CN112143731A - 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用 - Google Patents

靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112143731A
CN112143731A CN202010960568.3A CN202010960568A CN112143731A CN 112143731 A CN112143731 A CN 112143731A CN 202010960568 A CN202010960568 A CN 202010960568A CN 112143731 A CN112143731 A CN 112143731A
Authority
CN
China
Prior art keywords
grna
cov
sars
sequence
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010960568.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112143731B (zh
Inventor
梁峻彬
欧家裕
皇甫德胜
徐辉
古博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd filed Critical Guangzhou Ruifeng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010960568.3A priority Critical patent/CN112143731B/zh
Publication of CN112143731A publication Critical patent/CN112143731A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112143731B publication Critical patent/CN112143731B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种靶向破坏SARS‑CoV‑2病毒基因组的gRNA及其应用，属于基因编辑技术领域。该gRNA包括靶向结构域，所述靶向结构域的序列靶向所述SARS‑CoV‑2病毒基因组的S区域。本发明还提供用于治疗SARS‑CoV‑2病毒感染的gRNA表达载体、Crispr系统、和包含所述gRNA或编码其的核苷酸的组合物，以及它们的制药用途。本发明的gRNA靶向破坏SARS‑CoV‑2病毒基因组Spike区域，可用于治疗SARS‑CoV‑2病毒感染。

Description

靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的 gRNA及其应用。
背景技术
冠状病毒有多种类型，大多数类型仅感染动物，但有时会发生变异并感染人类。新型冠 状病毒——SARS-CoV-2，是一种变异的、可在人与人之间快速感染传播、并可导致严重呼吸 系统疾病的病毒。其传染性强、危害大，目前尚无可以治疗新型冠状病毒的特效药物和方法。 尽管有研究者提出一些上市或者在研的抗病毒药物可能对新型冠状病毒有抑制作用，但还未 被证明其有效性和安全性，需要进一步的临床研究。因此，开发新的治疗技术和药物成为了 迫切需要。
SARS-CoV-2属于冠状病毒谱系B(Betacoronavirus Lineage B,Sarbecovirus)，其遗传物 质为正链单股RNA，基因组长度约30000个核苷酸左右。SARS-CoV-2侵入宿主细胞的第一 步是结合到细胞表面，其病毒包膜上的刺突蛋白(Spike protein)通过与细胞表面ACE2受体 结合，介导病毒包膜与细胞膜的融合从而让病毒颗粒进入细胞。随后，病毒在细胞内进行复 制以及再组装。如果能够有效破坏宿主细胞内病毒的RNA，就可以有效抑制病毒的复制和分 泌，从而使病毒感染得到有效的控制。
2015年，研究者发现了一种新的CRISPR/Cas基因编辑系统，被称为Cas13系统，与之 前发现的切割DNA的Cas9编辑系统不同，该Cas13系统可以在小RNA的指导下特异地识别并切割单链的RNA。2019年9月，有研究者利用该系统，成功地实现了体外培养细胞中三种RNA病毒(淋巴细胞病毒LCMV、甲类流行性感冒病毒IAV、水疱性口炎病毒VSV)的 靶向切割，其有效性不亚于shRNA介导的RNA干扰作用。由于此前的研究已经证明Cas13 系统具有非常低的脱靶风险，该研究提示，利用Cas13系统直接靶向宿主细胞内的病毒RNA 将是一种安全高效的抗病毒策略。Cas13家族包含Cas13a(以前称为C2c2)、Cas13b、Cas13c 和Cas13d等亚型。
目前仍未有用于SARS-CoV-2病毒感染的可行的Cas13d基因编辑疗法被发明出来。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及 其应用，该gRNA或编码其的核酸递送至细胞将可作为CRISPR系统识别靶序列的组分，包含该gRNA或编码其的核酸的Crispr-Cas13d系统可有效破坏SARS-CoV-2病毒基因组Spike区域，可用于治疗SARS-CoV-2病毒感染。
一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA，所述gRNA包括包含靶向结构域，所述靶向结构域的序列靶向所述SARS-CoV-2病毒基因组的S区域。
上述gRNA，可有效破坏SARS-CoV-2病毒基因组Spike区域，实现细胞内高效破坏SARS-COV-2的病毒基因组，该gRNA或编码其的核酸的Crispr-Cas13d系统可用于治疗SARS-CoV-2病毒感染。
