CN105873941A - 生存素导向的癌症疫苗治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗有效的截短的生存素及其作为疫苗在脂质体制剂中的治疗应用,其中所述生存素片段优选是葡萄糖酸化的(gluconoylated),并且所述脂质体制剂引发体内抗肿瘤活性。更具体地,本发明涉及一种癌症疫苗,其包含人生存素的片段,该片段与脂质佐剂联合特别有效。更具体地,本发明涉及脂质体疫苗递送系统,该系统包含有活性的截短的生存素分子作为肿瘤抗原,和手性阳离子脂质(例如R‑DOTAP)作为佐剂,其为该脂质体制剂的部分,其中,所述脂质体药物递送系统在其脂质和佐剂组分、物理或物理化学参数,和释放的截短的生存素分子的最终疗效方面得到最优化。最后,本发明涉及一种提高体内CD4+/CD8+T细胞应答,由此得到提高的抗肿瘤活性的方法,所述方法通过提供包含所述截短的优选葡萄糖酸化的生存素的脂质体制剂进行。
Description
技术领域
本发明涉及治疗有效的截短型生存素(survivin)及其作为疫苗在脂质体制剂中的治疗应用,其中所述生存素片段优选是葡萄糖酸化的(gluconoylated),并且所述脂质体制剂引发体内抗肿瘤活性。更具体地,本发明涉及一种癌症疫苗,其包含人生存素的片段,该片段与脂质佐剂联合特别有效。更具体地,本发明涉及脂质体疫苗递送系统,该系统包含截短型生存素分子作为肿瘤抗原,和手性阳离子脂质(例如R-DOTAP)作为佐剂,其为该脂质体制剂的部分,其中,所述脂质体药物递送系统在其脂质和佐剂组分、物理或物理化学参数,和释放的截短型生存素分子的最终疗效方面得到最优化。最后,本发明涉及一种提高体内CD4+/CD8+T细胞应答,由此得到提高的体内抗肿瘤活性的方法,所述方法通过提供包含所述截短的优选葡萄糖酸化的生存素的脂质体制剂进行。
发明背景
凋亡是细胞自毁的遗传程序,已经表明凋亡的抑制是通过延长细胞的生命周期(这有利于转化突变的累积)的癌症形成中涉及的重要机制。
生存素,一种抑制细胞凋亡并属于凋亡蛋白的抑制剂(IAP)家族的蛋白质,于1997年被Altieri及其同僚发现并表征(参见例如WO 98/22589;Ambrosini等,NatureMedicine.917-921,1997;Adida等,American Journal of Pathology,152,43-49,1998;Cirino等,J Clinical Investigations,99,2446-2451,1997;Adida等,The Lancet,351,882-883,1998)。
生存素(survivin)是16.5kDa的胞质蛋白,其包含单一BIR和高度荷电的羧基末端卷曲区域,而不是RING指,其在B细胞前体中转换时抑制由生长因子(IL-3)抽回(withdrawal)所诱导的凋亡。生存素在多种实体瘤和血液恶性病中过表达,同时显示在最终分化的成人组织中具有有限的表达。已在人转录组中鉴定出约40个基因,其在全部癌症中但不在附近正常组织中过表达。在这40个基因中,生存素基因(BIRC5)被鉴定为人癌症中第四最常见的过表达肿瘤相关抗原(Velculescu等,Nat Genet 23(4):387-8,1999)。
生存素是142个氨基酸(aa)的蛋白质,其由Birc5基因(凋亡基因抑制剂家族的成员)编码。人生存素的氨基酸序列由SEQ ID NO:1表示
N--MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
KKEFEETAKK VRRAIEQLAA MD--C.
大多数人类癌症中,生存素的过表达表明肿瘤进展中的凋亡抑制的一般作用,这是由如下观察结果证实的概念:在结肠直肠和膀胱癌以及成神经细胞瘤的情况中,生存素的表达与不利预后相关联。相反,在正常成人组织中检测不到生存素。这些特点使生存素有资格作为合适的TAA,用于诊断和治疗目的。
生存素在大多数人类癌症中高度过表达,包括结肠直肠癌(67%)、非小细胞肺癌(96%)、乳腺癌(90%)、前列腺癌(83%)、肾细胞癌(79%)、卵巢癌(87%)、膀胱癌(88%)、子宫内膜癌(83%)等。在全部上述那些肿瘤中,生存素表达的增加与较差的临床结果相关。
癌症中生存素蛋白的表达与较差预后、诊断时晚期疾病、对于治疗的较高级别的抗性,和较高复发率相关联。生存素在确定细胞分裂和凋亡之间的平衡方面具有多种功能。首先,生存素以细胞周期依赖性方式(G2-M检验点)表达,并且显示与有丝分裂纺锤体相互作用以促进细胞周期的进展。第二,生存素通过干扰胱冬酶-9加工和下游效应物胱冬酶(例如,胱冬酶-3)的活化,由此抑制线粒体凋亡通路,来抑制凋亡。第三,在细胞应激反应过程中,生存素与分子伴侣热激蛋白90相互作用,以促进细胞存活。癌症中生存素的过表达,以及其在促进癌细胞的存活和持续生长方面的胞内作用,使得生存素成为免疫治疗的一个具有吸引力的目标。此外,已在肿瘤微环境中的增殖内皮细胞中鉴定到生存素表达,这显示了治疗型疫苗接种的另一个目标。
随着对于“免疫系统在生物学表现和癌症发展中起主要作用”的理解的递增,人们对于“在癌症治疗中采用疫苗接种”的概念产生了兴趣。癌症疫苗开发的过程从对于抗原、制剂和免疫方案的选择到对其效果的评估。与预防性疫苗(其通常旨在产生高水平的保护性抗体)不同,治疗性疫苗旨在引发有力的T细胞应答,其能够介导肿瘤细胞的毁灭或至少停止其生长。治疗性疫苗开发过程中的首要抉择是关于待用的抗原类型。目前已鉴定了数百种T细胞限定的肿瘤抗原。第二抉择有关将抗原递送至免疫系统的载剂的选择。存在的相对较大多样的可能性包括裸DNA、mRNA、重组蛋白、合成的肽、重组病毒或细菌载体或树突细胞(其离体荷载抗原)。本发明一般涉及基于蛋白质的治疗性癌症疫苗,并且具体涉及生存素导向的癌症疫苗。
许多治疗性的、基于蛋白质或基于肽的癌症疫苗的策略是将肿瘤抗原优先递送至适应性免疫系统的主要组织相容性复合物(MHC)I类物质,这随后诱导能够以抗原特异性方式识别和裂解肿瘤细胞的抗原特异性CD8+T细胞。这在基于肽的疫苗中通过下述方法得以实现:采用引发来自CD4+辅助T细胞的不充分的细胞因子支持的可能限制,将抗原性库限制至MHC I类肽。在过去十年间,已经发现了由生存素衍生的相当大量的MHC I/II类肽(参见例如US 6,245,523;EP 2 092 938;和EP 2 359 841)。这些发现强力表明,生存素作为肿瘤排斥抗原前体,TRAP,其由细胞加工成具有TRA功能性的肽。然而,相应的生存素衍生的9-至15-聚体肽的免疫原性通常低于全长生存素。
在治疗性癌症疫苗中,将全长肿瘤抗原呈递给免疫系统的好处之一在于,可能在接种疫苗的宿主中诱导加强的体液以及CD4+和CD8+T细胞应答(Davis等,PNAS 101(29):10697-702,2004)。先前已经报道了采用基于生存素肽的DC疫苗在脑神经胶质瘤的临床前模型中靶向CD4+和CD8+T细胞表位的治疗益处(Ciesielski等,Cancer Immunol Immunother57(12):1827-35,2008)。
肽和重组蛋白质本身的免疫原性通常较差,因此需要将其与佐剂联合给予。佐剂的作用是至少两倍。一方面,佐剂在足以允许充分引发T细胞应答的时间长度中将抗原递送至免疫系统。另一方面,佐剂触发树突细胞的活化和成熟。因此,载有抗原的DC迁移至附近的淋巴结,并获得以最优方式呈递抗原用于重新起始T细胞应答的能力。前一项佐剂功能可通过多种试剂满足,例如矿物油,用于乳液形成(不完全弗氏佐剂)、脂质体或生物可降解的微球。目前可用于人类的佐剂相对较少。这些包括明矾和MF59。然而,越来越多的分子限定的佐剂出现于临床开发中,并用于癌症疫苗接种的临床试验中。这些包括各种合成的或重组TLR配体、矿物油,例如蒙塔尼(montanide)、皂苷类,甚至脂质体。
用于癌症疫苗接种且包含阳离子脂质和疫苗佐剂(R,S DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷))的脂质体纳米颗粒已被建立成用于DNA、肽和蛋白质的有效递送系统。作为脂质组分和佐剂应用的其它阳离子脂质有:DSTAP、DMTAP、DODAP、DDAB、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R,S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC。DOTAP在脂质体制剂中的应用提供了净正表面电荷,其被报道能够促进纳米颗粒和APC之间的相互作用(Foged等,Int J Pharm 298(2):315-22,2005)。此外,DOTAP促进树突细胞成熟,由此增强抗原交叉呈递,这通过反应性氧物质(ROS)介导的机制发生(参见Yan等,J Control Release 130(1):22-8.2008)。
最近显示,以其分开的对映异构体形式(例如R-DOTAP和S-DOTAP)使用的,包含手性阳离子脂质作为脂质组分和佐剂的脂质体制剂在放大对于抗原的免疫应答,以及甚至在诱导、活化和导向性地调节免疫应答方面格外地有效(参见例如WO 2009/129227和WO2013/039989)。
脂质体是公认的药物递送载剂。它们是微小的、纳米颗粒大小的、封闭的载剂,其包封通过包含磷脂(优选是组成细胞膜的磷脂部分)的双层膜与外部介质分隔的内部水性空间。脂质体的结构与细胞的基础结构高度相似。它们也相对具有生物相容性。脂质体体现将药物递送至身体中希望的目标并降低系统毒性的潜力。因此,在改善的制剂和更好的靶向策略将获得更高的治疗方面存在越来越多的兴趣。脂质体可基于尺寸、形貌、组成、制备方法和功能而广泛分类。简言之,以尺寸来看,脂质体以两种常见类别存在:小单层载剂(SUV)和大单层载剂(LUV)。SUV的尺寸范围通常在20nm-100nm。尺寸范围在100nm-200nm的中间单层载剂(IUV)被视为在SUV之间。SUV是单壳载剂,优选通过高强度超声处理产生。亲水性药物被捕获在内部水性核心中,而疏水性药物被捕获在双层膜中。
