CN116617414A - 一种脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种脂质体，所述脂质体内包覆有Cas13d mRNA、crRNA、厚朴酚；所述Cas13d mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。该脂质体包覆有Cas13d mRNA、crRNA、厚朴酚，具有良好的抗病毒效果和广谱性；同时本发明还公开了该脂质体的应用以及制备方法。

Description

一种脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
据世界卫生组织统计，流感病毒导致全球每年约290,000-650,000人死亡。当前，H1N1和H3N2亚型流感病毒是季节性流行的主要毒株，此外，由于动物源性流感病毒频繁跨越种间障碍感染人，H5、H7、H9和H10等亚型流感病毒均已在人群中分离到。然而，现有的抗流感药物易诱导病毒耐药性或对机体具有致畸性等副作用。神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦和奥司他韦)是目前使用最广泛的抗流感药物，临床研究表明，流感病毒通过突变已经获得了对此类药物的耐药性。近年来上市的抗流感新药RNA聚合酶抑制剂(法匹拉韦和巴洛沙韦)也在短时间内致使流感病毒发生耐药突变。因此，亟需研发可有效防止病毒耐药突变的新型广谱抗流感药物。
目前的前沿技术已经将着眼点聚焦于核酸疗法，与传统的针对蛋白的治疗策略相比，该疗法由于其靶标为基因从而可以达到显著的疗效，目前应用较多的核酸疗法主要包括DNA药物、mRNA药物以及siRNA药物等，在癌症、病毒感染等疾病治疗中具有极大的潜力。当前大量研究利用CRISPR/Cas技术开发抗病毒新药，例如乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、猪流行腹泻病毒(PEDV)、艾滋病病毒(HIV)以及SARS-CoV-2等。同时，纳米递送技术的日渐成熟为核酸疗法的快速发展推波助澜，当前被数以亿计人次接种的mRNA新冠疫苗也采用了纳米脂质体递送系统。
现有技术大多通过重组病毒的方式作为疫苗株抗流感，其劣势在于:通过重组病毒得到减毒毒株并用于流感疫苗的抗流感效果取决于疫苗株与当前流行毒株之间的匹配程度，而流感流行株的快速变异也致使疫苗通常无法有效地发挥保护作用，并且当应对新突变流感毒株时，研发适配疫苗所需周期长，无法及时应对流感流行。
关于脂质体的检索大致可参考如下专利：
CN2023100109516公开了一种用于递送核酸的可电离阳离子脂质化合物和组合物及用途；
其说明书记载：
一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括根据前述权利要求中任一项所述的的式(I)化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体；
所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25％～75％；
所述载体还包含中性脂质；
其中所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1～15:1，优选为4.5:1。
其中所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。
CN115645383A公开了厚朴酚在制备抗EV71病毒药物中的应用；
CN111297851A公开了香豆素在蜜蜂抗病毒感染中的应用，发现香豆素能够抑制蜜蜂体内中蜂囊状病毒(CSBV)的增殖，降低病毒的拷贝数；同时，还能够诱导内源性抗菌肽的表达，提高蜜蜂的先天性免疫防御力。说明香豆素能够显著提高感染中蜂囊状病毒(CSBV)的中华蜜蜂幼虫的存活率，降低其死亡率。香豆素可用于制备防治CSBV感染的药物。
CN109432056A公开了一种聚合物包覆姜黄素共晶的复合纳米颗粒及其制备和在制药中的应用，包括核以及包覆在核上的壳，所述的核为姜黄素共晶，所述的壳为亲水性聚合；制得的复合纳米颗粒的应用，将其用于制备抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗氧化或免疫调节中的至少一种的药物。
通过以上可见，厚朴酚、香豆素、秦皮甲素、姜黄素均具有抗病毒、抗炎的作用。但是本领域技术人员无法获知，这四者能否与RNA结合，来进一步提高抗病毒效果。
在本发明的研究中，我们发现进一步提高脂质体抗流感的效果，不仅仅和RNA密切相关、脂质体壳材密切相关，在实验了多种被报道具有抗炎抗菌作用的中药提取物共载在纳米脂质体中后，发现一些令人惊奇的现象。
本案要解决的技术问题为：如何开发出一种具有广谱、效果优异的抗流感病毒的药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种脂质体，该脂质体包覆有Cas13dmRNA、crRNA、厚朴酚，具有良好的抗病毒效果和广谱性；
同时本发明还公开了该脂质体的应用以及制备方法。
一种脂质体，所述脂质体内包覆有Cas13d mRNA、crRNA、厚朴酚；所述Cas13d mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。
在上述的脂质体中，Cas13d mRNA、crRNA的总重、厚朴酚的重量的比例为10-50:100-1000，优选地，Cas13d mRNA、crRNA的总重、厚朴酚的重量的比例为14-22:300-700。
在上述的脂质体中，所述Cas13d mRNA、crRNA均经过加帽和加尾处理。
在上述的脂质体中，所述脂质体的壳层由如下成分组成：
DOPC 7.6份；
DOTAP 0.2份；
胆固醇0.5份；
DSPE-PEG2000 0.32份；
DSPE-PEG3600-GALA 0.08份。
