CN113234702A

CN113234702A - 一种Lt1Cas13d蛋白及基因编辑系统

Info

Publication number: CN113234702A
Application number: CN202110325574.6A
Authority: CN
Inventors: 谢红娴; 程欢欢; 黄龙; 兰凯
Original assignee: Zhuhai Shutong Medical Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Shutong Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN113234702B; WO2022199511A1

Abstract

本发明涉及一种Lt1Cas13d蛋白及基因编辑系统，其包含Lt1Cas13d蛋白或者编码所述Lt1Cas13d蛋白的一种或多种核苷酸序列，以及CRISPR RNA或转录所述CRISPR RNA的一种或多种核苷酸序列；其中，所述Lt1Cas13d蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1具有至少80％的同源性的序列。本发明找到一种新的RNA核酸内切酶即Lt1Cas13d蛋白，并使用其开发了VI‑D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，该基因编辑系统应用于编辑原核生物或真核生物基因，为基因编辑工具箱提供了新选择。

Description

一种Lt1Cas13d蛋白及基因编辑系统

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种Lt1Cas13d蛋白及基因编辑系统。

背景技术

基因编辑(gene editing)技术使得DNA序列定位点进行改造成为可能，比如第一代基因编辑工具锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs),第二代基因编辑工具类似转录激活的小型核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)，第三代基因编辑工具中的II型及V型的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas(CRISPR-associated protein)都可以用于改造靶向基因组，但这些基因编辑系统只能靶向基因组DNA，而不能对外来的RNA进行靶向编辑。

VI型的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列，Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeat)/Cas(CRISPR-associated protein)系统，是来自古生菌和细菌的天然免疫系统。其不同于以往基因编辑工具，利用核酸碱基互补配对原理进行目标RNA序列的识别，引导Cas效应蛋白进行定点切割，适用性强、设计简单、效率高。其中，VI-D型CRISPR/Cas13系统是目前发现的RNA编辑效率最高的CRISPR/Cas系统，且VI-D型CRISPR/Cas13系统的切割作用在原核及真核中均无PFS(Protospacer flanking site)。

在庞大以及各色各样的宏基因组中，隐藏了尚未培养甚至尚未发现的微生物，可能存在大量的未被发现的CRISPR/Cas系统，这些系统在原核生物和真核生物，以及在体外环境中的活性也需要得到证实。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、高效靶向编辑RNA的基因编辑系统，以丰富现有的基因编辑工具家族。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明第一方面提供一种Lt1Cas13d蛋白以及编码上述Lt1Cas13d蛋白的多核苷酸。所述Lt1Cas13d蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与其具有至少80％的同源性。

优选地，所述的Lt1Cas13d蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性，优选具有至少90％的同源性，进一步优选具有至少95％的同源性，再优选至少具有96％、97％、98％、99％的同源性。

该Lt1Cas13d蛋白包含957个氨基酸，是一种多结构域和多功能RNA核酸内切酶。它通过HEPN样核酸酶结构域有效切割与CRISPR RNA(crRNA)互补的单链RNA。

优选地，所述多核苷酸经密码子优化用于在目的细胞中的表达。

本发明的第二方面是提供一种载体，所述载体包含编码所述Lt1Cas13d蛋白的多核苷酸。

本发明的第三方面是提供一种载体系统，其包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含上述多核苷酸，并且在相同或不同的载体上包含转录CRISPR RNA的一种或多种多核苷酸。

本发明的第四方面是提供一种复合物以及一种VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，所述复合物包含所述的Lt1Cas13d蛋白，以及CRISPR RNA。所述VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统包含所述的Lt1Cas13d蛋白或者编码所述Lt1Cas13d蛋白的一种或多种多核苷酸，以及CRISPR RNA或转录所述CRISPR RNA的一种或多种多核苷酸。

本发明第五方面还提供一种CRISPR RNA的设计原则，包括以下一种或多种：

1)CRISPR RNA的间隔序列长度为9～30个碱基序列；

2)CRISPR RNA的间隔序列与目的基因的正义链反向互补；

3)CRISPR RNA的直接重复序列为12～36个碱基序列；

4)CRISPR RNA的直接重复序列包含2个茎环结构；

5)CRISPR RNA的间隔序列中间为seed区，与靶序列结合时不发生错配。

优选地，CRISPR Array转录得到前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，前体CRISPR RNA加工剪切形成所述的CRISPR RNA，所述的CRISPR RNA作为向导RNA与Lt1Cas13d蛋白形成复合体，