如前所述,已证明脂质体制剂作为药物递送载剂的多项益处。然而,因为它们的包封率低,它们必须用于携载极强力的药物。基于脂质的载剂还面临若干其它困难,例如,在血流中不稳定、许多药物在脂质/表面活性剂溶液中溶解性差、贮存稳定性差,和药物的快速突释。脂质体制剂也与严重副作用相关联,因为其会在皮肤组织中的累积。因此,2012年,仅12种采用脂质体递送系统的药物获得许可,还有五种其它脂质体药物处于临床试验中。
因此,目前十分需要提供高度有效且稳定的脂质体抗原递送系统,其能够释放需要在体内引发希望的增强免疫应答的选定的抗原,所述免疫应答通过高度有效的佐剂的存在而被加强。
生存素是有利的癌症疫苗候选物,出于如下原因,其具有用于持久肿瘤特异性免疫应答的潜力,和有利的安全性能:
·在终末分化的正常组织中低表达。
·在各种癌症类型中高表达。
·表达与晚期级别和治疗抗斥相关联。
·凋亡抑制剂。
·促进细胞分化和迁移/转移。
·促进肿瘤微环境中的血管生成。
·涉及细胞应激反应。
因此,本发明的一个目的是,提供用于生存素导向的癌症治疗的脂质体制剂,其至少在强佐剂DOTAP或结构类似的手性阳离子脂质的存在下,于体内稳定且充分有效。
待解决的问题之一必定是抗原与佐剂关于其不同的永久净电荷(R-DOTAP的正净电荷,和生存素的负净电荷)的固有不相容性,这导致稳定性降低。另一个问题是各制剂中的生存素的体内免疫原性不足。
通过本发明对于脂质体制剂的脂质组分的选择、生存素结构/序列的调节,和多种物理化学参数(例如粒径、抗原荷载、脂质组分和DOTAP的浓度和含量)的最优化,上述问题能够得到解决。
发明内容
在脂质体制剂中采用全长生存素的尝试显示,这些颗粒具有不尽如人意的生物物理蛋白质性质。总之,当与DOTAP,本发明的优选佐剂混合时,能够观察到缺乏稳定性的生存素(图1、图2)。
惊人地发现,通过采用C末端截短型生存素,能够解决稳定性问题。将生存素C末端截短能使该蛋白质在溶液中稳定,这通过移除诱导蛋白质在溶液中沉淀的疏水片来实现。蛋白质被加工成肽并呈递至免疫系统的能力不需要对于蛋白质的部分的生物活性–仅在与抗原呈递细胞的蛋白体复合物接触之前需要结构完整性。在本发明的一个方面中,C末端截短型生存素在生物学上仍有活性且有效。
因此,本发明的一个目的是,提供C末端截短的形式,其由全长生存素(SEQ ID NO:1)的1–119、1–120、1–121、1–122、1–123、1–124、1–125、1–126、1–127、1–128、1–129、1–130、1–131、1–132、1–133氨基酸残基组成,自N末端计算。
因为生物工程改造策略,在本发明的优选实施方式中,第一个甲硫氨酸残基可被切割去除,提供如下截短型生存素:SEQ ID NO:1的2–119、2–120、2–121、2–122、2–123、2–124、2–125、2–126、2–127、2–128、2–129、2–130、2–131、2–132或2–133。
在包含例如DOTAP(优选R-DOTAP)作为脂质佐剂的脂质体制剂中,与全长生存素相比,上述这些生存素短型序列全部显示的改善的生物-物理性质,同时发挥相似的药理学性质,其各自与142个氨基酸残基序列(SEQ ID NO:1)代表的全长生存素相比。
因此,本发明涉及如下截短型生存素氨基酸序列:
(SEQ ID NO:2):该序列的Gly2–K120序列部分在本发明中称作本发明的药物物质,或“dC-生存素药物物质”,并且与SEQ ID NO:3的序列部分1–119相同。
GAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
(SEQ ID NO:3):该序列的Gly1–K119序列部分在本发明中称作本发明的药物物质或dC-生存素,并且与SEQ ID NO:2的序列部分2–120相同。
本发明优选涉及由全长生存素的前120个N末端氨基酸残基组成的截短型生存素,其中优选删去位置1上的甲硫氨酸残基(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)。
更惊人地发现,如上所述的截短型生存素,在葡萄糖酸化至某一程度时,与截短的非葡萄糖酸化的生存素相比,能够引发显著改善的体内药理学性质。
因此,本发明的一个目的是,提供一种C末端截短型生存素,其由SEQ ID No.1代表的全长人生存素的前118–122个N末端氨基酸组成,或由与所述截短型生存素具有>90%,优选>91%、>92%、>93%、>94%、>95%、>96%、>97%、>98或>99%的同源性且引发相同或几乎相同的生物活性的序列组成,其中所述截短型生存素在一个或多个位置处被葡萄糖酸化。
在一个特定方面,本发明涉及C末端截短型生存素,其由SEQ ID NO:1所代表的全长人生存素的前118–133个N末端氨基酸组成,或与所述截短型生存素具有>90%的同源性的序列,其中,所述截短型生存素在一个或多个位置处葡萄糖酸化。在一个优选方面中,所述C末端截短型生存素发挥相同的生物活性。
本发明具体涉及由全长人生存素的前120个N末端氨基酸组成的相应的C末端截短型生存素;所述截短型生存素由氨基酸序列(SEQ ID NO:2)代表:
其中所述截短型生存素在一个或多个位置处葡萄糖酸化。
在本发明的一个优选实施方式中,至少在SEQ ID NO:2或如上所述的相应的118–122个氨基酸残基序列的位置2处的甘氨酸残基被葡萄糖酸化。
本发明具体涉及相应的截短型生存素,其中,位于N末端位置1处的甲硫氨酸残基被移除(通常在蛋白质表达步骤之后);所述截短型生存素由氨基酸序列(SEQ ID NO:3)代表:
GAPTLPPAW QPFLKDHRI S TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
其中所述截短型生存素在一个或多个位置处葡萄糖酸化。
在本发明的一个优选实施方式中,至少在SEQ ID NO:3或相应的118–122个氨基酸残基序列的位置1处的甘氨酸残基被葡萄糖酸化。
发明人已显示,如果在本发明的截短型生存素的赖氨酸残基处进行葡萄糖酸化(gluconoylation),能够进一步改善有利的性质。优选地,SEQ ID NO:2的位置23和103处的赖氨酸残基,和SEQ ID NO:3的位置22和103处的赖氨酸残基,可分别被葡萄糖酸化,优选通过葡糖酸-1,5-内酯进行,但原则上也可采用其它葡糖酸化试剂。因此,本发明的一个目的在于,提供一种相应截短的葡萄糖酸化的生存素,其中所述葡萄糖酸化在赖氨酸残基处额外地进行,所述赖氨酸残基优选是位于SEQ ID NO:2的位置23和/或位置103处,或位于SEQID NO:3的位置22和/或102处的赖氨酸残基。
惊人地发现,如果对应组合物中并非所有的截短型生存素分子均被葡萄糖酸化,则由本发明的脂质体制剂产生的体内药理学数据尤其有利,特别是关于活化的CD4+和/或CD8+T细胞应答的体内药理学数据。具体而言,40%的葡萄糖酸化获得了最为平衡的生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答。较高水平的葡萄糖酸化优先参与CD8+T细胞应答,这以CD4+辅助T细胞支持为代价。因此,本发明的一个目的在于,提供一种生存素组合物,其包含如上所述的截短型生存素,和相应的非葡萄糖酸化的截短型生存素,其中在所述组合物中,该截短型生存素的所述组合物中的10–80%,优选10–60%,更优选35–45%,最优选约40%的截短型生存素分子被葡萄糖酸化。
本发明的截短型生存素的葡萄糖酸化提供如下优势:
■合成的葡萄糖酸化允许提供宽修饰范围,允许对其药理学益处进行系统评价。
■建立的方案为设计高效且高性价比的方法提供了基础。
■(截短型)生存素的葡萄糖酸化提高了本发明的治疗性截短型生存素作为肿瘤疫苗的抗原性和功效。
■认为本发明的截短型生存素的合成葡萄糖酸化是一种优化,其在克服与宿主细胞葡萄糖酸化相关联的主要不利条件的方面具有潜力。
本发明的生存素可以是糖基化(glycosylated)的或非糖基化的。优选地,它是非糖基化的,并且由细菌系统(如大肠杆菌)制造。
如上所述,本发明的主要目的是提供一种脂质体制剂,其在疫苗接种后于体内产生生存素或生存素样活性,其中所述脂质体制剂在不同物理和药理学参数方面被优化,并且包含十分有效的免疫刺激剂和佐剂DOTAP,优选其手性组分R-DOTAP,或类似的手性脂质佐剂,例如R-或S-DOTMA或R,S DOEPC。因此,本发明的目的在于,提供一种脂质体制剂,其包含:
(i)截短型,优选葡萄糖酸化的生存素,如上所述,例如SEQ ID NO:2的包含120个氨基酸残基的序列,或SEQ ID NO:3的包含119个氨基酸残基的序列,或具有>90%,优选>95%的序列同源性的相应的经修饰的序列,或者,相应的截短型生存素的生存素组合物,其中该截短型生存素分子的10–60%,优选35–45%被葡萄糖酸化,如上所述,和
(ii)至少一种佐剂,其中所述至少一种佐剂是具有免疫调节剂作用的手性阳离子磷脂,优选选自下组:R,S DOTAP、R-DOTAP、S-DOTAP、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R,SDOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC。
发明人发现,如果以2–8mM,优选3–5mM,且最优选约4mM的浓度施加,尤其但不限于,联合脂质体制剂中的R-DOTAP施加,上述手性阳离子佐剂脂质特别有效。脂质体制剂中脂质佐剂的含量可变化,但有趣的是,15-30%(mol/mol)的含量产生药理学功效方面的最佳结果。
发明人还显示,除手性阳离子脂质的存在以外,脂质组合物的质和量在本发明的脂质体制剂的有利性质方面也起重要作用。
因此,本发明的另一个目的在于,提供一种脂质体制剂,其基于截短型生存素和至少一种手性阳离子脂质佐剂,例如DOTAP,如上所述,其包含胆固醇和选自下组的至少一种磷脂:卵磷脂(PC)、磷酸乙醇胺(PE),和磷酸甘油(PG)。
