CN110656123A - 基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用，特别是在RNA病毒敲降方面的应用。本发明利用mCherry荧光报告基因，将PRRSV病毒ORF4和ORF5两个表达阅读框序列分别融合到mCherry基因的碳端构建筛选CRISPR‑Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的荧光报告系统，利用CRISPR‑Cas13d高效切割mRNA的特性，进行高效率sgRNAs的快速筛选。然后利用筛选出的高效靶向结合的sgRNAs进行CRISPR‑Cas13d系统高效降解PRRSV‑GFP重组病毒。本发明提供的RNA病毒敲降方法具有高效率，高精准率及低脱靶率的优势。

Description

基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及 应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用。

背景技术

RNA病毒是一类严重危害人类健康，农业安全生产的病毒。由于其具有高度变异，快速复制，生命活动复杂等特点，RNA病毒的防控及相关疾病的治疗变得尤为艰难。常见RNA病毒及相关疾病的主要防治方法为疫苗、抗体的研发以及RNA干涉技术(RNAi)，但效果都不是很理想，新方法的探索及开发迫在眉睫。

近年来，可编程核酸酶介导的基因编辑技术迅猛发展，CRISPR(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)系统基因编辑技术广泛应用于生物学、基础医学等研究领域中，充分证明了该技术具有巨大的发展潜能。CRISPR系统是细菌和古生物菌免疫防御机制的一部分，在外源的质粒或病毒入侵宿主后，CRISPR通过内部的间隔序列来识别这些外源DNA，并形成记忆。当噬菌体再次入侵时，CRISPR区域内一段序列转录成前体的RNA(pre-crRNA)，pre-crRNAs受到转录活化RNA(tracrRNA)转录活化成为小的成熟的crRNA，结合相关的Cas蛋白形成crRNA-Cas蛋白复合体，再通过碱基互补配对精确的与目标DNA结合，从而指导Cas蛋白对目标DNA进行切割，并由这些核酸内切酶造成靶向的DNA双链断裂(DSBs)。经非同源末端连接(NHEJ)途径修复会出现非特异性的碱基缺失、插入或其他形式突变；DSBs也可利用DNA修复模板，如单链寡聚核苷酸(ssODN)在切割酶切位点经同源重组修复(HDR)纠正突变或是插入新的基因序列[Hsu et al.,2014；Kim and Kim,2014；Komor et al.,2017]。以Cas9蛋白作用的II型CRISPR系统，由于不需要复杂的蛋白复合体，且系统组成简单而广泛应用于哺乳动物的基因编辑中[Barrangou R&Doudna JA,2016；Komor et al.,2017]。

最新研究表明，Ⅱ类VI型CRISPR效应蛋白Cas13d蛋白可高效切割ssRNA(SilvanaKonermann et al.,2018)。Rfx-Cas13d属于含有2个HEPN核酶基序的2型CRISPR-Cas蛋白家族，长度仅约930aa，是目前最小的2型CRISPR效应物。与其他Cas13酶一样，Cas13d同源物能独立地将CRISPR序列加工成向导RNA。它们依赖crRNA来切割目标，而不依赖HEPN结构域。这些酶对目标的侧翼序列没有要求，因此可以靶向任何RNA序列。CRISPR-Cas13d基因编辑工具的出现将为RNA病毒的敲降提供新的策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用。

发明人基于CRISPR-Cas13d系统介导的ssRNA切割，尤其是Rfx-Cas13d(CasRx)介导的ssRNA切割的高效性，精准性和特异性，提供一种RNA病毒的敲降策略：通过CRISPR-Cas13d系统对mCherry-ORF4/ORF5报告质粒mRNA的切割筛选高效sgRNA，利用筛选出的高效sgRNA进行PRRSV-GFP重组RNA病毒的高效敲降，抑制RNA病毒的复制，从而实现对RNA病毒防治。

第一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法，包括以下步骤：

1)合成目标核酸序列，将目标核酸序列构建到含有报告基团的载体中，且目标核酸序列与报告基团位于同一表达盒内，得到报告载体；

2)根据目标核酸序列，设计并合成一系列基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA序列，并将这些sgRNA序列分别构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中；