在上述的脂质体中，Cas13d mRNA、crRNA的摩尔比为1：1。
此外，本发明还公开了如上任一所述的脂质体作为抗流感药物的活性成分的用途。
最后，本发明还公开了一种如上任一所述的脂质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：在旋膜瓶中加入壳层的材料以及厚朴酚；
步骤2：旋膜，得到脂材薄膜；
步骤3：将含Cas13d mRNA、crRNA的水溶液加入到步骤2的旋膜瓶中，旋膜瓶置于超声仪中轻晃以促使旋膜瓶壁上的脂材薄膜水合；得到脂质体药物；
步骤4：将脂质体药物通过水系滤膜，得到脂质体。
在上述的脂质体的制备方法中，所述步骤1具体为：将甲醇与氯仿按照体积比1:1配制成有机相，取2mL有机相于已用氯仿润洗后的50mL旋膜瓶中，并依次加入以下质量的材料：
DOPC 7.6mg；
DOTAP 0.2mg；
胆固醇0.5mg；
DSPE-PEG2000 0.32mg；
DSPE-PEG3600-GALA 0.08mg；
厚朴酚0.5mg。
DSPE-PEG3600-GALA的化学名称为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3600-GALA，GALA多肽连接在聚乙二醇3600上，该物质委托西安瑞禧生物合成。GALA为多肽，其氨基酸序列为WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA；GALA为本领域常用的肺靶向多肽。
在上述的脂质体的制备方法中，所述步骤2具体为：关闭旋蒸仪放气口，打开抽气阀，以100r/min转速旋膜25min；
所述步骤3中含Cas13d mRNA、crRNA的水溶液中的水为2ml；
所述步骤4中水系滤膜的规格为0.22μm。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
一方面，本发明的crRNA转录载体可转换得到CRISPR-Cas13d的crRNA，其和Cas13dmRNA配合，可达到广谱抗流感病毒的效果；CRISPR-Cas13d系统可以同时靶向流感病毒PA、NP、M基因，多靶点组合可以有效阻止流感病毒发生耐药突变。
crRNA中所具有的PA、NP、M基因是经过反复筛选，从2018年至2022年所有感染人类的H1N1、H3N2、H5NX、H7N9亚型流感病毒以及2018年至2022年所有的H9N2亚型流感病毒的PA、NP、M的mRNA序列中筛选得到3个分别靶向PA基因、NP基因、M基因的序列并将其设计为crRNA；并将其连接到载体上之后发现，其表现出非常优异的抗病毒效果。
具体来说，CRISPR-Cas13d系统可以同时靶向流感病毒PA、NP、M基因，多靶点组合可以有效阻止流感病毒发生耐药突变。
对于流感病毒来说，HA、NA、M1、M2、PA、PB1、PB2、NP、NS1、NS2、PB1-F2等11个已知的病毒蛋白质中，我们经过分析后认为：以HA、NA基因为例，这类病毒表面基因，很容易突变，同时，寻找这类基因的保守区有效的crRNA也会非常困难，从广谱抗病毒性的角度来说，经过前期实验，我们排除了此类基因进入后续筛选的可能性；
经过反复筛选后，我们确定了PA基因、NP基因、M基因是最佳候选对象；同时，我们也发现，在这三个基因中寻找保守区有效的crRNA会更为可靠和有效；
经过上述工作后，还需要进行不同病毒的PA基因、NP基因、M基因的筛选，寻求最佳的组合；crRNA中所具有的靶向PA、NP、M基因的序列是经过反复筛选，从2018年至2022年所有感染人类的H1N1、H3N2、H5NX、H7N9亚型流感病毒以及2018年至2022年所有的H9N2亚型流感病毒的PA、NP、M的mRNA序列中筛选得到3个靶向PA基因、NP基因、M基因的序列并将其设计为crRNA；并将其连接到载体上之后发现，其表现出非常优异的抗病毒效果。
上述的crRNA采用PA基因、NP基因、M基因可基本覆盖现有流行的流感病毒，具有广谱性和有效性。
另外一方面，采用脂质体对CRISPR/Cas13d系统、厚朴酚进行包覆，得到了远超脂质体对CRISPR/Cas13d体系与香豆素、秦皮甲素、姜黄素中的任一者进行复配后包覆的脂质体的抗病毒性能。
具体来说，本发明的药物利用经肺靶向肽改造的纳米脂质体载体，不仅可以保护CRISPR/Cas系统免于在体内降解并且实现药物肺部靶向功能，其精准给药的特点不仅可以快速达到治疗效果，并且可以降低药物在其他组织的累积从而极大地降低药物的毒副作用；此外，此药物为双载药体系，联合抗菌抗炎中药厚朴酚，降低病毒感染对机体的炎症反应的影响并且有效防止继发细菌感染等不良预后。
附图说明
图1为三质粒报告系统的构建示意图；
图2为含M基因的三质粒报告系统的靶向效果图；
图3为含NP基因的三质粒报告系统的靶向效果图；
图4为含PA基因的三质粒报告系统的靶向效果图；
图5为含M基因的三质粒报告系统的靶向效果表；
图6为含NP基因的三质粒报告系统的靶向效果表；
图7为含PA基因的三质粒报告系统的靶向效果表；
图8为含M基因的三质粒报告系统的reporter mRNA水平表；
图9为含NP基因的三质粒报告系统的reporter mRNA水平表；
图10为含PA基因的三质粒报告系统的reporter mRNA水平表；
图11为如SEQ ID NO.2所示的crRNA质粒的NP1、M2、PA5的三个最高效的crRNA串联示意图；
图12为含NP1 crRNA、M2 crRNA、PA5 crRNA以及NP1、M2、PA5串联的CRISPR/Cas系统的抗流感病毒效果表；
图13为负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的电镜图；
图14为不同氮磷比情况下的负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的电泳图；