在其中一个实施例中，所述靶向结构域的序列选自：
1)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示的基础序列；
2)与所述基础序列具有至少70％相似性的扩展序列。
优选的，所述扩展序列与所述基础序列的相似性为80％以上。更优选的，所述扩展序列 与所述基础序列的相似性为90％以上。更优选的，所述扩展序列与所述基础序列的相似性为 95％以上。
在其中一个实施例中，所述扩展序列通过以下方法获得：
通过在基础序列的末端删减不超过12个核苷酸而得；
或，通过在基础序列的末端增加不超过5个核苷酸而得，且增加的核苷酸与靶序列对应 位置互补；
或，通过在基础序列的基础上替换不超过5个核苷酸而得；
或，通过在基础序列的末端删减不超过12个核苷酸的基础上，替换不超过5个核苷酸而 得；
或，通过在基础序列的末端增加不超过5个核苷酸的基础上，替换不超过5个核苷酸而 得。
在其中一个实施例中，所述扩展序列通过在基础序列的末端增加不超过3个核苷酸而得。
在其中一个实施例中，所述扩展序列通过在基础序列的末端删减不超过10个核苷酸而 得。更优选的，所述扩展序列通过在基础序列的末端删减不超过8个核苷酸而得。更优选的， 所述扩展序列通过在基础序列的末端删减不超过6个核苷酸而得。
在其中一个实施例中，所述扩展序列通过在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示序列的 末端删减不超过10个核苷酸而得。
在其中一个实施例中，所述基础序列选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列。靶向 结构域为SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的gRNA能更有效地靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因 组。
本发明还提供一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA表达载体，所述gRNA表达载体包含编码上述gRNA的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，所述gRNA表达载体包含编码上述gRNA的核苷酸序列，以及与 所述核苷酸序列有效连接的启动子。
在其中一个实施例中，所述gRNA表达载体选自：质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒。
本发明还提供一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的Crispr系统，包括上述gRNA或 编码其的核苷酸序列。
本发明还提供一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的组合物，包括：
上述gRNA，以及Cas13d蛋白；
或，上述gRNA，以及编码Cas13d蛋白的核苷酸序列；
或，上述gRNA，以及编码Cas13d蛋白的mRNA；
或，编码上述gRNA的核苷酸序列，以及Cas13d蛋白；
或，编码上述gRNA的核苷酸序列，以及编码Cas13d蛋白的核苷酸序列。
本发明还提供一种用于非诊断治疗目的的改变SARS-CoV-2病毒基因组核酸序列的方 法，使SARS-CoV-2病毒感染细胞与以下物质进行接触：
上述gRNA、gRNA表达载体、Crispr系统、或组合物。
本发明还提供一种改变SARS-CoV-2病毒基因组核酸序列的方法，使SARS-CoV-2病毒 感染细胞与上述gRNA、表达载体、组合物、或Crispr系统进行接触。
本发明还提供一种上述gRNA、表达载体、Crispr系统、或组合物在制备用于治疗SARS-CoV-2病毒感染的药物中的用途。
在其中一个实施例中，所述药物在肺部给药。
本发明一方面还提供一种用于治疗SARS-CoV-2病毒感染的药物，包括Cas13dmRNA-gRNA脂质纳米颗粒或Cas13d mRNA-gRNA-超支化聚(β-氨基酯)聚合物纳米颗粒，所述gRNA为上述gRNA。所述Cas13d mRNA-gRNA脂质纳米颗粒或Cas13d mRNA-gRNA-超 支化聚(β-氨基酯)聚合物纳米颗粒可通过将Cas13d mRNA、gRNA与脂质或超支化聚(β-氨基 酯)聚合物混合后制备得到。随着新的RNA修饰方式和递送技术的发展，新型可降解纳米颗 粒高效递送mRNA药物的技术可以安全有效地将mRNA分子递送到靶细胞，使得mRNA的 成药性进一步拓广。比如，麻省理工学院的研究人员设计了一种可吸入式的mRNA，利用这 种气溶胶直接作用于肺部，以帮助治疗囊性纤维化等疾病。研究者合成了一种带正电荷的聚 合物——超支化聚合物(聚β氨基酯)，聚(β-氨基酯)是一种生物可降解聚合物，不会在体内堆积从而损害机体。研究人员将mRNA与该聚合物混合制成150纳米的颗粒并将这些颗粒悬浮在液滴中，使用喷雾器将它们作为可吸入的气雾递送给小鼠。研究人员发现这种方式可以 特异地将药物递送到小鼠肺部，而其它器官却几乎没有信号。该研究结果提示，通过吸入式 递送mRNA有可能治疗一系列肺部疾病，包括病毒感染。
在其中一个实施例中，Cas13d mRNA-gRNA-超支化聚(β-氨基酯)聚合物纳米颗粒为可降 解纳米颗粒。
在其中一个实施例中，Cas13d mRNA-gRNA脂质纳米颗粒或Cas13d mRNA-gRNA-超支 化聚(β-氨基酯)聚合物纳米颗粒中gRNA的靶向结构域的序列包含选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列，或与所述SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7具有至少70％相似性的扩展序 列。优选地，gRNA的靶向结构域的序列包含选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA，可有效破坏SARS-CoV-2病毒基因组Spike区域，实现细胞内高效破坏SARS-COV-2的病毒基因组，含该gRNA或编码其的 核酸的Crispr-Cas13d系统可用于治疗SARS-CoV-2病毒感染。