3)将步骤1)的报告载体、含有Cas13d蛋白的表达载体与步骤2)所得重组载体共同导入真核细胞中，得到一系列转化细胞；待转化细胞培养一段时间后，分别鉴定不同sgRNA对目标核酸序列的切割效率，根据切割效率筛选出高效sgRNA；

其中，步骤1)所述目标核酸序列含有或编码5‘端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。

所述目标核酸序列包括但不限于mRNA或RNA病毒核酸序列。

优选地，RNA病毒为PRRSV(猪蓝耳病病毒)。

所述含有报告基团的载体为携带mCherry荧光蛋白的真核表达载体，如pcDNA3.1-mCherry。

在本发明的一个具体实施方式中，报告载体的构建方法如下：利用载体同源重组的方法将从PRRSV病毒cDNA扩增所得ORF4/ORF5序列连接到常用商业化载体pcDNA3.1-mCherry中mCherry基因的下游，分别构建得到mCherry-ORF4和mCherry-ORF5荧光蛋白报告载体。

优选地，所述目标核酸序列位于mCherry荧光蛋白的C端。

前述的方法，步骤2)所述基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体为pC0043-PspCas13b crRNA backbone哺乳基因编辑质粒(参见Silvana Konermann etal.Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.(2018).Cell)。

前述的方法，步骤3)所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NES或NLS序列的载体。

优选地，所述含有Cas13d蛋白的表达载体的序列如SEQ ID NO:3或4所示。

更优选地，所述目标核酸序列为PRRSV的ORF4和/或ORF5基因；针对ORF4、ORF5基因筛选到的高效sgRNA，它们作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示。

可选地，步骤3)所述真核细胞为HEK293T。

第二方面，本发明提供根据上述方法获得的高效sgRNA在基于CRISPR-Cas13d系统的(非治疗目的)RNA病毒敲降中的应用。

所述应用包括：(1)根据待敲降RNA病毒，选定目标核酸序列，利用上述方法筛选出高效sgRNA；(2)将高效sgRNA序列构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中，所得重组载体与含有Cas13d蛋白的表达载体共同导入到感染了所述待敲降RNA病毒的真核宿主细胞中。

在本发明的一个具体实施方式中，所述RNA病毒为PRRSV，所述目标核酸序列为PRRSV的ORF4和/或ORF5基因；针对ORF4、ORF5基因筛选到的高效sgRNA，它们作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示。

优选地，所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NES序列的载体，其序列如SEQ ID NO:3所示。

第三方面，本发明提供一种用于RNA病毒敲降的试剂盒，所述试剂盒包括：根据上述方法获得的高效sgRNA，以及任选包括含有Cas13d蛋白的表达载体。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供一种CRISPR-Cas13d系统高效靶向sgRNA的筛选工具，具有普适性。本发明充分利用将目标序列连接在mCherry荧光基因的下游，构建融合蛋白报告系统，通过荧光值的变化显示Cas13d靶向切割mRNA的效率，筛选高效靶向结合sgRNA，将PRRSV病毒ORF4和ORF5两个表达阅读框序列分别融合到mCherry基因的碳端构通过对不同的PRRSV病毒变体序列的比较，选择相对保守的区域设计sgRNA，利用mCherry-ORF4/ORF5报告系统，成功筛选到针对PRRSV病毒ORF4和ORF5的两条高效的sgRNA，且此筛选方法适用于所有靶向mRNA降解对应基因的gRNA筛选。

(二)降解RNA病毒的高效性。利用荧光报告系统筛选得到的高效的sgRNA，结合CRISPR-Cas13d系统，成功在Marc145细胞上进行了PPRSV重组病毒的高效降解，被切割的病毒滴度下降，表达量降低，充分显示了该方法对RNA病毒的高效抑制性，同时适用于其他RNA病毒的抑制。

(三)本发明具有高精准性及低脱靶率的优势。通过对CRISPR-Cas13d系统转染细胞进行细胞活性的检测，潜在脱靶位点的检测，实验结果表明细胞活性状态未受影响，且无脱靶现象存在，进一步证明本发明的优异性。本发明提供的RNA病毒敲降方法具有高效率，高精准率及低脱靶率的优势，可应用于农业动物抗病育种及人类RNA病毒性疾病的研究与新型药物的研发等领域。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用CRISPR-Cas13d系统切割mCherry-ORF4(A)、mCherry-ORF5(B)实现高效sgRNA筛选的示意图。