所述的CRISPR Array包括与所述的Lt1Cas13d蛋白相匹配的直接重复序列以及间隔序列，所述的CRISPR Array的间隔序列包括靶序列，

所述的前体CRISPR RNA序列从5’到3’为：5’-直接重复序列-间隔序列-直接重复序列-3’。

具体地，所述的靶序列为外源的RNA的短片段逆转录出的DNA或针对目的基因设计并人工合成的靶序列。

转录加工出来的成熟的CRISPR RNA中的间隔序列与目的锚定基因互补，引导Lt1Cas13d蛋白去剪切目的基因组中的基因。成熟的CRISPR RNA(crRNA)序列5'端为直接重复序列，3'端为间隔序列，成熟的CRISPR RNA可作为向导RNA与Lt1Cas13d蛋白形成复合体，直接重复序列指导Lt1Cas13d蛋白与特异性RNA靶点结合，间隔序列与特异性RNA靶点互补配对。

根据一种实施方式，所述的CRISPR Array的直接重复序列如SEQ ID NO:4所示，或与其具有至少80％同源性。

根据一种具体实施方式，当所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统用于靶向切割大肠杆菌RNA时，所述的靶序列如SEQ ID NO:12所示；

根据一种具体实施方式，当所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统用于靶向切割内源性基因ANXA4时，所述的靶序列如SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14所示。

优选地，所述的CRISPR Array的间隔序列还包括与Lt1Cas13d蛋白相关的元件，所述的与Lt1Cas13d蛋白相关的元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:6所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:7所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:8所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:9所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:10所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:11所示，或与其具有至少80％同源性。

优选地，所述的基因编辑系统还包括辅助蛋白或编码所述的辅助蛋白的一种或多种多核苷酸。

所述的辅助蛋白可帮助捕获外源基因并参与前体CRISPR RNA剪切加工。

进一步优选的，所述的辅助蛋白包括Cas1蛋白和/或Cas2蛋白，

其中，所述的Cas1蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％的同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性，再优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性；

所述的Cas2蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％的同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性，再优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

本发明所述的CRISPR RNA(crRNA)，以碱基互补配对的形式引导Lt1Cas13d蛋白识别入侵的外源基因组。细菌在噬菌体或病毒等入侵时，在Cas1蛋白和Cas2蛋白的辅助下，由外源RNA的短片段逆转录出的DNA作为新的间隔序列整合到宿主染色体内的CRISPR Array的直接重复序列之间，从而提供了感染的遗传记录，当机体再次受到外源基因入侵时，CRISPR Array转录产生前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，前体CRISPR RNA(pre-crRNA)中包括与外来入侵基因的序列互补的间隔序列以及与Lt1Cas13d蛋白相关的元件互补的间隔序列，经剪切加工得到5'端为直接重复序列，3'端为间隔序列的成熟CRISPR RNA(crRNA)，3'端的间隔序列即为与外来入侵基因的序列互补的间隔序列，成熟CRISPR RNA(crRNA)作为Lt1Cas13d蛋白的向导RNA(sgRNA)。

本发明中还提供了所述的载体系统、或所述的复合物、或所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统在生物学过程中结合或切割RNA功能的结构；优选地，所述结合或切割RNA功能的结构包括但不限于CRISPR RNA(crRNA)二级结构、Lt1Cas13d效应蛋白功能域或Lt1Cas13d-crRNA复合物结构；优选地，所述RNA为原核生物或真核生物的RNA。

Lt1Cas13d蛋白能够识别并切割与CRISPR RNA(crRNA)间隔序列互补的单链RNA。与VI-A及VI-B型Cas13系统不同的是，Lt1Cas13d蛋白识别并切割单链RNA无PFS(Protospacer flanking site)。因此，通过干扰实验即可以说明Lt1Cas13d蛋白在原核系统里具有切割作用。通过人为设计CRISPR RNA(crRNA)，合成含有靶序列(与设计的CRISPRRNA的间隔序列相互补)的CRISPR Array，可以实现本发明的VI-D型CRISPR-Cas13系统靶向基因组中几乎所有感兴趣的RNA序列。

本发明第六方面还提供一种所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统在编辑原核生物或真核生物基因方面的应用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统用于在RNA水平上结合或切割。