本发明通过实验证实，本发明的gRNA用于Crispr-Cas13d系统可有效破坏SARS-CoV-2 病毒基因组RNA的Spike区域。其中，靶向结构域为nCoV-S-6和nCoV-S-7的gRNA效果尤 其显著。实验还证实，本发明的gRNA可通过脂质纳米颗粒的形式实现有效的肺部递送。
附图说明
图1为SARS-CoV-2基因组结构图；
图2为psiCHECK2-nCoV-S载体图谱；
图3为pXR004载体图谱；
图4为pXR001载体图谱；
图5为实施例3中hRluc表达量测试结果；
图6为实施例4中hRluc表达量测试结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了 本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的 实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人 员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施 例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所设计的内切酶均购自Thermo公司，核酸纯化试剂盒与2×Taqmaster Mix 购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，PrimeSTAR Max DNA polymerase premix和T4连接酶购 自TAKARA公司，ClonExpress II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公 司，双萤光素酶报告基因检测系统购自Promega公司。质粒构建与测序所用的引物由上海生 工生物工程有限公司合成。Stbl3感受态细菌购自深圳康体生命科技有限公司。实施例中的其 他试剂如无特殊说明，均为市售试剂。实施例中的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常 规实验方法或现有实验方法。
实施例1
Reporter载体设计与构建。
psiCHECK2质粒使用XhoI和NotI双酶切线性化，37℃反应1小时。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收6242bp的酶切产物，-20℃保存备用。
根据公布的SARS-CoV-2基因组序列(NC_045512.2)，全基因合成其S区域至pcDNA6B 载体。SARS-CoV-2基因组结构如图1所示。
使用PrimeSTAR Max DNA polymerase premix进行PCR扩增Spike区域的第24～3804bp 的碱基，同时引物中带入15～20bp的同源臂，用于后续克隆到psiCHECK2的NotI和XhoI 酶切位点之间，作为hRluc的3’UTR。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条 带。
PCR回收产物和psiCHECK2-XhoI/NotI酶切线性化回收产物使用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit进行重组连接，连接产物使用热击法转化大肠杆菌感受态细胞Stbl3，转化后向离 心管中加入不含抗生素的LB液体培养基，置于恒温摇床37℃、200rpm振荡培养60分钟使 菌体复苏。
将复苏后的Stbl3细胞涂布氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，于恒温培养箱37℃倒置培养 12-16小时。
从上述平板上分别挑取单菌落接种到50μl含氨苄青霉素的LB液体培养基中，使用引物 nCOV-S-F(5’-TGGCACACACTGGTTTGTAACAC-3’)(SEQ ID NO:10)和HSV TK-R (5’-CCGCGTCAGACAAACCCTAAC-3’)(SEQ ID NO:11)，对上述菌液进行PCR鉴定。PCR 产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，筛选出包含阳性克隆的菌液，接种至5ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12-16小时。
提取质粒并测定质粒浓度后，取部分质粒进行Sanger测序，测序正确的质粒保存于-20℃ 备用，该质粒命名为psiCHECK2-nCoV-S。psiCHECK2-nCoV-S载体图谱如图2所示。
实施例2
gRNA载体设计与构建。
根据SARS-CoV-2基因组S区域的靶序列设计30nt的gRNA靶向结构域序列，同时针对 hRluc区域设计2个gRNA作为对照，所述gRNA的靶向结构域如表1所示。
表1.gRNA的靶向结构域
名称 靶向结构域 序列编号
nCoV-S-1 AUAACCCACAUAAUAAGCUGCAGCACCAGC SEQ ID NO:1
nCoV-S-2 UUAGAAUUCCAAGCUAUAACGCAGCCUGUA SEQ ID NO:2
nCoV-S-3 UAGAACCUGUAGAAUAAACACGCCAAGUAG SEQ ID NO:3
nCoV-S-4 UCACCAUAUUGUUUGAUGAAGCCAGCAUCU SEQ ID NO:4
