (II) [(1,2-diaminocyclohexane)-cis-(pyruvato) platinum (II)] ; 및 (1,2-디아미노시클로헥산)-옥살라토-백금 (II) [(1,2-diaminocyclohexane)-oxalato-platinum (II)] ; 오르마플라틴(ormaplatin) 및 테트라플라틴(tetraplatin)을 포함한다.
시스플라틴은, 예를 들어, 물, 멸균 식염수 또는 다른 적합한 장치(vehicle)와 함께 설치(constitution) 하기 위한 분말로서 브리스톨 마이어스 스퀴브(Bristol Myers Squibb Corporation)의 플라티놀(Platinol)이라는 상표명으로 상업적으로 이용될 수 있다. 다른 백금 배위 화합물 및 이들의 약제학적 조성물은 상업적으로 이용될 수 있고/있거나 종래 기술에 의해 제조될 수 있다 .
상기 탁산 화합물은 브리스톨 마이어스 스퀴브(Bristol Myers Squibb)에서 탁솔(Taxol)이라는 상품명으로 판매될 수 있고, 도세탁셀은 론 플랑크 로허(Rhone-Poulenc Rorer)에서 탁소테르(Taxotere)라는 상품명으로 상업적으로 이용할 수 있다. 두 화합물 및 다른 탁산(taxane) 화합물은, 예를 들어, EP 253738, EP 253739 및 WO 92/09589, 또는 이에 유사한 방법에 의해 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 카바지탁셀(Cabazitaxel)은 사노피 파스퇴르(Sanofi Pasteur)로부터 이용할 수 있다.
캠프토테신(camptothecin) 화합물은 이리노테칸(irinotecan) 및 토포테칸(topotecan)을 포함한다. 이리노테칸(irinotecan)은, 예를 들어, 캠푸토(Campto)라는 상품명으로 론 플랑크 로허(Rhone-Poulenc Rorer)에서 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 유럽 특허 명세서 제137145호 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 토포테칸은, 예를 들어, 하이캄틴(Hycamtin)이라는 상표명으로 스미스클라인 비참(SmithKline Beecham)으로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 유럽 특허 명세서 제321122호 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 캄프토테신(camptothecin) 화합물은, 예를 들어, 이리노테칸(irinotecan)과 토포테칸(topotecan)에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방법에 의해 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
항-종양 빈카 알칼로이드(anti-tumour vinca alkaloids)는 상기 언급된 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 비노렐빈(vinorelbine)을 포함한다. 빈블라스틴은, 예를 들어, 벨반(Velban)이라는 상표명으로 일라이 릴리(Eli Lilly and Co)로부터 주사(injection)용 설페이트 염으로 상업적으로 이용될 수 있고, 예를 들어, 독일 특허 명세서 제2124023호 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 빈크리스틴(vincristine)은, 예를 들어, 온코빈(Oncovin)이라는 상표명으로 일라이 릴리(Eli Lilly and Co)로부터 주사(injection)용 설페이트 염으로 상업적으로 이용될 수 있고, 예를 들어, 독일 특허 명세서 제2124023호 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 비노렐빈(vinorelbine)은, 예를 들어, 나벨빈(Navelbine)이라는 상품명으로 글락소 웰컴(Glaxo Wellcome)에서 주사(injection)용 타르트레이트 염(tartrate salt)으로서 상업적으로 이용할 수 있고, 예를 들어, 미국 특허 명세서 제4307100호, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 항-종양 빈카 알칼로이드는, 예를 들어, 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 비노렐빈(vinorelbine)에 대해 상기 언급된 이들과 유사한 방법에 의해 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
항-종양 뉴클레오시드 유도체(anti-tumour nucleoside derivatives)는 상기 언급된 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine) 및 카페시타빈(capecitabine)을 포함한다. 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)은 상업적으로 광범위하게 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제2802005호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 젬시타빈(Gemcitabine)은, 예를 들어, 겜자르(Gemzar)라는 상품명으로 일라이 릴리(Eli Lilly)에서 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 유럽 특허 명세서 제122707호 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
카페시타빈(Capecitabine)은, 예를 들어, 젤로다(Xeloda)라는 상품명으로 호프만-라 로슈(Hoffman-La Roche)로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 유럽 특허 명세서 제698611호 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 항-종양 클레오시드 유도체는 카페시타빈(capecitabine) 및 젬시타빈(gemcitabine)에 대해 상기 언급된 이들과 유사한 방법에 의해 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
질소 머스타드 화합물(nitrogen mustard compounds)은 시클로포스파미드(cyclophosphamide)와 클로람부실(chlorambucil)을 포함한다. 시클로포스파미드(cyclophosphamide)는, 예를 들어, 사이톡산(Cytoxan)이라는 상품명으로 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)에서 상업적으로 이용될 수 있으며, 예를 들어, 영국 특허 명세서 제1235022호 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 클로람부실(chlorambucil)은, 예를 들어, 류케란(Leukeran)이라는 상품명으로 글락소 웰컴(Glaxo Welcome)으로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 명세서 제3046301호에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 용도를 위한 바람직한 니트로소우레아 화합물(nitrosourea compounds)은 상기 언급된 카무스틴(carmustine) 및 로무스틴(lomustine)을 포함한다. 카무스틴(carmustine)은, 예를 들어, 비아이씨엔유(BiCNU)라는 상품명으로 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 유럽 특허 명세서 제902015호에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 로무스틴(lomustine)은, 예를 들어, 시이이엔유(CeeNU)라는 상품명으로 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 명세서 제4377687호에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
항-종양 안트라사이클린 유도체(anti-tumour anthracycline derivatives)는 상기 언급된 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin) 및 아이다루비신(idarubicin)을 포함한다. 다우노루비신(daunorubicin)은, 예를 들어, 세루비딘(Cerubidine)이라는 상품명으로 베드포드 레버러토리스(Bedford Laboratories)로부터 히드로클로라이드염(hydrochloride salt)으로서 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 명세서 제4020270호에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다.
독소루비신(Doxorubicin)은, 예를 들어, 아스트라(Astra)에서 히드로클로라이드염(hydrochloride salt)으로서, 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 명세서 제3803124호에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 아이다루비신(idarubicin)은 이다마이신(Idamycin)이라는 상품명으로 파마시아-업존(Pharmacia & Upjohn)으로부터 히드로클로라이드염(hydrochloride salt)으로서 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 명세서 제4046878호에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 항-종양 안트라사이클린 유도체(anti-tumour anthracycline derivatives)는, 예를 들어, 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin) 및 아이다루비신(idarubicin)에 대해 상기 언급된 이들과 유사한 방법에 의해 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
트라스투즈맙(Trastzumab)은 헤르셉틴(Herceptin)이라는 상품명으로 제넨텍(Genentech)으로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 미국 특허 명세서 제5821337호 또는 PCT 특허 명세서 WO 94/04679 및 WO 92/22653에서 기재된 바와 같이 얻어질 수 있다.
항-종양 포도필로톡신 유도체(anti-tumour podophyllotoxin derivatives)는 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide)를 포함한다. 에토포시드(etoposide)는, 예를 들어, 베페시드(VePesid)라는 상품명으로 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, 유럽 특허 명세서 제111058호에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 테니포시드(teniposide)는, 예를 들어, 보몬(Vumon)이라는 상품명으로 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)로부터 상업적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어, PCT 특허 명세서 WO 93/02094에 기재된 바와 같이, 또는 이와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 다른 항-종양 포도필로톡신 유도체(anti-tumour podophyllotoxin derivatives)는 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide)에 대해 상기 언급된 이들과 유사한 방법에 의해 통상적인 방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 언급된 바와 같이, 이들의 미정제 형태(crude form) 또는 분획(fractions)의 사포닌(Saponins)은 자유 형태(free form), 즉, 항암제로서, 지질 포함 입자(lipid comprising particles)에 통합되지 않는 형태로 사용될 수 있다. 이러한 항암 화합물은 리포좀, 이스콤(ISCOM) 및/또는 이스콤 매트릭스, 포스인트로스(posintros)와 같은 지질 함유 입자와 혼합(mixed), 결합(coupled), 또는 통합(integrated)될 수 있다. 통합될 때 이들이 소수성이라면 적합하다. 그렇지 않으면 소수성 기는 EP 242380에 기재된 바와 같이 이들에 결합될 수 있다.
비-소수성 화합물 및 특히 단백질 또는 펩티드는 이들에 소수성 기 결합(coupling)에 의해 소수성이 되게 할 수 있다.
상기 비-소수성 화합물에 결합될 수 있는 소수성 기는, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개의 탄소 원자, 또는 소수성 아미노산 또는 펩티드 또는 스테로이드와 같은 다른 소수성 구조를 갖는 직쇄(straight), 분지쇄(branched), 포화 또는 불포화 지방족 사슬이다. 상기 소수성 구조의 길이는 상기 단백질의 크기 및 성질에 따라 조정된다. 예로서, 10-15 개의 아미노산을 갖는 펩티드(구제역 바이러스)가 상기 아미노 또는 카르복시 말단에서 2 개의 티로신(tyrosine)과 적합하게 나타났음이 거론될 수 있다. 70,000 달톤(daltons)의 분자량을 갖는 단백질은 약 20 개의 소수성 아미노산을 요구한다. 시험은 실험적(empirically)으로 만든다. 따라서, 단백질은 1 내지 20 개의 아미노산, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 개의 아미노산, 특히 Trp, Ile, Phe, Pro, Tyr, Leu, Val 중에서 선택되며, 특히 Tyr; 콜린 산, 우르소데옥시콜린 산(ursodesoxycholine acid)과 같은 콜레스테롤 유도체를 갖는 펩티드를 사용한다.
이러한 소수성 기는 카르복시-, 아미노-, 디설피드-, 하이드록시-, 설프하이드릴-(sulohydryl-)과 같은 비-소수성 단백질 또는 화합물 및 알데히드 기 같은 카보닐 기와 결합될 수 있는 기(group)와 결합되어야 한다.
결합될 수 있는 소수성 기는, 바람직하게 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 헥산, 헵탄, 옥탄의 카르복실, 알데히드, 아미노, 히드록실, 및 디설파이드 유도체 및 Cys, Asp, Glu, Lys 함유하는 펩타이드, 바람직하게 옥탄알(octanal) 및 Tyr.Tyr.Tyr-Cys,-Asp 또는 ?lu를 함유하는 펩타이드로 선택된다. 결합될 수 있는 기(group)를 갖는 상기 소수성 기는, 예를 들어, 상기 언급된 가용화제(solubilising agents) 및 세제(detergents) 또는 염산, 아세트산 부피에 따른 아세트산 67%, 부식제(caustic liquor), 암모니아의 도움으로 물에 용해되어야 하며, 이것은 주변 물질에 따라 용해된다. 그리고 나서, pH는 물질 침전없이 중성 방향으로 조정하고; 여기에 소수성 기가 결합되는 상기 단백질을 변성시키는 pH 값을 얻을 수 없는지를 확실히 하는 것이다. 지질은 상기 가용화(solubilisation)를 증대시킬 수 있다.
상기 소수성 분자는 10:1 대 0.1:1, 바람직하게 1:1의 몰비인 비-소수성 화합물에 첨가될 수 있다.
결합 분자(coupling molecule)로서 카르복실기를 갖는 소수성기는 수용성 카르 보디이미드류(carbodiimides) 또는 복합체 무수물(composite anhydrides)을 통해 단백질에 결합될 수 있다. 전자의 경우, 카르복실기가 카르보디이미드(carbodiimides)에 의해 pH 5로 활성화되고 높은 인산염 함량을 갖는 완충제 pH 8에서 용해되는 단백질과 혼합된다. 후자의 경우, 상기 카르복시 화합물은 디옥산 또는 아세토니트릴 중 트리에틸아민의 존재 하에 이소부틸 클로로포메이트(isobutylchloroformate)와 반응시켜, 생성된 무수물은 pH 8 내지 pH 9에서 상기 단백질에 첨가된다. 또한, 단백질의 과요오드 산화 설탕 유니트(periodate-oxidized sugar units)의 알데히드 및 케톤과 함께 하이드라존 결합(bond)을 제공하는 히드라진(hydrazine)과 함께 상기 카르복실기를 히드라지드(hydrazide)로 전환하는 것이 가능하다.
아질산을 포함하는 아미노기는 Tyr, His 및 Lys와 azo 결합을 제공하는 디아조늄 염으로 낮은 온도에서 전환될 수 있다. 석신산 무수물(succinic anhydride)을 포함하는 상기 하이드록실 기는 카르복실기 형태로써 결합될 수 있는 헤미석시네이트 유도체(hemisuccinate derivatives)로 전환될 수 있다. 알데히드 기는 시프 염기(Schiff's base)로 단백질 내에서 아미노기와 반응할 수 있다. 여러 결합 기(coupling groups) 및 방법은 기재된다6 .7.8.