本发明提供的一种新的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，该基因编辑系统具有新的理化性质且对单链RNA靶向编辑无PFS(Protospacer flanking site)。

本发明的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统相比现有CRISPR/Cas13基因编辑系统效率更高。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明找到一种新的RNA核酸内切酶即Lt1Cas13d蛋白，并使用其开发了VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，该基因编辑系统应用于编辑原核生物或真核生物RNA，为基因编辑工具箱提供了新选择。

附图说明

图1为VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统组成图。

图2为本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统识别的CRISPR RNA(crRNA)分子的RNA二级结构预测图；

图3为本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统的干扰实验结果；

图4为本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统与VI-D型CasRfxCas13d基因编辑系统靶向切割内源性基因后通过qPCR相对定量得到的相对表达量对比图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

通过对宏基因组进行分析预测和筛选得到与VI型CRISPR-Cas13系统相关的蛋白和相关的元件，获得如图1所示的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统。该VI-D型CRISPR-Cas13基因编辑系统包含以下组件：核酸内切酶Lt1Cas13d基因，辅助蛋白Cas1、Cas2，CRISPR Array。Lt1Cas13d基因包含957个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.1所示；辅助蛋白Cas1(其序列如SEQ ID NO.2所示)、Cas2(其序列如SEQ ID NO.3所示)，辅助蛋白Cas1和Cas2参与外源基因捕获以及CRISPR RNA(crRNA)的成熟；CRISPR Array包括重复序列(其序列如SEQ ID NO.4所示)和间隔序列(与Lt1Cas13d蛋白相关的元件，其序列如SEQ ID NO.5至11所示)。

在Cas1蛋白和Cas2蛋白辅助下，外源RNA的短片段逆转录出DNA或人工合成的序列(靶序列)作为新的间隔序列被整合到CRISPR Array的直接重复序列之间，CRISPR Array转录产生前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，pre-crRNA序列从5’到3’为：5’-直接重复序列-间隔序列-直接重复序列-3’，pre-crRNA的间隔序列包括与靶序列互补的序列以及与Lt1Cas13d蛋白相关的元件互补的序列。pre-crRNA随后进行剪切加工形成5'端为直接重复序列、3'端为间隔序列的成熟CRISPR RNA(crRNA)序列，3'端的间隔序列即为与外源RNA的短片段逆转录出DNA序列或人工合成的序列(靶序列)互补的序列，5'端的直接重复序列指导Lt1Cas13d蛋白与靶序列结合，从而作为向导RNA(sgRNA)引导Lt1Cas13d蛋白切割靶向目标序列。

实施例2

本实施例为预测本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统识别的crRNA分子的RNA二级结构。

由于pre-crRNA在Lt1Cas13d核酸酶的作用下经剪切加工形成5'端为间隔序列，3'端为直接重复序列的成熟crRNA，作为向导RNA(guide RNA)，5'端间隔序列与目的基因的正义链互补，因此可通过3'端保留的直接重复序列预测二级结构。

(1)材料：repeat序列(SEQ ID NO:4)，

(2)软件：NUPACK(http://www.nupack.org/partition/new)

(3)预测方法：通过使用在线应用NUPACK模拟体外37℃下repeat序列形成的二级结构，如图2所示。

由图2可知，repeat序列具有两个茎环结构，因此本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统识别的crRNA分子的RNA二级结构具有两个茎环结构。

实施例3

本实施例通过干扰实验确定本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统在原核生物水平的切割能力。干扰实验结果如图3所示。

(1)材料：实施例1预测的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统相关基因。

(2)验证方法：本实施例对本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统构建原核验证体系，验证其切割作用。

具体操作如下所示：

(a)在pET28a载体上插入本发明所述的新发现的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统(包括核酸内切酶Lt1Cas13d基因及其对应的CRISPR Array序列)，Lt1Cas13d基因序列进行大肠杆菌密码子优化，在CRISPR Array中加入含有人工合成的基因序列，序列如SEQ IDNO:12所示)，并且在Cas13d基因、CRISPR Array上源添加强异源启动子J23119，构建原核表达pET28a-Cas13d质粒；

(b)在pACYC184质粒的氯霉素基因的第一个起始密码子后插入人工合成的与CRISPR Array中人工合成的基因序列SEQ ID NO:12对应的target序列，构建pACYC184-target质粒；