在本发明的一个优选实施方式中,磷脂是选自下组的卵磷脂(PC):DLPC、DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、EPC和EPC3。如下所示,蛋卵磷脂(EPC)(其为不同PC的粗混物)是最为优选的,因为相较于其它磷脂酰胆碱(例如DMPC),其显示最显著的作用(例如,对于CD8+触发的体内应答)。不过,对于本发明的脂质体组合物的制备,也可采用并测试其它已知的磷脂。
本发明的脂质体制剂可包含如下含量的胆固醇:10–60%(mol/mol),优选20–45%,更优选30–45%,最优选45%,和如下含量的上述卵磷脂(PC):30–80%(mol/mol),优选30–50%,最优选约35%含量的EPC。
本发明的脂质体制剂包含介于40nm和500nm的不定尺寸的纳米颗粒。优选的脂质体组合物包含脂质体颗粒,其中至少70%的颗粒,优选至少80%的颗粒,的尺寸为50–500nm,优选100–300nm,最优选150–250nm,因为这些颗粒产生物理和生物性质方面的最有利结果。
还显示,当依赖于抗原荷载的颗粒表面电荷≥17mV,所述抗原荷载根据本发明是0.5–1.5mg/mL,优选0.75–1.0mg/mL时,能够获得尤其有利的结果。正表面电荷(ζ电位)能增强含DOTAP的脂质体纳米颗粒的免疫和抗肿瘤活性。
根据上文可见,脂质体纳米颗粒的全部相关参数和组分均经调节以获得最优化的脂质体制剂,其获得较为惊人的性质,并且在本发明中称为本发明的药物产品,或“dc-生存素药物产品”。
因此,本发明的特定目的是,提供一种相应的脂质体制剂,其包含:
(i)截短型(葡萄糖酸化的)生存素和截短型生存素的组合物,所述截短型生存素如上文和权利要求中所述,优选SEQ ID NO:2或3的序列,
(ii)脂质组分R-DOTAP、胆固醇和EPC,
(iii)该制剂中的R-DOTAP浓度是3–5mM,
(iv)脂质体颗粒,其中至少70%具有150–250nm的粒径,和
(v)0.5mg/mL(±0.1mg/mL)的抗原荷载。
在一个优选实施方式中,所述药物产品由如下参数表征:
(i)葡萄糖酸化、非葡萄糖酸化的截短型生存素,其由SEQ ID NO:3代表,其中,约40%(±2–5%,优选±5%)的所述截短型生存素被葡萄糖酸化,和
(ii)所述脂质组合物的含量为:10–30%,优选约20%(±1%)R-DOTAP;25–55%,优选约45%(±1%)胆固醇;和30–60%,优选约35%(±1%)EPC(mol/mol)。
本发明的脂质体制剂的脂质体颗粒,优选磷脂组分可通过标准方法被PEG化。本发明的这些PEG化的脂质颗粒显示增强的稳定性,和该制剂对于低盐浓度的敏感性降低方面的强趋势,由此显著影响并改善了蛋白质或制剂的沉淀。然而,相较于非PEG化的颗粒,本发明的PEG化的脂质体制剂惊人地获得较低的体内功效(CD4+/CD8+T细胞应答和抗肿瘤活性)。然而,可根据本发明来采用脂质颗粒的PEG化,以调节有需求的患者(尤其是具有过度反应的免疫应答的个体)中的免疫应答。因此,本发明的一个目的是提供一种脂质体制剂或疫苗组合物,如上文和下文所述的,其中所述脂质体颗粒经PEG化,优选介于0.5%和5%(mol/mol总脂质含量)之间。
本发明还涉及本发明的脂质体和疫苗制剂,其出于贮存目的被冻干。介于2.0-2.5%(w/v)的低浓度蔗糖的存在能使制剂充分稳定化而不影响冻干制剂的药理学功效。本发明的制剂还可包含抗氧化剂,优选一硫代甘油(MTG),用于保护不受氧化破坏。
如上下文所述的脂质体和疫苗制剂根据本发明用于制备疫苗组合物,所述疫苗组合物旨在用于疫苗接种治疗。
因此,本发明的一个目的在于,提供一种免疫刺激性疫苗,其包含如上下文所述的脂质体制剂,其还可包含运载体、赋形剂、添加剂、稀释剂、其它免疫增强剂或免疫效应物分子。
本发明的疫苗组合物与其它治疗有效的药物联合或分开使用(同时或依次给予),所述其它治疗有效的药物例如,抗肿瘤剂和/或其它治疗形式,例如辐照。
在一个优选实施方式中,所述脂质体疫苗制剂与化疗剂(例如环磷酰胺、卡铂,或紫杉醇)联合,或与抗肿瘤抗体或抗体-细胞因子融合蛋白(例如NHS-IL12)联合,如下所述。这些组合显示增强的体内功效(图21–24)。因此,更具体地,本发明的进一步目的是,提供一种药物组合物,其包含脂质体制剂或免疫刺激性疫苗组合物,在本文所述的每种情况中,联合选自下组的抗肿瘤剂:环磷酰胺、卡铂、紫杉醇和NHS-IL12。在一个优选的方面,本发明涉及所述药物组合物,其用于人个体的预防或治疗,其中所述个体患有癌症或癌症相关的疾病。
最后,本发明涉及所述通过疫苗接种来进行人个体的预防或治疗的免疫刺激性疫苗或脂质体制剂,其中所述个体患有癌症或癌症相关的疾病,或有这种倾向。本发明尤其涉及:通过疫苗接种来治疗患有癌症或具有患癌倾向的患者的相应的方法,其中所述疫苗接种触发所述个体中的生存素特异性免疫应答,例如,通过调节,优选通过攻击患者的免疫系统来增强CD4+和/或CD8+T细胞应答,并由此抑制或防止该患者中的肿瘤生长。
根据本发明,对于制剂优化了疫苗的如下参数,从而相较于全长生存素,增强免疫应答:
·生存素蛋白质修饰:10-80%,优选10-60%的受控合成的葡萄糖酸化影响生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答的最优诱导。
·R-DOTAP浓度:3.5–4.5mM DOTAP包括了生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答的最优平衡。
·颗粒表面电荷:ζ电位>17mV,优选约为18mV,这诱导生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答之间的最优平衡。
·粒径:较大纳米颗粒,优选>200nm,这增强生存素特异性CD8+T细胞IFN-γ生成。
·脂质组合物:在发展细胞免疫应答方面,EPC辅助脂质一致地胜过合成的辅助脂质,例如DMPC等。
·用于低温保存的赋形剂:2–3%蔗糖支持稳定且有活性的冻干疫苗制剂。
本发明的制剂能增强截短型生存素的水性稳定性,并通过转而采用所述截短型生存素克服了R-DOTAP和全长生存素固有的不相容性。通过施用如上所述的截短的葡萄糖酸化的生存素,与全长的原先的生存素对比,药理学活性得到了保持,并且,相对于非葡萄糖酸化的截短型生存素而言有所增加(参见图2–图14)。
附图简述
图1A:8mM脂质浓度、具有递增量的生存素的DOTAP脂质体。从左至右:0μg/mL蛋白质、41μg/mL蛋白质、3.1mg/mL蛋白质。由递增的蛋白质浓度诱导了DOTAP-蛋白质复合物的沉淀。
图1B:在多种pH和盐条件的基质中,全长生存素对比C末端截短型生存素的稳定性评估。绿色指示有利,红色为不利条件。对于1-120个氨基酸的生存素,观察到蛋白质相容的条件的相对延伸趋向于较低的盐和较低的pH。
图2:对于包含DOTAP/CHO/DMPC或DOTAP/CHO/DPPC的三元混合物的脂质组合物的滴定和粒径(颗粒尺寸)分布(96w形式)的影响,样品在t0和在2-8℃贮存1周后检测。在汇集并检测三份制备物后获得多个值。
图3:关于不同的PC组合(96w形式)的脂质体组合物的滴定:DMPC+DPPC、DOPC+DPPC、DOPC+DSPC,当采用DOPC+DPPC或DPPC+DMPC的组合时获得合适的粒径分布。值代表三个小瓶各自值的汇集。
图4:关于不同比例的DPPC和DOPC、具有固定含量的DOTAP(20%mol/mol)和胆固醇(45%mol/mol)的脂质体组合物的滴定(96w形式),在宽范围的比例中获得合适的粒径分布。值代表三个小瓶各自值的汇集。
图5:关于不同的PC组合(96w形式)的脂质体组合物在降低的盐含量(100mM KCl)条件下的滴定。在使载有生存素的脂质体稳定的方面,显示DMPC优于DPPC和DSPC。也显示DOTAP含量的减少使脂质体稳定。值代表三个孔各自值的汇集。
图6:在存在减少的KCl含量(50mM)的条件下的脂质体组合物(96w形式)的滴定。关于制剂可行性和在4℃放置一周的短期稳定性,研究了不同比例的DSPE-PEG2000(1–5%mol/mol)和不同的辅助脂质。采用DMPC、DPPC和DOPC作为磷脂。值代表三个孔各自值的汇集。
图7:佐剂浓度的影响。C57BL/6小鼠2次疫苗接种之后的CD4和CD8读出值,疫苗组合物:100nm DOTAP脂质体,0.5mg/mL抗原荷载,脂质:20%DOTAP、35%EPC、45%胆固醇。
A:T细胞记忆应答暗示约2mM DOTAP条件下的增殖最大值。
B:相反,在制剂中DOTAP的最高浓度条件下观察到产生CD8+T细胞的SVN特异性IFN-γ的最高频率。
对照例:非特异性的免疫活化通过如下方式定量:用MHC I类限制性卵清蛋白肽(SIINFEKL)刺激从疫苗接种的小鼠分离的CD8+T细胞。
图8:DOTAP浓度的影响–2mM对比4mM R-DOTAP。
A:CD4+T细胞增殖,和
B:在C57BL/6小鼠中进行2次疫苗接种之后的CD8+IFN-γ生成,疫苗组合物:100nmDOTAP脂质体,0.5mg/mL抗原荷载,脂质:20%DOTAP、35%EPC、45%胆固醇。
对照例:非特异性的免疫活化通过如下方式定量:用MHC I类限制性卵清蛋白肽(SIINFEKL)刺激从疫苗接种的小鼠分离的CD8+T细胞。
4mM DOTAP诱导了生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答的最优平衡。
图9:ζ电位和疫苗荷载对生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答的作用。2次疫苗接种后C57BL/6小鼠的CD4和CD8读出值,疫苗组合物:10mM脂质浓度,脂质:20%DOTAP,35%EPC,45%胆固醇。
A:SVN特异性CD4+T细胞增殖,其根据通过用纯化的全长生存素蛋白质脉冲处理的抗原呈递细胞刺激的分离的CD4+T细胞中的3H-胸苷摄取来检测。