图15为负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的表面电位图；
图15中横坐标的中文含义为脂质体表面电位；纵坐标的中文含义为该电位脂质体在制备体系中的占比；
图16为负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的粒径分布图；
图16中横坐标的中文含义为脂质体粒径；纵坐标的中文含义为该粒径脂质体在制备体系中的占比；
图17为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H1N1病毒的抗病毒效果；
图18为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H3N2病毒的抗病毒效果；
图19为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H5N6病毒的抗病毒效果；
图20为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H7N9病毒的抗病毒效果；
图21为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H9N2病毒的抗病毒效果；
图17-21的纵坐标的中文含义为流感病毒核蛋白的相对变化倍数；
图22为不同的材料的抗流感病毒时的炎性因子IL-1β的表达水平的图表；
图22中，纵坐标表达的中文含义为炎性因子IL-1β的相对变化倍数；
图23为不同的材料的抗流感病毒时的炎性因子IL-6的表达水平的图表；
图22中横坐标轴上各英文代表的实验对象分别为空白对照组、CRISPR/Cas组、厚朴酚组、CRISPR/Cas+厚朴酚组、空载脂质体组、脂质体包裹的CRISPR/Cas+厚朴酚组；
图23中，纵坐标表达的中文含义为炎性因子IL-6的表达水平；
图23中横坐标轴上各英文代表的实验对象分别为空白对照组、CRISPR/Cas组、厚朴酚组、CRISPR/Cas+厚朴酚组、空载脂质体组、奥司他韦组、脂质体包裹的CRISPR/Cas+厚朴酚组；
图24为采用单独crRNA或采用串联crRNA时，脂质体的抗病毒效果图表；
图25为采用DMPC、DOPE、DOPC作为壳材材料时，脂质体的抗病毒效果图表；
图26为采用不同重要提取物替代厚朴酚时，脂质体的抗病毒效果图表；
图27为本发明的脂质体在0.5h时没有被细胞内的溶酶体吞噬的显微镜照片；
图28为2h、4h、10h时细胞内的脂质体的分布状态，4h时纳米脂质体多数被溶酶体吞噬，10h时纳米脂质体成功从溶酶体中出逃。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
第一部分CRISPR/Cas13d体系的构建和三质粒体系性能验证
1、筛选高效、广谱的crRNA并串联组合
(1)保守序列分析：从NCBI与GISAID下载2018年至2022年所有感染人类的H1N1、H3N2、H5NX、H7N9亚型流感病毒以及2018年至2022年所有的H9N2亚型流感病毒的PA、NP、M的mRNA序列，并利用MAFFT Version7进行序列比对，随后将比对好的序列导入jalview(2.11.2.0)以分析保守性，以21-30个碱基序列为分析单位计算保守性并作为crRNA的spacer序列，由此筛选出18条序列，序列如下表1；
表1各基因的序列以及保守性数据表
NP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
NP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
NP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
NP4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
NP5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
NP6的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示；
NP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示；
PA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
PA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
PA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
PA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
PA5的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
M1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
M2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
M3的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
M4的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
M5的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
M6的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；
(2)高效crRNA筛选三质粒体系的构建：如图1所示，为三质粒筛选示意图，Cas13d表达质粒序列如SEQ ID NO.1所示；