(c)把含有pET28a-Cas13d以及pACYC184-target共同电转入大肠杆菌DH5a，将含有pET28a-Cas13d以及空载的pACYC184共同电转入大肠杆菌DH5a作为对照，37℃复苏1h后按梯度稀释菌液并滴在含有卡那霉素(50ug/ml)及氯霉素(30ug/ml)双抗性的SOB培养基上37℃孵育12-16h，观察不同浓度梯度下的单克隆菌落数。

图3显示：通过干扰实验验证Lt1Cas13d能够在大肠杆菌体内有效靶向切割RNA序列。图3右列为Lt1Cas13d靶向切割目标质粒，图3左列为单独的Lt1Cas13d与空载的pACYC184，梯度稀释观察单克隆菌落数，发现右列的菌落数明显减少，说明Lt1Cas13d能够在大肠杆菌体内有效靶向切割RNA序列。

实施例4

本实施例通过靶向真核内源性基因ANXA4及qPCR相对定量的方法比较本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统与VI-D型CasRfxCas13d基因编辑系统在真核生物水平的切割能力。qPCR相对定量结果如图4所示。

(1)材料：实施例1预测的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统相关基因以及已发现的切割效果最强的VI-D型CRISPR基因CasRfxCas13d(简称CasRx，公开于文献1.Konermann,Silvana,et al.“Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPREffectors.”Cell(2018)pii:S0092-8674(18)30207-1.2.Yan,Winston X.,et al.“Cas13dIs a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by aWYL-Domain-Containing Accessory Protein.”Mol Cell.(2018)pii:S1097-2765(18)30173-4.)及其相关基因。

(2)验证方法：本实施例对本发明所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统构建真核验证体系，验证其切割作用并对比其与CasRx切割效果；

具体操作如下所示：

根据下列原则设计靶向内源性基因ANXA4的CRISPR RNA(crRNA)：

a)crRNA的间隔序列长度为30个碱基序列；

b)crRNA的间隔序列与ANXA4基因的正义链反向互补；

c)crRNA的直接重复序列为36个碱基序列；

d)crRNA的直接重复序列应包含2个茎环(stem loop)结构；

e)在cRNA的间隔序列中间为seed区，与靶序列结合时不能发生错配。

crRNA由CRISPR Array转录的前体crRNA剪切加工获得，前体crRNA包括间隔序列(spacer)和直接重复序列(Direct Repeat,DR)，序列从5端到3端为:5’直接重复序列-间隔序列-直接重复序列-3’。

在ANXA4外显子上设计两个靶点crRNA-1、crRNA-2以及不靶向ANXA4的Nontarget(NT)，crRNA-1、crRNA-2及Nontarget(NT)的长度均为30bp，序列分别为SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15：

(3)在minicircle载体(minicircle载体已于文献[1]Darquet AM,Rangara R,Kreiss P,Schwartz B,Naimi S,Delaère P,Crouzet J,Scherman D.Minicircle:animproved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.GeneTher.1999Feb；6(2):209-18.doi:10.1038/sj.gt.3300816.PMID:10435105.[2]Chen ZY,He CY,Ehrhardt A,Kay MA.Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA resultin persistent and high-level transgene expression in vivo.Mol Ther.2003Sep；8(3):495-500.doi:10.1016/s1525-0016(03)00168-0.PMID:12946323.[3]Kay MA,He CY,Chen ZY.A robust system for production of minicircle DNA vectors.NatBiotechnol.2010Dec；28(12):1287-9.doi:10.1038/nbt.1708.Epub 2010Nov 21.PMID:21102455；PMCID:PMC4144359.中公开)上插入本发明的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统(包括核酸内切酶Lt1Cas13d蛋白基因以及其对应的CRISPR array序列)或VI-D型CRISPR基因CasRfxCas13d(包括CasRx蛋白基因及其对应的CRISPR array序列)，Lt1Cas13d蛋白基因和CasRx蛋白基因序列进行人源优化，分别合成具有crRNA-1、crRNA-2及Nontarget(NT)序列的CRISPR array。在Lt1Cas13d蛋白基因上源添加启动子EF-1a，分别在CRISPR array上源添加人源启动子U6，构建真核表达minicircle-Cas13d-crRNA和minicircle-CasRx-crRNA质粒，包括间隔序列靶向内源基因ANXA4的minicircle-Cas13d-crRNA-1、minicircle-Cas13d-crRNA-2、minicircle-CasRx-crRNA-1、minicircle-CasRx-crRNA-2质粒及未靶向任何内源性基因的质粒minicircle-CasRx-crRNA-NT、minicircle-CasRx-crRNA-NT；