그래서, 상기 단백질, 펩티드 또는 소수성 기를 수용하도록 만들어진 화합물은 a)에서 기재된 바와 같이, 글리코시드와 함께 결합된 착물(complex)을 만들지만, 본원에서 세포 프래그먼트(fragments) 제거를 위한 정제 단계는 생략될 수 있다.
에워싸인(enclosed) 소수성기를 갖는 친수성 단백질은 상기 단백질을 약하게(gently) 변성시킴으로써, 즉, 3 M 우레아 또는 70℃ 이상 고온, 약 2.5의 낮은 pH에서, 상기 소수성 기가 접근 가능하게 함으로써, 소수성이게 할 수 있다. 이러한 단백질은 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 면역글로블린(immunoglobulines)일 수 있다. 상기 면역글로블린은 항이디오타입항체(antidiotypic antibodies)로서 사용될 수 있다. 상기 단백질은 (b)에서 기재된 바와 같은 단백질로서 정제되어 수득되고 이어서 (a)에서 기재된 바와 같이 글리코시드와 착물-결합되며, 세포 프래그먼트 제거를 위한 정제 단계는 생략될 수 있다.
또한, 상기 소수성 또는 양친매성 분자는, 포스파티드 산(phosphatidic acids)의 유도체, 즉, 레시틴, 세팔린, 이노시톨 인지질(inositol phosphatides), 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 개의 탄소 원자를 갖는 스핑고신(spingosine) 유도체, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린 (phophatidylserine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)과 같은 글리세롤 포스페이트(glycerol phosphates)의 유도체와 같은 인지질(phospholipids)로부터 선택될 수 있다.
상기 언급된 모든 양친매성 및 소수성 분자는, 항원, 보조제(adjuvant), 표적화 분자(targeting molecule), 약제학적 화합물(pharmaceutical compound)로부터 선택될 수 있으며, 영양분(nutriment)은 상기 나노입자 내로 통합되거나 조성물에서 그 안에서 혼합될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 보조제(adjuvant)로서, 예를 들어, 개발 중인 백신과 조합한 용도로서, 계절 인플루엔자 바이러스 백신과 조합한 용도로서, 범유행성 인플루엔자 백신과 조합한 용도로서, 또는 생화학 무기에 대한 백신과 같은 긴급 백신과 조합한 용도로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재한 바와 같이 상기 G3 입자를 포함하는 약제학적 백신 제형에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 이를 필요로 하는 사람에게 본 발명에 따른 약제학적 백신 제형을 피험자(subject)에게 투여하는 것을 포함하여, 유기체(organism)에 의해 발생하거나 복잡해지는 질환을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약제학적 유효량의 나노입자 또는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 암의 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 일 구현예에 따르면, 상기 암은 백혈병(leukemia)이다.
상기 약제학적 조성물(pharmaceutical compositions)은 멸균 주사 가능한(injectable) 수성 또는 유성 현탁액(oleaginous suspension)의 형태일 수 있다. 본 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제(dispersing) 또는 습윤제(wetting agents), 현탁화제(suspending agents)를 이용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 또한, 상기 멸균 주사 제제는, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 용액으로서, 비-독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 채용될 수 있는 상기 허용가능한 장치(vehicles) 및 용매 중에는 물, 링거액(Ringer's solution) 및 등장성 생리식염 용액(isotonic sodium chloride solution)이 있다. 또한, 멸균 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 배지로서 채용된다. 이러한 목적을 위해서, 임의의 블랜드(bland) 고정 오일은 합성 모노- 또는 디글리세라이드(diglycerides)를 포함하여 채용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에서의 사용을 알아낸다.
또한, 상기 용액 또는 현탁액은 하기의 보조제(adjuvants)들 중 적어도 하나를 포함할 수 있다 : 예를 들어, 주사용 증류수(water for injection), 식염수(saline), 고정 오일(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols), 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol) 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제(sterile diluent), 벤질 알코올(benzyl alcohol) 또는 메틸 파라벤(methyl paraben)과 같은 항균제, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite)와 같은 항산화제, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid)과 같은 킬레이트제, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제(buffers) 및 염화나트륨 또는 덱스트로스(dextrose)와 같은 등장성 조정을 위한 제제. 상기 비경구용 제제(parenteral preparation)는 앰플(ampoules), 일회용(disposable) 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 만든 다회 투약 용기에 동봉될(enclosed) 수 있다.
상기 화학식의 화합물은 비경구적으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구(parenteral)는 피하 주사액(subcutaneous injections), 정맥 주사(intravenous), 근육내(intramuscular), 주입 기술의 피내 주사(intradermal injection of infusion techniques), 전기 천공법(electroporation, EP), 무침 주입용(for needle less injection)-분사 주사(jet injection), 유전자 총(gene gun), 바이오젝터(biljector)뿐만 아니라 경구(oral), 에어로졸 투여(aerosol administrations)를 포함한다. 경구용의 경우, 예를 들어, 단백질 A 유래 화합물 CTA1DD가 엘리아슨(Eliasson et al 9 )의 문헌에 의해 기재된 바와 같이, 사용될 수 있으며, 이것은 특히 장관(intestinal tract)의 점막 면역 유도를 위해서 뿐만 아니라 특히 B-세포 림프종 암에 대해 잠재적으로 유용한 치료 세포인 B-세포를 표적으로 하기 위한 특성을 갖는다.
일반적으로, 본 발명의 지질 함유 입자는 약제학적 유효량으로 투여된다. 상기 입자의 실제 투여된 양은 치료될 조건, 투여의 선택 경로, 투여된 실제 화합물, 나이, 체중, 및 개별 환자의 반응, 환자의 증상의 심각도 등을 포함하는 관련 환경의 관점에서 의사에 의해 전형적으로 결정될 것이다.
본 발명에 따른 상기 나노입자는 임의의 미생물에 대응하는 임의의 백신에서 보조제(adjuvant)로서 사용될 수 있다. 조류와 같은 임의의 동물, 인간과 같은 포유류, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소 및 말과 같은 가축에 대해 사용될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 본 발명은 동물의 연쇄상구균(streptococci) 및 말의 인플루엔자에 대한 백신의 보조제(adjuvant)로서 사용된다.
인간 사용를 위한 투여량(doses)은 포함된 다른 화합물에 따라 달라질 수 있다. 치료 기관의 관점에서 상기 투여량은 하루에 < 50 ㎍ 내지 1 mg을 범위로 할 수 있다.
또한, 개인 환자에게 본 발명에 따른 암 치료를 위한 방법의 적용성을 평가하기 위한 방법으로서,
Figure pct00011
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 또는 제8항 또는 제9항에 따른 약제학적 조성물을 생체외(in vitro)로 접촉시키고 상기 환자로부터 암 세포를 가져오고;
Figure pct00012
상기 암세포에 대한 상기 나노입자 또는 약제학적 조성물의 치료 효과를 나타내는 적어도 하나의 효과를 측정하는 것;을 포함하며,
상기 제10항 또는 제11항에 따른 방법은 상기 나노입자 또는 약제학적 조성물이 상기 암세포에 대해 상당한 효과를 나타내는 치료 효과를 보이는 경우 상기 개인 환자에게 적용할 수 있는 것으로 평가하는 것이다.
상기 치료 효과의 표시는 유전자의 하향 조절에 의해 나타낼 수 있는데, 이것은 사이클린 의존성 키나아제(cycline dependent kinases : CDKs), 사이클린 또는 세포 주기 및 복제(CDK2, CDK6 및 CyclineD1)에서 체크 포인트(check points)를 통과하도록 촉진(promoting)하는 다른 분자로서 세포 주기 조절에서 중요성을 가지는 유전자에 관한 것이며, 티미딘 키나아제(thymindine kinase : TK)의 하향 조절 또는 IL-8, FOXC1 및 HDAC5와 같은 상기 세포 분화(differentiation)를 촉진하는 분자의 상향 조절도 상기 세포 주기로부터 출구(exit)를 또한 표시한다. 상기 조절 인자는 예들로서 더 많이 존재하며, 즉, 상기 예는 제한점으로 결론을 내리지 않는다.
본 발명은 또한 하기 단계(steps)를 포함하는 인지질 없는(phospholipid-free) 나노입자 제조 방법에 관한 것이다;
a) 리포좀의 현탁액(suspension) 또는 소수성 표면(hydrophobic surface)을 준비하고,
b) 리포좀의 현탁액(suspension) 또는 소수성 표면을 가져와 유기 용매 또는 세제 중 단량체로 용해되는 스테롤, 바람직하게 콜레스테롤의 용액과 접촉시키고
c) 상기 표면에 스테롤 막(membrane)을 형성하는 상기 용매 또는 세제를 제거하고,
d) 퀼라자 사포닌 미셀(micelles)의 수용액을 준비하고,
e) 상기 스테롤 막(membrane)에 상기 사포닌 미셀을 포함하는 수용액을 첨가하며, 여기서 착물(complex)은 상기 사포닌과 상기 스테롤 사이에 형성되고, 상기 수용액에 현탁됨(suspended).
상기 소수성 표면은 항아리(jar), 터브(tub), 여러 층의 표면, 비드(beads), 예를 들어, 라텍스(latex) 비드, 망(nets) 또는 3차원망(three dimensional nets) 또는 다공성 물질의 표면일 수 있다. 또한 지질막(들)에 통합된 성분(components)을 포함하는 리포좀일 수 있다.
상기 리포좀은 (예를 들어, in Review Liposomes Preparation Methods Mohammad Riaz Faculty of Pharmacy, University of the Punjab, Lahore, Pakistan Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences Vol.19(1), January 1996, pp.65-77) 기재된 바와 같이 다양한 기술 및 상이한 조성에 따라 구성될 수 있다. 또한 리포좀 막에 삽입된 바이러스 단백질을 함유하는 바이로좀(virosome)으로서 구성될 수 있다. 상기 리포좀은 수용액에 존재할 수 있다. 상기 장치는, 예를 들어, 컬럼에 충진(packed)될 수 있다.
상기 사포닌 및 스테롤은 상기 나노입자에 대해 상기 언급된 것들일 수 있다.
상기 용매는 사이트 http://en.wikipedia.org/wiki/Organic_solvents 또는 세제, 바람직하게 클로로포름, 에탄올 또는 아세토니트릴(acetonirtril)에서 발견할 수 있는 임의의 용매일 수 있다. 상기 용매의 성질은 en.wikipedia.org/wiki/organic solvents에 기재되어 있다. 상기 용매의 선택은 용해되는 분자의 특성에 의존성이 있다. 상기 용매의 상이한 유형(type)은 주로 극성 및 비-극성에 따라 분류된다. 비극성 용매는, 예를 들어, 헥산, 클로로포름 및 디에틸 에테르이다. 증발(evaporation)에 의해 제거가 용이한 35 및 65 사이의 비점(boiling point)을 가져 증발될 수 있기 때문에 상기 언급된 것들은 유용하다. 극성 비양자성 용매(Polar aprotic solvents)는 약제학적 분자, 예를 들어, 디메틸 설폭사이드, 아세토니트릴의 가용화(solubilization)를 위해 종종 사용된다. 후자는 낮은 비점을 가지고 있기 때문에 흥미롭다. 또한, 극성 양자성 용매(Polar protic solvents)는 다른 용매와 조합에 특히 유용하다. 에탄올, 메탄올은 낮은 비점을 가지고, 아세트산은 높은 비점을 갖는다. 낮은 비점은 증발 기술에 특히 중요하다. 상기 가용화(solubilisation)는 둘 이상의 용매를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 언급된 용매는 예시이며, G3 제형을 형성하기 위한 혁신의 용도를 위해 아마 더욱 바람직한 특성들이 많이 있다.