当构建crRNA转录质粒时，依据上述的保守序列，在Oligo合成时F链5’端添加AAC(如果第一个碱基不是G，就添加AACG)，R链5’端添加TTG(或TTGC)，具体合成序列如下表2；
crRNA质粒载体序列如SEQ ID NO.2所示，并且连接了EGFP绿色荧光蛋白；
需要说明的是：SEQ ID NO.2所示的序列是指搭载了NP1、M2、PA5三个crRNA序列；其插入先后顺序为M2、PA5、NP1；其插入位置为SEQ ID NO.2的第4850-5100位核苷酸的位置；
表2各基因对应的引物表
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将合成后的Oligo稀释至100μM，并通过退火的方式合成双链，体系如下表3：
表3合成体系配方
需要说明的是，表3中的F为上述表2中的上游引物；R为上述表2中的下游引物；10*PCR buffer的供应商为：Takara
在PCR仪中进行退火条件如下表4：
表4合成退火条件
crRNA质粒载体的酶切，反应体系如下表5：
表5酶切体系
crRNA质粒载体的序列可参考SEQ ID NO.2，删除掉第4850位核苷酸～第5100位核苷酸即为表5中的crRNA质粒载体；
反应程序：50℃酶切4h。
NEB buffer 3.1(10x)的供应商为：New England Biolabs；
BspQ1酶的供应商为：New England Biolabs；
酶切后进行琼脂糖凝胶电泳并切胶利用胶回收产物试剂盒(供应商为：omega)回收，酶切好的crRNA质粒载体；使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定回收产物浓度，并做好记录。
crRNA载体与退火后DNA的连接体系参考表6：
表6连接体系配方表
表6中的退火产物即为表4退火合成的双链；
反应程序：16℃过夜。
T4DNA连接酶的供应商为：New England Biolabs；
T4 DNA连接buffer(10x)的供应商为：New England Biolabs；
通过表6的配方，得到连接产物，将连接后的质粒转化：取10μL连接产物，加入到50μL感受态细胞中，冰上静置5min，随后金属浴42℃热激45s，后置于冰上2min，然后加入到500μL LB培养基中放入37℃摇床中摇10min，取200μL加入到提前37℃预热的LBA平板中，倒入6颗玻璃株后充分摇晃，倒扣于37℃培养箱中培养13h，次日每组挑取5个单菌落送测序(U6引物正向测一个反应)。
上述的连接产物根据连接的退火后的双链的不同，得到不同的连接产物，如插入NP1的crRNA质粒、插入M1的crRNA质粒、插入PA1的crRNA质粒；
这些连接产物在后续的三质粒报告系统进行crRNA靶向效果检测中使用；
Reporter表达质粒的构建
Reporter表达质粒构建时从H1N1与H5N6病毒上通过PCR的方式获得PA、NP、M片段序列，并在PCR引物F端添加同源臂TGGACGAGCTGTACAAGTAA，在R端添加同源臂AGCGGTTTAAACTTAAGCTT，PCR引物合成序列如下表7所示，reporter表达质粒序列如SEQ IDNO.3所示；
需要说明的是，SEQ ID NO.3所示的reporter表达质粒的序列，在第927位核苷酸～第1637位核苷酸为mCherry(红色荧光蛋白)的序列；在第1638位核苷酸～第2619位核苷酸为CA04 M基因所对应的序列；
在后续的三质粒报告系统进行crRNA靶向效果检测中，会使用到插入有CA04 NP基因、CA04 PA基因、H5N6 M基因、H5N6 PA基因的reporter表达质粒，在上述CA04 M基因的位置进行替换即可；为了节约篇幅，不对每个reporter表达质粒进行序列表示；
CA04 NP基因如SEQ ID NO.77所示；CA04 PA基因如SEQ ID NO.78所示；H5N6 M基因如SEQ ID NO.79所示；H5N6 PA基因如SEQ ID NO.80所示；
表7Reporter表达质粒构建时所用引物
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利用phanta高保真酶获得线性化的Reporter报告载体反应体系参考表8：
表8Reporter报告载体的线性化反应体系配方表
本步骤的主要目的是得到线性化Reporter质粒，得到的序列大体和如SEQ IDNO.3所示，不同的是，没有插入如SEQ ID NO.3所示的CA04 M基因。
2xphanta Flash Master mix的供应商为：诺唯赞；
反应程序参考表9；
表9Reporter报告载体的线性化反应程序
上述98℃，10s；Tm-5℃，5s；72℃，5s循环30次；
将线性化reporter报告载体与CA04与H5N6的PA、NP、M片段连接，根据clonExpress说明书计算出加入体系中的插入片段的含量与线性化reporter报告载体的含量：
表10reporter报告载体连接各基因的配方表
连接反应体系：
表11reporter报告载体连接各基因的配方表
5xCEII buffer的供应商为：诺唯赞；
将连接后的质粒转化：取10μL连接产物，加入到50μL感受态中，冰上静置5min，随后金属浴42℃热激45s，后置于冰上2min，然后加入到500μL LB培养基中放入37℃摇床中摇10min，取200μL加入到提前37℃预热的LBA平板中，倒入6颗玻璃株后充分摇晃，倒扣于37℃培养箱中培养13h，次日每组挑取5个单菌落送测序(BGH反向测通)。
(3)利用(2)中构建的三质粒报告系统进行crRNA靶向效果检测：
①使用贴壁得包板子，提前一天向24孔板中加入稀释200倍的贴壁得溶液，每孔添加500μL，并置于细胞培养箱30min后弃去多余的溶液，包好的板子可置于常温以供后续使用；
②在包好的24孔板中铺入293T细胞板，每孔铺2.5×105个细胞；