(4)将上述构建的minicircle-Cas13d-crRNA、minicircle-CasRx-crRNA质粒通过Hp转染的方式分转入空白的HEK293细胞中，以转入minicircle-Cas13d-crRNA-1、minicircle-Cas13d-crRNA-2质粒以及minicircle-CasRx-crRNA-1、minicircle-CasRx-crRNA-2为实验组，以转入minicircle-Cas13d-crRNA-NT、minicircle-CasRx-crRNA-NT质粒为阴性对照组，另设一组未转质粒的HEK293细胞为空白对照，培养48h后收细胞，提取RNA，并将其逆转录为cDNA，以GAPDH为内参基因进行qPCR相对定量分析，观察实验组的目标内源性基因ANXA4的相对空白对照组的表达量是否下降。

由图4可知：VI-D型CRISPR/Cas13和VI-D型CasRfxCas13d的实验组相对各自空白对照组目标内源性基因ANXA4表达量均明显降低，且VI-D型CRISPR/Cas13目的基因表达量的下降程度比VI-D型CasRfxCas13d更为明显。证明本发明中的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统在真核生物中具有靶向切割作用且切割效果强于现有的VI-D型CasRfxCas13d。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司

<120> 一种Lt1Cas13d蛋白及基因编辑系统

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 957

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

Met Ile Leu Ile Leu Gly Glu Gly Thr Ile Arg Met Ala Lys Lys Lys

1 5 10 15

Asn Ala Arg Gln Arg Arg Glu Glu Glu Lys Asn Arg Ile Lys Ala Ile

20 25 30

Ile Glu Lys Ile Lys Asn Lys Val Val Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu

35 40 45

Ile Val Glu Asn Asn Glu Thr Lys Asn Val Glu Ser Ile Val Val Glu

50 55 60

Pro Lys Lys Lys Ser Leu Ala Lys Ala Ser Gly Val Lys Ser Val Phe

65 70 75 80

Ile Asn Asn Asp Glu Ile Ile Met Thr Ser Phe Gly Arg Gly Asn Asp

85 90 95

Ala Val Ile Glu Lys Ile Ile Lys Asp Asn Asn Ile Asp Asn Glu Asn

100 105 110

Lys Asp Lys Pro Val Tyr Asp Val Val Ala Ile Glu Asn Glu Gly Asn

115 120 125

Ile Ile Lys Val Gln Ser Glu Arg Phe Lys Ala Ile Glu Ser Ala Asn

130 135 140

Thr Glu Ile Pro Pro Glu Arg Asn Gly Met Asp Leu Ile Lys Arg Lys

145 150 155 160

Asp Lys Leu Glu Glu Val Tyr Phe Gly His Thr Phe Asn Asp Asn Ile

165 170 175

His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Ile Leu Asp Ile Glu Lys Ile Leu Ser