nCoV-S-5 ACUCUGACAUUUUAGUAGCAGCAAGAUUAG SEQ ID NO:5
nCoV-S-6 AGCAGGAUCCACAAGAACAACAGCCCUUGA SEQ ID NO:6
nCoV-S-7 CAGAGACAUGUAUAGCAUGGAACCAAGUAA SEQ ID NO:7
hRluc-1 ACAAAGAUGAUUUUCUUUGGAAGGUUCAGC SEQ ID NO:8
hRluc-2 CGAAGAAGUUAUUCUCAAGCACCAUUUUCU SEQ ID NO:9
分别合成靶序列对应的Oligo DNA，正义链为靶序列的反向互补序列，并且5’加AAAC， 反义链为靶序列5’加CTTG。
pXR004质粒使用BpiI酶切线性化，37℃反应1小时。将上述靶序列对应的OligoDNA 正义链和反义链混合，95℃孵育5分钟后放置在冰上冷却退火形成带粘性末端的双链DNA。 pXR004载体图谱如图3所示。
酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收2923bp的酶切产物。
退火产物和pXR004-BpiI酶切线性化回收产物使用T4连接酶进行连接，连接产物使用热 击法转化大肠杆菌感受态细胞Stbl3，转化后向离心管中加入不含抗生素的LB液体培养基， 置于恒温摇床37℃、200rpm振荡培养60分钟使菌体复苏。
将复苏后的Stbl3细胞涂布氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，于恒温培养箱37℃倒置培养 12-16小时。
从上述平板上分别挑取单菌落接种到50μl含氨苄青霉素的LB液体培养基中，使用引物 U6 Promoter-F(5’-GGGCCTATTTCCCATGATTCCTT-3’)(SEQ ID NO:12)和f1 ori-R(5’-GCTGGCAAGTGTAGCGGTCA-3’)(SEQ ID NO:13)，对上述菌液进行PCR鉴定。PCR 产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，筛选出包含阳性克隆的菌液，接种至5ml含氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12-16小时。
提取质粒并测定质粒浓度后，取部分质粒进行Sanger测序，测序正确的质粒保存于-20℃ 备用。
将包含编码靶向nCoV-S-1的gRNA的序列的载体命名为pXR004-nCoV-S-Pre-gRNA1， 包含编码靶向hRluc-1的gRNA的序列的载体命名为pXR004-hRluc-Pre-gRNA1，其他载体的 命名以此类推。pXR004-nCoV-S-Pre-gRNA1所表达的Pre-gRNA序列为 CAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAACAUAACCCACAUAAUAAGCUG CAGCACCAGCCAAGUAAACCCCUACCAACUGGUCGGGGUUUGAAAC(SEQ ID NO:14)， 其他Pre-gRNA分子除靶向结构域外的其他部分与pXR004-nCoV-S-Pre-gRNA1相同。
实施例3
质粒转染与双荧光素酶报告基因检测。
293T细胞按一定量接种至24孔板，使得24小时后细胞汇合度达到约80％。
使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂，将克隆了gRNA的pXR004质粒、表达Cas13d 的pXR001质粒(pXR001载体图谱如图4所示)、psiCHECK2-nCoV-S质粒按1:1:1的比例共 转染上述293T细胞，单独转染psiCHECK2-nCoV-S质粒设为阴性对照组，不转染任何质粒 的细胞作为空白对照。每个转染设置3个复孔(A/B/C)。质粒转染分组如表2所示。
表2.质粒转染分组
Figure BDA0002680397430000061
Figure BDA0002680397430000071
转染质粒48小时后按照双萤光素酶报告基因检测系统的使用方法，使用1×PLBBuffer 将细胞震荡裂解，随后将所有细胞碎片以及液体转移到1.5ml离心管，置于-80℃保存。
按照双萤光素酶报告基因检测系统的使用方法，使用多功能酶标仪进行双荧光素酶检测。
数据处理与分析见下表3和图5。结果显示1-9组可显著降低hRluc的表达量。其中靶向 结构域为nCoV-S-6和nCoV-S-7的两组尤其能够有效地降低hRluc的表达量，抑制率超过95％， 优于其他靶向结构域的分组，甚至优于直接靶向hRluc区域的分组。
表3.各组hRluc的表达量
Figure BDA0002680397430000072
Figure BDA0002680397430000081
备注：*表示与组10相比具有统计学差异(P<0.01)。
实施例4
质粒转染与双荧光素酶报告基因检测。
293T细胞按一定量接种至24孔板，使得24小时后细胞汇合度达到约80％。
使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂，将克隆了gRNA的pXR004质粒、表达Cas13d 的pXR001质粒按1:1的比例共转染上述293T细胞，24小时后再转染psiCHECK2-nCoV-S 质粒。每个转染设置3个复孔(A/B/C)。质粒转染分组如表4所示。不转染任何质粒的细胞 作为空白对照(组6)。
表4.质粒转染分组
分组 质粒1 质粒2 质粒3
1 psiCHECK2-nCoV-S pXR001 pXR004-nCoV-S-Pre-gRNA6
2 psiCHECK2-nCoV-S pXR001 pXR004-nCoV-S-Pre-gRNA7