사용가능한 예는 초과 사용된 갈산(gallic acid)을 기반으로 하는 쯔비터젠트(Zwittergent) 또는 세제(detergent)와 같은 비-이온성(non-ionic), 이온성(-ionic), 즉, 양이온 또는 음이온 또는 양쪽성 이온(Zwitter-ionic)의 세제이다. 적합한 비-이온성 세제의 전형적인 예로는, N-알카노일-N-알킬-글루카민(N-alkanoyl-N-alkyl-glucamines), 지방족(aliphatic) 또는 방향지방족(aralylphatic) 산 및 알코올을 포함하는 폴리글리콜 에스테르류(polyglycol esters) 및 폴리글리콜 에테르류(polyglycol ethers)이다. 이들의 예는 일반식 CnH2n +1(OCH2CH2)xOH를 갖는 알킬폴리옥시에틸렌 에테르류(alkylpolyoxyethylene ethers), CnEx로 축약하며; 상기 알킬기 및 상기 폴리옥시에틸렌 사슬 사이의 페닐 고리(ring)를 함유하는 알킬-페닐 폴리옥시에틸렌 에테르, Cnphi.Ex로 축약하고, Triton X-100=tertC8E96 [폴리에틸렌 옥사이드의 옥틸페놀에테르(octylphenolether of polyethylene oxide)], 아실폴리옥시에틸렌 에스테르(acylpolyoxyethylene esters); 아실폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(acylpolyoxyethylene sorbitane esters), Cn sorbitane Ex로 축약하고, 예를 들어, 트윈(Tween) 20, 트윈 80, 베타-D-알킬글루코시드(beta-D-alkylglucosides), 예를 들어, 베타-D-옥틸글루코시드 (beta-D-octylglucoside)이다. 적합한 이온성 세제의 전형적인 예는, 예를 들어, 콜린 산(cholic acid), 데스옥시콜레이트(desoxycholate), 콜레이트(cholate) 및 CTAB(세틸트리메틸암모니움 브로마이드)와 같은 갈산(gallic acid) 세제이다. 예를 들어, 타우로데옥시콜레이트(taurodeoxyoholate), 글리코데옥시콜레이트(glycodeoxycholate) 및 글리코콜레이트(glycocholate)와 같은 복합 세제(conjugated detergent)도 사용될 수 있다. 다른 가능한 가용화제(solubilizing agents)는 리소레시틴(lysolecithin) 및 합성 리소인지질(lysophosphoilipids)이다. 상기 언급된 세제의 혼합물도 사용될 수 있다. 투석 방법을 사용하는 경우, 상기 세제는 너무 오래 시간이 아닌 시간에 투석할 수(dialyzable) 있어야 한다.
일부 표면 활성 물질이 매트릭스 형성을 매우 용이하게 한다. 이들은 극성 헤드기(polar head group)를 갖는 고유의 생물학적 막 지질과 비-극성 지방족 사슬, 예를 들어, 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline, 음전하) 및 포스파티딜 에탄올 아민(phosphatidyl ethanolamine, 양전하)을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 세제는 트리톤-X-100, 트윈-20, 노니데트(Nonidet), NP-40, 데옥시콜레이트(deoxycholate), MEGA-10 및 옥틸글리코시드(octylglycoside)일 수 있다. MEGA-10 및 옥틸글리코시드(octylglycoside)은 투석에 의해 제거될 수 있다. 다른 경우, 다른 기술들은, 언급된, 예를 들어, 원심(centrifugation)법 또는 컬럼 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
상기 가용화제(soluble agent)는 낮은 비점을 갖는 유기 용매를 이용하는 증발(evaporation)에 의해 또는 투석에 의해 또는 EPC-특허 제0 109 942호에 기재된 바와 같이 투석, 크로마토그래피, 여과 또는 접선 유동(tangential flow)에 의해 제거될 수 있다.
상기 사포닌 미셀의 수용액은 제조자로부터 전달되어 동결 또는 분무 건조된 분말을 첨가함으로써 수득된다. 상기 사포닌 또는 사포닌 분획은 일반적으로 원액(stock solution), 예를 들어, 10 ㎎/ml의 물로서 유지되나, 이 농도에 제한되지 않고, CMC, 즉 임계 미셀 농도 이상, 예를 들어, 퀼라자(quillaja) 제품에 의존하는 30 ㎎/리터의 정확한 수치의 최종 농도에서 지질막을 둘러싼 물에 첨가한다. 상기 사포닌은 퀼라자(Quillaja) 분말 추출로 수득되며, 미정제(crude) 퀼라자 추출물 [브르크하우젠(Berghausen), 미국], 퀼라자 울트라 분말 QP UF 300 [Quillaja Ultra Powder QP UF 300], 퀼라자 울트라 분말 QP UF 1000 [Quillaja Ultra Powder QP UF 1000], 비-분획 퀼라자 사포닌 제품인 Vax-Sap, QHA 및 QHC 분획 (자연 반응으로부터 3 개 모두, 칠레) 또는 칠레 산티아고 Prodalysa로부터 수득될 수 있다.
본 발명은 소수성 표면에 부착된 스테롤(sterol)의 인공막은 단계 a) 내지 단계 c)에서 생성되는 신규 제조 방법을 사용한다. 퀼라자(quillaja) 사포닌 제품의 수용성 미셀 및 상기 퀼라자(quillaja) 미셀과 상기 인공막의 성분 사이의 화학 (공유) 결합(binding)은 혁신적인 수용성 나노 입자(nanoparticulate) 착물, 즉, G3 같은 수용성 착물 내로 인공막 성분을 추출한다. 본 착물은 수상에서 함께 친수성 부분을 유지하고 결합하는 화학적 (공유)결합 및 상기 착물의 중심부에 남아 있는 성분 사이의 소수성 상호 작용에 의해 함께 유지된다. 상기 막은 세제 또는 유기 용매일 수 있는 가용화제(soluble agent)를 포함하는 유기 용액으로부터 형성된다.
상기 인공막에 혼입되는 소수성 및 양친매성 분자는 단계 b)에서 스테롤과 함께 유기 용매나 세제로 가용화되고, 상기 유기 용매의 증발에 의해 수상(waterphase)으로 전환한다. 용매에 의존하는 것은 비점이 물보다 낮다면 증발에 의해 또는 투석(dialyses)에 의해 또는 이스콤(ISCOM) 형성에 대해 기재된 유사한 기술에 의해 제거된다. 따라서, 상기 용매의 제거는 입자의 형성의 일부가 아니고 상기 입자의 형성의 일부가 아닌 인공막의 형성이다. 상기 인공막의 형성 다음에 인공막 주변의 물이 있는 것으로 완료된다. 이러한 수상 내로, 물에 현탁된(용해된) 퀼라자(quillaja) 미셀이 첨가되고, 상기 인공막은 수상으로 추출되고 신규 G3-제형(formulation)으로 상기 퀼라자(quillaja) 미셀의 수상 및 재편성(reorganization)으로 추출된다. 상기 조성물은 쉽게 조절하여 물 중 입자 현탁액 내로 상기 인공막을 완전하게 용해시킬 수 있다. 상기 조성물은 공유 결합 연결이 관련되어서 혁신적인 입자가 형성된다는 구성(construction)의 관점에서 미셀과 다르다.
단계 f) 및 단계 g)에서, 상기 퀼라자(quillaja) 생성물의 수용성 미셀 형태는 수상으로 최종 제품을 얻기 위하여 상호 작용하도록 하게 한다. 본 단계에서 첫 번째 상호작용은 상기 퀼라자(quillaja) 미셀 및 인공막의 상기 스테롤 사이의 공유 결합이며, 두 번째 상호작용은 퀼라자 트리테르페노이드(triterpenoid) 골격 및 상기 스테롤 사이에 공유 결합이다. 적당한 비율에서 인공막의 모든 성분은 17 nm에서 최대 40 nm의 다양한 크기로 신규 나노입자를 형성하는 수용성 퀼라자(quillaja) 미셀에 혼입된다. 지질, 예를 들어, 인지질이 인공막에 존재할 경우, 더 큰 크기가 수득된다. 상기 실시예 2, 4, 9, 14, 15 및 16은 다양한 종류의 친유성 분자가 DT, 부설판(busulfan), 로스코비틴(roscovitine), 비보럭스 40(vivolux40) 및 비타민 D3을 포함하는 본 발명에 따라 혼입되었음을 입증한다.
이스콤(ISCOM) 매트릭스는 단계 b)에서 스테롤을 포함하는 상기 현탁액에 적어도 하나의 인지질(phospholipide)을 추가함으로써 신규 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 인지질은, 포스파티드 산(phosphatidic acids)의 유도체, 즉, 레시틴, 세팔린, 이노시톨 인지질(inositol phosphatides), 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 개의 탄소 원자를 갖는 스핑고신(spingosine) 유도체, 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phophatidylserine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)과 같은 글리세롤 포스페이트(glycerol phosphates)의 유도체로부터 선택될 수 있다.
소수성 성분은 또한 지질, 스테롤을 포함하는 단계 b), 즉, 상기 인공막에서 혼입될 수 있다.
단계 d)에서, 상기 수용성 형태, 즉, 미셀 형태의 사포닌은 상기 인공막을 덮는 수상(water phase)에 첨가된다.
세 가지 성분, 즉, 퀼라자(quillaja) 사포닌, 콜레스테롤, 및 상기 제 3 성분 인지질, 예를 들어, 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)을 포함하는 상기 이스콤(ISCOM) 입자 형성에 대하여 본 발명에 따른 나노입자가 두 가지 성분, 즉, 퀼라자(quillaja) 사포닌, 콜레스테롤을 기반으로 하고 있기 때문에 제조하기에 더 간단하고 경제적으로 생산하기 때문에 본 발명 나노입자는 상기 이스콤(ISCOM) 매트릭스를 대체한다. 상기 퀼라자(quillaja) 성분(들)은 세제 또는 유기 용매를 이용하여 용해될 필요가 없다. 본 발명에 따른 신규 제조 기술은 견고하며(robust), 상기 센시티브 밸런스(sensitive balance)는 극복된다. 따라서, 지금까지 개발된 방법은 이러한 화합물의 강한 경향이 자발적으로 안정한 착물(자기 조립), 예를 들어, 착물을 형성할 수 있게 허용하기 때문에 신규 방법은, 네 번째, 다섯 번째 이상, 즉, 다른 소수성 또는 양친매성 분자의 통합을 위한 이스콤(ISCOM) 매트릭스 기술보다 더 적합하므로, 상기 이스콤(ISCOM) 매트릭스 제형에, 예를 들어, 소수성 상호 작용에 의해 통합되지 않는다. 따라서, 상기 이스콤(ISCOM) 매트릭스 기술은 일반적인 전달 시스템으로서 전개되는 단점을 가지고 있지만, 본 발명은 이러한 단점을 가지지 않는다.
본원에서 언급된 모든 출판물(publication)은 참조로서 포함될 수 있다. 본 발명은 하기 비-제한적예에 의해 앞으로 설명될 것이다.
실시예
재료 및 방법
화학 물질 및 화합물( Chemicals and compounds )
콜레스테롤(C8667), 포스파티딜콜린(PC, P-5763) 및 클로로포름(288306)은 모두 스웨덴, 스톡홀름, 스웨덴 에이비, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구매하였다. 퀼라자 사포닌의 분획 A(QHA) 및 분획 C(QHC)은 스웨덴 웁살라 이스코노바 에이비(ISCONOVA AB)로부터 구매되었다. 디테르페노이드(Diterpenoid, DT), 즉, 스테비아(Stevia)는 칠레의 Prodalysa Ltda로부터 구매되었다. 비타민(Vitamin) D3는 중국, 상하이의 Miva Nutri-molecular Research로부터 상업적으로 수득되었다.
세포주( Cell lines )
(생물학 및 암 연구의 모델 세포주로서 종종 사용되는) 인간 대식세포[human macrophage (M
Figure pct00013
)] 세포주(cell line) U937 및 인간 급성 골수 백혈병(human Acute Myeloid Leukemia, AML) 세포주 HL-60은 배지 RPMI-1640에서 성장되었다. 상기 인간 전립선 선암(prostate adenocarcinoma), PC-3는 HAM'ㄴ F-12K 및 RPMI-1640의 50/50 혼합물에서 배양되었다. 모든 세포는 웁살라 대학의 임상 약학부에 의해 친절하게 제공되었다. 모든 배지(media)는 10% 열-불활성화된 소태아혈청(heat-inactivated fetal calf serum, FCS), 2 mM 글루타민, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 IE/ml 페니실린으로 보충되었다[모두 미국 미주리주 세인트 루이스의 시그마 알드리치(Sigma Aldrich Co)로부터]. 모든 세포주는 5% CO2를 함유하는 가습 공기 중에서 37℃에서 배양되었다.
인간 수지상 세포( Human Dendritic cells , DCs )
미성숙 인간 수지상 세포(immature human DCs)는 스웨덴 웁살라의 3에이치 바이오메디칼(3H Biomedical)로부터 구매하였다.