③次日，当细胞密度长至80％时，根据以下体系向每个孔中转入对应crRNA的三质粒系统，并对每个reporter设置一组non-target对照组；
表12三质粒体系的配方表
需要说明的是：Cas13d表达质粒如SEQ ID NO.1所示；crRNA转录质粒即上述经过转化后的连接产物；
④转染后48h观察每孔crRNA靶向效果，红光为mCherry蛋白的表达水平，其表达水平越低，表示crRNA效果越佳，结果如图(图2-图7)所示；
图2为含M基因的三质粒报告系统的靶向效果图；
图3为含NP基因的三质粒报告系统的靶向效果图；
图4为含PA基因的三质粒报告系统的靶向效果图；
图5为含M基因的三质粒报告系统的靶向效果表；
图6为含NP基因的三质粒报告系统的靶向效果表；
图7为含PA基因的三质粒报告系统的靶向效果表；
图5-7中纵坐标的中文含义为reporter载体中mCherry荧光蛋白的水平；
⑤提取各组RNA并利用qPCR检测各组中reporter mRNA水平，结果如图(图8-图10)所示，由此筛选出靶向效果最佳的crRNA:PA5、NP1、M2；
图8为含M基因的三质粒报告系统的reporter mRNA水平表；
图9为含NP基因的三质粒报告系统的reporter mRNA水平表；
图10为含PA基因的三质粒报告系统的reporter mRNA水平表；
图8-10中纵坐标的中文含义为reporter载体中靶基因的表达水平；
需要说明的是，在本发明的图9中，NP5和NP1的靶向切割效果是相近的，但是经过序列比对分析后发现，NP1能够和更多的流感病毒匹配，NP5能够匹配的流感病毒的种类比较少，广谱性不佳；从广谱性和抗病毒能力的角度来说，我们最终选择了NP1；
在本发明的图10中，PA3基因和P5基因的靶向切割效果是相近的，我们选择了PA5，其原因在于序列比对分析表明其能够和更多的流感病毒匹配，所以，我们最终选择了PA5；
(4)利用Golden Gate技术将效果最佳的crRNA:PA5、NP1、M2三者串联，串联后质粒序列见SEQ ID NO.2，示意图见图11。通过oligo退火方式获得双链DNA，oligo合成如下表：
表13PA5、NP1、M2串联所需引物表
将退火后的双链DNA中PA5片段进行磷酸化，磷酸化反应体系：
表14PA5、NP1、M2串联后的双链DNA磷酸化配方表
于37℃反应1h。
使用引物F:ggctacggtctctCGAAGACTTTTTTTTTCGCTTC(SEQ ID NO.75)，R:ggctacggtctcctggtaggggtttacttgCGGTGTTTCGTCCTTTCC(SEQ ID NO.76)对crRNA转录载体进行PCR，并通过胶回收后得到线性化的载体，随后利用以下体系(表15和16)进行Golden Gate实验：
表15配方表
反应程序：
表16反应条件表
上述37℃，1min；16℃，1min循环30次；
将连接产物进行转化，取10μL连接产物，加入到50μL感受态中，冰上静置5min，随后金属浴42℃热激45s，后置于冰上2min，然后加入到500μL LB培养基中放入37℃摇床中摇10min，取200μL加入到提前37℃预热的LBA平板中，倒入6颗玻璃株后充分摇晃，倒扣于37℃培养箱中培养13h，次日每组挑取5个单菌落送测序(U6引物正向测一个反应)。
2、广谱抗流感病毒的crRNA组合的抗病毒效果评估
(1)A549细胞铺细胞板：每个六孔板孔中铺入5×105个细胞，待细胞长至细胞孔80％-90％时，将细胞孔中的培养液轻轻移除，使用PBS轻轻洗涤细胞一次，弃去洗液；
(2)使用jetprime转染试剂向A549细胞中同时转染Cas13d表达质粒(SEQ IDNO.1)和串联crRNA转录质粒(SEQ ID NO.2)，每孔的转染体系如下表18：
表18转染体系配方表
混匀后，室温静置10min，随后加入到六孔板中的细胞培养基中；
(3)感染病毒：在转染后24h，将MOI＝0.1感染病毒H1N1，并用(配方：29mL DMEM+1mL BSA+0.6μL TPCK)加入到洗涤好的六孔细胞板中，放置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，待病毒吸附1h后，吸去病毒液，并用PBS洗涤细胞两次以洗去未吸附的病毒，随后，向每个孔中加入2mL无血清培养基(配方：29mL DMEM+1mL BSA+0.6μL TPCK)；
(4)收样，感染后24h收取细胞上清液进行TCID50检测，评估抗病毒效果，结果如图12所示。
通过图12可见，单采用NP1、M2、PA5，其抗病毒效果均不及NP1-M2-PA5，可以得到如下结论：crRNA串联之后可以保证NP1、PA5、M2均进入细胞，为crRNA在病毒复制的多个阶段(分别阻断NP核蛋白、PA聚合酶、M基质蛋白的转录和翻译)发挥阻滞作用提供保障，因此具有更高的抗病毒作用。
第二部分LNP-CRISPR/Cas13d体系、LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚体系的构建和性能验证
2.1LNP-CRISPR/Cas13d的制备，具体操作如下：
(1)Cas13d mRNA和crRNA的体外转录质粒模板构建：以经过哺乳动物密码子优化的Cas13d表达质粒为模板(序列如SEQ ID NO.4所示)，其需转录的RNA上游插入T7启动子，下游插入SapI酶切位点，在crRNA转录载体上游插入T7启动子，下游插入BbsI酶切位点；
(2)对(1)中质粒模板线性化：
酶切体系：
表19线性化配方表
表20线性化配方表
酶切程序：37℃水浴中孵育4h，65℃孵育20min以灭活酶；
crRNA转录质粒模板如SEQ ID NO.2所示；
(3)线性化模板胶回收：使用omega胶回收试剂盒对线性化后质粒模板进行回收与纯化，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定回收产物浓度，并做好记录。