B:SVN特异性CD8+T细胞IFN-γ生成,其通过采用经MHC I类限制性SVN肽脉冲处理的抗原呈递细胞刺激的分离的CD8+T细胞的ELISPOT分析来检测。
颗粒表面电荷:-6mV~+33mV。疫苗荷载导致颗粒表面电荷的荷载。+18.3mV的ζ电位诱导生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答的最优平衡。
图10:粒径对细胞毒性免疫应答的影响。制剂由20%R-DOTAP/35%EPC/45%胆固醇(mol/mol)以10mM的总脂质浓度,各药物载量为0.5mg/mL组成。较大的纳米颗粒(200nm)增强了生存素特异性CD8+T细胞IFN-γ生成。EPC辅助脂质在发展细胞免疫应答方面一致地优于合成的辅助脂质(例如,DMPC)。
图11:DMPC对比EPC作为磷脂组分的比较。脂质体的组成如下:20%DOTAP/25%EPC/45%胆固醇(mol/mol)或20%DOTAP/50%DMPC/30%胆固醇,脂质浓度:10mM,药物载量:0.5mg/mL,尺寸:105nm(EPC)对比129nm(DMPC),数据在每周两次疫苗接种之后采集,N=10只小鼠/组。
图12:载有下述物质的PEG化的脂质体的细胞毒性免疫应答:
A:两次疫苗接种。
B:四次疫苗接种,脂质浓度:10mM,尺寸:50-60nm,抗原荷载:0.5mg/mL,n=10只小鼠/组。
3和5%PEG化。
图13:PEG化的生存素脂质体(3%,5%)对比非PEG化的制剂(0%)的比较,脂质体组成:20mM脂质浓度(app)。200nm尺寸,抗原载量0.5mg/mL,数据显示非PEG化制剂优越的细胞毒性作用。
图14:液体(EPC液体形式)和冻干(EPC冻干形式)脂质体重建后的比较,脂质体组成:20mM,20%DOTAP/35%EPC/45%胆固醇,尺寸:200nm,抗原载量:0.5mg/mL,EPC冻干形式额外包含100mg/mL蔗糖。
图15A:葡萄糖酸化方案。
图15B:通过使用葡萄糖酸-1,5-内酯试剂产生的生存素葡萄糖酸化范围。
图15C:反应参数及其对生存素葡萄糖酸化的作用的评价。
图16:生存素葡萄糖酸化对生存素特异性CD4+和CD8+T细胞应答的作用。
图17:生存素葡萄糖酸化对dC-生存素在皮下MC38/SVN肿瘤模型中的抗肿瘤功效的作用。
图18:根据本发明的1–120aa截短型生存素的合成的基因。表达质粒AL37包含编码该截短型生存素(SEQ ID NO:2;1–120aa)的DNA序列。表达之后,SEQ ID NO:3(对应于SEQID NO:2的2–120,省略了第一个甲硫氨酸残基)的截短型生存素被释放进入培养基。
图19:pAL37中的限制性位点。
图20:包含编码SEQ ID NO:2/3的截短型生存素DNA的表达质粒pAL37(SEQ ID NO:4)的DNA序列和特征。
图21:本发明的截短型生存素(SEQ ID NO:3的2–120aa)与环磷酰胺(CPA)的组合。
图22:本发明的截短型生存素(SEQ ID NO:3的2–120aa)与抗体-细胞因子融合蛋白NHS-IL12的组合。
图23:在荷载卵巢肿瘤的SVN.Tg小鼠中,本发明的截短型生存素(SEQ ID NO:3的2–120aa)与紫杉醇的组合。
图24:在荷载卵巢肿瘤的SVN.Tg小鼠中,本发明的截短型生存素(SEQ ID NO:3的2–120aa)与卡铂的组合。
发明详述
根据本发明的定义,术语“药物物质”指的是“dC-生存素”(2–120aa二聚生存素构建体,在C末端截短),简称为本发明的截短型生存素(基于SEQ ID NO:3),其中,截短型生存素至少在SEQ ID NO:3的Gly1被特定地葡萄糖酸化。
根据本发明的定义,术语“药物产品”指的是包含如上所述的“药物物质”的脂质体制剂,并且优选地如本文上下文所述。更具体地,本发明的“药物产品”是:(i)由SEQ ID NO:3表示且非糖基化的截短型生存素,其中所述截短型生存素的40%(±0.5%)被葡萄糖酸化,和(ii)脂质组合物的含量为:10–30%,优选约20%(±1%)R-DOTAP;25–55%,优选约45%(±1%)胆固醇;和30–60%,优选约35%(±1%)EPC(mol/mol)。
表达系统的选择
小尺寸,以及产生缺乏翻译后修饰的多肽的意图,使截短型生存素成为用于在原核表达系统(例如大肠杆菌)中生成的特别合适的候选物。归因于其天然的胞质定位,生存素适应还原环境。在发展过程中,它变得明显,从而生存素蛋白需要连续的抗氧化保护以维持结构完整。该要求显然有利于用于重组生成的胞内靶向。此外,在毕赤(Pichia)系统中进行的可行性研究揭示生存素的失效的分泌性质。这些考量使大肠杆菌被选择成为生成宿主,同时保持胞内蛋白质产物。还决定采用诱导型启动子系统(lacIq/T7),联合附加体载体。基于质粒的系统具有如下优势:在项目进展过程中便于对表达盒进行修饰。通过诱导来控制表达,允许调节并优化转录本水平。其还避免了细胞库加工中,以及发酵培养物的生长期过程中的负选择压力。
大肠杆菌产生的生存素的质谱分析揭示,两种物质的质量相对于主要形式增加了+178和+258Da。该模式指示通过反应性糖衍生物进行的蛋白质修饰,产生所谓的磷酸-葡萄糖酸化。其产生自具有磷酸-葡萄糖酸内酯的蛋白质中的伯胺基团的自发反应,该具有磷酸-葡萄糖酸内酯的蛋白质是处于糖酵解和戊糖磷酸通路的界面处的代谢中间体。在初始磷酸-葡糖酸基蛋白质加合物(+258Da)形成后,存在对葡糖酸基形式的部分水解(+178Da)(参见Geoghegan等,Anal Biochem 267(1):169-84,1999)。在生存素的情况中,该反应被限制于Gly2处的α-氨基基团。在测试的表达条件的范围下,多达12%的生存素蛋白质基于该机制被修饰。该修饰是不希望的,并且被评价为生产控制方面的风险。还观察到其可能引起管控方面的关注。然而,对于去除纯化过程中的经修饰物质或避免其通过合适的发酵设置而产生所做的多项努力均不成功。
随着宿主细胞积累代谢物磷酸-葡萄糖酸内酯,会出现失控的磷酸-葡萄糖酸化。因此,本发明的目的是提供一种大肠杆菌菌株,其中不发生葡萄糖酸化,然而,通过这些研究令人吃惊地发现,本发明的葡萄糖酸化的截短型生存素相比非葡萄糖酸化的生存素具有更多的药理学活性。
因此,发明人开发出一种表达宿主,其本身不使表达的截短型生存素(磷酸)-葡萄糖酸化。而是,(磷酸)-葡萄糖酸化应在表达之后通过合成的手段和受控的方式进行。然而,应注意,本发明包括其中葡萄糖酸化是通过天然的或生物工程改造的表达宿主系统获得的,截短的葡萄糖酸化的生存素。
根据本发明可用于本发明的截短型生存素的表达的合适且优选的大肠杆菌菌株是大肠杆菌BL21(DE3)(诺瓦基公司(Novagen))。然而,该菌株天然地具有内酯酶活性方面的不足,并将该反应性中间体水解成惰性葡糖酸。这一可购得的菌株根据本发明经生物工程改造,所述工程改造通过将(磷酸)-葡萄糖酸内酯酶基因引入该表达菌株的基因组来进行。这一方案完全废除了磷酸-葡萄糖酸化的和葡萄糖酸化的生存素物质的出现,并且为以受控的方式通过本领域通晓的合成的手段引入葡萄糖酸化提供了可能。因此,原则上,也可对内酯酶活性方面不足的其它细菌菌株进行工程改造,进而可用于产生本发明的截短型生存素。
根据本发明,采用由上述生物工程改造大肠杆菌菌株(优选大肠杆菌BL21(DE3))而产生的菌株,用于用包含本发明的截短型生存素的表达质粒进行转化。本发明的特异性的菌株被称为大肠杆菌T7E2(#1)。
为了产生本发明的非糖基化且原始地非葡萄糖酸化的截短生存素,构建质粒,并通过该质粒转化大肠杆菌T7E2。该质粒称为pAL37,并且序列和特征示于图19和20。当然,本发明原则上包括该质粒构建体的变体和修饰形式,尤其是带有先导序列、启动子序列、限制性位点、抗生素抗性等的那些。应指出,(合成地)糖基化的截短型生存素(以修饰生存素的生物和物理性质)的应用也涵盖在本发明的要点中。
修饰反应(葡萄糖酸化)
通过细菌表达宿主表达时,本发明的截短型生存素优选是非葡萄糖酸化的。为了使生物工程改造的截短型生存素具有受控和所需的葡萄糖酸化率,通过标准方法合成地进行葡糖酸基残基的引入。葡萄糖酸化通过使游离氨基基团与标准葡糖酸化试剂(例如葡萄糖酸-1,5-内酯)反应来实现(图15A)。本发明的截短型生存素中的可能的游离氨基残基是:切割掉甲硫氨酸残基之后的SEQ ID NO:2的位置2的甘氨酸,和SEQ ID NO:3的位置1的甘氨酸。此外,用于葡萄糖酸化的候选物是截短的分子中的所有赖氨酸残基,尽管赖氨酸23和赖氨酸103(SEQ ID NO 2)或赖氨酸22和赖氨酸102(SEQ ID NO:3)是优选的赖氨酸残基,因为这些位置处的葡萄糖酸化产生具有最佳药理学性质的生存素。
根据本发明,具有本发明的葡萄糖酸化的截短型生存素的疫苗触发的体内免疫应答强于具有相同但非修饰的生存素的相应疫苗。
宿主细胞介导的生存素的葡萄糖酸化作为采用的大肠杆菌菌株(例如BL21(DE3))中的次优代谢情况的不希望的后果而产生。观察到低可及程度的修饰(至多12%)和对于该事件的受限的控制不利于利用该机制。为了进行较宽修饰范围下的生存素葡萄糖酸化的电位药理学益处的系统性评估,已设计一种合成方案作为替代。使源自表达菌株T7E2#1的非修饰的生存素DS批次与葡萄糖酸-1,5-内酯反应。修饰程度随着葡萄糖酸-1,5-内酯提供的量而增加。实现的修饰水平高达80%,优选65%–80%(图15B)。
该反应保持了对于位于Gly2(SEQ ID NO:2)或Gly1(SEQ ID NO:3)处的α-氨基基团显著的选择性,这可能归因于其独特的pKa性质。然而,观察到低于两种处于低水平的赖氨酸残基的提高的内酯浓度修饰。可用采用正交检测原则的两种方法来定量生存素的葡萄糖酸化水平(基于电荷的cIEF,基于质量的ESI-MS,基于固定相相互作用性质的RP-HPLC)。归因于内酯在水性溶液中的自发水解,其必须以粉末形式添加,并且摩尔量相对蛋白质组分显著过量。除了葡萄糖酸化试剂的量以外,还评价了关键反应参数如温度、反应时间和pH的影响(图15C)。
所用缓冲系统、包括的抗氧化剂的制剂可行性