图2为本发明实施例1中利用工程化NES-Cas13d(A)、NLS-Cas13d(B)切割PRRSV-GFP重组RNA病毒，实现高效率敲降RNA病毒的示意图。

图3为本发明实施例1中mCherry-ORF4(A)、mCherry-ORF5(B)报告系统在HEK293T上的mRNA敲降效果图。

图4为本发明实施例2中PRRSV-GFP重组病毒在Marc145细胞上的敲降效果图。

图5为本发明实施例2中CRISPR-Cas13d系统敲降PRRSV-GFP病毒收集细胞的潜在脱靶位点基因表达量检测图；其中，A、B分别为OF4-sgRNA1靶向基因组可能潜在脱靶基因NUP210与MAGI1的mRNA相对表达量检测，与对照组相比，表达量无明显变化，ORF4-sgRNA1靶向组无脱靶情况出现；C、D分别为OF5-sgRNA1靶向基因组可能潜在脱靶基因F11-AS1与CPEB2-AS1的mRNA相对表达量检测，与对照组相比，表达量无明显变化，ORF5-sgRNA1靶向组无脱靶情况出现。

具体实施方式

根据本发明的第一方面，提供一种RNA病毒敲降方法，其包括：

构建mCherry-ORF4/ORF5荧光蛋白报告载体，比对选定PRRSV病毒相对保守的编码区(CDS区)ORF4/ORF5的30bp模板序列(无PAM限制)。

利用sgRNA序列来将Cas13d定位到目标序列以使病毒RNA被切割，从而实现病毒RNA的敲降。

所述sgRNA序列为与目标序列正向一致的30bp序列。

根据本发明，Cas13d蛋白载体可选自：RfxCas13d-NLS-HA(CasRx)。参见SilvanaKonermann et al.Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPREffectors.(2018).Cell。

根据本发明的方法，可用于敲降的mRNA来自如下三个靶基因：mCherry-ORF4，mCherry-ORF5与PRRSV-GFP重组病毒的ORF4和ORF5，与其相应的sgRNA序列分别与选定目标基因序列的30bp一致。

根据本发明的第二方面，提供上述方法在细胞系HEK293T进行mCherry-ORF4/ORF5报告系统筛选CRISPR-Cas13d高效切割mRNA的sgRNAs筛选。

根据本发明的第三方面，提供了上述方法在细胞系Marc145进行CRISPR-Cas13d系统介导的PRRSV-GFP重组RNA病毒高效敲降的应用。

根据本发明的第四方面，提供了根据上述应用而获得的分离的Marc145细胞系或它们的次代培养物。

根据本发明的第五方面，提供了一种用于RNA病毒敲降的试剂盒，包括筛选到的高效sgRNA、工程化的Cas13d载体以及扩增试剂。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1基于CRISPR-Cas13d系统的针对PRRSV的sgRNA高效作用靶点的筛选

一、构建mCherry-ORF4/ORF5荧光报告系统

如图1所示，将ORF4/ORF5序列扩增后，融合至mCherry基因的碳端(C端)，形成如下两种荧光报告系统：

(1)mCherry-ORF4，图1(A)，SEQ ID NO:1；

(2)mCherry-ORF5，图1(B)，SEQ ID NO:2；

报告载体的构建方法如下：利用载体同源重组的方法将从PRRSV病毒cDNA扩增所得ORF4/ORF5序列连接到常用商业化载体pcDNA3.1-mCherry中mCherry基因的下游，分别构建得到mCherry-ORF4和mCherry-ORF5荧光蛋白报告载体。

同时构建出核信号NES与入核信号NLS介导的Cas13d系统，如图2所示，将合成的NES与NLS序列分别插入至Cas13d蛋白的首尾两端，形成如下两种工程化Cas13d表达系统：