인 비트로 분석 절차( In vitro assay procedur e )
5,000-20,000 세포/웰(well)의 세포 밀도로 96-웰 마이크로 타이터(titer) 플레이트의 세포는 계열 희석된(serial diluted) G3에 노출되었고, KGI 및 퀼라자(Quillaja) 사포닌 제품은 5% CO2를 함유하는 가습 분위기에서 37C에서 72 시간 동안 QHC의 동일한 양을 함유하는 것이다. U937 세포의 경우, 상기 세포의 한 세트(set)는, 상기 제형의 세포 사멸 효과를 측정하기 위해 형광계 미소 배양 세포 독성 분석(fluorometric microculture cytotoxicity assay, FMCA)에 직접 사용되었다. 상기 세포의 다른 세트의 경우, 상기 상등액은 사이토카인(cytokine) IL-8 결정을 위해 150 μl/웰 수집하였다.
암세포 사멸 효과의 측정( Measurement of cancer cell killing effect )
상기 FMCA 방법은 손상되지 않은 원형질막(intact plasma membranes)을 포함하는 세포에 의해 플루오레세인 디아세테이트(fluorescein diacetate, FDA)의 가수분해 내지 플루오레세인(fluorescein)으로 생성된 형광의 측정을 기반으로 한다. 3 일간 상기 언급된 배양 후, 상기 배지는 흡인(aspiration)에 의해 제거되었다. PBS로 세척한 후, 생리 버퍼(10 μg/ml)에 용해된 FDA의 100 μl/웰이 첨가되었다. 상기 플레이트는 45 분 동안 배양하고 각 웰로부터 생성된 형광은 96-웰 주사형 형광 분석기(96-well scanning fluorometer)로 측정되었다. 상기 형광은 상기 웰(well)의 손상되지 않은(intact) 세포의 수에 비례한다. 성공적인 분석을 위한 품질 평가 기준(quality criteria)은 평균 블랭크(blank) 값의 5 회 이상의 대조군 웰의 형광 신호, 30% 미만의 대조군 웰의 평균 변동 계수(CV)를 포함하였다.
G3 제형으로 자극되는 U937 세포를 위한 사이토카인 IL -8 결정
( Cytokine IL -8 determination for U937 cells stimulated with G3 제형)
인간 IL-8의 검출을 위한 ELISA는 제조업체(인간 IL-8 ELISA, 카탈로그 번호 S8000C, R&D 시스템, 미네아폴리스 MN55413, 미국)의 지시에 따라 수행하였다. 간략하게, 50 μl의 인간 IL-8의 재구성된 기준 및 상기 상등액(supernatant)은 삼중(triplicate) 웰의 각 웰에 잘 첨가되고 부드럽게 플레이트를 여러 번 두드려 잘 혼합하였다. 그리고 나서 상기 플레이트는 접착제 플레이트 커버를 이용하여 덮고, 실온(RT, 20 ~ 25℃)에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후에, 상기 플레이트는 세척 완충액을 이용하여 3 회 세척시키고 바이오틴이 부착된(Biotinylated) 항체 시약(항-인간 IL-8)의 50 μl/웰이 첨가되었다. 상기 플레이트는 접착 플레이트 커버를 이용하여 다시 덮고, RT에서 1 시간 동안 배양시켰다. 세척 완충액을 이용하여 3 회 세척된 후, 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP 용액 100 μl/웰이 가해졌다. 상기 플레이트는 접착 플레이트 커버를 이용하여 다시 덮고, RT에서 30 분 동안 배양하였다. 상기 플레이트의 내용물은 폐기되었고, 상기 플레이트는 세척 완충액을 이용하여 3 회 세척시켰다. TMB 기질 용액 100 μl는 각 웰에 분배되었다(dispended). 상기 효소 발색 반응은 30 분 동안 어두운 곳에서 RT에서 전개시켰다. 상기 반응은 정지 용액(Stop Solution) 100 μl/웰을 첨가함으로써 중지되었다. 상기 흡광도는 450 nm 및 550 nm에서 ELISA 플레이트 리더로 분석되었다. 상기 마이크로플레이트에서 광학 결함(optical imperfections)을 보정하기 위해 450 nm의 값에서 550 nm을 뺀다(subtract). 그리고 나서, 상기 표준 곡선은 생성되고 미지 시료에서 인간 IL-8의 양을 계산하는 데 사용되었다. 상기 표준 곡선은 세로(Y)축 각 표준 농도 대 가로(X) 축에 해당하는 농도(pg/ml)에서 얻은 평균 흡광도를 플롯팅(plotting)함에 따라 만들어졌다.
G3 의 제형에 의해 자극된 인간 단핵 세포의 사이토카인 IL -12 유전자 발현( Cytokine IL -12 gene expression of human monocytes stimulated by G3 formulation )
G3, DT에 의해 처리된 수지상 세포(DCs)의 사이토카인 IL-12 유전자 발현은, 혼입된(incorporated) DT를 포함하는 G3는 유전자 어레이에 의해 세포 대조군과 비교하였다. 간단히 말하면, 정상적인 인간 단핵 세포는 G3의 10 ㎍/ml, DT의 100 ㎍/ml, 6 시간 동안 동일한 농도를 갖는 동일한 입자의 이러한 2 개의 조합에 노출된 후, RNA는 제조업자 매뉴얼(퀴아젠 알엔이지 미니키트, QIAGEN RNeasy Minikit)에 따라 분리하였다. RNA 발현 분석은 역전사를 통해 표지(labeled) cDNA에 RNA 샘플을 변환하고 처리되지 않은 세포와 다양한 샘플로부터 정량적 데이터를 비교함으로써( Ambion WT Expression Kit ) "웁살라 어레이 플랫폼, 임상 화학 및 약리학, 웁살라 대학 병원 웁살라-스웨덴(Uppsala Array Platform, Clinical Chemistry and Pharmacology, Uppsala University Hospital Uppsala-Sweden)"에서 수행되었다.
티미딘 키나아제 ( TK ) 활성[ thymidine kinase ( TK ) activity ]
상기 TK 활성은 Biovica (웁살라, 스웨덴)에서 얻은 키트를 이용하여 조사하였다. 간략하게, 다양한 시점에서 KGI 또는 G3 제형에 노출시킨 후, 0.1 ~ 1 × 106 세포/ml의 농도에서 100 μl의 세포 현탁액을 에펜도르프 튜브로 옮기고, 10 분 동안 200 g으로 원심 분리시켰다. 상기 세포 펠릿(pellet)을 100 μl의 차가운 PBS에 재-현탁시키고 2 ~ 3 회 동결/해동시켰다. 5 분 동안 최대 속도로 원심 분리한 후, 그 후에 상기 세포를 수집하였다. 상기 세포간(inter-cellular) TK 활성은 제조업자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
비타민 D3 의 검출( Detection of Vitamin D3 )
G3 입자에 혼입된 콜레칼시페롤(cholecalciferol, 비타민 D3)을 포함하는 샘플은 대학 병원 연구소에서 리아종(Liaison) 자동 기기로 분석하였다. 상기 분석(DiaSorin Liaison)은 25 HO-D3를 측정하도록 설계되었지만, 이것은 비-수산화된(non-hydroxylated) 비타민 D3와 약 1퍼센트의 교차 반응성(cross-reactivity)을 가진다.
인플루엔자 바이러스 균주와 백신( Influenza virus strains and vaccine )
상기 인간 인플루엔자 바이러스 A/California/07/2009(H1N1), 비-보조제(adjuvanted) 백신으로서 A Perth/16/2009(H3N2) 및 B/Brisbane/60/2008(B)는 상기 백신의 제조, 혈청학적 검사(serological tests) 및 림프구의 재-자극(re-stimulation)에서 항원으로서 사용되었다. 상기 바이러스는 VERO 세포 상에 배양되었으며, 데옥시콜레이트(deoxycolate)와 분리시켰다. 이것은 상기 제조업체에 의해 친절하게 제공되었다. 수거(harvest) 후, 상기 바이러스는 정제, 불활성화(inactivated), 분리시키고(split), 30 μg 단백질/㎖의 농도에서 재-현탁(re-suspended)되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 용량은 1 μg 바이러스 항원 및 다양한 양의 보조제를 함유했다.
백신 접종( Vaccination )
스톡홀름, 카롤린스카 연구소(Karolinska Institute), 대학 병원, 동물 시설(animal facility)에서 호스팅된(hosted) C56Bl6 마우스는 목에 2 회 피하(subcutaneously) 예방 접종을 했다. 자세한 내용에 대하여, 실시예 12 참조.
혈구응집반응 시험[ Haemagglutination ( HA ) test ]
구연산 용액에 수집된 닭 적혈구(erythrocytes, RBCs)는 0.01 M 포스페이트 완충 식염수 (PBS) pH 7.2를 이용하여 3 회 세정하고, 0.05% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin, BSA)을 함유하는 PBS 중 0.5%의 농도로 재-현탁(re-suspended)하였다. 상기 HA 시험은 4℃에서 1 시간 동안 U-형 마이크로 플레이트에서 수행하였다.
혈구응집억제반응 시험[ Haemagglutination inhibition ( HI ) test ]
혈청 샘플은 1 시간(h) 동안 닭 적혈구의 30% 현탁액(suspension)과 함께 실온 (RT °)에서 배양하였다. 흡수(absorption) 후, 상기 혼합물은 10 분 동안 500 xg 에서 원심 분리하였고, 상기 상등액(supernatants)은 수집되었다. 상기 최종 혈청 희석은 1 : 5 였다. 상기 HI 시험은 V-형 마이크로플레이트 및 16 HA-유니트 /50 ㎕를 이용하여 수행하였다. 혈청 샘플 25 ㎕는 PBS-BSA의 동일한 양을 이용하여 2 배 희석하였다. 상기 희석된 혈청은 상기 혼합물이 1 시간 동안 4℃에서 배양된 후 바이러스 현탁액 25 ㎕와 함께 실온(RT°)에서 1 시간 동안 배양하였다. 혈구응집반응(haemagglutination)을 100% 저해하는 가장 높은 혈청 희석은 상기 샘플에 대해 항체 타이터(titer)로서 간주되었다.
림프구의 제조( Preparation of Lymphocytes )
상기 비장(spleen)-림프구(비장세포)는 가능한 한 무균(aseptically)으로 수득하였다. 면역 및 비-면역 마우스는 3 주후 백신의 재접종(revaccination)에서 출혈과 자궁 전위(cervical dislocation)에 의해 희생되었다. 비장을 제거하고 그 후 조심스럽게 괴롭히고(teased), 멸균 스테인레스 스틸 메쉬(mesh)를 통과하고, 피펫을 이용하여 트리신(Tricine)을 포함하는 EMEM으로 플러싱(flush)하였다. 상기 세포는 500 xg에서 원심 분리 수단과 Tricine을 포함하는 EMEM으로 2 회 세척하였다. 그리고 나서, 상기 펠릿(pellets)은 1% 소 태아 혈청(FCS), 10 μg 겐타마이신(gentamicin)/㎖, 2 mMl L-글루타민, 3.81 g 헤페스(Hepes)/L 및 5×10-5 M β-머캅토에탄올(배지)이 보충된 F-DMEM 배지에 재현탁되었다. 상기 세포 생존력(viability)은 트리판 블루 염색 배제 시험(Trypan blue dye exclusion test)으로 측정하였다.
효소-결합 면역스팟 분석법[ Enzyme - linked immunespot assay ( ELISPOT )]
상기 사이토카인을 분비하는 비장세포(splencytes)의 열거(enumeration)는 INF-γ, IL-2, 또는 IL-4를 위한 상업용 ELISPOT-키트를 이용하여 수행하였다. 상기 키트는 스웨덴, 스톡홀름(Stockholm)의 맵테크(Mabtech)로부터 구매하였다. 상기 ELISPOT 플레이트는 맵테크(Mabtech)에 의해 권장하는 하기 지침에 따라 사용하였다.
각 사이토카인의 경우, 100 ㎕ 배지 당 2 x 105 농도로 비장세포를 8 개의 상이한 웰로 피펫팅(pipette)하였다. 4 개의 복제(replicates)된 웰은 인플루엔자 바이러스 항원의 4.5 μg의 적혈구응집소(haemagglutinin)를 함유하는 50 μl의 배지를 받았다(received). 상기 나머지 4 개의 웰은 배지의 100 μl 만을 받았다. 플레이트는 세포가 폐기되고 상기 웰은 세척한 후, 18 시간 동안 가습 상자(humidified boxes)에서 37℃에서 배양하였다. 반점(spots)은 맵테크(Mabtech)에 의해 설명하는 하기 절차에 따라 전개되었다. 요약하면, 플레이트는 100 μl 비오틴이 부착된(biotinylated) 단일 클론 항체 (MoAb) 항 IFN-γ, IL-2, 또는 IL-4 를 이용하여 실온(RT°)에서 2 시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 상기 플레이트는 주의깊게 세척시키고, 이후 HRPO 복합 스트렙타비딘(Strepavidin)과 실온(RT°)에서 1 시간 동안 배양하였다. 다른 세척 주기 후, 상기 플레이트는 약 15 분 동안 실온(RT°)에서 또는 뚜렷한 반점(spot)이 나타날 때까지 기질(substrate)과 함께 배양하였다. 수돗물로 플레이트를 세척한 것은 상기 반응을 중단했다. 최종적으로, 상기 플레이트는 건조시켰고, 이후 반점의 수는 ELISPOT 카운터를 이용하여 계수하였다.