在本发明的截短型生存素的开发的构架中,进行了对缓冲介质的调整。具有优化的特点的一种合适的配制缓冲剂包含50mM Na-P、150mM NaCl、1mM DTT,pH 7.5。由于DTT未被卫生当局批准,需要根据批准的抗氧化剂重新设计缓冲组合物。此外,探索了缓冲盐系统的类型、pH和单价盐浓度,以确定生存素构建体的最优稳定性范围。结果可汇总如下:
乙醇和叔丁醇在5–20%的范围中测试。采用递增的溶剂浓度,在25℃下5天之后观察到增加的氧化二聚作用。至少采用5%叔丁醇检测到二聚作用。
截短型生存素显示pI为6.1。当在4-9的范围内进行pH滴定时,在5.0<pH<6.0检测到稳定性最低值,且在这些pH值下对应于净分子电荷时出现沉淀。在不添加抗氧化剂的情况下检测时,化学稳定性(氧化)在≥7.0的较高pH值下显著地降低。通过向制剂导入150mMNaCl,pH 6下的pH稳定性惊人地增强。在最优盐浓度,API可在6-8的pH范围中被稳定化,其中,最优稳定性出现在pH 6-6-5。显示NaCl在接近dC-生存素的pI附近的pH值下使该分子稳定。此外,还证明其在在载药的含R-DOTAP的脂质体的加工过程中是关键组分。在不具有或具有不足的NaCl浓度(<150mM)的情况下,蛋白质在阳离子脂质体的存在下沉淀。
最终优选的缓冲组合物确定为由如下赋形剂组成:20mM K2HPO4、150mM KCl、10mMMTG,pH 7,然而,组成和含量的变化形式也在本发明范围内。
在保护本发明的截短型生存素不受氧化损伤方面,测试了如下抗氧化剂:抗坏血酸、亚硫酸钾、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、半胱氨酸、甲硫氨酸、单硫代甘油、甲醛磺酸钠,和没食子酸丙酯。所有这些赋形剂以根据FDA成分列表的市售胃肠外产品形式使用。抗氧化剂性能在25℃孵育5天后测试。结果显示了单硫代甘油(MTG)优于其它抗氧化剂的优越性。仅MTG、甲硫氨酸和硫代硫酸钠在测试方案中防止了氧化。没食子酸丙酯和抗坏血酸造成了不希望的反应并且导致测试样品变色。MTG浓度以0–10mM在20mM K2HPO4、150mM KCl,pH 7.0中滴定。氧化的防止(25℃下5天)依赖于MTG浓度。
用于本发明的脂质体制剂中的脂质和磷脂
多种脂质化合物和衍生物可用于制备本发明的脂质体颗粒的脂质组分。所述脂质体制剂通常包含脂质化合物,例如胆固醇或α-生育酚、阳离子磷脂和中性磷脂。阳离子组分是本发明必需的,以抵消用于本发明的脂质体制剂中的生存素片段的负电荷。
(A)手性阳离子磷脂
阳离子磷脂组分优选具有手性性质,因为分离的对映体形式显示增加的生物学和药学功效。它们可以优选自:R,S DOTAP、R-DOTAP、S-DOTAP、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R,S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC,但不限于这些试剂。
截短型生存素脂质体的制剂可行性由截短型生存素和佐剂组分(优选R-DOTAP)的固有的不相容性主导。图1给出了关于该现象的示意,其归因于生理条件下DOTAP的永久正电荷与生存素的净负电荷之间的不受控的相互作用。在制剂开发的过程中,一项主要目标是抑制不希望的静电相互作用,同时使每脂质体的DOTAP含量最大化。DOTAP的作用不只是作为脂质体双层的部分的脂质组分,还作为佐剂在疫苗接种方案和设定(本文中,关于截短型生存素)中发挥强力作用。
通过在0–50%(mol/mol)范围中滴定DOTAP,能够证明可在0–30%(mol/mol)DOTAP的范围内控制电荷相互作用。此外,能够显示DOTAP和一种中性脂质组分的混合物不导致设想的目标尺寸的颗粒。将DOTAP、胆固醇和一种PC以独特的比例混合时,获得优选的结果,所述比例例如:10–30%,优选约20%(±1%)R-DOTAP;25–55%,优选约45%(±1%)胆固醇;和30–60%,优选约35%(±1%)EPC(mol/mol)。
(B)其它脂质和磷脂
发现电荷相互作用的控制可通过向脂质体双层导入中性脂质组分(磷脂酰胆碱(PC),包括卵PC(EPC)、胆固醇和生育酚)来实现。合适的中性磷脂的示例有:磷脂酸(磷脂酸盐)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、卵磷脂(蛋黄素)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2),和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)。
此外,合成的磷脂衍生物可用于本发明:
·磷脂酸(DMPA、DPPA、DSPA)
·卵磷脂(DHPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC)
·磷脂酰甘油(DMPG、DPPG、DSPG、POPG)
·磷脂酰乙醇胺(DMPE、DPPE、DSPE DOPE)
·磷脂酰丝氨酸(DOPS)
表1给出了优选用于本发明来制备本发明的脂质体制剂的脂质的概况。
除了三元混合物,还研究了DOTAP、胆固醇和一种磷脂更复杂系统的混合物,尤其着重于模拟和替代制剂组分类脂EPC中的脂肪酸组成。作为主要PC,该混合物包含DSPC、DPPC、POPC和DOPC。两种限制复杂EPC被这些制剂组分中的两种的混合物替代。图2、3和4示例了辅助脂质组合物对脂质体的制剂可行性和稳定性的影响。尽管DSPC在在制剂特点方面显示有限的合适性,DOPC和DPPC或DMPC和DPPC的混合物显示良好的制剂稳定性。DPPC和DOPC在相关浓度范围内滴定,并且,当分别滴定2–32%(mol/mol)的DOPC和3–32%的DPPC时,仅显示PSD的微小变化。
糖基化的脂质体和盐浓度减少
在初步试验中,证明单价离子的浓度对于分散稳定性而言是重要的。尽管在液体制剂中不那么重要,但冻干或冷冻制剂在150mM KCl的盐含量处存在凝固点的问题。发现–与标准PC不同–脂质体双层中PEG化磷脂的存在降低了制剂对于减少的盐含量的敏感度。图5显示,在100mM KCl(标准150mM)下的制剂试验,和在该条件下对于蛋白质/制剂沉淀的惊人效果。相反,图6显示在50mM KCl盐含量下的制剂选择的概况。可见,在制剂中引入低至3%(mol/mol)的DSPE-PEG2000允许产生载有生存素的脂质体。在1–2%DSPE-PEG2K,制剂显示沉淀和粒径分布(PSD)的显著增加。
这些结果显示(图6),如前所述,磷脂或脂质体颗粒的PEG化在本发明的截短型生存素的可能的沉淀方面促进了脂质体制剂的稳定性。然而,不利的是,相较于具有相同含量和组成的非PEG化颗粒,包含生存素的PEG化脂质体颗粒显示降低的抗肿瘤功效和减小的CD4+/CD8+T细胞活性。
脂质体的冷冻和冻干
测试了三种不同的制剂在-70℃的冷冻和冻干:
DOTAP/EPC/CHO 20/35/45(%比例)
DOTAP/CHO/DOPC/DSPE-PEG2K 20/45/32/3(%比例)
DOTAP/CHO/DOPC/DSPE-PEG2K 20/45/30/5(%比例)
不同的冷冻保护剂(例如,海藻糖或蔗糖)的可行性测试显示蔗糖在冻干后维持脂质体尺寸分布方面的优越性。因此,滴定了不同的蔗糖浓度,以确定最优尺寸维持的范围。设定浓度为0%、2.5%、5%、7.5%和10%蔗糖(w/v)。
发现约10%的蔗糖是最优的,但干扰体内功效。因此,基于脂质组分DOTAP/CHO/EPC和2–3%蔗糖(w/w),优选约2.5%蔗糖的冷冻分散物脂质体引发最优物理化学和体内药学活性。
此外,发现在免疫应答方面,包含PEG2K的制剂劣于非PEG化形式。
体内实验
(i)DOTAP浓度的影响
为了研究DOTAP浓度/疫苗接种丸剂的影响,脂质体数量以及由此的DOTAP的浓度在0.7mM~7mM DOTAP范围内变化。图7显示疫苗接种了安慰剂脂质体(P.L.)或包封了生存素蛋白质的脂质体的小鼠的相应的CD4+和CD8+T细胞应答。然而,在佐剂含量和CD8+T细胞应答之间观察到剂量依赖性关系(图7A),注意到在最高的DOTAP浓度损失了SVN特异性CD4+T细胞增殖。该结果指示,2~7mM R-DOTAP的DOTAP浓度是最优的,其在最高DOTAP浓度(7mM)具有朝向SVN特异性CD8+T细胞的优先偏斜。此外,图7中的数据显示,在疫苗制剂中的DOTAP中等浓度(例如,2mM)处同时存在CD4+和CD8+SVN特异性T细胞应答。为了进一步说明相关的浓度范围,将第二研究设定为比较2mM和4mM R-DOTAP(图8)。结果指示,在诱导SVN特异性CD4+T细胞增殖(图8A)和产生IFN-γ的CD8+T细胞(图8B)方面,4mM的DOTAP浓度优于2mM。
(ii)抗原荷载的影响
本发明的脂质体(例如,100nm脂质体、10mM脂质、20%DOTAP、35%EPC、45%胆固醇)载有不同程度的生存素(0、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL和1.5mg/mL)和δC(截短的)生存素(SEQ ID NO 3)。CD4/CD8应答表明,荷载最优值在0.5–10.0mg/mL之间(图9A),而细胞毒性效果的稳定阶段似乎在0.1–0.5mg/mL抗原之间达到(图9B)。尤其,安慰剂脂质体和纯的蛋白质均不引发任何显著的免疫作用。
(iii)粒径的影响
本发明的脂质体(例如,100nm对比200nm脂质体)在不同的粒径在疫苗生物活性的影响方面进行比较。图10显示,在两次疫苗接种后,CD8+活化的差异。粒径为180–350nm,优选200–250nm的脂质体在测试设定中显著地增大了免疫应答。该结果表明,约200nm的粒径非常适用于疫苗应用。
(iv)脂质组合物的影响