180 185 190

Val Tyr Ile Asn Asn Ile Val Tyr Ala Leu Gly Asn Leu Glu Arg Lys

195 200 205

Asp Thr Asp Glu Glu Lys Asp Leu Ile Gly Tyr Ser Ser Ala Arg Ala

210 215 220

Lys Tyr Glu Asp Phe Ile Glu Asn Glu Lys Leu Glu Asp Arg Lys Lys

225 230 235 240

Leu Leu Glu Glu Phe Ile Glu Asn Gly Asp Arg Leu Gly Tyr Phe Gly

245 250 255

Asn Val Phe Phe Lys Asn Asp Lys Glu Leu Lys Ser Lys Lys Glu Ile

260 265 270

Tyr Asn Ile Leu Gly Leu Leu Gly Ser Leu Arg Gln Phe Cys Phe His

275 280 285

Tyr Asn Glu Ala Val Phe Glu Asn Glu Glu Gly Lys Ile Asn Gln Glu

290 295 300

Tyr Lys Ser Asn Ser Trp Leu Tyr Asn Leu Gly Gln Leu Phe Asp Glu

305 310 315 320

Phe Lys Asp Thr Leu Asn Gly Phe Tyr Asn Glu Lys Ile Asp Ser Ile

325 330 335

Asn Lys Asp Phe Ile Lys Thr Asn Gln Ile Asn Leu His Ile Ile Cys

340 345 350

Ser Glu Leu Gly Met Asn Met Asp Lys Glu Gln Val Val Gly Asp Tyr

355 360 365

Tyr Asp Phe Ile Ile Ser Lys Lys His Lys Asn Met Gly Phe Ser Ile

370 375 380

Lys Lys Ile Arg Glu Tyr Met Phe Asp Ile Tyr Glu Ala Phe Asp Ile

385 390 395 400

Lys Asp Lys Glu Phe Asp Ser Val Arg Ser Ile Leu Tyr Lys Ile Ile

405 410 415

Asp Phe Ile Ile Tyr Tyr Ser Phe Ile His Tyr Lys Asn Asp Ile Ala

420 425 430

Glu Asn Ile Val Ser Arg Leu Arg Val Ser Leu Ser Glu Glu Asp Lys

435 440 445

Asp Lys Val Tyr Glu Glu Ile Ala Arg Asp Thr Trp Asn Glu Tyr Lys

450 455 460

Asp Gln Ile Asn Lys Leu Lys Glu Leu Leu Thr Lys Arg Ile Gly Glu

465 470 475 480

Phe Ser Asp Ala Lys Asn Lys Asn Val Tyr Tyr Lys Glu Phe Glu Ser

485 490 495

Ile Lys Phe Asp Glu Ile Gly Lys Lys Lys Leu Gly Glu Asn Ala Asp

500 505 510

Tyr Phe Cys Lys Leu Met Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Leu Asp Gly Lys

515 520 525

Glu Ile Asn Asp Leu Leu Thr Thr Leu Ile Asn Lys Phe Asp Asn Ile

530 535 540

Arg Ser Phe Ile Glu Ile Met Glu Glu Lys Gln Ile Glu Cys Asn Phe

545 550 555 560

Asp Glu Lys Phe Ser Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Val Cys Asp Thr