데이터 분석 및 통계( Data analysis and statistics )
투여량-반응 데이터는 계산된 SI 값 및 소프트웨어 프로그램 GraphPadPrism4 (그래프 패드 소프트웨어 주식회사, 샌디에고, 캘리포니아, 미국)를 이용하여 분석되었다. 데이터는 평균값 ± SE 로서 나타낸다. 여러 가지 방법들 사이의 통계적 추론은 그룹 평균(means)의 Tukey의 다중 비교 후 시험(Tukey's multiple comparison post test)을 포함하는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 의해 및 GraphPadPrism(그래프패드프리즘)의 학생의 T-검정에 의해 두 방법의 비교를 위해 수행되었다.
------------------------- 파트 I. 제형 및 특징--------------------------
실시예 1
본 실시예에 있어서, 상기 G3 나노입자의 제형이 설명된다. 실험 셋업(experimental set up) 단계 2에서, A와 B, (하기 참조) 콜레스테롤 대 퀼라자(Quillaja) 사포닌의 QHC 분획(스웨덴, 웁살라, ISCONOVA AB로부터, WO2008/063129 참조)의 비율의 영향이 탐구되었다. C에서 인지질의 첨가 효과는 입자 제형에 관하여 탐구된다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
단계 1에서
인공 콜레스테롤막은 세제 또는 유기 용매의 가용화(solubilisation)를 필요로 하여 생성된다. 본 실험에서 본 발명자들은 콜레스테롤(C8667, 시그마-알드리치 스웨덴 AB, 스톡홀름, 스웨덴)에 대한 용매로서 클로로포름(288306, 시그마-알드리치 스웨덴 AB, 스톡홀름, 스웨덴)을 사용해서, 100 ㎎/㎖의 원액(stock solution)을 생성하였다. 에펜도르프 튜브에서, 50 ㎕의 클로로포름으로 희석된 원액으로부터 2 ㎕의 콜레스테롤이 첨가되었고, 이어서 ½ ml의 물은 상기 콜레스테롤 용액의 상부에 적층시켰다(layered). 상기 클로로포름은 바늘을 갖는 주사기로 만든 공기의 스트림(stream)에 의해 증발시켰다. 콜레스테롤의 보이는 층(layer)은 상기 튜브의 벽에 보였다.
단계 2에서
상기 ½ ml의 물은 신선한 1 ㎖의 물에 의해 대체되었고 상기 10 ㎕의 QHC 원액 (물 중 100 ㎎/㎖)은 상기 물에 첨가되었고, 이어서 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 막은 상기 벽으로부터 사라졌고 맑은 수용액이 보여진다.
Figure pct00014
A. 2 ㎕의 콜레스테롤 원액 및 단계 1에 기재된 바와 같이 처리하고 단계 2에서 상기 10 ㎕의 QHC는 본 G3 제형을 생성시키는 데 사용되었으며, 이것은 1:1의 몰비였다.
Figure pct00015
B. 또한, 다른 몰비는, 즉, 2 몰의 콜레스테롤 대 1 몰의 QHC가 사용되었다. 그 외에는, 상기 실험은 A에 대해 동일했다.
Figure pct00016
C. 1 몰 콜레스테롤 및 1 몰 포스파티딜콜린(P-5763은 스웨덴, 스톡홀름, 스웨덴 AB, 시그마-알드리치로부터 임)의 A 비율을 단계 1의 막을 형성하기 위해 사용하였다. 단계 2에서, 2 몰의 QHC를 사용하였다.
결과( Results )
A. 증발 후, 균일한 크기를 갖는 17 nm 입자가 도 1a에서 보여지는 전자 현미경과 구배 원심 분리에 의하여 특정되어 얻어졌다. 상기 G3 현탁액은 맑은 용액으로 보여진다.
B. 증발 후, 약간 넓은 크기 범위의 입자가 약 17 nm(미도시)의 중간 직경으로 EM에서 관찰되었으며, 즉, 17 nm의 입자는 또한 2 몰의 콜레스테롤과 1 몰의 퀼리자(Quillaja) 사포닌 범위 내에서 만들어졌다.
C. 상기 생성물은 약 40 ㎚의 직경을 갖는 이스콤(ISCOM) 입자(도 1b)의 직경과 같은 형태(morphology)를 가졌다. 따라서, 상기 형태(morphology)는 상기 포스파이딜콜린(phophatidylecholine)없이 상기 G3 발명에 따른 나노입자의 형태로부터 포스파티딜콜린(phophatidylecholine)의 추가(inclusion)와 완전히 상이하다. 또한, 본 발명에 따른 나노입자가 Lovgren & Morein1에 의해 청구된 이스콤(ISCOM) 제형에 대해 필수적인 포스파이딜콜린(phosphatidylecholine)을 포함하는 인지질의 통합을 위한 우수한 근거라고 결론지을 수 있다.
결론 및 검토( Conclusion and discussion )
1 콜레스테롤 대 1 퀼라자(Quillaja)의 몰비를 이용하여, 작은 (17 nm) 나노입자가 형성된다. 상기 콜레스테롤의 더 높은 비율, 즉, 2 콜레스테롤 대 1 퀼라자(Quillaja) 이상의 몰비일수록, 입자는 더 크게 나타난다. 주의할 것은, 단계 1에서 다른 친유성 성분의 추가(inclusion)에 의해, 상기 입자의 크기가 달라질 것이며, 즉, 상기 입자의 로딩(loading)은 상기 크기에 영향을 미친다. 이러한 경우, 상기 크기의 범위는 17 내지 40 nm 사이에 기록되지만 상기 범위를 제한하는 것은 아니다. 특히 중요한 것은 EM에서 입자의 응집(aggregation)이 없는 것은 상기 입자가 서로 잘 분산되었음을 보였다는 것이다.
친유성 물질의 수용성이게 하는 필수적인 신규 개념은 이러한 두 단계 절차이다. 지질막, 예를 들어, 고체 소수성 지지체(support)를 갖지 않으나, 수상에서 유리(free) 현탁액인 리포좀을 형성하는 여러 가지 방법이 있다. 두 번째 단계는 우선 수용성 G3 입자를 통해 수상으로 상기 막을 추출한다.
주의할 것은, 본 발명에 따른 나노 입자를 형성하기 위한 절차는 견고하고 현재 사용되는 방법, 예를 들어, 이스콤(ISCOM) 제형을 만들기 위한 방법보다 훨씬 더 간단하다(Lovgren & Morein, 상기 참조). 특히, 사용된 증발로써, 입자 제형을 위해 사용된 물질, 즉, 상기 언급된 경우 퀼라자(Quillaja) 사포닌, QHC 또는 콜레스테롤의 손실이 거의 없고, 인지질이 필요치 않으며, 추가로 생산 비용이 절감된다는 것이다. 흥미롭게도, 본 발명에 따른 나노입자는 ISCOMs을 형성하기 위한 기초로서 사용될 수 있다.
세제가 가용화를 위해 사용되는 경우, 상기 세제의 제거는 Lovgren & Morein2 에 의해 기재된 바와 같이, 예를 들어, 투석(dialyses), 컬럼 크로마토그래피, 초원심분리법 또는 접선유동(tangential flow)에 의해 수행되어야 한다. 이것은 소수성 표면을 갖는 비드[예 : 라텍스 비드(latex beads)]를 사용하는 것이 더 실용적일 수 있다. 따라서, 상기 2 단계의 절차는 나노 입자를 제형화하는 것에 대한 혁신적인 강력한 방법이며, 이것은 부하(load)에 따라 형태가 다를 수 있다.
또한, 단계 1에서 막(membrane)을 만드는 이러한 방법은 단계 2에서 수용성 G3 입자로 친유성 분자를 혼입하기 위한 일반적인 방법이다.
실시예 2
본 실시예는 양친매성 특성을 가진 분자가 실시예 1에 기재된 바와 같은 기술에 따른 상기 G3 입자에 혼입될 수 있음을 보여준다. 주의할 것은, G3는 미셀이 주입 부위(site)에서 희석때문에 투여 후 그리고 그 뒤에 상기 부위로부터 수송(transportation) 후에 분해됨으로써 물에 자연스럽게 용해된다. 그러므로, 낮은 약한 생체이용율(bioavailability)을 가진다. 따라서 G3의 안정한 착물은 중요하다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
상기 실험 셋-업은 실시예 1에서 기재한 바와 같이 소수성 분자 디테르페노이드(DT)가 콜레스테롤과 동시에 또한 용해되었다는 것을 제외하고, 실시예 1과 본질적으로 동일하다. 실시예 1에 있는 즉, 1 μl DT(원액으로 99% 에탄올 중 100 ㎍/㎖)로서 두 단계 절차를 이용하여 G3 입자에 혼입되었던 Quil A 분획 C(QHC) 및 콜레스테롤과 상기 DT 분자는 실시예 1의 단계 1에 기재된 1 콜레스테롤 : 0.5 DT의 몰 비율로 용해되었다. 단계 2에서, QHC는 실시예 1 에서 콜레스테롤과 1 대 1의 몰 비율로 첨가하였다.
결과( Results )
상기 혼입된 DT를 갖는 G3 입자는 도 1a에서 도시된 DT 없는 상기 G3 입자와 같은 동일한 형태를 가지고 있다. 단계 1에서, 막은 단계 2에서 사라진 상기 튜브의 벽에 가시화 되었다. 단계 2로부터 수용액은 약간 오팔색 (opalescent)으로 맑고 침전이 검출되지 않았다.
결론( Conclusion )
상기 미셀 형태의 양친매성 분자 디테르페노이드(DT)는 사용된 용매에 의해 성공적으로 분해하고 단계 2에서 본 발명에 따른 상기 나노입자에 통합되며, 이것은 17 ㎚의 전형적인 G3 나노입자를 야기했다. 따라서, 양친매성 분자 담체를 위한 담체/전달 시스템으로서 본 발명에 따른 상기 G3 나노입자를 사용하는 능력(capacity)을 나타낸다. 필요한 구조(configuration) 형태 미셀을 갖는 양친매성 분자는 개인에게 투여 후 대부분 불안정하여 종종 낮은 생체이용율(bioavailability)을 야기한다. 실시예 4에서는, 본 G3-DT 입자가 생물제제 활성이 있음을 나타낸다. 추가 연구가 면역 향상 능력 및 전달 입자로서 본 발명에 따른 상기 나노입자의 유용성, 및 세포와의 상호작용에 의한, 예를 들어, 상기 세포 막의 수용체를 통하여 생물학적 효과를 향상시키는 것에 대해 추가 입증하기 위해 파리 조약 우선년도(priority year) 중에 수행될 것이다. 보다 자세한 정보를 위해 참조문헌으로서 본원에 포함되는 Hu et al.3을 참조. 면역 향상 및 암세포 사멸 효과를 포함하는 상보적 특성을 가진 다른 분자의 혼입(incorporation)을 통하여 잠재적이고 실질적으로 확대될 것이다.
실시예 3
암세포를 사멸시키는 G3의 능력은 림포구 종양 세포를 나타내는 U937 모델에 대한 생체외(in vitro) 검사하였다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
G3 입자는 물질 및 방법에서 기재된 바와 같이 콜레스테롤과 QHC 사이에 다양한 중량 또는 몰비를 이용하여 제형화되었다. 상기 다양한 제형은 배양되었고, 상기 암 세포 사멸 효과는 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 FMCA 방법에 의해 염색(staining)후에 측정되어 해독(reading)되었다.
결과( Results )
G3 입자는 중량에 따라 1 콜레스테롤 대 5 QHC의 비율, 즉, 실시예 1에 기재된 바와 같이 몰농도에 따라 1 콜레스테롤 대 1 QHC로 형성되고, 상기 EM 결과에 따른 형태(morphology)로부터 결론 지었다(실시예 1 및 도 1a 참조). 상기 G3 입자의 U937 암세포 사멸 효과는 KGI 입자에 대해 말하자면 동일한 크기였고(도 2), 이것은 상기 G3 제형에 혼입될 때 활성 성분 QHC가 유지되었음을 나타낸다. KGI는 U937 암세포(PCT/SE 2007/050878)를 사멸시키는 것으로 종래 공지되어 있다.