出于项目历史原因,所有早期试验均采用包含20%DOTAP/35%EPC/45%胆固醇(mol/mol)的脂质体进行。EPC是不同的磷脂酰胆碱的相当粗制的混合物,主要由具有C16、C18和C18:1脂肪酸的PC组成。在确定其它制剂组成以获得脂质体的优越物理化学稳定性和降低制剂的复杂度方面做出了很多努力。EPC能够被作为磷脂组分的DMPC有效替代,同时能够保持所有其它制剂参数,例如尺寸、表面电荷和抗原荷载。建议的制剂由20mM 20%DOTAP/50%DMPC/30%胆固醇(mol/mol)组成,并且经过免疫学动物研究。数据显示,当用合成的辅助脂质替代EPC时,完全损失免疫活性(图11)。
在第二组实验中,评价PEG化脂质体的免疫原性。脂质体由20%DOTAP/45%胆固醇/32%DOPC/3%DSPE-PEG2000组成,或由20%DOTAP/45%胆固醇/30%DOPC/5%DSPE-PEG2000组成,并且其针对标准含EPC的脂质体进行测试(图12)。在2次和4次疫苗接种之后记录CD8应答。数据表明,1)在引发特异性的细胞毒性应答方面,3%PEG化具有优越性,和2)在4次疫苗接种之后,免疫应答进一步增大。与含DMPC的脂质体相类似,CD8+T细胞的频率远低于用含EPC的脂质体进行疫苗接种之后的情况。当引入低量的DSPE-PEG2000时,脂质体小得多。尚不清楚活性的损失主要由颗粒表面上的PEG遮蔽介导还是由减小的粒径(可能会导致从免疫系统的识别下逃逸)介导。因此,进行采用最优化的粒径(约200nm)和DOTAP浓度(4mM R-DOTAP)的另一组实验(参见图13)。同样地,在PEG化制剂仅能检测到温和的免疫活化,而对于具有0%PEG化的基于阳离子EPC的制剂而言观察到强应答。
(v)冻干制剂的性能
归因于生存素蛋白质在水性环境中固有的稳定性,需要确定用于长期贮存产品的替代形式。开发了用于保持脂质体的物理化学性质的冻干方案。其包括向制剂添加冷冻保护剂。制剂缓冲液中,约25–150mg/mL,优选100–150mg/mL的蔗糖浓度显示能够有效地保持相关疫苗的参数(粒径、电荷、药物荷载)。图14说明疫苗接种方案,以及重建的冻干制剂相较于同等脂质组合物的液体制剂的相应的CD8+读出值。可见,冻干制剂的细胞毒性降低。
上述结果清楚地显示,能够在阳离子脂质体中配制120aa(源自SEQ ID NO:1)的截短型生存素变体。该制剂允许具有强且可再生的佐剂能力,如果采用DOTAP(优选R-DOTAP),这取决于脂质颗粒的尺寸和组成。制剂试验揭示,脂质体稳定性和特点取决于对制剂组分的谨慎选择。尽管纯的R-DOTAP不适于配制敏感抗原,但DOTAP、胆固醇和磷脂酰胆碱组分的混合物允许产生根据目标概况稳定的脂质体。特殊的相关性在于脂质体基质中引入的PEG化脂质,因为这些显著地降低了生存素和R-DOTAP之间的不希望的静电反应,并且允许以减少含量的单价离子进行产生和贮存。
体内结果强调了制剂参数对于疫苗的佐剂性能的重要性。在约200nm(150–300nm)的粒径下,3–5mM,优选3.5–4.5mM,更优选4mM R-DOTAP被鉴定为最优佐剂浓度。并且,证明脂质组合物对于疫苗而言具有最外部(outmost)的重要性。引入作为制剂组分的DMPC使疫苗失活,而采用DOTAP、EPC和胆固醇的混合物能检测到强且稳健的作用。PEG化脂质和蔗糖的添加降低了疫苗的功效。但甚至在100mg/mL蔗糖的情况下仍能记录到细胞毒性作用。通过将蔗糖浓度减少至50–25mg/mL,增强了体内性能。
组合治疗
在另一方面,免疫治疗剂的给予有利于同时或依次与本发明的脂质体疫苗接种组合物联用。本发明的合适的免疫治疗剂有,例如,抗癌症抗体,例如抗VEGF(R)抗体,抗EGFR抗体如贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、埃罗替尼、吉非替尼和阿法替尼,或抗PDL1抗体,例如如WO 2013/079174中所公开。抗体可优选通过其C末端重链融合至细胞因子,例如IL-2、TNFa、IFNb和IL12。
在本发明的一个优选实施方式中,已知的融合蛋白NHS-IL12和NHS-IL2(Selectikine),优选NHS-IL12,与本发明的脂质体制剂联用。NHS-IL12是融合蛋白,其包含通过核细胞结合至肿瘤的坏死核心("TNT"抗体,参见WO 2000/001822)的已知人抗体NHS76的重链,其中所述抗体在其C末端共价融合至IL-12的p40和/或p30亚基(经修饰),并且具有潜在的免疫刺激和抗肿瘤活性。给予后,免疫细胞因子NHS-IL12的抗体部分结合至从主要定位于坏死的固体肿瘤的核心处的坏死的肿瘤细胞释放的DNA,由此递送IL-12部分。进而,该试剂的IL-12部分刺激宿主免疫系统增加针对肿瘤细胞的免疫应答,由此抑制肿瘤生长。IL-12是促炎性细胞因子,其具有多种免疫调节功能,并且可增大宿主对于肿瘤细胞的免疫应答。通过靶向肿瘤细胞,NHS-IL-12可以降低与重组人IL-12的全身性给予相关联的毒性。
基于本发明的截短型生存素的,用于治疗多种癌症(优选卵巢癌症)的优选的组合疗法包括(图21–24):
·与低剂量环磷酰胺(CPA)组合:发现低剂量CPA增强了免疫应答,并且已知这通过CD4_25-Treg细胞的消耗介导。在数个癌症疫苗临床试验中也观察到了CPA活性。在DPX-Survivac I期研究中,还显示节律式低剂量CPA可直接增强DPX-Survivac的免疫原性。
·与抗PD-L1组合:疫苗的常规基本原理是对APC的活化和对抗原特异性CTL介导的免疫应答的刺激。然而,在慢性肿瘤抗原刺激的设定中,CD8T细胞经历耗竭,使它们变得功能失调。尽管多种机制会促进耗竭过程,但PD-L1是最为成熟表征的上调的抑制性分子,并且与疾病进展和免疫功能失调相关联。PD-L1的阻塞已显示对于在临床试验中增加肿瘤清除率的有效性。因此,认为本发明与抗PD-L1的组合将会促进CTL应答。此外,已在至少于一线化疗中失败的卵巢癌症患者中研究了抗PD-L1。18%的卵巢癌症患者(n=17)能够达到疾病稳定至少6个月。
·与NHS-IL12的组合:NHS-IL12是IL-12的靶向递送,其经建议以使该细胞因子成为更安全、更有效的癌症疗法。IL-12涉及原初T细胞向Th1细胞的分化,其可刺激T细胞的生长和功能。其刺激从T和NK细胞产生IFN-γ和TNF-α,并减少IL-4介导的IFN-γ抑制。IL-12还具有抗血管生成活性,这意味着其能够阻断新血管生成。因此,建议将本发明的截短型生存素与上述药物或其它抗癌症药物组合以增强总体抗肿瘤活性。
本发明的疫苗组合物还可额外包含其它化合物,所述化合物已知具有免疫刺激性,例如CpG或环磷酰胺。CpG核酸优选包含至少一种或多种(促有丝分裂的)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。在某些实施方式中,本发明的脂质体制剂或疫苗组合物的功能与促进免疫应答的效应物分子相呼应。例如,所述效应物分子可以是细胞因子部分,包括但不限于,IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、GM-CSF或任何其它细胞因子,尤其是能够激活ThI免疫应答的因子。所述效应物分子还可以是抑制免疫系统的细胞因子的抑制剂,例如,STAT3抑制剂。
治疗应用
在一个方面中,本发明涉及本文所述的脂质体制剂或本文所述的免疫刺激性疫苗在制备用于预防或治疗癌症或癌症相关的疾病的药物中的应用,其中所述癌症或癌症相关的疾病基于生存素特异性肿瘤细胞的存在。在一个优选方面中,所述脂质体制剂与选自下组的抗癌剂联用:环磷酰胺、卡铂、紫杉醇和NHS-IL12。
在一个方面中,本发明涉及预防或治疗有需要的个体中的癌症或癌症相关的疾病的方法,其中所述癌症或癌症相关的疾病基于所述个体中生存素特异性肿瘤细胞的存在,所述方法通过给予所述个体治疗有效剂量的本文所述的免疫刺激性疫苗来进行。在一个优选方面中,本发明涉及通过额外给予选自下组的抗肿瘤剂:环磷酰胺、卡铂、紫杉醇和NHS-IL12来进行治疗的方法。
因为生存素似乎在大多数癌症形式中表达,本发明的疫苗组合物或脂质体制剂很可能能够用于控制其中表达生存素的任何类型的癌症疾病。
因此,作为示例,本发明的组合物和制剂针对恶性血液病(包括慢性淋巴性白血病和慢性骨髓性白血病)、黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和前列腺癌具有免疫活性。该治疗应用包括给予患有所述疾病的患者有效量的本发明的药物组合物。
根据本发明,本发明的疫苗组合物或脂质体制剂还可包含药学上可接受的运载体和/或其它辅助物质和添加剂和/或佐剂。
本发明制剂通常包含安全且有效的量的上述截短型生存素多肽。本文中所用的"安全且有效的量"指,一定量的本发明的截短型生存素,其足以显著诱导对于癌症(例如,肺癌或卵巢癌)的积极改善。然而,同时,"安全且有效的量"足够小以避免严重副作用,即,允许在优势和风险之间存在一个合适的关系。对于这些限制的确定通常处于合理医学判断的范围内。关于本发明的药物物质,表述"安全且有效的量"优选指一定量的本发明的截短型生存素,其适于以如下方式刺激适应性免疫系统:不造成过度或破坏性的免疫反应,但优选地,也没有处于可检测水平以下的免疫反应。"安全且有效的量"还关于如下因素而变化:待治疗的具体病症以及待治疗患者的年龄和身体状况、病症的严重程度、治疗时长、伴随性治疗的性质,所用的具体药学上可接受的运载体,和类似因素,这可根据随诊医生所掌握的知识和经验来确定。本发明的脂质体或疫苗制剂可根据本发明用于人,也可用于兽医学目的,作为药物组合物用于疫苗接种。
本文所用的表述"药学上可接受的运载体"优选包括本发明脂质体或疫苗制剂的液体或非液体基质。如果本发明的脂质体制剂或疫苗组合物以液体形式提供,该运载体将通常是无热原的水;等张盐水或带缓冲的(水性)溶液,例如,磷酸盐或柠檬酸盐缓冲的溶液。
本发明的免疫原性疫苗组合物的量可根据具体应用而变化。然而,在各种情况中,单剂量疫苗优选是约10μg-约5000μg,更优选约50μg-约2500μg,例如,约100μg-约1000μg。在本发明的一个优选实施方式中,脂质体制剂的单一剂量根据本发明可包含500–1,200μg的所述脂肽,更优选700–900μg。在本发明的一个优选实施方式中,通过本发明的脂质体制剂进行的疫苗接种伴随着给予100–400mg/m2,优选250mg/m2的环磷酰胺,通过这种方式能够激活或增强患者的免疫系统。通常,在疫苗接种开始之前,一般1~5天,优选2~5天的单剂量应足够有效,然而其它不同的方案也是可用的。