565 570 575

Leu Arg Glu Val Asn Ser Phe Ala Arg Met Gln Arg Pro Leu Asp Asn

580 585 590

Lys Ser Val Gln Arg Glu Met Tyr Arg Asp Ala Ile Lys Ile Leu Leu

595 600 605

Lys Asp Thr Trp Val Glu Glu Lys Asn Ile Asp Arg Ile Leu Asp Glu

610 615 620

Tyr Ile Pro Asn Lys Glu Asn Lys Ser Ile Lys Lys Asp Phe Arg Asn

625 630 635 640

Phe Ile Ile Lys Asn Ile Ile Lys Ser Asn Arg Phe Ile Tyr Leu Ile

645 650 655

Lys Tyr Ser Asn Pro Thr Asp Val Arg Lys Leu Ala Ser Asn Lys Asp

660 665 670

Val Val Lys Phe Val Leu Asn Thr Ile Pro Glu Ala Gln Ile Asp Arg

675 680 685

Tyr Tyr Asn Ser Cys Gly Leu Pro Leu Glu Glu Asp Asn Asn Val Gln

690 695 700

Ile Glu Lys Leu Ser Glu Ile Ile Thr Asn Ile Asp Tyr Ile Glu Phe

705 710 715 720

Leu Asp Val Gln Gln Ser Tyr Lys Asn Glu Asp Lys Ser Gln Lys Gln

725 730 735

Ala Val Val Thr Leu Tyr Leu Thr Ile Leu Tyr Ile Leu Thr Lys Asn

740 745 750

Leu Val Asn Val Asn Ser Arg Tyr Val Ile Ala Leu His Cys Leu Glu

755 760 765

Arg Asp Ser Thr Leu Tyr Gly Ile Lys Leu Lys Lys Glu Lys Asn Lys

770 775 780

Pro Ser Lys Tyr His Lys Leu Thr Gln Tyr Phe Ile Asp Asn Arg Tyr

785 790 795 800

Phe Asp Arg Lys Lys Lys Asp Arg Lys Asn Gly Glu Tyr Val Ser Lys

805 810 815

Lys Ile Ser Gly Tyr Ile Glu Lys Asn Met Lys Asn Tyr Ile Glu Cys

820 825 830

Glu Gln Ile Glu Thr Thr Glu Gln Tyr Lys Glu Thr Gly Val Asp Met

835 840 845

Phe Ile Asn Tyr Arg Asn Ser Ile Ala His Leu Asn Thr Val Arg Lys

850 855 860

Ala Ser Lys Tyr Ile Lys Asp Ile Lys Tyr Phe Gly Thr Tyr Phe Glu

865 870 875 880

Leu Tyr His Tyr Ile Met Gln Arg Tyr Leu Lys Asp Asn Ile Glu Leu

885 890 895

Lys Gly Glu Asn Asn Ala Leu Glu Gly Tyr Phe Asp Asn Leu Cys Lys

900 905 910

Tyr Gly Thr Tyr Val Lys Asp Phe Val Lys Thr Leu Asn Val Pro Phe

915 920 925

Ala Tyr Asn Tyr Pro Arg Tyr Lys Asn Leu Ser Ile Asp Glu Leu Phe

930 935 940

Asp Lys Asn Asn Thr Arg Lys Thr Lys Lys Ser Ser Leu

945 950 955

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

Leu Ile Asn Asp Gly Trp Arg Thr Val Ile Ile Ser Ser Arg Ala Glu

1 5 10 15

Leu Lys Tyr Ser Asp Gly Asn Val Ile Val Leu Ser Asp Glu Lys Lys

20 25 30

Glu Ile Pro Ile Gly Gln Ile Ser Val Leu Met Leu Asn Cys Asp Gly

35 40 45

Ile Lys Phe Thr Thr Gly Val Met Arg Glu Leu Leu Glu Asn Asn Ile

50 55 60

Lys Val Ile Phe Cys Asp Lys Lys Tyr Asn Pro Cys Gly Glu Thr Cys

65 70 75 80

Gly Tyr Asn Asn Thr Phe Met Ser Gly Lys Ile Asp Glu Gln Ile Lys

85 90 95

Trp Ser Ser Glu Ile Lys Gly Leu Thr Trp Gln Leu Ile Val Ser Asn

100 105 110

Lys Ile Asp Cys Gln Arg Lys Leu Leu Glu Lys Tyr Gly Leu Asp Gly

115 120 125

Phe Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ala Glu Val Val Leu Val Asn Asp Lys

130 135 140

Ser Asn Lys Glu Gly Gln Ala Ala Arg Ile Tyr Phe Gly Ser Leu Phe

145 150 155 160

Gly Lys Gln Phe Asn Arg Arg Ser Leu Asn Asn Ile Asn Gly Ala Leu

165 170 175

Asn Tyr Gly Tyr Ser Ile Ile Leu Ser Asn Ile Asn Arg Leu Leu Ala

180 185 190

Ile His Gly Tyr Asn Leu Ala Leu Gly Leu Lys His Cys Asn Lys Lys

195 200 205

Asn Ser Tyr Asn Phe Ser Cys Asp Leu Met Glu Pro Phe Arg Pro Phe

210 215 220

Val Asp Glu Tyr Val Phe Leu Asn Arg Glu Arg Glu Leu Asp Trp Asp

225 230 235 240

Tyr Lys Arg Glu Leu Ile Asn Leu Thr Tyr Lys Thr Ile Tyr Tyr Gly

245 250 255

Lys Arg Lys Met Glu Leu His Ile Ala Glu Asp Met Phe Ile Cys Asp

260 265 270

Val Ile Lys Thr Leu Asn Gly Asn Thr Ser Gln Ile Lys Glu Phe Asp

275 280 285

Phe Ile

290

<210> 3

<211> 97

<212> PRT

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

Met Val Met Phe Asp Leu Pro Asn Lys Glu Lys Glu Glu Arg Leu Ala

1 5 10 15

Tyr Arg Lys Phe Tyr Lys Phe Leu Lys Ser Asn Gly Tyr Ser Phe Leu

20 25 30

Gln Glu Ser Val Tyr Val Lys Leu Leu Arg Asn Phe Thr Val Ile Glu

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Lys Leu Tyr Glu Ile Ala Pro Thr Asp Gly Thr Val