실시예 4
본 실시예는 상기 양친매성 분자 DT가 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 기술에 따른 상기 G3 입자로 혼입될 수 있다는 것을 보여준다.
DT는 디테르펜(diterpen), 스테비아 리바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana bertoni) 10 로부터 생산되는 스테비오사이드(stevioside)이다. 본 발명자들은 공개된 바와 같이 면역 특성을 포함하는 다수의 흥미로운 의학 특성을 가지기 때문에 DT를 사용해 왔다. 본 화합물이 갖는 한가지 문제는 본 발명자들이, 예를 들어, 나노입자의 전달 시스템을 필요로 하는 것을 경험했던 것처럼 생체내(in vivo) 낮은 생체이용율(bioavailability)을 가진다는 것이다.
IL-8을 생산하기 위해 암세포 U937을 유도하는 상기 DC의 능력은 면역학적 효과가 연구되었으나, 더욱 중요하게 DC가 상기 조절되지 않는 암세포 증식을 중단하는 것에 중요한 암의 분화를 이끌 수 있음을 사이토킨으로 입증하기 위해 수행되었다. 또한, IL-12를 포함하는 인간 DC 사이토카인을 유도하기 위해 DT의 능력(capacity)을 시험하였다. 이러한 시험은 DT가 Quil A에 중요한 상보적 면역 효과를 가지고 있음에 따라, 상기 G3 입자에 혼입되기에 유용하다는 것을 강조하기 위해 수행하였다. DT는 칠레, 산티아고, Prodalysa LTDA에 의하여 공급되었다. 본원에서 본 발명자들은 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 제조된 인간 수지상 세포(DC)를 사용했다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
상기 U937 세포는 100 ㎍/ml부터 시작하는 KGI 또는 G3 제형과 함께 배양되고 이어서 37℃에서 48 시간 동안 6 단계로 5 배 희석하였다. 그리고 나서, 상기 상등액상등액tant)은 수집되어 물질 및 방법에 기재된 바와 같이 IL-8 검출에 사용되었다.
상기 유전자 발현의 측정을 위해, 인간 DCs는 BBE, KGI, 스테비아(Stevia) 및 BBE 또는 KGI와 조합하는 스테비아(Stevia) (도 4a)뿐만 아니라, 혼입된 스테비아를 포함하거나 또는 포함하지 않는 G3(도 4b)와 6 시간 동안 배양되었다. 상기 처리된 수지상 세포(DCs)로부터 여러 가지 사이토카인 유전자의 발현은 물질 및 방법에서 기재된 바와 같이 mRNA의 어레이 분석에 의해 수행하였다.
결과( Results )
G3 입자는 암세포의 분화(differentiation) 마커이고 KGI에 의해 유도되어 생산되는 IL-8의 유사한 수준을 생성하기 위해 U937 암세포를 유도했다(도 3).
도 4a는 DT가 IL-12, IL1β 및 IL-6의 높은 수준을 유도했으며, 제형 KGI 및 BBE 같은 이스콤(ISCOM)에 의하여 유도된 이들보다 더 높은 것임을 나타낸다.
상기 DT 혼입된 G3 입자는 IL-12의 높은 수준을 유도한 반면, 상기 DT 혼입 없는 G3 제형은 IL-12의 검출할 수 있는 수준을 유도하지 않았다(도 4b).
검토 및 결론( Discussion and conclusion )
DT는 G3에 상보적 특성을 갖고 있다. IL-8을 생산하기 위해 U937 암세포를 유도하는 능력은 면역 향상을 나타낼 수 있다. 더 중요한 것은, G3 독립형(standalone)은 분화시킬 수 있고, 본 발명자들이 보여주었던(보충할 작업 중인 원고) KGI 처럼 암세포가 증식을 중단하도록 이끌 수 있다. G3 단독에 대한 상보적 효과는, DT 가 유력하게, 특히 특정 종양에 대한 항암 효과를 가지는 IFN-의 생산에 반응하는 Th1 타입의 유도에 중요한 IL-12를 유도하는 것을 보여준다. 면역학적 관점에서, 면역 시스템에 알려진 종양 항원이 있는 경우 IL-12는 종양의 제거에 중요하다. 또한, IL-12는 바이러스 감염에 대한 면역 방어에 중요하다. 이것은 DT가 담체/전달 입자로서 기여하는 G3에 혼입되며, 이것은 투여 후 입자 형태의 안정성을 증가시키고 결과적으로 G3의 생체 이용률(bioavailability)을 증가시킨다고 기록된 것이 특히 흥미롭다. 주의할 것은, DT 독립형(standalone)는 물 중 미셀 형태이다. 투여 부위(site)에서 희석되고 이어서 상기 부위로부터 이송될 때 감소하기 때문에 개인의 몸에 투여된 미셀 형성은 분해된다(disintegrate). 상기 G3 입자는 다른 힘에 의해 함께 유지되고, 예를 들어, 주입 후 분해되지 않으며, EM 연구에 의해 기록되었다(비공개). 본 실시예에서는 상기 G3 발명이 양친매성 분자를 위한 담체로서 기여한다는 점을 강조한다.
실시예 5
G3 입자에 의한 티미딘키나제(TK) 활성의 억제는 암 세포의 제어되지 않는 복제를 방지하고, 후속 단계가 프로그래밍된(programmed) 세포 죽음, 즉, 세포 사멸(apoptosis)에 대해 상기 세포를 조종하는 본질적 특성이다.
상기 암 세포 복제를 억제하는 G3 입자의 하나의 메커니즘을 연구하는 것은 U937 세포에 대해 TK 효소의 억제를 측정함으로써 평가하였다. 암 세포 복제의 억제를 나타내는 TK 효소 활성의 억제를 사용하는 것외에, 이 동작(action) 모드는 G3 입자 또는 항암 치료를 위해 사용되는 임의의 다른 퀼라자(quillaja) 제형이 종양 환자를 치료하는 데 독립형(stand alone) 또는 다른 항암 제형과 조합하여 유용한 지 여부를 평가하는데 사용될 것이다. 이러한 시험은 맞춤 의학(personalized medicine)으로서 정의된 분야에서 임상 샘플에 대한 TK 동작 모드의 억제를 이용함으로써 항암제의 감도를 측정하기 위하여 키트에 사용할 수 있다.
실험 배치( Experimental lay - out )
U937 세포는 G3 또는 KGI의 동일한 양에 노출되었다. 다양한 시점에서, 상기 처리된 세포가 수집되고, 물질 및 방법에서 기재된 바와 같이 세포간(inter-cellular) TK 활성이 측정되었다.
결과( Results )
G3 입자는 KGI에 의한 것처럼 (도 5) 세포간(inter-cellular) TK 활성의 거의 같은 크기로 억제한다.
결론( Conclusion )
상기 TK 활성의 억제는 상기 암 세포가 복제하는 것을 중단시키는 것을 보여준다. 그러므로, 상기 세포 수준에서 TK 활성의 억제는, 환자 샘플에서 약물, 즉, 상기 G3 입자까지 항암 세포의 감도를 측정하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 맞춤 의학에 길을 만들어 냈다. 본 발명자들이 아는 바로는, TK 활성은 암 환자 또는 환자의 다른 질환의 징후에서 혈청 TK의 검출을 위한 비-특이적 시험으로서 사용되었다: 환자의 암 세포에 직접 사용하는 것이 본 발명자들의 혁신이다(100 % 특이성, 즉, 암 세포만 사용됨). 암 세포 사멸 특성을 갖는 이것은 비응답(non-responding) 환자에 대해 이의 사용을 피함으로써 G3 입자가 임상적 용도를 위해 더 실현 가능하게 한다.
------------------- 파트 II . 항암제로서 G3 -----------------------
실시예 6
본 실시예는 G3 및 DT를 포함하는 G3(G3-DT)가 비-입자 형태의 G3에서 상기 활성 성분 QHC(QHC)보다 더 효율적으로 비-고형 종양 인간 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia, AML) 세포를 사멸시키는 것을 보여준다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 기재된 바와 같이 제형화된 상기 나노입자 G3 및 G3DT는 암세포 사멸 효과를 위한 활성 성분 QHC 형태와 비교하였다. 상기 샘플은 100 ug/㎖에서 시작하여 6 단계로 5 배 계열 희석되었고, HL-60 AML 세포를 3 일 동안 배양시켰다. 그리고 나서, 상기 세포는 상기 FMCA 방법에 의해 염색되어 분석되었다(read).
결과( Result )
G3 (IC50=3.144 ug/ml) 및 G3-DT (IC50=3.12 ug/ml)는 QHC(IC50=8.473 ug/ml) 보다 좀 더 효율적으로 상기 AML 세포의 성장을 억제하였다(도 6).
결론 및 검토( Conclusions and discussions )
본질적으로, G3은 비-입자 QHC에 비해 강한 암세포 사멸 효과를 가진다. G3-DT를 형성하는 상기 G3 입자에 DT를 혼입하면 DT 없는 QHC 또는 G3에 비해 암세포 사멸 효과를 향상시킨다. DT 단독은 암세포 사멸 효과를 가지지 않는다(미도시). 상기 비-입자 QHC는 상기 입자(particulate) 형태에 의해 폐기되는 국소 반응(local reaction)이 발생한다. 또한, 상기 AML 암세포를 사멸시키는 데 G3-DT의 추가 효과는 유리한 용량 감소를 보여줄 것이다.
실시예 ( Example 7)
시타라빈(cytarabine)은 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료에 사용되는 상업적으로 이용가능한 세포 증식 억제 약물(cytostatic drug)이다. 본 실시예는 시타라빈(cytarabine)의 암세포 사멸 효과를 향상시키기 위해 G3의 능력(capacity)을 연구하도록 설정되었다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
도 7에 보여지는 바와 같이 HL-60 AML 세포는 G3와 시타라빈(cytarabine) 따로따로 및 이들 2 개의 조합으로 미리 정해진 농도에서 3 일 동안 노출시켰다. 그리고 나서, 상기 세포는 암 세포 사멸 효과를 위해 상기 FMCA 방법으로 염색되어 분석되었다.
결과( Result )
3 일간 배양 후, G3 또는 시타라빈의 단독처리는 상기 세포를 각각 5% 및 55% 미만으로 사멸시켰다. 이들이 조합되었을 때, 사멸 속도(killing rate)는 약 75%로 현저하게(P <0.01) 상승했다(도 7).
결론 및 검토( Conclusions and discussions )
상기 G3 입자는 HL-60 AML 세포에 대해 시타라빈(cytarabine)의 사멸 효과를 현저하게 향상시켰다. 세포 증식 억제 약물(cytostatic drug) 시타라빈을 이용한 치료는 환자의 불편함과 부작용을 일으킨다. G3 입자가 거의 비-독성(non-toxic)이기 때문에, G3 및 시타라빈을 이용한 병용 치료(combination treatment)는 또한 증가된 효능에 대한 전망을 가지고 시타라빈의 투여량을 낮춤으로써 부작용을 감소시킬 것이다.
실시예 8
본 실시예는 G3가 비-고형 종양 인간의 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포에 대해 상업용 세포 증식 억제 항암제 다우노루비신(daunorubicin)의 추가된 항암 세포 사멸 효과를 가짐을 입증한다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
HL-60 AML 세포는 1,000 nM로 시작하여 증가하는 농도의 다우노루비신(daunorubicin)과 조합하는 G3의 고정된 농도(1 uM)에 노출되었고, 3 일 동안 배양되었다. 그리고 나서, 상기 세포는 상기 FMCA 방법에 의해 염색되어 분석하였다.
결과( Result )
G3는 다우노루비신(daunorubicin) 독립형(stand alone)에 비해 다우노루비신의 암세포 사멸 효과를 현저하게 (P <0.0001) 향상시킨다(도 8).
결론 및 검토( Conclusions and discussions )
상기 G3 입자는 HL-60 AML 세포에 대한 다우노루비신(daunorubicin)의 사멸 효과를 상승적으로 향상시킨다. G3 입자가 거의 비-독성이기 때문에, 그것은 세포 증식 억제 약물 다우노루비신의 복용량은 더 나은 치료 효과를 보여주는 G3를 이용하는 병용 요법으로 현저하게 감소될 것 같으며, 저하된 부작용 때문에 상기 치료는 다우노루비신에 민감한 환자에게 장기간 동안 계속될 수 있다.