给予模式包括皮内、皮下和静脉内给予、以时间控释制剂形式植入等。本文涵盖本领域抑制的任何和所有给予形式。还涵盖适于配制可注射的免疫原性肽组合物的本领域已知的任何和所有常规剂型,例如冻干形式和溶液、悬液或乳液形式,其必要时包含常规的药学上可接受的运载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲组分等。
在本发明的另一个方面中,本发明的疫苗组合物和脂质体制剂可与其它药学上有效的制剂和药物联合,这在下文中将做详细描述。
化疗/放疗
本发明的疫苗接种方法还包括“化-放疗”。本发明的化-放疗包括“化疗”。化-放疗也包括通过按照标准方法辐照进行或通过给予带放射性标记的化合物进行的“放疗”。根据本发明,辐照是优选的。
本文所用的术语“细胞毒性试剂”指的是一种物质,其通过造成细胞损毁来抑制或阻止细胞功能。该术语意在包括放射性同位素、化疗剂、免疫治疗剂,和毒素,例如具有酶促活性的细菌、真菌、植物或动物源性的毒素,或其片段。该术语还可包括细胞因子家族的成员,优选IFNγ,以及还具有细胞毒性活性的抗肿瘤试剂。
术语“抗癌剂”或“抗肿瘤剂”描述有效于癌症/肿瘤治疗的所有试剂。该术语包括,细胞毒性剂、化疗剂,和免疫治疗剂。
本发明的化-放疗通常以化疗起始,随后是放疗。然而,以放疗起始治疗也是可行的。化疗通过给予至少一种“化疗剂”,优选基于铂的药物,例如顺铂或卡铂来进行。根据本发明,化疗剂每天、每周或每2~5周给予,这取决于给药时程和给予的次数。
本发明的化疗包括给予化疗剂,其根据本发明的理解是细胞毒性剂类别的一员,并且包括直接对肿瘤细胞,且不间接通过其它机制(例如生物反应调节)发挥抗肿瘤作用(即,防止肿瘤细胞的发育、成熟或扩散)的化学剂。
以本发明的化-放疗设定给予的本发明优选的化疗剂有:基于铂的试剂,例如,顺铂或卡铂。然而,也可使用如下所述的其它化疗剂。
此外,可给予额外化疗剂或其它抗癌剂以促进请求保护的治疗的功效。市售应用、临床评价和临床前开发中存在大量的抗肿瘤试剂,其可包括在本发明中,用于通过联合治疗来治疗肿瘤/肿瘤形成。应指出,化疗剂可任选地与上述脂质体制剂一同给予。化疗或化疗剂的示例包括烷基化试剂,例如,氮芥、乙亚胺化合物、烷基磺酸酯/盐和具有烷基化作用的其它化合物,例如亚硝基脲、顺铂和达卡巴嗪;抗代谢物,例如,叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂;有丝分裂抑制剂,例如,长春花生物碱和足叶草毒素的衍生物;细胞毒性抗生素和喜树碱衍生物。优选的化疗剂或化疗包括氨磷汀(Ethyol)、卡巴他赛、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、放线菌素D、多西他赛、二氯甲基二乙胺、链脲菌素、环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、阿霉素(亚德里亚霉素)、阿霉素脂质体(Doxil)、吉西他滨(健择)、道诺霉素、道诺霉素脂质体(Daunoxome)、甲基苄肼、酮康唑、丝裂霉素、阿糖孢苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、五氟尿嘧啶(5-FU)、长春花碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇(紫杉酚)、多西他赛(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链脲菌素、它莫西芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、瘤可宁,及其组合。
在本发明的一个优选实施方式中,提供脂质体制剂,其中化疗剂选自下组:顺铂或卡铂,并且非铂基的化疗剂选自下组:长春瑞滨、依托泊苷、紫杉醇、多西他赛、长春地辛、吉西他滨、异环磷酰胺和培美曲塞,优选紫杉醇。
根据本发明施加化疗,通常通过至少两个周期,优选2–8个周期,更优选2–5个周期来进行。一个周期为21~35天,优选21~28天。化疗剂的给药方案取决于不同可能的患者和药物相关的状况与性质。通常,顺铂以每周期50–120mg/m2的剂量施用。卡铂或紫杉醇可根据本发明以每周期和每单剂量100–1500mg施用。
放疗根据本发明通过标准辐照进行,其中施加总计40–120Gy,优选至少50Gy,更优选50~75Gy。放疗通常分级进行,其中1.5–3.5Gy每天施加持续至少四天,优选依次5–7天。根据本发明待施加的总辐照剂量在21–35天范围内,优选28天内。必要时或有利时,可在辐照开始时或在中间间隔时施加3.5–15Gy,优选5–10Gee的加强剂量。
以下实施例以更具体的方式描述本发明,但不限制本发明的范围。
实施例
实施例1:材料
本发明中施用的磷脂物质列于表1。DOTAP获自默克密理博公司(MerckMillipore),且胆固醇购自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)。所有其它脂质获自德国脂质有限公司(Lipoid AG)。dC-生存素如下所述制备并由在C末端截短的人生存素的氨基酸序列组成,以获得更优的稳定性特点和更好的可制造性。其包含人生存素的氨基酸2-120(SEQ ID NO:3),并且具有如下特点:分子量13.8kDa,等电点6.0和熔点48℃。
实施例2:来源菌株大肠杆菌BL21(DE3)的工程改造和大肠杆菌T7E2菌株作为用于本发明的截短型生存素的表达菌株的制备
来源菌株大肠杆菌BL21(DE3)(诺瓦基)工程改造如下:
·大肠杆菌BL21(DE3)的引入(incoming)分析
·改变大肠杆菌BL21(DE3)基因组rpsL基因以获得链霉素抗性表型
·用大肠杆菌BL21(DE3)STR基因组背景中的loxP-cmR–loxP盒替代非必要的DE3原噬菌体区
·用大肠杆菌BL21(DE3)STR L'1DE3:loxP-cmR-loxP遗传背景中的合成的pgl基因替代Rac原噬菌体
·移除loxP-侧接的氯霉素标志物
大肠杆菌BL21(DE3)的基因组序列[gb#CPOO 1509.3]和Artemis软件(Rutherford等,Bioinformatics 16(10):944-5,2000)用于计算机虚拟(in-silico)菌株工程改造。大肠杆菌BL21(DE3)在补充有L-亮氨酸(0.04mg/mL)的LB Vegitone肉汤和琼脂或麦芽糖M9-小板(0.4%)上有氧增殖。必要时,氨苄青霉素(Ap)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Km)、链霉素(Str)和四环素(Tc)分别添加至最终浓度50flg/mL、15flg/mL、15flg/mL、50flg/mL和3flg/mL。
为了确保来源菌株大肠杆菌BL21(DE3)(购自诺瓦基)不具有葡萄糖酸化作用,生物工程改造菌株基因组DNA。BL21(DE3)基因组包含多种原噬菌体。存在潜在的风险,即在某些生理条件下,这些中的一些可能会变得具有活性以产生感染性噬菌体颗粒。λDE3噬菌体的存在退回到T7聚合酶(T7-RNAP)向细菌基因组的导入。为了进一步减少活动的机会,已在表达菌株中删除了位于T7-RNAP基因上游的38.3千碱基的DE3原噬菌体序列。此外,在引入磷酸-葡萄糖酸内酯酶基因拷贝的过程中删除Rac原噬菌体基因座。根据本发明的所得菌株是大肠杆菌T7E2(#1)并且特征为具有如下遗传特点:(i)链霉素抗性,这归因于基因组rpsL中的点突变,导致Lys43Arg交换(后续基于rpsL的逆选择的先决条件),(ii)无标记移除89.1%的DE3-原噬菌体,不破坏T7RNA-聚合酶基因和功能,和(iii)用源自大肠杆菌MG1655基因组序列的合成的pgl-基因替代Rac-原噬菌体。
实施例3:用表达质粒pAL37转化大肠杆菌T7E
来源质粒是pET42(诺瓦基),其通过pAL28最终设计成最终表达质粒pAL37。pLA37的质粒DNA完全示于图20并且由SEQ ID NO:4代表。相应的限制性内切酶的限制性位点示于图19。质粒AL37包含编码截短型生存素序列SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:1的1–120aa)的DNA,该截短型生存素从其表达后释放进入介质,第一甲硫氨酸残基被切割掉,由此得到代表性的截短型生存素SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:1的2–120aa)。
对于转化,大肠杆菌T7E2#1细胞在冰上溶解,添加1μl的质粒al37并在冰上孵育30分钟,在42℃孵育30秒,并再次于冰上孵育2分钟。然后,添加250μl无抗生素的LB Vegitone肉汤,并在37℃孵育60分钟,以450rpm振荡。培养物铺板于补充有卡那霉素和链霉素的LBVegitone琼脂板并在37℃孵育过夜。
来自该板的细胞用于产生通过三重划线而具有单个集落的琼脂板。在28℃孵育两天后,采用小型单个集落来接种具有挡板的1L摇瓶中的200mL化学确定的培养基,以28℃和160rpm保持过夜用于一次培养物。二次预培养物采用1.44mL的一次培养物接种,供于光学密度为OD 578nm=0.001。培养物在28℃,160rpm下孵育约20小时。添加17%甘油和2mM甜菜碱,并使细胞悬液分散在10x1mL冷冻管中,盖上盖子,并将所述管在液氮中速冻,并贮存在上述液氮中。