3 psiCHECK2-nCoV-S pXR001 pXR004-hRluc-Pre-gRNA2
4 psiCHECK2 pXR001 pXR004-nCoV-S-Pre-gRNA7
5 psiCHECK2-nCoV-S / /
6 / / /
转染质粒48小时后按照双萤光素酶报告基因检测系统的使用方法，使用1×PLBBuffer 将细胞震荡裂解，随后将所有细胞碎片以及液体转移到1.5ml离心管，置于-80℃保存。
按照双萤光素酶报告基因检测系统的使用方法，使用多功能酶标仪进行双荧光素酶检测。
数据处理与分析见下表5和图6。靶向结构域为nCoV-S-6和nCoV-S-7的两组能有效降 低hRluc的表达量，抑制率约90％。
表5.各组hRluc的表达量
Figure BDA0002680397430000082
Figure BDA0002680397430000091
备注：*表示与组4相比具有统计学差异(P<0.01)，#表示与组5相比具有统计学差异 (P<0.01)。
实施例3和实施例4的实验结果显示，本发明的gRNA用于Crispr-Cas13d系统可破坏 SARS-CoV-2病毒基因组RNA的Spike区域，效果显著，因此可用于治疗SARS-CoV-2病毒感染。
实施例5
Cas13d-mRNA及gRNA纳米系统的制备与递送。
一、配制脂分子溶液。
按照摩尔比5A2-SC8/DOPE/cholesterol/DMG-PEG/DOTAP＝15/15/30/3/63的配比进行脂 分子溶液配制。以配制100ml的脂分子溶液为例，将488mg DLin-MC3-DMA(分子量642.11)、 565.46mg DOPE(分子量744.03)、587.71mg Cholesterol(分子量386.65)、381.40mg DMG-PEG2000(分子量2509.20)、2229.74mg DOTAP(分子量698.54)溶于100ml无水乙醇， 最终获得脂分子浓度为42.52mg/ml的乙醇溶液。
二、体外转录与配制RNA溶液。
使用RiboTM RNAmax-T7体外转录试剂盒在体外转录和纯化Cas13d mRNA和pregRNA6 (实施例2中SEQ ID NO:6所对应的pregRNA)，测定浓度后将Cas13d mRNA和pregRNA6 按摩尔比＝1/4的配比溶于citrate buffer(10mM,pH 4.0)，调节浓度至1.06mg/ml。
三、制备递送用纳米颗粒溶液。
取1ml上述RNA溶液，加入2ml citrate buffer(10mM,pH 4.0)，然后再迅速与1ml脂分 子溶液混合，即体积比为3:1(水相：乙醇相)，室温静置10min。其中脂分子:RNA分子(wt/wt) ＝40:1，所得纳米颗粒溶液中RNA的浓度为：0.27mg/ml。纳米颗粒溶液通过超滤的方法进行 浓缩以及Buffer置换，将加到10KD的超滤管中，4000rpm离心10min，随后加入5mlPBS 并再次按上述方法离心，重复用PBS洗2次后，最后用PBS调整体积至2ml。此时纳米颗粒溶液中含有1.06mg RNA，浓度约为0.53mg/ml。重复该步骤，制备6ml递送用纳米颗粒溶液。
四、小鼠雾化吸入纳米颗粒。
将小鼠雾化给药仪的气流速度设置为9L/min，小鼠放入雾化室内，加入2ml递送用纳米 颗粒溶液(实验组)，对照组小鼠使用2ml生理盐水，使其吸入雾化的溶液，直至所有的溶 液被用完。实验组小鼠和对照组小鼠各雾化递送3只，雾化结束后48小时，处死小鼠，取约 30mg肺组织，使用SteadyPure Universal RNA Extraction Kit(艾科瑞生物，AG21017)抽提 RNA。
五、RT-QPCR检测Cas13d mRNA。
使用EvoM-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR II(艾科瑞生物，AG11711)进行gDNA 去除与逆转录反应。
QPCR检测Cas13d mRNA的表达，以mGAPDH为内参。引物设计及QPCR反应体系如 下：
Cas13d-QPCR-F ATCACCAAGCTCAGGGAAGTG(SEQ ID NO:15)
Cas13d-QPCR-R AGGGACTTATTGGCGGCAGC(SEQ ID NO:16)
mGAPDH-QPCR-F CGTCCCGTAGACAAAATGGT(SEQ ID NO:17)
mGAPDH-QPCR-R TCAATGAAGGGGTCGTTGAT(SEQ ID NO:18)
表6.QPCR反应体系
Figure BDA0002680397430000101
进行结果分析，结果如下表7所示。在雾化递送纳米颗粒后，可在小鼠肺部组织中检测 到Cas13d mRNA的存在。
表7.RT-QPCR检测Cas13d mRNA
Figure BDA0002680397430000102
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州瑞风生物科技有限公司
<120> 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
auaacccaca uaauaagcug cagcaccagc 30
<210> 2
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uuagaauucc aagcuauaac gcagccugua 30
<210> 3
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uagaaccugu agaauaaaca cgccaaguag 30
<210> 4
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ucaccauauu guuugaugaa gccagcaucu 30