(1)NES-Cas13d-NES，图2(A)，SEQ ID NO:3；

(2)NLS-Cas13d-NLS，图2(B)，SEQ ID NO:4；

然后进行sgRNA的设计。Cas13d蛋白酶对目标的侧翼序列没有要求，可以靶向任何RNA序列。本发明如下选择设计sgRNA：

通过比对10种PRRSV的不同毒株序列，选择ORF4与ORF5两个开放阅读框中相对保守的区域进行sgRNA的设计，sgRNA的长度均为30bp，分别设计3对sgRNA用于效率验证；

制备与目标序列正向一致的30bp sgRNA序列。

本发明选定下述目标序列来设计相应的sgRNA：

PRRSV-ORF4：

ORF4-sgRNA1:GATGTCCGAAAGACTCGAACTGAAACATGG

ORF4-sgRNA2:CGGCACTGAGAACTTTTGCGAATCGTCGGA

ORF4-sgRNA3:ATGTAGATAATTTTCATCTGTGACATTGGC

PRRSV-ORF5：

ORF5-sgRNA1:TGCTACTCAAGACATACCGCCCGTGATAAT

ORF5-sgRNA2:AGATGACAAAAGTCTCCACTGCCCAGTCAA

ORF5-sgRNA3:TGTGTCAAGGAAATGGCTGGTGGTGAGTGC

针对上述选定的目标基因序列，ORF4与ORF5各三条，构建相应的sgRNA表达载体，将不同的sgRNA分别导入pC0043-PspCas13b crRNA backbone哺乳基因编辑质粒(sgRNA表达载体)。

二、在细胞株上进行CRISPR-Cas13d系统介导的mCherry-ORF4/5报告质粒的mRNA切割，实现高效靶向结合sgRNA的筛选

按常规操作，进行细胞株的mRNA敲降(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。

(1)以HEK293T细胞为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：HEK293T细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B),其中含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

(2)在转染前分至24孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)转染以脂质体转染为例。按照Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，以mCherry-ORF4报告质粒为例，将50ng mCherry-ORF4/mCherry-ORF5质粒与300ng NES-Cas13d-NES/NLS-Cas13d-NLS及600ng pC0043-PspCas13b crRNA backbone质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，48小时后进行切割效率的鉴定及检测。

(4)mRNA切割效率分析

A、转染细胞48h后，使用PBS清洗细胞两次，补充500ul浓度10％FBS的培养基，进行细胞荧光成像拍照，然后消化部分细胞进行C-FLOW检测mCherry荧光效率；

B、收取另外一部分细胞使用Trizol法进行总RNA提取，提取的RNA进行浓度测定，使用反转试剂进行反转录获取cDNA，反转录体系(以1μg为例)：

1μg mRNA，4μl 5×HiScript II Select qRT SuperMix，4μl 4×gDNA wiperMix，不含RNase的ddH₂O，补齐至20μl。

反转录程序：42℃，15min；50℃20min；85℃5s；4℃保持。

C、实时荧光定量PCR：针对ORF4/ORF5设计Q-PCR检测引物，利用反转录产物(稀释10倍)进行Q-PCR检测转染48h后mCherry-ORF4/ORF5 mRNA的相对表达量。Q-PCR反应体系为：1μl cDNA，5μl 2×Q-PCR Mix，0.2μl正向引物，0.2μl反向引物，不含RNase的ddH₂O，补齐至10μl。

Q-PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；按照仪器操作说明选择熔解曲线分析：95℃15s，60℃15s，95℃，利用^△△CT法分析定量数据。Q-PCR引物如下：

PRRSV-ORF4：

Forward:ATGGCTGCGTCCTTTCTTTTC

Reverse:GTCCTGGAGGACAACGAAGTC

PRRSV-ORF5：

Forward:ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCG

Reverse:CGTTAAGTTATAAATCAACTG

GAPDH(内参基因)：

Forward:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG

Reverse:AGGGGCCATCCACAGTCTTC

结果表明，mCherry-ORF4/5报告质粒mRNA发生了高效的敲降，效率最高达96％，其中ORF4-sgRNA1(SEQ ID NO:5)与ORF5-sgRNA1(SEQ ID NO:6)效果最佳，生物重复性最好，选择作为后续PRRSV-GFP重组病毒敲降的sgRNA(图3，A和B)。实施例2PRRSV-GFP重组病毒的敲降