(4)体外转录：实验前使用RNA酶与核酸清除剂喷洒生物安全柜台面和移液器，并准备已经高压过的ddH2O和带滤芯的无RNA酶；将1.5离心管、无RNA酶枪头、移液器、EP管架均置于紫外下照射30mins；从-20℃冰箱取出体外转录试剂盒置于冰上融化，然后置于漩涡仪中振荡混匀后瞬离；
体外转录体系：
表22转录配方表
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表23转录配方表
体外转录程序：37℃水浴中孵育16h，随后向体系中加入70μL ddH20，再加入1μLDNase I，于37℃水浴中孵育15min，以消除体系中的DNA模板。
经过转录后，得到如SEQ ID NO.4所示的Cas13d mRNA和如SEQ ID NO.81所示的三基因串联的crRNA；需要说明的是，Cas13d mRNA的序列和转录前的Cas13d表达质粒模板的序列基本相同。
(5)RNA的纯化：使用RNA纯化试剂盒对体外转录产物进行纯化以消除体系中存在的酶等杂质；向50μL体外转录产物中加入100μL Binding Buffer；随后，向体系中加入150μL无水乙醇，轻柔吹吸或轻弹离心管壁，切勿涡旋；将RNA吸附柱置于收集柱上，然后将混匀后的体系全部加入至RNA吸附柱中，16000g离心1min，弃去滤液；将RNA吸附柱重新插入收集管，加入500μL wash buffer后于16000g离心1min，弃去滤液，重复上述步骤一次；将吸附柱置于洁净的1.5毫升离心管中，加入80μL nuclease-free water，于16000g离心1min，为了最大限度回收RNA，将上述洗脱液重新加入至吸附柱中央，于16000g离心1min进行二次回收。
(6)RNA加帽：从-20℃冰箱中取出Vaccinia Capping system加帽试剂盒后置于冰上融化，然后置于漩涡仪中振荡混匀后瞬离；将10μg RNA与nuclease-free water混合，使终体积为15μL，于65℃水浴中孵育5min；取出后置于冰上静置5min，得到变性RNA，再依次加入以下体系：
表24RNA加帽配方表
反应程序：37℃水浴孵育30min。
(7)RNA加尾：从-20℃冰箱中取出E.coli Poly(A)Polymerase加尾试剂盒后置于冰上融化，然后置于漩涡仪中振荡混匀后瞬离；依次加入下列试剂：
表25RNA加尾配方表
反应程序：37℃水浴孵育30min，随后加入终浓度为10mM的EDTA以终止反应，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA浓度，并做好记录。
(8)LNP-CRISPR/Cas-厚朴酚纳米药物制备：
a)提前打开旋蒸仪制冷机和水浴锅，待制冷机温度降至-15℃，水浴锅温度升至37℃，方可进行实验；
b)将甲醇与氯仿按照体积比1:1配制成有机相，取2mL有机相于已用氯仿润洗后的50mL旋膜瓶中，并依次加入以下质量的材料：
表26脂质体壳材-厚朴酚配方表
如果要制备不含厚朴酚的脂质体，则参考表27
表27脂质体壳材配方表
c)关闭旋蒸仪放气口，打开抽气阀，以100r/min转速旋膜25min；
d)关闭抽气阀，打开放气口，取下旋膜瓶。将Cas13d mRNA与crRNA按照1:1的比例溶于2mL ddH2O中，根据计算不同氮磷比时加入的RNA总量如下：
表28Cas13d mRNA与crRNA比例表
e)水合：将溶有RNA的ddH2O加到旋膜瓶底部，置于超声仪中轻晃以促使旋膜瓶壁上的脂材薄膜水合，待薄膜全部从旋膜瓶壁上脱落时，将液体吸取至4mL离心管中，置于超声仪中30min。
f)过膜，将制备所得脂质体药物过孔径为0.22μm的水系滤膜，将制备所得纳米脂质体药物置于4℃冰箱保存以用于后续实验；
在进行不含厚朴酚的脂质体壳材的制备的过程中，采用表27中的配方，在制备成为脂质体壳材后，其抗病毒效果可参考图24，图24中，横坐标分别为NC(空白)、CRISPR/Cas、LNP(CRISPR/Cas-M2)、LNP(CRISPR/Cas-PA5)、LNP(CRISPR/Cas-NP1)、LNP(CRISPR/Cas-M2-PA5-NP1)，其代表的意思分别为：空白样、未包覆的CRISPR/Cas、脂质体包覆CRISPR/Cas-M2、脂质体包覆CRISPR/Cas-PA5、脂质体包覆CRISPR/Cas-NP1、脂质体包覆CRISPR/Cas(CRISPR/Cas由如SEQ ID NO.4所示Cas13d mRNA和SEQ ID NO.81所示crRNA按照1:1的比例组成)。LNP(CRISPR/Cas-M2)、LNP(CRISPR/Cas-PA5)、LNP(CRISPR/Cas-NP1)、LNP(CRISPR/Cas-M2-PA5-NP1)中脂质体的组成如表27所示；
CRISPR/Cas-M2由1:1的如SEQ ID NO.4所示Cas13d mRNA和如SEQ ID NO.82所示的M2基因的crRNA组成；
CRISPR/Cas-PA5由1:1的如SEQ ID NO.4所示Cas13d mRNA和如SEQ ID NO.83所示的PA5基因的crRNA组成；
CRISPR/Cas-NP1由1:1的如SEQ ID NO.4所示Cas13d mRNA和如SEQ ID NO.84所示的PA5基因的crRNA组成；
图24可见，单独使用含靶向某一个基因的crRNA如M2与Cas13d mRNA进行脂质体包覆后，其抗病毒效果是远弱于LNP(CRISPR/Cas-M2-PA5-NP1)，由于每个crRNA如M2、NP1、PA5均具有较佳的抗病毒效果，因此在进行脂质体包覆后，表现出截然不同的抗病毒效果，我们认为这种结果是不可预期的。