<210> 5
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acucugacau uuuaguagca gcaagauuag 30
<210> 6
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcaggaucc acaagaacaa cagcccuuga 30
<210> 7
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagagacaug uauagcaugg aaccaaguaa 30
<210> 8
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acaaagauga uuuucuuugg aagguucagc 30
<210> 9
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgaagaaguu auucucaagc accauuuucu 30
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggcacacac tggtttgtaa cac 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccgcgtcaga caaaccctaa c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggcctattt cccatgattc ctt 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctggcaagt gtagcggtca 20
<210> 14
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caaguaaacc ccuaccaacu ggucgggguu ugaaacauaa cccacauaau aagcugcagc 60
accagccaag uaaaccccua ccaacugguc gggguuugaa ac 102
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcaccaagc tcagggaagt g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agggacttat tggcggcagc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtcccgtag acaaaatggt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcaatgaagg ggtcgttgat 20

Claims (10)

1.一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA，其特征在于，所述gRNA包括包含靶向结构域，所述靶向结构域的序列靶向所述SARS-CoV-2病毒基因组的S区域。
2.根据权利要求1所述的gRNA，其特征在于，所述靶向结构域的序列选自：
1)SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任一所示的基础序列；
2)与所述基础序列具有至少70％相似性的扩展序列。
3.根据权利要求2所述的gRNA，其特征在于，所述扩展序列通过以下方法获得：
通过在基础序列的末端删减不超过12个核苷酸而得；
或，通过在基础序列的末端增加不超过5个核苷酸而得，且增加的核苷酸与靶序列对应位置互补；
或，通过在基础序列的基础上替换不超过5个核苷酸而得；
或，通过在基础序列的末端删减不超过12个核苷酸的基础上，替换不超过5个核苷酸而得；
或，通过在基础序列的末端增加不超过5个核苷酸的基础上，替换不超过5个核苷酸而得。
4.根据权利要求2或3所述的gRNA，其特征在于，所述基础序列选自SEQ ID NO:6或SEQID NO:7所示序列。
5.一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA表达载体，其特征在于，包含编码如权利要求1～4任一项所述的gRNA的核苷酸序列。
6.一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的Crispr系统，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的gRNA，或编码所述gRNA的核苷酸序列。
7.一种靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～4任一项所述的gRNA，以及Cas13d蛋白；
或，权利要求1～4任一项所述的gRNA，以及编码Cas13d蛋白的核苷酸序列；
或，权利要求1～4任一项所述的gRNA，以及编码Cas13d蛋白的mRNA；
或，编码如权利要求1～4中任一项所述的gRNA的核苷酸序列，以及Cas13d蛋白；
或，编码如权利要求1～4中任一项所述的gRNA的核苷酸序列，以及编码Cas13d蛋白的核苷酸序列。
8.一种用于非诊断治疗目的的改变SARS-CoV-2病毒基因组核酸序列的方法，其特征在于，使SARS-CoV-2病毒感染细胞与以下物质进行接触：
权利要求1～4任一项所述的gRNA、权利要求5的gRNA表达载体、权利要求6所述的Crispr系统、或权利要求7所述的组合物。
9.权利要求1～4任一项所述的gRNA、权利要求5所述的gRNA表达载体、权利要求6所述的Crispr系统、或权利要求7所述的组合物在制备用于治疗SARS-CoV-2病毒感染的药物中的用途。