为了产生研究工作细胞库,在各例中,解冻一管第一细胞储液。采用175μl的储液接种具有挡板的1L摇瓶中的200mL化学确定的培养基,以28℃,160rpm孵育过夜。添加17%甘油和2mM甜菜碱,并使培养物分散于50x1mL冷冻管(供于第一RWCB)和100x1mL管(供于第二RWCB)中。盖上盖子并将管置于细胞冷冻装置Planer Kryo 10中并冷冻。冷冻之后,处理结束,并将管小心置于冷冻罐中。分析所得物质的特性、纯度、活力、革兰氏染色和污染的噬菌体。符合所有可接受的标准。
实施例4:本发明的截短型生存素的葡萄糖酸化的方案
·获自实施例3的截短型生存素经凝胶过滤进入缓冲液
·125mg生存素(5mg/mL)在25℃水浴中搅拌
·添加固体葡萄糖酸-1,5-内酯,200mM终浓度
·时程0-20h,主反应在45分钟后撤回
·凝胶过滤
·浓缩
·通过cIEF、ESI-MS、SE+RP-HPLC分析
·产出约100mg(80%),其中总葡萄糖酸化的部分为约65%
·反应物在约60分钟后获取(pH指示GL完全水解)
·该分辨率下,单和双修饰动力学之间无差异
实施例5:脂质体生成方法
向96孔板的各孔添加220μl的缓冲液或蛋白质溶液。首先将脂质溶解于乙醇,然后以33μl/孔注射进入含有缓冲液的孔。各制剂重复三次。各孔通过吹打混合。脂质注射通过Eppendorf多吸管分液器以分配模式和速度水平5进行,这对应于约0.5mL/分钟的水性溶液。最终混合步骤通过Biohit Proline 12-通道吸管,以P模式和速度水平1进行,这是约30mL/分钟。用于混合的每次吹打体积为100μl,且各孔吹打一次。除非另有说明,最终脂质浓度为1mM,且生存素浓度为0.1mg/mL。各制剂重复三次。
实施例6:连续乙醇注射脂质体生产方法
采用2mm内径的硅酮管,以80mL/分钟的流速,将缓冲液或蛋白质溶液泵入样品容器。脂质先溶解于乙醇,然后以12mL/分钟的流速注射进入缓冲流。最终脂质体溶液收集于样品容器中。除非另有说明,最终制剂显示10mM的脂质浓度和1mg/mL的总蛋白质含量。各制剂重复三次。
实施例7:粒径和ζ电位检测
脂质体的尺寸测量通过动态光散射采用Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器进行。检测在25℃下以固定的173°反向散射角进行。通过相同的Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器检测脂质体的ζ电位。脂质体溶液以1:100在水中稀释。检测在25℃采用斯莫路科夫斯基(Smoluchowski)模型进行。
实施例8:产生本发明的药物产品的药物物质的配制
脂质体分散于由如下组分组成的缓冲介质:
·脂质组合物:20%R-DOTAP,35%高纯度EggPC(EPC),45%胆固醇(全部%mol/mol)
·分散物中的总体脂质组合物:20mM
·分散介质:20mM磷酸钾pH7、150mM KCl、10mM单硫代甘油(MTG)
·含量dC-生存素:0.8–1.0mg/mL总含量,药物载量0.6mg/mL
包含77mM脂质的磷脂的乙醇溶液通过如下方式制备:称取107.6mg DOTAP,207.1mg EPC和134.0mg胆固醇于合适的玻璃烧杯中,并用乙醇(>99%纯度)添加至10mL。API在包含20mM K2HPO4、150mM KCl、10mM MTG的缓冲液中稀释。
脂质体通过如下方式制备:在t型混合装置中控制混合乙醇和缓冲溶液。乙醇相的流速为12mL/分钟且缓冲液相的流速为80mL/分钟。所得的脂质体分散物通过在Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO 10kDa,PES)中透析24h(采用5x缓冲液交换)来纯化。在最后一步中,脂质体通过渗滤法浓缩2x。所得的脂质体通过DLS检测并显示平均粒径为约120nm且PDI<0.15。供于进一步处理,脂质体在2.5%(w/v)蔗糖的存在下经冷冻或冻干。所得的颗粒显示平均粒径为200–300nm,PDI>0.15。药物载量分析揭示有0.6mg/mL的抗原结合至脂质体颗粒。
为了允许冻干样品,缓冲组合物变成20mM K2HPO4。还要求阳离子根据单价盐中的钾进行调整。在由20mM K2HPO4、10mM MTG组成的pH 7.0的缓冲液中进行从0到150mM的KCl滴定。需要最少30mM KCl来保持DS缓冲液中的蛋白质。为了确保脂质体存在下的可加工性,浓度提高至150mM KCl。
Claims (32)
1.一种C末端截短型生存素,其由如SEQ ID NO:1所示的全长人生存素的前118–133N末端氨基酸组成,或与所述截短型生存素具有>90%的同源性的序列,其中,所述截短型生存素在一个或多个位置经葡萄糖酸化。
2.如权利要求1所述的C末端截短型生存素,其中存在的赖氨酸残基中的至少一个被葡萄糖酸化。
3.如权利要求1或2所述的C末端截短型生存素,其由全长人生存素的前120个N末端氨基酸组成,其中所述截短型生存素如氨基酸序列(SEQ ID NO:2)所示:
MGAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK。
4.如权利要求1或2所述的C末端截短型生存素,其中,N末端位置1处的甲硫氨酸残基被移除。
5.如权利要求4所述的C末端截短型生存素,其由全长人生存素的前120个N末端氨基酸组成,其中所述截短型生存素如氨基酸序列(SEQ ID NO:3)所示:
GAPTLPPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFCFKELEGWEPD
DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK。
6.如权利要求4所述的C末端截短型生存素,其中位置1处的甘氨酸残基被葡萄糖酸化。
7.如权利要求6所述的截短型生存素,其中位置1处的甘氨酸残基和位置22和/或位置102处的赖氨酸残基被葡萄糖酸化。
8.如权利要求1-7中任一项所述的截短型生存素,其中所述葡萄糖酸化以合成方式通过葡萄糖酸-1,5-内酯来实现。
9.如权利要求1-8中任一项所述的截短型生存素,其中所述截短型生存素是非糖基化的。
10.一种生存素组合物,其包含如权利要求1-9中任一项所述的截短型生存素,和相应的非葡萄糖酸化的截短型生存素,其中在所述组合物中,10–80%的所述截短型生存素分子被葡萄糖酸化。
11.如权利要求10所述的生存素组合物,其中,35–45%的所述截短型生存素分子被葡萄糖酸化。
12.一种脂质体制剂,其包含如权利要求1-9中任一项所述的截短型生存素,或如权利要求10或11所述的生存素组合物,和至少一种佐剂,其中,所述至少一种佐剂是起免疫调节剂作用的手性阳离子磷脂。
13.如权利要求12所述的脂质体制剂,其中,所述手性阳离子磷脂是DOTAP。
14.如权利要求13所述的脂质体制剂,其中,所述脂质体制剂中的DOTAP的浓度是2–8mM。
15.如权利要求13或14所述的脂质体制剂,其中,所述手性阳离子脂质是R-DOTAP。
16.如权利要求12-15中任一项所述的脂质体制剂,其包含胆固醇和选自下组的至少一种磷脂:卵磷脂(PC)、磷酸乙醇胺(PE)和磷酸甘油(PG)。
17.如权利要求16所述的脂质体制剂,其中,所述磷脂是选自下组的卵磷脂(PC):
DLPC、DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、EPC和EPC3。
18.如权利要求17所述的脂质体制剂,其中,所述卵磷脂是蛋卵磷脂(EPC)。
19.如权利要求12-18中任一项所述的脂质体制剂,其中,所述手性阳离子磷脂佐剂是R-DOTAP,且其在所述脂质制剂中的含量是15~30%(mol/mol)。
20.如权利要求12-19中任一项所述的脂质体制剂,其包含含量为25–55%(mol/mol)的胆固醇。
21.如权利要求12-20中任一项所述的脂质体制剂,其包含含量为30–80%(mol/mol)的卵磷脂(PC)。
22.如权利要求12-21中任一项所述的脂质体制剂,其中所述制剂的脂质体颗粒的颗粒表面电荷≥17mV。
23.如权利要求12-22中任一项所述的脂质体制剂,其中抗原荷载是0.5–1.5mg/mL。
24.如权利要求12-23中任一项所述的脂质体制剂,其中所述制剂中至少70%的脂质体颗粒的粒径为50~500nm。
25.如权利要求12-24中任一项所述的脂质体制剂,其包含
(i)如权利要求10所述的生存素组合物,
(ii)脂质组分R-DOTAP、胆固醇和EPC,
(iii)在所述制剂中具有3–5mM的浓度的R-DOTAP,
(iv)脂质体颗粒,其中至少70%的所述颗粒的粒径是50–250nm,和
(v)0.5mg/mL(±0.1mg/mL)的抗原荷载。
26.如权利要求25所述的脂质体制剂,其中
(i)所述截短型生存素如SEQ ID NO:3所示并且是非糖基化的,其中40%(±5%)的所述截短型生存素被葡萄糖酸化,和
(ii)脂质组合物的含量是:
10–30%R-DOTAP、
25–55%胆固醇,和
30–60%EPC(mol/mol)。
27.一种免疫刺激性疫苗,其包含如权利要求12-26中任一项所述的脂质体制剂,任选地还包含药学上可接受的运载体、赋形剂、添加剂或稀释剂。
28.如权利要求27所述的免疫刺激性疫苗,其通过疫苗接种在人个体的预防或治疗中应用,其中所述个体患有癌症或癌症相关的疾病,或具有患癌症或癌症相关疾病的倾向,其中所述癌症或癌症相关的疾病基于生存素特异性肿瘤细胞的存在。
29.用于如权利要求28所述应用的免疫刺激性疫苗,其用于治疗人个体,其中,所述疫苗接种触发所述个体中的生存素特异性免疫应答。
30.用于如权利要求29所述的应用的免疫刺激性疫苗,其中CD4+和/或CD8+T细胞应答被引发。
31.用于如权利要求28-30中任一项所述应用的免疫刺激性疫苗,其中采用所述疫苗进行的疫苗接种抑制或阻止肿瘤生长。
32.一种药物组合物,其包含如权利要求12-26中任一项所述的脂质体制剂,或如权利要求27所述的免疫刺激性疫苗,和选自下组的抗肿瘤剂:环磷酰胺、卡铂、紫杉醇和NHS-IL12。
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