在进行不含厚朴酚的脂质体壳材的制备的过程中，采用DMPC、DOPE分别替换了表27中的DOPC，在制备成为脂质体壳材后，其抗病毒效果可参考图25，图25中，横坐标分别为NC(空白)、CRISPR/Cas、LNP-DMPC(CRISPR/Cas)、LNP-DOPE(CRISPR/Cas)、LNP-DOPC(CRISPR/Cas)，其代表的意思分别为：空白样、未包覆的CRISPR/Cas、采用DMPC替换DOPC的脂质体(该脂质体包覆CRISPR/Cas)、采用DOPE替换DOPC的脂质体(该脂质体包覆CRISPR/Cas)、以及表27的脂质体(该脂质体包覆CRISPR/Cas)。上述CRISPR/Cas是指Cas13d mRNA(如SEQ ID NO.4所示)与crRNA(如SEQ ID NO.81所示)按照1:1的比例进行混合。
通过图25的抗病毒效果对比可见，采用DOPC作为壳材之一，其表现出非常优异的抗病毒效果。说明本发明的脂质体特别适用于CRISPR/Cas体系。
(9)凝胶阻滞电泳检测LNP与CRISPR/Cas最佳配比：
a)RNA电泳液的配制：向2L纯水中加入1mL DEPC后，于室温中置于磁力搅拌机上搅拌过夜，随后121℃高压15min以得到DEPC处理水；进而配制TBM缓冲液：称取6.055gTris、3.062g硼酸以及0.020g氯化镁，用DEPC处理水定容至1L并搅拌至固体完全溶解，将制备得到的TBM缓冲液置于4℃预冷；
b)RNA电泳凝胶的制备：称取0.5g琼脂糖粉末溶于50mL TBM缓冲液中；
c)电泳：将水平电泳仪置于冰上，取10μL LNP与10μL 2×RNA Loading buffer混匀后点样，在电压为120V条件下电泳15min,将凝胶置于紫外灯下观察不同氮磷比下LNP负载Cas13d mRNA(如SEQ ID NO.1所示)与crRNA(如SEQ ID NO.2所示)的能力，结果如图13、图14、图15和图16；图13为负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的电镜图；图14为不同氮磷比情况下的负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的电泳图；
通过图13可以看出制备所得的脂质体药物电镜图像，可见所得脂质体形态清晰，粒径适宜；
图14中摸索脂质体包载RNA配方，条带亮则表示未包裹进去的游离RNA，可知当氮磷比为4/1时，脂质体可以完全包裹RNA。
图15为负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的表面电位图；
图15中横坐标的中文含义为脂质体表面电位；纵坐标的中文含义为该电位脂质体在制备体系中的占比；
图16为负载Cas13d mRNA和crRNA后的脂质体的粒径分布图；
图16中横坐标的中文含义为脂质体粒径；纵坐标的中文含义为该粒径脂质体在制备体系中的占比；
(10)LC-MS检测厚朴酚包封率：
a)以1μg/mL厚朴酚的乙腈溶液上机检测，离子对为265.1-245.15，结果显示出峰良好且丰度佳；
b)将(8)中制备所得的LNP-CRISPR/Cas-厚朴酚进行超滤以滤去未包封进LNP的游离厚朴酚；取1mL未过膜脂质体药物，在2根30KD超滤管中各加入500μL，4000r/min离心3min后取出，再用黄枪头吹吸一至两次，再4000r/min离心2min，取上层脂质体悬液，并记录上层脂质体悬液体积和下层滤液体积。
c)取200mL上层脂质体悬液，加入200μL甲醇后漩涡进行破乳，随后，取1μL使用金标乙腈稀释1000倍，使终体积为1mL即可。过水系滤膜后注入质谱瓶中，使用LC-MS检测；
d)标准厚朴酚溶液的配制：0.01μg/mL、0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL；
e)厚朴酚载药率：encapsulation rate＝weight of drug in liposomes/initial amount of drug×100％＝54％
(11)：LNP-CRISPR/Cas-厚朴酚粒径与电位表征：取1mL脂质体药物过水系滤膜，然后取100μL稀释至1mL后装入样品池中，测得该脂质体药物的粒径约为100nm，表面电位为37mV，电镜表征及粒径、电位表征结果如图13-16；
2.2、LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚体系纳米药物效果评估
(1)A549细胞铺细胞板：每个六孔板孔中铺入5×105个细胞，待细胞长至细胞孔80％-90％时，将细胞孔中的培养液轻轻移除，使用PBS轻轻洗涤细胞一次，弃去洗液；
(2)感染病毒：将MOI＝0.1的病毒稀释液加入到洗涤好的6孔细胞板中，放置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，待病毒吸附1h后；
(3)用PBS洗去未吸附病毒，将LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体与细胞培养基按体积比1:20预混匀后加至细胞表面，培养24h后取上清和细胞裂解物，抗炎及抗病毒效果如图17-23。
随后，将RNA水平的CRISPR/Cas13d系统递送进细胞内，检测其对抗H1N1、H3N2、H5N6、H7N9、H9N2亚型流感病毒的抑制效果。
图17为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H1N1病毒的抗病毒效果；
图18为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H3N2病毒的抗病毒效果；
图19为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H5N6病毒的抗病毒效果；
图20为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H7N9病毒的抗病毒效果；
图21为LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对H9N2病毒的抗病毒效果；