设计工程化NLS-/NES-Cas13d，在Marc145细胞上进行PRRSV-GFP重组病毒的敲降。

(1)将Marc145细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B),其中含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

(2)在转染前分至24孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)转染以脂质体转染为例。按照Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将400ng NES-/NLS-Cas13d及600ng pC0043-PspCas13b crRNA backbone质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液(设置不同转染组别，分别用于不同时间段细胞上清液中病毒滴度的测定，特点时间点细胞内部病毒表达情况的检测)；

(4)RNA病毒感染细胞：细胞转染12小时后进行PRRSV-GFP重组RNA病毒的感染实验(控制滴度MOI＝0.01)。弃掉细胞培养液，将病毒与无血清培养基DMEM混匀后添加至各孔细胞，37℃培养2h后补充10％FBS完全培养基，继续培养，收集病毒感染0h，12h，24h，36h，48h，72h等不同时间段的培养基上清，进行病毒滴度测定及利用实时荧光定量PCR技术进行病毒mRNA表达水平的检测。同时在第48h时进行细胞的GFP荧光成像、C-FLOW荧光率检测及Q-PCR检测细胞内部病毒mRNA的相对表达水平。

(5)mRNA切割效率分析

A、转染细胞48h后，使用PBS清洗细胞两次，补充500ul浓度10％FBS的培养基，进行细胞荧光成像拍照，然后消化部分细胞进行C-FLOW检测mCherry荧光效率；

B、取另一部分细胞使用Trizol法进行总RNA提取，提取的RNA进行浓度测定，使用反转试剂进行反转录获取cDNA，反转录体系(以1μg为例)：1μg mRNA，4μl 5×HiScript IISelect qRT SuperMix，4μl 4×gDNA wiper Mix，不含RNase的ddH₂O，补齐至20μl。

反转录程序：42℃，15min；50℃20min；85℃5s；4℃保持。

C、利用反转录产物(稀释10倍)进行Q-PCR检测转染48h后PRRSV-ORF4/ORF5mRNA的相对表达量。Q-PCR反应体系为：1μl cDNA，5μl 2×Q-PCR Mix，0.2μl正向引物，0.2μl反向引物，不含RNase的ddH₂O，补齐至10μl。

Q-PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环；按照仪器操作说明选择熔解曲线分析：95℃15s，60℃15s，95℃，利用^△△CT法分析定量数据。Q-PCR引物如下：

PRRSV-ORF4：

Forward:ATGGCTGCGTCCTTTCTTTTC

Reverse:GTCCTGGAGGACAACGAAGTC

PRRSV-ORF5：

Forward:ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCG

Reverse:CGTTAAGTTATAAATCAACTG

GAPDH(内参基因)：

Forward:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG

Reverse:AGGGGCCATCCACAGTCTTC

(6)病毒滴度测定(TCID50法)

转染细胞感染PRRSV-GFP重组病毒0-72h时间范围内，分别收集0h，12h，24h，36h，48h，72h等时间点的细胞培养液，使用TCID50法进行病毒滴度的测定。

TCID50法测定病毒滴度：

A、细胞准备：将Marc-145细胞经过24-48h培养后，传代至96孔板中，通过细胞计数法使每个96孔板中的细胞为2×10⁴，每孔100μl，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养12-24小时，接种病毒前使细胞长至80-90％汇合度。

B、病毒准备：每个病毒样品取100μl，加入900μl 2％FBS和1％PS的DMEM维持培养基，再取100μl原液稀释10倍，设置9-10个梯度进行稀释。

C、细胞接毒：将细胞用PBS清洗一遍，弃掉上清液，按照稀释倍数由高到低的顺序加入病毒液100μl，每个梯度接种8个孔，注意过程中不要使细胞变干。同时设置至少5孔对照组不加病毒，只添加维持培养基。

D、病毒培养：接种后的培养皿于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每天观察细胞病变装并作记录。

E、滴度计算：细胞培养4-5天后，统计每个梯度的病变孔数，使用Reed-Muench的方法进行计算TCID50值。

(7)Q-PCR法检测细胞培养液中RNA病毒的相对表达量

使用Trizol法进行0h，12h，24h，36h，48h，72h等时间点的细胞培养液的总RNA提取，按照上述步骤进行cDNA反转及Q-PCR定量检测PRRSV-ORF4/ORF5的相对表达量。