실시예 9
본 실시예는 G3 및 인간 전립선 암세포 PC-3에 의해 예시화된 고형 종양에 혼입된 DT 를 포함하는 G3(G3DT)와의 효과를 비교하기 위해 고안되었다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
G3 및 G3DT는 비-입자 QHC와 비교하였다. 상기 샘플은 100 ug/㎖에서 시작하여 6 단계로 5 배 계열 희석되었고, PC-3 전립선 암 세포를 3 일 동안 배양시켰다. 그리고 나서, 상기 세포는 상기 FMCA 방법에 의해 염색되어 분석되었다.
결과( Result )
상기 G3 입자(IC50= 2.75 ug/㎖) 및 상기 혼입된 G3-DT(IC50 = 1.662 ug/㎖)는 동일한 활성 성분 QHC 단독(alone) (IC50 = 3.388 ug/㎖)보다 좀 더 강력하게 상기 전립선 암 세포의 성장을 억제하였다(도 9).
결론 및 검토( Conclusions and discussions )
본질적으로, 본 실시예의 G3은 QHC의 효과와 같이 상기 PC-3 전립선 암 세포에 대한 유사한 사멸 효과를 가졌다. 상기 입자로 DT의 혼합, 즉, G3-DT에 의해, 상기 G3의 암 세포 사멸 효과가 AML 세포와 같이 향상된다. DT 단독은 암 세포 사멸 효과가 없는 것으로 알려져 있다. PC-3 암 세포가 사멸하는 것에 있어서 본원에서 추가된 효과는 상기 G3 효과의 향상 및 또한 만약 있다면 부작용의 감소를 보여준다. 주의할 것은, 상기 비-입자 형태의 QHC는 생체외(in vitro)에서 비교적 효율적이지만 생체내(in vivo)에서 주입 부위에 남아 있는 QHC는 낮은 생체이용률 및 국소 부작용을 야기한다.
실시예 10
본 실시예는 PC-3 전립선 암 세포에 의해 예시화된 고형 종양에 G3 및 상업용 약물 도세탁셀(docetaxel) 사이의 조합 효과를 입증한다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
PC-3 세포는 G3 및 도세탁셀(docetaxel)을 별도로 및 그래프에서 보여지는 바와 같이 조합하여 미리 정해진 농도에서 3 일 동안 노출시켰다. 그리고 나서, 상기 FMCA 방법에 의해 염색시켜 분석하였다.
결과( Result )
상기 G3 또는 도세탁셀(docetaxel) 단독의 암 세포 사멸 효과는 각각 35% 및 2% 이상 세포를 약간 사멸시켰다. 이러한 두 가지 약물이 조합되었을 때, 상기 사멸 속도는 약 75%로 현저하게 상승했다(P <0.01) (도 10).
결론 및 검토( Conclusions and discussions )
상기 G3 입자는 G3 입자가 거의 비-독성이라는 사실의 관점을 고려하여 증가된 효능 및 감소된 부작용을 가진 세포 증식 억제 약물의 감소된 투여량과 관련하여 보면 전립선 PC-3 암세포에 대한 세포 증식 억제 도세탁셀(docetaxel)의 암세포 사멸 효과를 현저하게 향상시킨다.
실시예 11
본 실시예는 G3 및 고형 종양 인간의 전립선 암 PC-3 세포에 대해 세포 증식 억제 상업용 약물 카바지탁셀(cabazitaxel)을 포함하는 최근의 하기 특허 사이의 조합 효과를 연구하기 위해 고안되었다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
PC-3 전립선 암 세포는 100 uM부터 시작하여 증가하는 농도의 카바지탁셀(cabazitaxel)과 조합된 G3의 고정된 농도(1 uM)에 노출되었고, 3 일 동안 배양되었다. 그리고 나서, 상기 세포는 상기 FMCA 방법에 의해 염색되어 분석되었다.
결과( Result )
카바지탁셀(cabazitaxel) 단독은 IC50=25.54 uM에서 PC-3 암세포를 사멸시켰다. G3와 조합된 카바지탁셀(cabazitaxel)의 암 세포 사멸 효과(IC50 =0.00023 uM)는 현저하게 향상시켰다(P <0001) (도 11).
결론 및 검토( Conclusions and discussions )
상기 G3 입자는 더 나은 효능, 감소된 부작용 및 G3 입자가 거의 비-독성이라는 사실의 관점에서 장기간 치료 가능성에 대한 전망과 관련하여 보면 PC-3 전립선 암 세포에 대한 카바지탁셀(cabazitaxel)의 사멸 효과를 현저하게 및 상승적으로 향상시킨다.
실시예 12
이 분획을 이용하여 제형화된 Duecom 입자가 분획 C(QHC)를 이용하여 제형화된 Duecom 입자 보다 더 강한 사멸 능력을 가지고 있음을 전에 관찰하였으므로, 본 실시예는 ACHN 신장 암 세포주와 본원에서 예시화된 고형 종양을 사멸시키는데 있어 다른 중요한 퀼라자(Quillaja) 사포닌 분획 QHA를 이용하여 제형화된 G3 입자의 능력을 연구하기 위해 고안되었다.
실험 배치( Experimental lay - out )
QHA 및 QHC를 이용하여 제형화된 G3는 100 ㎍/ml에서 0.032 ㎍/ml까지 6 단계로 5 배 희석시켜 3 일 동안 37℃에서 ACHN 신장 암(renal carcinoma) 세포와 배양시켰다. 상기 세포 생존(survival)은 상기 FMCA 법에 의해 측정하였다.
결과( Result )
QHA를 이용하여 제형화된 G3는 QHC를 이용하여 제형화된 G3 보다 더 ACHN 신장 암 세포를 현저하게(P <0.01) 사멸시킨다(도 12).
결론 및 검토( Conclusions and Discussions )
이러한 결과는 QHA를 이용하여 제형화된 Duecom 입자와의 종래 관찰과 거의 동일하고, QHC, 즉, QHC를 이용한 제형이 비-고형 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 반면에, QHA를 이용한 제형이 바람직하게 비-고형 종양보다 좀 더 고형을 사멸시킨다. G3 제형을 포함하는 이러한 종양 유형(type) 특이성 사멸 특성은 다른 카테고리에서 Duecom 입자가 정상 세포를 사멸시키는 것을 피하기 위해 고정될(harnessed) 수 있다.
--------------- 파트 III . 보조제( adjuvant )로서 G3 -----------------
실시예 13
전체 바이러스에 대한 보조제 (adjuvant)로서 G3 입자의 동물 시험
ISCOMs에 비해 G3의 보조제(adjuvant) 효과는 C57BL/6 마우스에 대한 동물 시험으로 평가되었다. 상기 분해된(disintegrated) 및 불활성화된(inactivated) 인플루엔자 바이러스는 실험에서 모델 항원으로서 사용되었다.
실험 배치( Experimental lay - out )
그룹 당 6 마리 마우스는 4 주 간격 2 회 예방 접종하였고, 혈액 샘플은 1차 접종 후 3 주에 취하고, 2차 접종 후 4 주에 취했다(다음 페이지의 그래픽 설명을 참조). 재료 및 방법에서 기재된 바와 같이, 부검에서, 즉, 상기 2차 접종 후 4 주에, 비장세포는 사이토카인 생산을 위해 분석되었다. 이해를 용이하게 하기 위하여, 상기 동물의 그룹핑(grouping)은 도 13a에 도시된다.
결과( Result )
1차 예방 접종 후 G3와 이스콤(ISCOM)은 용량 의존 방법으로 HI 항체의 검출 수준을 유도하였다. 2차 예방 접종 후, HI 항체의 수준은 G3 보조제(adjuvanted) 제형에 대한 용량 의존 방법으로 또한 현저하게 증가하였다[클리어 부스트 효과(clear boost effect)]. 상기 이스콤(ISCOM), G3 및 DT 혼입된 보조제 제형을 포함하는 G3는 비-보조제(adjuvanted) 상업용 백신보다 현저하게 높은 수준의 HI 항체를 유도했으며, 즉, 유사하거나 더 높은 수준의 HI 반응이 1차(도 13a) 및 2차(도 13b) 예방 접종 후 두 시점에서 G3 및 이스콤(ISCOM) 제형으로 예방 접종된 동물들 사이에 기록되었다.
2차 예방 접종 4 주후 부검에서 G3 및 이스콤(ISCOM) 제형으로 예방 접종된 동물 사이의 분할(split) 바이러스에 생체외(in vitro) 재-자극(re-stimulation)후에 IFN-γ및 IL-4 반응의 유사하거나 더 높은 수준이 비장세포에서 검출되었다(도 13c).
결론( Conclusion )
G3 및 이스콤(ISCOM) 제형에 의해 유도된 항체-매개성 및 세포-매개성 면역(immunities) 둘 다 질적으로 및 양적으로 동일한, 즉, G3 제형, 즉, G3 및 G3DT는 보조제 (adjuvant)로서 상기 이스콤(ISCOM)을 대체할 수 있다.
---------------파트 IV. 약물 전달 시스템으로서 G3 ----------------
실시예 14
VLX40은 암을 치료하기 위한 유망한 약물로 간주되었다. VLX40이 전임상 실험의 동물 투여에 적합하도록 제형화될 수 없고, 결과적으로 환자에게 후속 실험을 할 수 없기 때문에 시장 조사는 정지했다. 그 이유는 몸에 의해 흡수할 필요가 있는 VLX40가 물에 용해되게 할 수 없다는 것이었다. 본 실험은 상기 G3 기술이 상기 문제를 해결하고 VLX40를 수용성으로 만들 수 있는지를 확인하기 위해 고안되었다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
VLX40은 20 mM의 농도(5.8664 mg/ml, 권고된 가장 높은 농도)를 수득하기 위해 유기 용매 DMSO에 처음에 용해시키고 원액으로 지정되었다.
100 g/ml의 농도에서 VLX40는 물 중 VLX40에 대한 대조군, 즉, 거의 비-수용성 제형으로서 사용되었다.
상기 8.5 ul의 VLX40 원액은 인공 지질막을 형성하기 위해 500 ul 물을 함유하는 에펜도르프(Ependorf) 튜브에서 50 ul 클로로포름과 혼합되었다 (실시예 1 참조). 두 번째 단계에서는, 상기 10 ul Quil A (원액으로 물 중 100 mg/ml)가 첨가되어 37℃에서 하룻밤 배양되었다. 이것은 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방법으로 형성된 G3-VLX40 제형이다.
상기 VLX40-DMSO 대조군(2) 및 G3-VLX40 현탁액/용액(3)은 수집되어 상기와 같은 동일한 농도로부터 계열 희석된 후 U937-GTB 세포에 대해 시험하였고, IC50s은 회귀 곡선으로부터 계산되었다.
결과( Results )
물에 첨가된 상기 원액(1)은 가시적(visible) 침전물(sediment) 또는 석출물(precipitate), 즉, 종래 실험에서처럼 예상대로 생기게 되었다. 따라서, VLX40는 상기 대조군 튜브(2)에서 물에 용해될 수 없었다. 상기 G3-VLX40 입자의 제형(3)은 상기 투명 용액/현탁액의 전자 현미경에 의해 확인되었다. 상기 G3-VLX40 제형을 함유하는 튜브로부터 침전물이 없거나 또는 단지 정말 얼마 안 되는 침전물이 있었다.
상기 다양한 제형은 기능에 대한, 즉, U937 세포의 암세포 사멸 효과에 대한 생물 검정(bioassay)으로 검사를 했다(재료 및 방법 참조). 상기 VLX40/DMSO의 수상(water phase)(2)은 낮은 항암 효과를 가졌고(IC50으로서 표시), 이것은 VLX 40/DMSO 혼합물의 단지 매우 작은 분획이 물에 용해되는 것을 의미한다(도 14 A).
그에 반해서, 도 14a에 나타낸 바와 같이, 상기 G3 VLX-40 입자 제형(3)의 수상은 높은 항암 세포 활성을 가졌다.
또한 상기 침전된 비-수용성 부분은 암세포 사멸 효과에 대해 생체외(in vitro) 시험하였다. 높은 암세포 사멸 효과가 수-불용성 침전물에서 VLX 40/DMSO(2)와 기록되었고, G3-VLX40-제형의 얼마되지 않는(scanty) 수-불용성 침전물은 낮은 암세포 사멸 효과를 가졌다(도 14b).
이러한 실험들은 3 회 반복되었다.