图17-21的纵坐标的中文含义为流感病毒核蛋白的表达水平；
通过上述图17-21可见，本发明的LNP-CRISPR/Cas13d-厚朴酚脂质体针对多种不同的流感病毒具有广谱性；
图22为不同的材料的抗流感病毒时的炎性因子IL-1β的表达水平的图表；
图22中，纵坐标表达的中文含义为炎性因子IL-1β的表达水平；
图22中横坐标轴上各英文代表的实验对象分别为空白对照组、CRISPR/Cas组、厚朴酚组、CRISPR/Cas+厚朴酚组、空载脂质体组、脂质体包裹的CRISPR/Cas+厚朴酚组；
图23中，纵坐标表达的中文含义为炎性因子IL-6的表达水平；
图23中横坐标轴上各英文代表的实验对象分别为空白对照组、CRISPR/Cas组、厚朴酚组、CRISPR/Cas+厚朴酚组、空载脂质体组、奥司他韦组、脂质体包裹的CRISPR/Cas+厚朴酚组；
上述CRISPR/Cas是指Cas13d mRNA(如SEQ ID NO.1所示)与crRNA(如SEQ ID NO.2所示)按照1：1进行复配。
通过上述对比可以发现，炎性因子IL-6的表达水平上，本发明的脂质体包裹的CRISPR/Cas+厚朴酚组能够媲美奥司他韦组。
相比奥司他韦，本发明的脂质体包裹的CRISPR/Cas+厚朴酚具有更强的广谱性。
通过本发明的图27和图28可见，在图27中示出了本发明的脂质体在0.5h时没有被细胞内的溶酶体吞噬；
图28示出了2h、4h、10h时细胞内的脂质体的分布状态，4h时纳米脂质体多数被溶酶体吞噬，10h时纳米脂质体成功从溶酶体中出逃(红色为溶酶体，绿色为纳米脂质体药物)；
当前，多数药物进入细胞后会被溶酶体吞噬降解从而降低药物效率。本纳米脂质体设计了DOTAP阳离子脂材，使其表面带正电荷，从而能够利用质子海绵效应协助药物从溶酶体中逃逸出来，进而提高药物利用率。
2.4其他中药提取物和CRISPR/Cas构成的脂质体的性能验证
采用“(8)LNP-CRISPR/Cas-厚朴酚纳米药物制备”中所示的步骤，分别采用香豆素、秦皮甲素、姜黄素替代厚朴酚，得到样品3个样品，具体可见图26，图26的纵坐标的中文含义为流感病毒核蛋白的表达水平，横坐标分别为空白样、负载CRISPR/Cas和厚朴酚的脂质体、负载CRISPR/Cas和香豆素的脂质体、负载CRISPR/Cas和秦皮甲素的脂质体、负载CRISPR/Cas和姜黄素的脂质体；
通过图26的对比可见，负载CRISPR/Cas和厚朴酚的脂质体的抗病毒效果远优于负载CRISPR/Cas和香豆素的脂质体、负载CRISPR/Cas和秦皮甲素的脂质体、负载CRISPR/Cas和姜黄素的脂质体。
说明本发明的CRISPR/Cas和厚朴酚在脂质体中会产生协同作用，一般来说，厚朴酚仅起到抗炎作用，不会起到抗病毒效果，但是由于病毒在体内的作用并不仅仅是病毒的复制，还会在病毒复制后产生一定的炎症，其可降低病毒感染对机体的炎症反应的影响，相比于香豆素、秦皮甲素、姜黄素表现出的降低炎症反应的效果，我们认为厚朴酚在降低机体的炎症反应后能够进一步显著促进CRISPR/Cas的抗病毒效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种脂质体，其特征在于，所述脂质体内包覆有Cas13d mRNA、crRNA、厚朴酚；所述Cas13d mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。
2.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，Cas13d mRNA、crRNA的总重、厚朴酚的重量的比例为10-50∶100-1000，优选地，Cas13d mRNA、crRNA的总重、厚朴酚的重量的比例为14-22∶300-700。
3.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述Cas13d mRNA、crRNA均经过加帽和加尾处理。
4.根据权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体的壳层由如下成分组成：
DOPC 7.6份；
DOTAP 0.2份；
胆固醇 0.5份；
DSPE-PEG2000 0.32份；
DSPE-PEG3600-GALA 0.08份。
5.根据权利要求1-4任一所述的脂质体，其特征在于，Cas13d mRNA、crRNA的摩尔比为1∶1。
6.如权利要求1-5任一所述的脂质体作为抗流感药物的活性成分的用途。
7.一种如权利要求1-5任一所述的脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：在旋膜瓶中加入壳层的材料以及厚朴酚；
步骤2：旋膜，得到脂材薄膜；
步骤3：将含Cas13d mRNA、crRNA的水溶液加入到步骤2的旋膜瓶中，旋膜瓶置于超声仪中轻晃以促使旋膜瓶壁上的脂材薄膜水合；得到脂质体药物；
步骤4：将脂质体药物通过水系滤膜，得到脂质体。
8.根据权利要求7所述的脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：将甲醇与氯仿按照体积比1∶1配制成有机相，取2mL有机相于已用氯仿润洗后的50mL旋膜瓶中，并依次加入以下质量的材料：
DOPC 7.6mg；
DOTAP 0.2mg；
胆固醇 0.5mg；
DSPE-PEG2000 0.32mg；
DSPE-PEG3600-GALA 0.08mg；
厚朴酚 0.5mg。
9.根据权利要求7所述的脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体为：关闭旋蒸仪放气口，打开抽气阀，以100r/min转速旋膜25min；
所述步骤3中含Cas13d mRNA、crRNA的水溶液中的水为2ml；
所述步骤4中水系滤膜的规格为0.22μm。
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