(8)转染细胞的活性检测

转染细胞48h后，利用MTT assay试剂盒进行细胞活性的检测。

PRRSV-GFP重组病毒在Marc145细胞上的敲降效果见图4。

(9)转染细胞的脱靶情况检测

将选取的sgRNA序列与Marc145细胞基因组进行比对，查找相应的高度重复序列，选取可能存在脱靶的基因位点CPEB2-AS1，F11-AS1,MAGI1,NUP210，设计相应的Q-PCR检测引物，对转染48h的细胞样品提取mRNA，反转获得cDNA样品，进行Q-PCR检测上述可能存在脱靶效应的基因mRNA的相对表达量，以此来判断是否可能存在脱靶情况。

结果表明，NES-Cas13d系统介导PRRSV-GFP病毒发生了高效的敲降，细胞活性未出现明显变化，且无脱靶情况发生(图5，A～D)。

实施例1和2中，对照组(NC)中的NC-sgRNA为不靶向任何基因的一段随机序列形成的sgRNA(TCACCAGAAGCGTACCATACTCACGAACAG)，连接pC0043-PspCas13b crRNA backbone质粒。

本发明利用CRISPR-Cas13d系统建立了ssRNA切割技术，通过精准的RNA病毒特定ORF的切割，从而提供比传统RNA敲降方法更高效、更精确以及更少脱靶效应的RNA病毒敲降策略，为RNA病毒介导疾病的治疗提供了新的思路及方向。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

[1]Aaron A.Smargon,David B.T.Cox,Neena K.Pyzocha,et al.Cas13b Is aType VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated byAccessory Proteins Csx27 and Csx28.Molecular Cell 65(4),Pages 618-630.e7(2017).

[2]D.B.T.Cox,J.S.Gootenberg,O.O.Abudayyeh.RNA editing with CRISPR-Cas13.Science,358(6366):1019-1027(2017).

[3]Omar O.Abudayyeh,Jonathan S.Gootenberg,Silvana Konermann,et al.C2c2 isa single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPReffector.Science 353(6299),aaf5573(2016).

[4]R.J.Chand,B.R.Trible,R.R.Rowland.Pathogenesis of porcinereproductive and respiratory syndrome virus.Current Opinion in Virology 2(3),256–263(2012).L.(15)Zhou and H.Yang.Porcine reproductive and respiratorysyndrome in China.Virus Research 154,31–37(2010).

[5]Silvana Konermann,PeterLotfy,Nicholas J.Brideau.TranscriptomeEngineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.Cell 173(3),665-676(2018).

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用

<130> KHP191115201.1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1785

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctgcgt cctttctttt cctcttggtt ggttttaaat gtttcgtggt ttctcaggcg 60

ttcgcctgca agccatgttt cagttcgagt ctttcggaca tcaaaaccaa caccaccgca 120

gcatcagact tcgttgtcct ccaggacatc agctgcctta ggcatggcga ctcgccctct 180

ccgacgattc gcaaaagttc tcagtgccgc acggcgatag ggacgcccgt gtacatcacc 240

atcactgcca atgtcacaga tgaaaattat ctacattctt ctgatctcct catgctttct 300

tcttgccttt tctatgcttc cgagatgagt gaaaagggat tcaaagtagt gtttggcaat 360

gtgtcaggca tcgtggctgt gtgcgtcaac tttaccagct acgtccaaca tgtcaaggag 420

tttacccaac gctccttagt ggtcgatcat gtgcgactgc ttcatttcat gacacctgag 480

accatgaggt gggcaaccgt tttagcctgt ctttttgcca tcctactggc aatttgaatg 540

gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 600

cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 660

ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc 720

gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 780

gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 840

atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 900

gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 960

cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 1020

ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 1080

gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 1140

atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 1200

gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaagtaaat ggctgcgtcc 1260

tttcttttcc tcttggttgg ttttaaatgt ttcgtggttt ctcaggcgtt cgcctgcaag 1320

ccatgtttca gttcgagtct ttcggacatc aaaaccaaca ccaccgcagc atcagacttc 1380

gttgtcctcc aggacatcag ctgccttagg catggcgact cgccctctcc gacgattcgc 1440

aaaagttctc agtgccgcac ggcgataggg acgcccgtgt acatcaccat cactgccaat 1500

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<210> 2

<211> 1917

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<212> DNA

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tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc 480