결론 및 검토( Conclusion and Discussion )
약 50 ~ 100 마이크로그램 VLX40은 1 ml의 부피의 물 중 퀼라자(Quillaja) 성분으로서 측정된 2 mg G3과 용해되었다. 이것은 상기 G3 입자의 농도는 G3 입자의 농도, 예를 들어, 맑은 용액이 될 수 있는 상기 G3 제형의 10 mg/ml를 증가시킴으로써 증가될 수 있음을 주목해야 한다. 본 발명자들은 더 많은 양 VLX(40)의 혼입을 용이하게 하기 위하여 상기 G3 입자의 조성을 또한 변경할 수 있다. 본 실시예는 상기 약물이 종래 기술을 이용하여 물에 용해되도록 할 수 없기 때문에 상기 G3 기술없이 환자에 이를 수 없는 임상적 용도를 만족시키기 위해 상기 G3 입자가 약의 제형을 용이하게 하기 위한 미해결 요구를 채우는 방법임을 명백히 입증한다.
실시예 15
　본 실시예는 약물 전달 시스템으로서 G3 입자가 다른 2 개의 비-수용성 항암제 부설판(busulfan) 및 로스코비틴(roscovitine)을 용이하게 혼입할 수 있으며, 이것은 이들을 물에 용해되게 함을 입증한다.
실험 셋-업( Experimental set - up )
2 ㎕ 콜레스테롤(클로로포름 중 100 mg/ml)과 함께 2 ㎕ 부설판(busulfan) (DMSO 중 50 mg/ml) 또는 1 ? 로스코비틴(roscovitine) (클로로포름 중 100 mg/ml)은 각각 부설판(busulfan) 또는 로스코비틴(roscovitine)과 지질막을 형성하는데 사용되었으며 , 이것은 실시예 1의 단계 1에서 기재된 방법을 이용한 것이다. 그리고 나서, 10 ㎕ QHC (물 중 100 mg/ml)은 실시예 1의 단계 2의 경우처럼 첨가되어 QHC : 콜레스테롤 : 부설판/ 로스코비틴 = 1:1: 0.5의 몰비가 제공되었다.
　
결과( Result )
두 화합물, 즉, 부설판(busulfan) 및 로스코비틴(roscovitine)의 경우, 투명 용액이 가시화 되었으며, 즉, 불용성 약물에 기인하는 수상에서의 침전물 또는 탁도(cloudiness)가 상기 수용성 G3 입자로 이들을 혼입시킴으로써 제거되었다.
검토( Discussion )
실시예 13과 유사한 본 실시예는, 이들을 상기 G3 입자로 혼입시킴으로써 비-수용성 친유성 약물/분자를 수용성으로 만들기 위한 일반적인 플랫폼(platform)으로서 G3의 능력(capacity)을 다시 한 번 보여준다. 상기 항암제 후보 물질의 약 40%가 물에 용해되지 않으므로, 상업용 제품으로 발전할 수 없는 것을 고려하면, 본 발명자들의 발명은 크게 상황이 개선될 수 있다.
실시예 16
본 실시예에서, 본 발명자들은 친유성 비타민, 즉, 비타민 D3가 수용성이 되게 하기 위하여 상기 G3 나노입자로 통합될 수 있는지를 연구하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 이것은 클로로포름에 용해시키고, 상기 G3 입자에 혼입되었으며 추가 자세한 내용에 대해 재료 및 방법을 참조.
실험 셋-업( Experimental set - up )
G3 입자는 지질막을 형성하기 위하여 50% 콜레스테롤 및 50% 비타민 D3을 이용하여 형성되었다. Quil A는 상기 G3 입자를 생성하기 위하여 상기 수상에 첨가되었다(자세한 내용에 대해 실시예 1 참조). 물 중 100% 콜레스테롤과 100% 비타민 D3가 대조군으로 사용되었다. G3 입자에 혼입된 비타민 D3를 포함하는 샘플은 웁살라(Uppsala) 대학 병원 연구소에서 DiaSorin Liaison 자동 기기 상에서 분석되었다.
결과( Result )
단계 2에서 회수된 상기 수상(water phase)은 맑은 용액이었고, 침전은 검출되지 않았다. 많은 비타민 D3가 퀼라자(quillaja) QHC 분획 제형, 즉, 55 nmol/L에서 보다 비-분획 퀼라자(quillaja)를 기반으로 하는 G3-비타민 D3 제형(950 nmol/L)에서 검출되었다. 희석 실험에서, 비타민 D3의 농도는 도 1에서 보여지는 바와 같이, 입자의 균일한 현탁액, 즉, 다른 G3 입자와 일치되는 응집(aggregation)이 없다는 것을 보여주는 판독(read out)에서 직선형이었다. 비교하자면, 단지 미량의 비타민 D3가 비타민 D3 대조군에서 검출되었고 어느 비타민 D3도 콜레스테롤 대조군에 존재하지 않았다.
결론 및 검토( Conclusion and Discussion )
비타민 D3는 경구(oral) 또는 비경구(parenteral) 경로에 의해 상기 지질 형태로 몸에 저조하게(poorly) 흡수되는 필수 비타민이다. 따라서, 수용성 형태는 이들 경로에 의해 비타민의 흡수를 용이하게 할 것이다. 본 발명자들은 비타민 D3가 퀼라자(quillaja) 사포닌의 QHC 분획뿐만 아니라 비-분획을 포함하는 G3 나노입자로 혼입됨을 본 실험에서 보여준다. 중요한 것은, 상기 희석 실험의 직선형 판독(read out)은 일반적으로 G3 입자에 전자 현미경에 의해 밝혀졌던 입자의 균일한 분산(dispergation)을 보여준다(도 1 참조). 식품의 경우, 상기 비-분획 퀼라자(quillaja) 사포닌은 잘 수용하고, 예를 들어, 베어(bear)을 포함하는 음료 및 또한 음식의 다른 유형으로 사용된다. 따라서, 본 비타민의 전달을 위한 G3의 제형을 위한 보다 경제적 대안은 G3 제형에 대한 기초(base)로서 비-분획 퀼라자(quillaja)이다. 본 실험에서 더 많은 D3는 상기 QHC 사포닌 분획을 포함하는 G3 입자에 비해 비-분획 퀼라자(quillaja) 사포닌을 포함하는 G3에 혼입되었다.
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Claims (28)

  1. 스테롤, 바람직하게 콜레스테롤 및 퀼라자 산(quillaja acid)과 퀼라자 사포닌(quillaja saponin)으로부터 선택된 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)의 성분(component)을 포함하는 나노입자로서, 상기 나노입자는 인지질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 10-40 나노미터, 바람직하게 12-35 나노미터 또는 15-25 나노미터 범위 내의 입자 직경을 갖는, 나노입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 퀼라자 성분은 퀼라자 사포닌, 바람직하게 퀼라자 사포닌 분획(fraction) QHA, QHB 및/또는 QHC인 것인, 나노입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤과 퀼라자 사포닌 사이의 비율은 1:10 내지 10:1, 바람직하게 1:2 내지 2:1인 것인, 나노입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 양친매성 또는 소수성 분자를 추가 포함하는 것인, 나노입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 양친매성 또는 소수성 분자는 항원, 보조제(adjuvant), 표적화 분자(targeting molecule), 약제학적 화합물(pharmaceutical compound), 및 식품 관련 화합물로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 나노입자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 나노입자를 포함하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상이한 퀼라자 사포닌 분획들(fractions)은 상이한 나노입자에 각각 혼입되는 것인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 또는 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 조성물에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 완충제, 희석제, 부형제, 보조제(adjuvants), 및/또는 담체(carriers)를 더 포함하는 약제학적 조성물에서 선택적으로 약제학적으로 사용되는, 나노입자 또는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 항암제 Komplettering Saideh와 같은 약제학적 활성 화합물, 백금 배위 화합물, 탁산(taxane) 화합물, 캄프토테신(camptothecin) 화합물, 항-종양 빈카 알칼로이드(anti-tumour vinca alkaloids), 항-종양 뉴클레오시드 유도체, 질소 머스타드(nitrogen mustard) 또는 니트로소우레아 알킬화제(nitrosourea alkylating agents), 항-종양 안트라사이클린 유도체(anti-tumour anthracycline derivatives), 트라스투즈맙(trastzumab) 및 항-종양 포도필로톡신 유도체(anti-tumour podophyllotoxin derivatives), 항대사성물질(antimetabolites), 스테로이드, 포유동물 라파마이신 표적(mTOR의)의 억제제, 퀼라자 사포나리아 몰리나 및 이의 서브 프래그먼트(sub fragments), 항체 또는 Fc 수용체 또는 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A의 DD와 같은 단일클론 항체에 대한 수용체, 시타라빈(Cytarabin), 다우노루비신(Daunorubicin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 카바지탁셀(Cabazitaxel), 토리셀(Toricsel) 및 트라벡터딘(Trabectidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 제제와 같은 암 치료제를 추가 포함하며, 활성 화합물은 상기 나노입자 에 통합되거나 또는 상기 조성물과 혼합될 수 있는, 약제학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 보조제(adjuvant)로서 사용되는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 개발 중인 백신과 조합하여 사용되는, 약제학적 보조제(adjuvant) 제형.
  13. 제11항에 있어서, 계절 인플루엔자 바이러스 백신과 조합하여 사용되는, 약제학적 보조제(adjuvant) 제형.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 범유행성(pandemic) 인플루엔자 백신과 조합하여 사용되는, 약제학적 보조제(adjuvant) 제형.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 무기에 대한 백신과 같은 긴급 백신으로 조합하여 사용되는, 약제학적 보조제(adjuvant) 제형.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 보조제(adjuvant)를 포함하는, 약제학적 백신 제형.
  17. 제16항에 따른 약제학적 백신 제형을 피험자에게 투여하는 것을 포함하고, 유기체(organism)에 의해 발생하거나 복잡해지는(complicated) 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 또는 제7항 내지 제10항에 따른 조성물의 약제학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암은 백혈병인 것인, 암 치료 방법.
  20. 하기 단계(steps)를 포함하는 인지질 없는(phospholipid-free) 나노입자 제조 방법:
    a) 리포좀의 현탁액(suspension) 또는 소수성 표면을 준비하고,
    b) 리포좀의 현탁액(suspension) 또는 소수성 표면을 유기 용매 또는 세제 중 단량체로 용해되는 스테롤, 바람직하게 콜레스테롤의 용액과 접촉시키고,
    c) 상기 표면에 스테롤 막(membrane)을 형성하는 상기 용매 또는 세제를 제거하고,
    d) 퀼라자 사포닌 미셀(micelles)의 수용액을 준비하고,
    e) 상기 스테롤 막(membrane)에 상기 사포닌 미셀을 포함하는 수용액을 첨가하며, 여기서 착물(complex)은 상기 사포닌과 스테롤 사이에 형성되고, 상기 수용액에 현탁됨.
  21. 제20항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올 및/또는 클로로포름인 것인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 용매 또는 세제는 증발에 의해 제거되는 것인, 방법.
  23. 제20항 또는 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매 또는 세제는 투석(dialysis), 크로마토그래피(chromatography), 여과(filtration), 또는 접선유동(tangential flow)에 의해 제거되는 것인, 방법.
  24. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 퀼라자 사포닌은 퀼라자 사포닌 분획 QHC인 것인, 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜레스테롤과 퀼라자 사포닌 사이의 비율은 1:10 내지 10:1, 바람직하게 1:2 내지 2:1인 것인, 방법.
  26. 제20항 또는 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 인지질은 제20항의 단계 b)에서 스테롤을 포함하는 현탁액에 첨가되는 것인, 이스콤 매트릭스(Iscom matrix)의 제조 방법.
  27. 개인 환자에게 제17항 또는 제18항에 따른 방법의 적용성(applicability)을 평가하기 위한 방법으로서,
    Figure pct00017
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 나노입자 또는 제8항 또는 제9항에 따른 약제학적 조성물을 생체외(in vitro)로 접촉시키고 상기 환자로부터 암 세포를 가져오고;
    Figure pct00018
    상기 암세포에 대한 상기 나노입자 또는 약제학적 조성물의 치료 효과를 나타내는 적어도 하나의 효과를 측정하는 것;을 포함하며,
    상기 제10항 또는 제11항에 따른 방법은 상기 나노입자 또는 약제학적 조성물이 상기 암세포에 대해 치료 효과를 나타내는 중요한 효과를 보이는 경우 상기 개인 환자에게 적용할 수 있는 것으로 평가됨하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 치료 효과를 나타내는 효과는 사이클린 의존성 키나아제(cycline dependent kinases : CDKs)의 하향 조절 또는 티미딘 키나아제(thymindine kinase : TK)의 하향 조절, 분화 마커(differentiation markers)의 상향 조절인, 방법.
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