50 55 60

Ile Ala Leu Pro Met Asn Leu Asn Gln Phe Lys Lys Met Arg Val Ile

65 70 75 80

Cys Gly Lys Gly Phe Asp Val Arg Phe Phe Ser Asp Asp Met Val Cys

85 90 95

Ile

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

gaactacagc cttaacgaat gttaaggttc tgaaac 36

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

caatgaacaa agttgaagca aagcatattg aa 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 6

gatatataaa aatattcgaa ataactttaa ta 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 7

ccaagggatt gaatgggagg attggactac aa 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 8

catgagtatc ctaataatag ggtatatcat gt 32

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 9

tgattttctt aaaactatcg gtggaagtat tga 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 10

taatggaaac tttggtattg gacgcatggt ata 33

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 11

attctctttc taaaatcgaa aatgaattct at 32

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 12

gaagtttgca gctggatacg acagacg 27

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 13

aattaggcag ccctcatcag tgccggctcc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 14

cttgtaggct gtcctgatct cctggcgctg 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 15

ctacctggta gcccttgtat ttgatcaggc 30

Claims

1.一种VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，其特征在于：其包含Lt1Cas13d蛋白或者编码所述Lt1Cas13d蛋白的一种或多种多核苷酸，以及CRISPR RNA或转录所述CRISPR RNA的一种或多种多核苷酸，所述的Lt1Cas13d蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性，再优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

2.根据权利要求1所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，其特征在于：所述的Lt1Cas13d蛋白为RNA核酸内切酶，所述Lt1Cas13d蛋白通过HEPN样核酸酶结构域切割与CRISPR RNA互补的单链RNA。

3.根据权利要求1所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，其特征在于：所述的CRISPR RNA的设计原则包括以下一种或多种：

1)CRISPR RNA的间隔序列长度为9～30个碱基序列；

2)CRISPR RNA的间隔序列与目的基因的正义链反向互补；

3)CRISPR RNA的直接重复序列为12～36个碱基序列；

4)CRISPR RNA的直接重复序列包含2个茎环结构；

4.根据权利要求1至3中任一项所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，其特征在于：CRISPR Array转录得前体CRISPR RNA，前体CRISPR RNA剪切加工形成的CRISPR RNA，所述的CRISPR RNA作为向导RNA与Lt1Cas13d蛋白形成复合体，

所述的CRISPR Array包括多个与所述的Lt1Cas13d蛋白相匹配的直接重复序列以及间隔序列，所述的CRISPR Array的间隔序列包括靶序列，

5.根据权利要求4所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，其特征在于：所述的CRISPR Array的直接重复序列如SEQ ID NO:4所示，或与其具有至少80％同源性。

6.根据权利要求4所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，其特征在于：所述的CRISPR Array的间隔序列还包括与Lt1Cas13d蛋白相关的元件，

所述与Lt1Cas13d蛋白相关的元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:6所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:7所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:8所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:9所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:10所示，或与其具有至少80％同源性，和/或，

如SEQ ID NO:11所示，或与其具有至少80％同源性。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，其特征在于：所述的基因编辑系统还包括辅助蛋白或编码所述的辅助蛋白的一种或多种核苷酸序列。所述的辅助蛋白包括Cas1蛋白和/或Cas2蛋白，

所述的Cas1蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％的同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性，再优选具有至少96％、97％、98％、99％的同源性；

8.一种如权利要求1至7中任一项所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统中所述的Lt1Cas13d蛋白，或者编码所述Lt1Cas13d蛋白的多核苷酸，或者包含所述多核苷酸的载体，或者包含所述多核苷酸以及包含编码所述CRISPR RNA的一种或多种多核苷酸的载体系统，或者包含所述的Lt1Cas13d蛋白和所述CRISPR RNA的复合物；

优选地，所述核苷酸经密码子优化用于在目的细胞中的表达。

9.一种如权利要求1至7中任一项所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，或权利要求8所述的Lt1Cas13d蛋白、编码所述Lt1Cas13d蛋白的多核苷酸、载体、载体系统、复合物在生物学过程中结合或切割DNA功能的结构；优选地，所述结合或切割RNA功能的结构包括CRISPR RNA二级结构、Lt1Cas13d效应蛋白功能域或Lt1Cas13d-CRISPR RNA复合物结构；优选地，所述RNA为原核生物或真核生物的RNA。

10.一种如权利要求1至7中任一项所述的VI-D型CRISPR/Cas13基因编辑系统，或权利要求8所述的Lt1Cas13d蛋白、编码所述Lt1Cas13d蛋白的多核苷酸、载体、载体系统、复合物在编辑原核生物或真核生物RNA方面的应用。