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acgagtacat ctccacactg aactacctgt acgacaggat caccaacgag ctgacaaaca 2700

gcttctccaa gaactctgcc gctaacgtga actacatcgc tgagaccctg ggcatcaacc 2760

cagctgagtt cgctgagcag tacttcagat tttccatcat gaaggagcag aagaacctgg 2820

gcttcaacat cacaaagctg agagaagtga tgctggacag aaaggatatg tccgagatca 2880

ggaagaacca caaggtgttc gattctatca gaaccaaggt gtacacaatg atggactttg 2940

tgatctacag gtactacatc gaggaggatg ccaaggtggc cgctgccaac aagagcctgc 3000

ccgacaacga gaagtctctg agcgagaagg atatcttcgt gatcaacctg agaggctcct 3060

ttaacgacga tcagaaggac gctctgtact acgatgaggc caacaggatc tggagaaagc 3120

tggagaacat catgcacaac atcaaggagt tccggggaaa caagacccgc gagtacaaga 3180

agaaggacgc tccaaggctg cctaggatcc tgcctgctgg aagggacgtg agcgccttca 3240

gcaagctgat gtacgccctg acaatgtttc tggacggaaa ggagatcaac gatctgctga 3300

ccacactgat caacaagttc gacaacatcc agtcttttct gaaagtgatg cctctgatcg 3360

gcgtgaacgc taagttcgtg gaggagtacg ccttctttaa ggacagcgcc aagatcgctg 3420

atgagctgcg gctgatcaag tcctttgcca ggatgggaga gccaatcgct gacgctagga 3480

gagctatgta catcgatgcc atccggatcc tgggaaccaa cctgtcttac gacgagctga 3540

aggctctggc cgacaccttc agcctggatg agaacggcaa caagctgaag aagggcaagc 3600

acggaatgcg caacttcatc atcaacaacg tgatcagcaa caagcggttt cactacctga 3660

tcagatacgg cgacccagct cacctgcacg agatcgctaa gaacgaggcc gtggtgaagt 3720

tcgtgctggg acggatcgcc gatatccaga agaagcaggg ccagaacgga aagaaccaga 3780

tcgaccgcta ctacgagacc tgcatcggca aggataaggg aaagtccgtg tctgagaagg 3840

tggacgctct gaccaagatc atcacaggca tgaactacga ccagttcgat aagaagagat 3900

ctgtgatcga ggacaccgga agggagaacg ccgagagaga gaagtttaag aagatcatca 3960

gcctgtacct gacagtgatc taccacatcc tgaagaacat cgtgaacatc aacgctagat 4020

acgtgatcgg cttccactgc gtggagcgcg atgcccagct gtacaaggag aagggatacg 4080

acatcaacct gaagaagctg gaggagaagg gctttagctc cgtgaccaag ctgtgcgctg 4140

gaatcgacga gacagccccc gacaagagga aggatgtgga gaaggagatg gccgagagag 4200

ctaaggagag catcgactcc ctggagtctg ctaaccctaa gctgtacgcc aactacatca 4260

agtactccga tgagaagaag gccgaggagt tcaccaggca gatcaacaga gagaaggcca 4320

agaccgctct gaacgcctac ctgaggaaca caaagtggaa cgtgatcatc cgggaggacc 4380

tgctgcgcat cgataacaag acctgtacac tgttccggaa caaggctgtg cacctggagg 4440

tggctcgcta cgtgcacgcc tacatcaacg acatcgccga ggtgaactcc tactttcagc 4500

tgtaccacta catcatgcag aggatcatca tgaacgagag atacgagaag tctagcggca 4560

aggtgtctga gtacttcgac gccgtgaacg atgagaagaa gtacaacgat agactgctga 4620

agctgctgtg cgtgcctttc ggatactgta tcccacggtt taagaacctg agcatcgagg 4680

ccctgttcga ccgcaacgag gctgccaagt ttgataagga gaagaagaag gtgagcggca 4740

actccggttc tggtctcgag cccaagaaga agaggaaagt cctcgaggct actaacttca 4800

gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctatgcat atggtgagca 4860

agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcacatgg 4920

agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg 4980

agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc ttcgcctggg 5040

acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca 5100

tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact 5160

tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca 5220

tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga 5280

agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg 5340

gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga 5400

ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt 5460

tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg 5520

gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta atagctagaa tcaacctctg 5580

gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta 5640

tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt 5700

ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc 5760

aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt 5820

gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg 5880

gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac 5940

aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc 6000

acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac 6060

cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct 6120

cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc gataccgtcg acctcgactg 6180

tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 6240

aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 6300

gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 6360

aagacaatag caggcatgct ggggataact ttaaataatt ggcattattt aaagttaacg 6420

cgtacaagtt tgtacaaaaa agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata 6480

ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact acataatact gtaaaacaca acatatccag 6540

tcactatgct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 6600

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 6660

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 6720

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 6780

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 6840

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 6900

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 6960

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 7020

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 7080

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 7140

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 7200

ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 7260

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 7320

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 7380

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 7440

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 7500

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 7560

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 7620

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 7680

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 7740

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 7800

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 7860

caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 7920

gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 7980

ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 8040

tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 8100

caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 8160

tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 8220

cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 8280

ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 8340

aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 8400

tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 8460

gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 8520

gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaatc 8580

aaataatgat tttattttga ctgatagtga cctgttcgtt gcaacaaatt gatgagcaat 8640

gcttttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctg tcgacgatgt aggtcacggt 8700

ctcgaagccg cggtgcgggt gccagggcgt gcccttgggc tccccgggcg cgtactccac 8760

ctcacccatc tggtccatca tgatgaacgg gtcgaggtgg cggtagttga tcccggc 8817

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgtccgaa agactcgaac tgaaacatgg 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgctactcaa gacataccgc ccgtgataat 30

Claims (10)

1.基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成目标核酸序列，将目标核酸序列构建到含有报告基团的载体中，且目标核酸序列与报告基团位于同一表达盒内，得到报告载体；

2)根据目标核酸序列，设计并合成一系列基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA序列，并将这些sgRNA序列分别构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中；

3)将步骤1)的报告载体、含有Cas13d蛋白的表达载体与步骤2)所得重组载体共同导入真核细胞中，得到一系列转化细胞；待转化细胞培养一段时间后，分别鉴定不同sgRNA对目标核酸序列的切割效率，根据切割效率筛选出高效sgRNA；

其中，步骤1)所述目标核酸序列含有或编码5‘端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标核酸序列为mRNA或RNA病毒核酸序列；

优选地，RNA病毒为PRRSV。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有报告基团的载体为携带mCherry荧光蛋白的真核表达载体；

优选地，所述目标核酸序列位于mCherry荧光蛋白的C端。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体为pC0043-PspCas13b crRNA backbone质粒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NES或NLS序列的载体；

优选地，所述含有Cas13d蛋白的表达载体的序列如SEQ ID NO:3或4所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述目标核酸序列为PRRSV的ORF4和/或ORF5基因；针对ORF4、ORF5基因筛选到的高效sgRNA，它们作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示；和/或

步骤3)所述真核细胞为HEK293T。

7.根据权利要求1-6任一项所述方法获得的高效sgRNA在基于CRISPR-Cas13d系统的非治疗目的RNA病毒敲降中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：(1)根据待敲降RNA病毒，选定目标核酸序列，利用权利要求1-6任一项所述方法筛选出高效sgRNA；(2)将高效sgRNA序列构建到基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA表达载体中，所得重组载体与含有Cas13d蛋白的表达载体共同导入到感染了所述待敲降RNA病毒的真核宿主细胞中。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述RNA病毒为PRRSV，所述目标核酸序列为PRRSV的ORF4和/或ORF5基因；针对ORF4、ORF5基因筛选到的高效sgRNA，它们作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:5、6所示；和/或

所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NES序列的载体，其序列如SEQ ID NO:3所示。

10.用于RNA病毒敲降的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：根据权利要求1-6任一项所述方法获得的高效sgRNA，以及任选包括含有Cas13d蛋白的表达载体。

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