10.一种用于治疗SARS-CoV-2病毒感染的药物，其特征在于，包括Cas13d mRNA-gRNA脂质纳米颗粒或Cas13d mRNA-gRNA-超支化聚(β-氨基酯)聚合物纳米颗粒，所述gRNA为权利要求1～4任一项所述的gRNA。
CN202010960568.3A 2020-09-14 2020-09-14 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用 Active CN112143731B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010960568.3A CN112143731B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010960568.3A CN112143731B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112143731A true CN112143731A (zh) 2020-12-29
CN112143731B CN112143731B (zh) 2022-03-15

Family

ID=73892196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010960568.3A Active CN112143731B (zh) 2020-09-14 2020-09-14 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112143731B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022071890A1 (en) * 2020-10-02 2022-04-07 Agency For Science, Technology And Research Guide rnas targeting sars-cov-2
KR20220105087A (ko) * 2021-01-19 2022-07-26 한국표준과학연구원 SARS-CoV-2 RNA 절단용 CRISPR-Cas13 조성물 및 PCR 키트
CN115304756A (zh) * 2022-01-30 2022-11-08 上海科技大学 一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656123A (zh) * 2019-10-12 2020-01-07 中国农业大学 基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用
CN111139242A (zh) * 2020-04-03 2020-05-12 苏州吉玛基因股份有限公司 一种小干扰核酸及组合物和应用
CN111139241A (zh) * 2020-04-03 2020-05-12 苏州吉玛基因股份有限公司 抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用
CN111328343A (zh) * 2017-08-22 2020-06-23 萨克生物研究学院 Rna靶向方法和组合物
CN111518809A (zh) * 2020-05-12 2020-08-11 杭州勇诚睿生物科技有限公司 干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111328343A (zh) * 2017-08-22 2020-06-23 萨克生物研究学院 Rna靶向方法和组合物
CN110656123A (zh) * 2019-10-12 2020-01-07 中国农业大学 基于CRISPR-Cas13d系统的sgRNA高效作用靶点的筛选方法及应用
CN111139242A (zh) * 2020-04-03 2020-05-12 苏州吉玛基因股份有限公司 一种小干扰核酸及组合物和应用
CN111139241A (zh) * 2020-04-03 2020-05-12 苏州吉玛基因股份有限公司 抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用
CN111518809A (zh) * 2020-05-12 2020-08-11 杭州勇诚睿生物科技有限公司 干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIMOTHY R. ABBOTT等: "Development of CRISPR as an Antiviral Strategy to Combat SARS-CoV-2 and Influenza", 《CELL》 *
TUAN M. NGUYEN等: "Virus against virus: a potential treatment for 2019-nCov (SARS-CoV-2) and other RNA viruses", 《CELL RESEARCH》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022071890A1 (en) * 2020-10-02 2022-04-07 Agency For Science, Technology And Research Guide rnas targeting sars-cov-2
KR20220105087A (ko) * 2021-01-19 2022-07-26 한국표준과학연구원 SARS-CoV-2 RNA 절단용 CRISPR-Cas13 조성물 및 PCR 키트
KR102597362B1 (ko) 2021-01-19 2023-11-06 한국표준과학연구원 SARS-CoV-2 RNA 절단용 CRISPR-Cas13 조성물 및 PCR 키트
CN115304756A (zh) * 2022-01-30 2022-11-08 上海科技大学 一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用
CN115304756B (zh) * 2022-01-30 2023-05-09 上海科技大学 一种五元脂质纳米颗粒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112143731B (zh) 2022-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112143731B (zh) 靶向破坏SARS-CoV-2病毒基因组的gRNA及其应用
US20200009268A1 (en) Expression constructs and systems for systemic and non-specific in vivo delivery of a nucleic acid to human cells and transient target cell-specific production of a therapeutic protein
WO2017213898A2 (en) Rna guided compositions for preventing and treating hepatitis b virus infections
JP2007527240A5 (zh)
US11525146B2 (en) Expression constructs, fusogenic lipid-based nanoparticles and methods of use thereof
US20220088049A1 (en) Compositions, methods, and kits for delivery of polyribonucleotides
US20180161455A1 (en) Non-integrating viral delivery system and methods of use therof
JP2020505390A (ja) Ｃｒｉｓｐｒ治療薬を送達するためのウイルスベクターとしてのレンチウイルスおよび非組み込みレンチウイルス
Li et al. Advances in mRNA vaccines
US20220106608A1 (en) Fusogenic lipid nanoparticles for the target cell-specific production of rapamycin inducible therapeutic proteins
MX2011001315A (es) Modulacion de la expresion de los receptores del tipo toll 7 mediante oligonucleotidos antisentido.
EP3369435B1 (en) Composition for the treatment of inflammatory joint disease
JP2002541125A (ja) エアロゾル送達のためのポリエチレンイミン：ｄｎａ製剤
CN115161289B (zh) 一种用于炎症性疾病治疗的重组腺相关病毒及其构建方法和应用
WO2022109093A1 (en) Compositions and methods for treating and suppressing allergic responses
CN112266912A (zh) 靶向miR-29b的gRNA、AAV8-CRISPR/Cas9系统及其应用
EP4008785A1 (en) Circular nucleic acids and uses thereof for interfering with genome expression and proliferation of coronaviruses
EP3954773A1 (en) Compositions and methods for the treatment of diseases by enhancing arginase 2 in macrophages
US20220403384A1 (en) Engineered circular rna circmir-29b and use thereof in preparation of medicine for treating muscle atrophy
RU2815001C2 (ru) Составы на основе липидов для доставки рнк
CN113105537B (zh) 一种促进a型流感病毒复制的宿主蛋白及其应用
CN107586778B (zh) 抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用
US20220251601A1 (en) mRNA NANOCAPSULE AND USE IN PREPARATION OF ANTIVIRAL DRUGS
JP2004525602A (ja) 組織特異的および病原菌特異的毒性剤、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの使用方法
CN114533901A (zh) 一种同时靶向rna与dna病毒的药物及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant