CN109868283A - 一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，属于生物工程领域，主要包括三个部分：首先为了快速筛选转基因植株，选择标记基因mCherry插入表达载体中；其次为了快速鉴定CRISPR/Cas9基因的编辑效率和脱靶频率，将脂肪酸脱氢酶FAD2、FAD3作为靶基因插入载体中；最后利用靶基因突变后脂肪酸组分的变化，通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成快速简便地筛选出被编辑的植株和未被编辑的植株，从而快速、准确、高效地确定特定的CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率和脱靶效应。

Description

一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及CRISPR/Cas9基因编辑，具体地，涉及一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法。

背景技术

CRISPR的全称是“Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats”，即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免疫的作用。通过CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，其中I类和III类需要多种Cas蛋白共同发挥作用，而II类系统只需要一个Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用。CRISPR簇序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时CRISPR转录为crRNA(CRISPR-derived RNA)，crRNA通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的外源DNA序列靶位点剪切双链DNA。所以当前CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白和sgRNA，这种人工设计的sgRNA通过碱基互补配对结合到靶序列，引导Cas9蛋白结合到特定区域发挥作用，实现定点编辑。通过理论的不断发展和技术的不断地推进，使CRISPR/Cas9在基因编辑中得到广泛应用。高效的CRISPR/Cas9系统可以极大地节省人力、物力和财力，故一个好的编辑载体将会推进实验的进程。近期，Wang等(2015)报道了一种新型的CRISPR/Cas9编辑载体，该载体中的Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子驱动，以此可以有效地避免组成型过表达启动子常产生的嵌合型T1代突变体。另外，该载体中两个串联的sgRNAs取代了传统的单个sgRNA，从而可以同时对两个甚至多个基因进行编辑，避免了传统的杂交方法获得多突变体过程中的基因连锁和基因渗透现象。

CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。这三种技术都是在特定的DNA靶序列产生DSBs，通过非同源末端连接(NHEJ)和同源修复(HDR)来修复DSBs，在修复DSBs的过程中发生自发错误或人为引入突变或修饰，对目的基因进行精准的定点修饰。相较于ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9系统有着可用位置多、应用潜力大、操纵方便等许多优点，在2013年CRISPR/Cas9作用机制与使用方法得以明确后，ZFN与TALEN的使用逐渐减少，而CRISPR/Cas9系统呈现爆炸性增长，慢慢取代了前两代基因编辑技术，成为了主流的第三代的基因编辑的技术。但是如何高效地评估CRISPR/Cas9基因编辑效率的问题还有待解决。如果我们能够找到一种靶基因，通过待评估的CRISPR/Cas9编辑载体编辑后出现易于检测的表型，计算这种表型出现的频率即可得到编辑效率。明确了该编辑载体的编辑效率之后就可以对准确计算筛选突变体所需植株的规模提供参考，以及为该载体的大规模推广提供依据。

虽然CRISPR/Cas9基因编辑技术相比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)技术更易于操作，更加高效，但研究发现，设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。目前，用来检测脱靶效应的方法主要有ChIP-seq法，GUIDE-seq法，Digenome-seq技术，以及利用整合酶缺陷的慢病毒载体来检测脱靶效应。但这些方法往往费时费力，甚至敏感度不高。用来检测CRISPR/Cas9是否编辑的方法有错配酶法，高通量测序法，分子鉴定，高分辨率溶解曲线等，这些方法都存在一定的缺点，在大规模筛选中不适用。因此，研发出一种可以高效评估CRISPR/Cas9编辑载体的脱靶频率的体系具有重要的实际应用价值。

在拟南芥中，FAD2是位于内质网的油酸(18:1)去饱和酶，负责在油酸中引入第二个双键形成亚油酸(18:2)。同样位于内质网的亚油酸去饱和酶FAD3则是催化亚油酸形成亚麻酸。因此，突变体fad2和fad3中C18不饱和脂肪酸的组成均较野生型有极大的区别。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，目的二在于提供一种CRISPR/Cas9基因编辑载体；通过对现有的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行设计和改造，将以脂肪酸脱氢酶FAD2或FAD3为基础设计的靶基因插入载体中；最后利用靶基因突变后脂肪酸组分的变化，通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成快速简便地筛选出被编辑的植株和未被编辑的植株，从而确定特定的CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率和脱靶效应。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，包括以下步骤：

步骤一：构建CRISPR/Cas9基因编辑载体：将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中；所述sgRNA包含以脂肪酸去饱和酶FAD2或FAD3基因为基础设计获得的靶序列；

步骤二：将步骤一构建好的载体利用农杆菌介导法转化植株，再利用荧光光蛋白报告基因筛选植株转基因后代；

步骤三：利用植株脂肪酸组分的变化确定编辑效率或脱靶频率。

作为对上述方案的进一步优化，所述编辑载体中包含单个或两个sgRNA，采用两个sgRNAs可以同时对两个甚至多个基因进行编辑。

作为对上述方案的进一步优化，步骤三所述利用植株脂肪酸组变化，是通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出被编辑的植株进而确定编辑效率，或计算脱靶频率。

本发明进一步提供一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋白基因和mCherry荧光蛋白基因。

作为对上述编辑载体的进一步优化，所述mCherry荧光蛋白基因由种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动。

作为对上述编辑载体的更进一步优化，所述sgRNA包含两条以FDA2基因为基础设计的两条靶序列T1和T2，或者包含两条以FDA3基因为基础设计的两条靶序列T3和T4；其中，T1的碱基序列如SEQ ID NO：01所示，T2的碱基序列如SEQ ID NO：02所示，T3的碱基序列如SEQ ID NO：03所示，T4的碱基序列如SEQ ID NO：04所示。在此基础上，本发明另外还提供上述CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑效率上的应用。

作为对上述编辑载体的更进一步优化，所述sgRNA包含碱基序列如SEQ ID NO：05所示的FAD2的靶序列。在此基础上，本发明另外还提供上述CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶频率上的应用。

有益效果：

1、本发明通过设计和改造现有的CRISPR/Cas9编辑载体，在编辑载体中插入以FAD2或FAD3为基础设计的靶序列，导入到植株中引起突变，因为突变体fad2和fad3中C18不饱和脂肪酸的组成均较野生型有极大的区别，利用这一特性，通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成筛选出未编辑、FAD2编辑和FAD3编辑的植株，从而计算编辑效率和脱靶频率。上述体系有效地克服了分子鉴定存在的缺陷，能够有效地筛选出被CRISPR/Cas9基因编辑后一个或两个碱基的缺失、插入或者替换的突变体，从而快速、准确、高效地检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率和脱靶频率。

2、本发明利用基因工程手段，通过合理设计并成功构建了CRISPR/Cas9编辑载体，该载体中的Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子驱动，以此可以有效地避免组成型过表达启动子常产生的嵌合型T1代突变体；改变Cas9蛋白基因的启动子后，可以通过该体系测定特定启动子的CRISPR/Cas9的编辑效率。

3、在标记基因的选择上，用报告基因替代了常用的选择基因，将种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动的mCherry荧光蛋白基因插入在Cas9蛋白基因之后，可以高效筛选转基因阳性植株以及最终获得非转基因的突变后代。

4、利用拟南芥两个脂肪酸去饱和酶FAD2和FAD3的高度同源性，设计FAD2的靶序列，使该靶序列与FAD3基因序列的某一片断仅有四个碱基的差别，将该靶序列插入到编辑载体中，然后导入植株中，通过测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成可快速简便地检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶效应。

附图说明

图1是改造后用于快速检测CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑效率的双元载体质粒图谱；

图2是改造后用于快速检测CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶效应的双元载体质粒图谱；

其中，图1与图2中：RB/LB表示T-DNA左右边界；EC1.2p为EC1.2基因的启动子；rbcS-E9t为rbcS E9基因的终止子；2-sgRs为两个sgRNA组成的表达组件；zCas9为玉米密码子优化的Cas9蛋白基因；U6-26p和U6-29p为两个拟南芥U6基因的启动子；U6-26t为U6-26基因的终止子；At2S3p为拟南芥2S3基因的启动子；mCherry为mCherry荧光蛋白基因；NOSt为NOS基因的终止子；Hyg为潮霉素抗性基因；

图3是质粒载体pFGC-mCherry-NOS图谱；

图4是表达载体pFGC-At2S3-mCherry-NOS图谱；

图5是pFGC-At2S3-mCherry-NOS菌落PCR验证电泳图；其中，泳道7、8、9、12、13、14、15、16、17为连接正确的载体；M表示DNA Marker；

图6是pFGC-At2S3-mCherry-NOS双酶切电泳图；其中，泳道2、4、6为酶切正确的质粒；M表示DNA Marker；

图7是pFGC-At2S3-mCherry-NOS和pHEE401质粒载体酶切电泳图；其中，泳道1、2、3、4、5、6为酶切后的pFGC-At2S3-mCherry-NOS，泳道7、8为酶切后的质粒pHEE401；M表示DNAMarker；

图8是pHEE401-At2S3-mCherry-NOS质粒载体AaTII酶切验证电泳图；其中，泳道1：pFGC-At2S3-mCherry-NOS(AaTII)；M：DNA Marker；

图9是表达载体pHEE401-At2S3-mCherry-NOS图谱；

图10是表达载体pCBC-DT1T2质粒图谱；

图11是表达载体pHEE401-At2S3-mCherry-FAD2 target sequence 1 and FAD2target sequence 2质粒图谱；

图12是pHEE401-At2S3-mCherry-FAD3 target sequence 1 and FAD3 targetsequence 2和pHEE401-At2S3-mCherry-FAD2 target sequence 1 and FAD2 targetsequence 2酶切验证电泳图；其中，泳道1、2、5、6为酶切验证正确的阳性克隆；泳道11：未被酶切的质粒载体对照；M：DNA Marker；

图13是pHEE401-At2S3-mCherry-NOS质粒载体BsaI酶切电泳图；

图14是pHEE401-FAD2 sgRNA off target-At2S3-mCherry质粒载体图谱；

图15是pHEE401-FAD2 sgRNA off target-At2S3-mCherry质粒载体BamHI酶切验证电泳图；

图16是借助mCherry荧光蛋白报告基因高效筛选拟南芥转基因后代示意图；其中，A为T1代转基因种子在绿光激发下的照片，B为T1代转基因种子在明场中的照片，其中的箭头指示在绿光激发下能够显示红色荧光的种子，即转基因阳性种子；Bar＝500μm；

图17是对T1代植株进行检测的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，泳道1、2、3为DNA样品，泳道4为哥伦比亚野生型对照；M：DNA Marker；

图18是FAD3突变体测序结果图；

图19是FAD2突变体测序结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例：

1、CRISPR/Cas9载体的构建

1.1克隆报告基因至CRISPR/Cas9载体

以拟南芥基因组DNA为模板，以ZYP11-FP(如SEQ ID NO：17)和ZYP11-BP(如SEQ IDNO：18)为引物，扩增种子特异性表达的At2S3基因启动子，用来驱动mCherry荧光蛋白基因；电泳检测具有At2S3条带后，将第一次PCR产物稀释100倍，以稀释后的PCR产物为模板，ZYP12-FP(如SEQ ID NO：19)和ZYP12-RP(如SEQ ID NO：20)为引物进行第二次扩增，将酶切位点BamHI和EcoRI克隆到At2S3片段两端，PCR产物为BamHI-EcoRI-At2S3-BamHI，其长度为455bp，将扩增后的产物进行胶回收备用。

用BamHI酶切pFGC-35S-mCherry-NOS质粒载体(质粒图谱如图3所示)和BamHI-EcoRI-At2S3-BamHI片段；pFGC-35S-mCherry-NOS酶切后去磷酸化，回收纯化以备用。

用T4 DNA连接酶连接纯化后的pFGC-35S-mCherry-NOS和At2S3片段，获取表达载体pFGC-At2S3-mCherry-NOS，大小为10.1kb，载体图谱如图4所示；将连接产物转化大肠杆菌，37℃恒温培养长出单菌落。以ZYP5-RP(如SEQ ID NO：08)和ZYP11-FP为引物，进行菌落PCR验证，电泳后挑选出阳性的单克隆菌落进行液体培养基培养，电泳图如图5所示。提取质粒后进行SpeI和HindIII双酶切验证，电泳图如图6所示。

用EcoRI分别酶切质粒pHEE401和pFGC-At2S3-mCherry-NOS，pHEE401质粒酶切后片段大小为16.6kb，胶回收后备用，pFGC-At2S3-mCherry-NOS酶切后电泳结果显示为三条带，大小分别为1.5kb、7.8kb和885bp，电泳如图7所示，胶回收纯化1.5kb大小的片段，将回收后的片段与EcoRI酶切后的pHEE401进行连接，构建pHEE401-At2S3-mCherry-NOS质粒载体。将连接产物转化大肠杆菌，37℃恒温培养长出单菌落。以ZYP5-RP和ZYP11-FP为引物，进行菌落PCR验证，电泳后挑出阳性的单克隆菌落进行液体培养基培养。提取质粒后，用AaTII进行酶切验证，酶切后的电泳图如图8所示，酶切后的片段大小为1.4kb和16.6kb。构建好的pHEE401-At2S3-mCherry-NOS质粒载体如图9所示。

1.2插入靶序列

1.2.1构建pHEE401-At2S3-mCherry-FAD2/3-NOS编辑载体

登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html筛选目标基因的靶序列，然后到http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站评估脱靶情况。所述靶序列选自FAD2或FAD3基因的编码区且与其他基因的相似度不高于80％；其中，拟南芥中FAD2核苷酸序列如SEQ ID NO：06所示；拟南芥中FAD3核苷酸序列如SEQ ID NO：07所示。

以1ng/μL的pCBC-DT1T2质粒(质粒图谱如图10所示)为模板，用分别含有一个FAD3基因靶序列的左右引物，ZYP6-F0(如SEQ ID NO：10)和ZYP6-R0(如SEQ ID NO：11)进行PCR扩增，将两个靶序列克隆到所需片段上，得到片段FAD3 target sequence 1-gRNA-U6-26t-U6-29p-FAD3 target sequence 2，其中，FAD3 target sequence 1为T3，碱基序列如SEQID NO：03所示；FAD3 target sequence 2为T4，碱基序列如SEQ ID NO：04所示。同理，用分别含有一个FAD2基因靶序列的左右引物ZYP7-F0(如SEQ ID NO：14)和ZYP7-R0(如SEQ IDNO：15)扩增出FAD2 target sequence 1-gRNA-U6-26t-U6-29p-FAD2target sequence 2，其中，FAD2 target sequence 1为T1，碱基序列如SEQ ID NO：01所示；FAD2 targetsequence 2为T2，碱基序列如SEQ ID NO：02所示。分别设计一对引物ZYP6-BSF(如SEQ IDNO：09)和ZYP6-BSR(如SEQ ID NO：12)，ZYP7-BSF(如SEQ ID NO：13)和ZYP7-BSR(如SEQ IDNO：16)将BsaI酶切位点分别克隆到片段的两端。

用BsaI酶切pHEE401-At2S3-mCherry-NOS质粒载体，用胶回收试剂盒纯化备用；用BsaI分别酶切FAD3-1-gRNA-U6-26t-U6-29p-FAD3-2和FAD2-1-gRNA-U6-26t-U6-29p-FAD2-2。

将纯化后的pHEE401-At2S3-mCherry分别与FAD3-1-gRNA-U6-26t-U6-29p-FAD3-2和FAD2-1-gRNA-U6-26t-U6-29p-FAD2-2连接，得到pHEE401-At2S3-mCherry-FAD3targetsequence 1 and FAD3 target sequence 2和pHEE401-At2S3-mCherry-FAD2target sequence 1 and FAD2 target sequence 2(质粒载体图如图11所示)。

将连接后的产物转化大肠杆菌DH5α，37℃恒温培养长出单菌落后进行菌落PCR验证。此次验证分别采用引物ZYP13-FP(如SEQ ID NO：21)和ZYP6-BSR(用来验证FAD3)，以及ZYP13-FP和ZYP7-BSR(用来验证FAD2)。电泳后挑选阳性克隆进行液体培养基培养，提取质粒后用HindIII酶切验证，酶切后的电泳图如图12所示，酶切后的片段大小为2.2kb和15.3kb。

1.2.2构建pHEE401-FAD2 sgRNA off target-At2S3-mCherry-NOS编辑载体

将酶切位点BsaI设计在靶序列T5两端，T5的碱基序列如SEQ ID NO：05所示。采用引物ZYP17-FP(如SEQ ID NO：22)、ZYP17-RP(如SEQ ID NO：23)自连的方法来设计靶序列。用DNA寡核苷酸退火缓冲液稀释引物至0.2μg/μL，将引物混合后加入DNA寡核苷酸退火缓冲液，在沸水浴中3-5分钟后自然冷却至室温备用，获取FAD2 off target FAD3片段。

用BsaI酶切FAD2 off target FAD3片段和PHEE401-At2S3-mCherry-NOS，酶切后的pHEE401-At2S3-mCherry-NOS电泳结果显示为两条带，大小分别为1.2kb和16.8kb，电泳如图13所示，胶回收纯化16.8kb大小的片段备用。

用T4 DNA连接酶连接纯化后的pHEE401-At2S3-mCherry-NOS和FAD2 offtargetFAD3片段，得到表达载体pHEE401-FAD2 sgRNA off target-At2S3-mCherry-NOS，载体图谱如图14所示。

将连接后的产物转化大肠杆菌DH5α，37℃恒温培养长出单菌落后进行菌落PCR验证。此次验证采用引物ZYP13-FP和ZYP17-RP，电泳后挑选阳性克隆进行液体培养基培养，提取质粒后用BamHI酶切验证，酶切后的电泳图如图15所示，酶切后的片段大小为1.8.kb、1.6kb和13.6kb。

上述步骤所涉及的引物的序列表如下表1所示。

表1：引物序列表

2、农杆菌介导的浸花法转化拟南芥

将构建好的编辑载体利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥，利用荧光蛋白报告基因快速简便地筛选转基因阳性植株，如图16所示，然后将筛选得到的转基因阳性植株进行种植(荧光蛋白报告基因同时有助于在T2及之后的世代中筛选不具有外源基因插入的突变体植株)。

3、检测编辑效率

对T1代植株叶片提取DNA，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测编辑效率；对T2代种子进行脂肪酸组分分析，得出编辑效率。下面分别利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法与拟南芥种子油脂分析法对CRISPR/Cas9是否对靶序列进行了编辑进行检测。

3.1聚丙烯酰胺凝胶电泳法

配制40毫升8％的PAGE胶：10.67毫升30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺溶液(29:1)；4毫升10×TBE；加水定容到40ml，摇匀再加入400μl的10％APS(过硫酸铵)；20μl的TEMED。混匀后，沿着玻璃板一侧缓慢加入约配置好的胶液，使得胶面略高于制胶框，待胶凝固后加入1×TBE直至溢出至电泳槽指定高度，每个孔里加入1.5μl样品，同时将DNAmarker点样，用200V电压进行电泳，根据DNA大小选择电泳时间。电泳停止后将胶清洗数次并加入0.1％硝酸银溶，摇床上摇动10min后清洗数次，加入显色液继续于摇床上反应10min直至显色。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法，我们分别对哥伦比亚野生型和实验室已有的拟南芥突变体为背景的转基因阳性植株进行鉴定，从而确定CRISPR/Cas9编辑效率。下表2为通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法获得的CRISPR/Cas9编辑效率的统计结果，根据表2的统计结果，对WT、Z1(atgpat5-2)、Z2(atgpat5-1)、Z6(atgpat7-1)这四种背景的编辑效率的进行统计，分别为a1、a2、a3和a4，其中，a1＝(1+4)/(23+26)＝10.2％，a2＝(0+2)/(21+22)＝4.6％，a3＝(2+1)/(24+27)＝5.8％，a4＝(5+1)/(27+25)＝11.5％。

表2：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法获得的CRISPR/Cas9编辑效率的统计结果

3.2拟南芥种子油脂分析法

称取10mg种子或者数20粒种子，放入2ml进口离心管中，在离心管中放入玻璃珠，60hz、60s连续两次破碎。短离10s后加入400μl 1mg/ml C17：0(现配现用,C17：0TAG溶解于hexane)，上下摇匀(10mg种子用400μg内标；20-50粒种子，加入20μg内标(1mg/ml的原液稀释10倍，加入400μl正己烷)；再进行破碎(60hz 60s)，室温静置1h后12000g离心10min。吸取200μl或者250μl上清(20粒种子)转移到12ml玻璃管中，氮吹至似干非干(切勿吹干，C17：0TAG在甲醇中溶解性很低，可能会导致内标甲脂化不完全，留存大概50-100μl之间)。加入2ml，1％H₂SO₄/CH₃OH，进行甲脂化(80℃2h)，期间需要轻微摇晃管子，把管壁上残留的溶解下来。玻璃瓶放置于冰盒冷却，加入2ml 0.9％NaCl，摇匀后加入2ml Hexane,3000g离心6-10min。吸取上层清液，转移到12ml的玻璃管中，原瓶中继续加入2ml Hexane，吸取上层清液，合并。氮吹，浓缩清液至300μl。转移到安捷伦小瓶中继续氮吹至50μl。然后用气相色谱仪的TLC.M程序进行检测。

将T1代对应的T2代种子分别进行脂肪酸组分的分析，得出CRISPR/Cas9的编辑效率如下表3所示。根据表3的统计结果，对WT、Z1(atgpat5-2)、Z2(atgpat5-1)、Z6(atgpat7-1)这四种背景的编辑效率的进行统计，分别为b1、b2、b3和b4，其中，b1＝(12+15)/(23+26)＝55.1％，b2＝(14+12)/(21+22)＝60.4％，b3＝(15+20)/(24+27)＝68.6％，b4＝(15+18)/(27+25)＝63.5％。

表3：通过脂肪酸组分分析获得的CRISPR/Cas9编辑效率的统计结果

其中，一般野生型拟南芥种子中C18：2的含量大约在30％，而当C18：2>＝39％时判定FDA3位点突变；一般野生型拟南芥种子中C18：1的含量大约在20％，而当C18：1>＝30％时判定FDA2位点突变。

我们对脂肪酸组分变化的株系提取DNA后进行了测序，测序结果表明确实存在突变。

我们可以通过T1代分子鉴定(聚丙烯酰胺凝胶电泳法)获得CRISPR/Cas9编辑效率，也可以对获得的的T2代种子的脂肪酸组分进行分析，通过脂肪酸组分的变化获得CRISPR/Cas9编辑效率。比较两者的结果，通过后者方法获得的编辑效率漏检率低，结果更准确，方法更具优越性。该方法有效的克服了分子鉴定存在的缺陷，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳无法有效的筛选出被CRISPR/Cas9基因编辑后一个或两个碱基的缺失、插入或者替换的突变体，从而不能高效快速的检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶效应。

4、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和油脂分析法对比

如上述3.1所述采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对T1代植株叶片进行检测，结果如图17所示，结果显示，通过对T1代植株叶片提取DNA利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测并未检测出突变体植株，但通过对T2代种子的脂肪酸组分进行测定后分析发现，泳道2株系C18：2的含量由原来的30.7％变为44.8％，与野生型相比上升了14.8％。对该株系的后代分离群体提取DNA进行测序，测序结果表明该株系确实存在突变(测序结果如图18所示)，且该突变为一个碱基的插入。同样的我们也检测出FAD2一个碱基缺失的突变体，其C18：1的含量由16％上升为40％(测序结果图如图19所示)。因此，通过脂肪酸组分的变化获得CRISPR/Cas9编辑效率准确性更高。

5、鉴定脱靶频率

我们对转基因拟南芥T2代种子进行脂肪酸组分的分析，利用脂肪酸组分的变化对CRISPR/Cas9是否脱靶进行了检验，可以发现在120株哥伦比亚野生型的转基因植株中，并未发现有脱靶效应。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江农林大学

<120> 一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法

<130> 1

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 1

tcgcacggca cacgctttg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 2

gtttgtcctc gggtggccc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 3

cctcgttcct taccatggt 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 4

tgttgaaaac gacgagtca 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 5

ccttgacagg cccaatagag 20

<210> 6

<211> 3000

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 6

ttttttcaca agtaaaaaat gggttatttg cggtaaataa aaataccaga tattttgaat 60

tgattaaaaa ggttgaaata agagaggagg ggaaagaaaa gaaggtgggg gcccagtatg 120

aaagggaaag gtgtcatcaa atcatctctc tctctctctc tctaccttcg acccacgggc 180

cgtgtccatt taaagccctg tctcttgcca ttccccatct gaccaccaga agaagagcca 240

cacactcaca aattaaaaag agagagagag agagagagac agagagagag agagattctg 300

cggaggagct tcttcttcgt agggtgttca tcgttattaa cgttatcgcc cctacgtcag 360

ctccatctcc aggtccgtcg cttctcttcc atttcttctc attttcgatt ttgattctta 420

tttctttcca gtagctcctg ctctgtgaat ttctccgctc acgatagatc tgcttatact 480

ccttacattc aaccttagat ctggtctcga ttctctgttt ctctgttttt ttcttttggt 540

cgagaatctg atgtttgttt atgttctgtc accattaata ataatgaact ctctcattca 600

tacaatgatt agtttctctc gtctacaaaa cgatatgttg cattttcact tttcttcttt 660

ttttctaaga tgatttgctt tgaccaattt gtttagatct ttattttatt ttattttctg 720

gtgggttggt ggaaattgaa aaaaaaaaaa acagcataaa ttgttatttg ttaatgtatt 780

cattttttgg ctatttgttc tgggtaaaaa tctgcttcta ctattgaatc tttcctggat 840

tttttactcc tattgggttt ttatagtaaa aatacataat aaaaggaaaa caaaagtttt 900

atagattctc ttaaacccct tacgataaaa gttggaatca aaataattca ggatcagatg 960

ctctttgatt gattcagatg cgattacagt tgcatggcaa attttctaga tccgtcgtca 1020

cattttattt tctgtttaaa tatctaaatc tgatatatga tgtcgacaaa ttctggtggc 1080

ttatacatca cttcaactgt tttcttttgg ctttgtttgt caacttggtt ttcaatacga 1140

tttgtgattt cgatcgctga atttttaata caagcaaact gatgttaacc acaagcaaga 1200

gatgtgacct gccttattaa catcgtatta cttactacta gtcgtattct caacgcaatc 1260

gtttttgtat ttctcacatt atgccgcttc tctactcttt attccttttg gtccacgcat 1320

tttctatttg tggcaatccc tttcacaacc tgatttccca ctttggatca tttgtctgaa 1380

gactctcttg aatcgttacc acttgtttct tgtgcatgct ctgtttttta gaattaatga 1440

taaaactatt ccatagtctt gagttttcag cttgttgatt cttttgcttt tggttttctg 1500

cagaaacatg ggtgcaggtg gaagaatgcc ggttcctact tcttccaaga aatcggaaac 1560

cgacaccaca aagcgtgtgc cgtgcgagaa accgcctttc tcggtgggag atctgaagaa 1620

agcaatcccg ccgcattgtt tcaaacgctc aatccctcgc tctttctcct accttatcag 1680

tgacatcatt atagcctcat gcttctacta cgtcgccacc aattacttct ctctcctccc 1740

tcagcctctc tcttacttgg cttggccact ctattgggcc tgtcaaggct gtgtcctaac 1800

tggtatctgg gtcatagccc acgaatgcgg tcaccacgca ttcagcgact accaatggct 1860

ggatgacaca gttggtctta tcttccattc cttcctcctc gtcccttact tctcctggaa 1920

gtatagtcat cgccgtcacc attccaacac tggatccctc gaaagagatg aagtatttgt 1980

cccaaagcag aaatcagcaa tcaagtggta cgggaaatac ctcaacaacc ctcttggacg 2040

catcatgatg ttaaccgtcc agtttgtcct cgggtggccc ttgtacttag cctttaacgt 2100

ctctggcaga ccgtatgacg ggttcgcttg ccatttcttc cccaacgctc ccatctacaa 2160

tgaccgagaa cgcctccaga tatacctctc tgatgcgggt attctagccg tctgttttgg 2220

tctttaccgt tacgctgctg cacaagggat ggcctcgatg atctgcctct acggagtacc 2280

gcttctgata gtgaatgcgt tcctcgtctt gatcacttac ttgcagcaca ctcatccctc 2340

gttgcctcac tacgattcat cagagtggga ctggctcagg ggagctttgg ctaccgtaga 2400

cagagactac ggaatcttga acaaggtgtt ccacaacatt acagacacac acgtggctca 2460

tcacctgttc tcgacaatgc cgcattataa cgcaatggaa gctacaaagg cgataaagcc 2520

aattctggga gactattacc agttcgatgg aacaccgtgg tatgtagcga tgtataggga 2580

ggcaaaggag tgtatctatg tagaaccgga cagggaaggt gacaagaaag gtgtgtactg 2640

gtacaacaat aagttatgag gatgatggtg aagaaattgt cgacctttct cttgtctgtt 2700

tgtcttttgt taaagaagct atgcttcgtt ttaataatct tattgtccat tttgttgtgt 2760

tatgacattt tggctgctca ttatgttatg tgggaagtta gtgttcaaat gttttgtgtc 2820

ggtattgttc ttctcatcgc tgttttgttg ggatcgtaga aatgtgacct tcggacagta 2880

aaactcttgt actaaaacta tctccctatt ggcatttctt aaacttttaa tagttacgtg 2940

ctcgtagtga atcttgactt gagtcaactt cttgtttaag acctgccaag tgtataagag 3000

<210> 7

<211> 4250

<212> DNA

<213> 拟南芥

<400> 7

ttttatttcc accaactact tttatgacaa aaaaatgaaa aatatagata aacaaaaaat 60

caaccaatta cgttgtataa aatcggtgat ggcaattggg aaagaaaaga aaacggtgat 120

ggtggactat tttaaattaa ttaaaaacaa tacaaaccgg ttatttaggt aaaataaatc 180

agagtgatgt gccacttata tttaaatttt cctcagctaa ctaatttcta gtactatata 240

ttaatactaa cctttgattt tagatttgct ttttctttta ttgcgagttt gtcatttttt 300

tttaacttct tgtcattttt acatttaatt ttcttttact actatatact actattagcc 360

atcagttttc tcctatttag tttttaggat aactaaaatt tcaagaaata ttgtatttgg 420

tgcataatac attggggttg gtagattctc catagtaaga aatgaatata atttagttgg 480

tatacttggt acgtgcaagg aaaaaccaag aaatattcat cttcttatca caattgctta 540

tattaggaaa taaatcagag aaatatattc ttaacttaca cgaattgaaa tggtgaaaca 600

aattatggta aagttttgtt cttcttaaaa ttttattact tactttagcg tgcgtgtcac 660

acatttctga ccaattttgt tttcacttaa caacgtaacc aaaagtatta aacagcaact 720

ttaacccaaa aaaacagcaa aattacccat tttatccttc aaataaataa aaagttataa 780

gaaaacaaaa acaaaaattg gagtctttct cattgtcgac acatcttctc tctttatata 840

aacaaatctc acaaacccca aaaattcatc aaaccctttc ttcaccacat tattttcact 900

gagcgcataa catttttgag acaagagact ctctctctct ctcttctctc tttctctccc 960

cctctctccg gcgatggttg ttgctatgga ccaacgcacc aatgtgaacg gagatcccgg 1020

cgccggagac cggaagaaag aagaaaggtt tgatccgagt gcacaaccac cgttcaagat 1080

cggagatata agggcggcga ttcctaagca ctgttgggtt aagagtcctt tgagatcaat 1140

gagttacgtc gtcagagaca ttatcgccgt cgcggctttg gccatcgctg ccgtgtatgt 1200

tgatagctgg ttcctttggc ctctttattg ggccgcccaa ggaacacttt tctgggccat 1260

ctttgttctc ggccacgact ggtataattt cttaatctta cgtttaacat tttcatttta 1320

atttaattaa tccttcttta tcaactaatc tcttaaattt ttcatttttt ctaattgttt 1380

gtgttacttt ttgctttttt aattgcctcg aattcttaaa ttacttagaa tacacgttcg 1440

atgagtattg tcgctaactt caatatttgt tcttttgagg ttactttatt ttttttgtaa 1500

tattaaaaaa caaaacagga aaagaggatc caagatttct gtttttagat atttttcttc 1560

aataagcttc cacgatgatg attagtcgta agactcgtaa caaaatatct tttctattat 1620

taatgttaat tccgcatttc atggatctac gttccaagtt tccaattatt tctcctctag 1680

atctccggaa cttttaatta gaaattaaat attttataca atgtttttat taactctttt 1740

ttatgtgtgt accaatgtac tttcgagatt tatacacgtc atatatagat tttcttactt 1800

tcttaaggtg tcttaaatta aaacaaacat ggaaaagcaa tatttttttg cagtaaatgt 1860

gatatatact atgaataata attgaatgtg taaatcatga tacagtggac atgggagttt 1920

ctcagacatt cctctactga atagtgtggt tggtcacatt cttcattctt tcatcctcgt 1980

tccttaccat ggttggtaag ttacttattt ttattctttt ctactattat ttctcttttt 2040

actgtttatt ttgttattta tggtgcatgg tatcaagtta atctgtttga tttttgttcc 2100

atcttttttt ggtataggca gattttgtaa tttaattaat gcatgtgact gtgtgggtgg 2160

cttttatttt tccactccaa aagcatcaaa tctttagtaa ccaaagaaaa agaatcaata 2220

cttttattaa ctgctgtggg cctatttatg gccctttagc caacctgaac ttgaagaaat 2280

taatgcacct ttgtgtaatt ttttttttaa agccaaatga ttttgatata tgtcaatctt 2340

tatatgtatt catcagttga tatcattaaa aaaagtagat ctttatgtat catttttacg 2400

aaacattata gtatttgttt gttacttact tatccctagt tataaatttg agattgttag 2460

aatctgcccc gaaaacgaca ttatatgaca gatgtattta taatttacga attgaaatgt 2520

taatattaat tgggttatgc aggagaataa gccaccggac acaccaccag aaccatggcc 2580

atgttgaaaa cgacgagtca tgggttccgg taatctttcc ctctctcatc agtgtactct 2640

tgtctttttc attttatatt tattttcccg tcgaataatt tatatgctta aaacacttag 2700

aaaattctat gttttttaat atgttttagt tttagtttta gtttaggcaa cttgtcagtt 2760

ttttgttttc tagctgtagt aaaaaaagat ttgcaagtgt cgtagttcag tctgtaattg 2820

attttttata ggaccaactc tatcgtagta tataagttaa ataatggacc actaatattc 2880

gagtgcttcg catagaacga ttctcctcga aatgcgaata cttttcttcc attacttttt 2940

gagttttttt ggcgttttcg ttatgttttg tctatatctt agaattaaaa aaatgcacat 3000

gcaatatatt gataaacacg attaaaagca taatgtaaat ttctacgagt actaataata 3060

atcagtcatt ttaattaaaa cgtttcagtt accagaaagg gtgtacaaga aattgcccca 3120

cagtactcgg atgctcagat acactgtccc tctccccatg ctcgcatatc ctctctattt 3180

ggtaaatttt gaaattccca aacctttata gttgatttga gatgggtaag agtaaaatat 3240

atttgatatt gggggattga ttttatagtg ctacagaagt cctggaaaag aaggatcaca 3300

ttttaaccca tacagtagtt tatttgctcc aagcgagaga aagcttattg caacttcaac 3360

tacttgttgg tccataatgt tcgtcagtct tatcgctcta tctttcgtct tcggtccact 3420

cgcggttctt aaagtctacg gtgtaccgta cattgtaagt catacgaaaa ttcatatctt 3480

ataatgatca cttttagata tttatacgtt ttgacataag tttggatttt ctgtttaatc 3540

agatctttgt gatgtggttg gatgctgtca cgtatttgca tcatcatggt cacgatgaga 3600

agttgccttg gtatagaggc aaggtaagta aaatcaaata tatatgtttt gtaacagaaa 3660

attagcgatg ttatggatta atggatttgt ttgattaata ggaatggagt tatctacgtg 3720

gaggattaac aacaattgat agagattacg gaatctttaa caacattcat cacgacattg 3780

gaactcacgt gatccatcat ctcttcccac aaatccctca ctatcacttg gtcgacgccg 3840

tgagtgatca ttccattaca ttgtattgag atttaataca tagtgttact agaaaaggtg 3900

attaataatt agggattgtt taattgatta atgacagacg aaagcagcta aacatgtgtt 3960

gggaagatac tacagagaac cgaagacgtc aggagcaata ccgattcact tggtggagag 4020

tttggtcgca agtattaaaa aagatcatta cgtcagtgac actggtgata ttgtcttcta 4080

cgagacagat ccagatctct acgtttatgc ttctgacaaa tctaaaatca attaactttt 4140

cttcctagct ctattaggaa taaacactcc ttctctttta cttatttgtt tctgctttaa 4200

gtttaaaatg tactcgtgaa accttttttt tattaatgta tttacgttac 4250

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

agcggataac aatttcacac ag 22

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atatatggtc tcgattgcct cgttccttac catggtgtt 39

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tgcctcgttc cttaccatgg tgttttagag ctagaaatag c 41

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aactgactcg tcgttttcaa cacaatctct tagtcgactc tctac 45

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

attattggtc tcgaaactga ctcgtcgttt tcaacac 37

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

atatatggtc tcgattgtcg cacggcacac gctttggtt 39

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tgtcgcacgg cacacgcttt ggttttagag ctagaaatag c 41

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

aacgtttgtc ctcgggtggc cccaatctct tagtcgactc tctac 45

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

attattggtc tcgaaacgtt tgtcctcggg tggcccc 37

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tttcagatta agctggcaca ac 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

agacgaggaa gagcttgtta gc 22

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

attcgcggat ccgaattctt tcagattaag ctggc 35

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gcacgcggat ccgttttgct atttgtg 27

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

tgtcccagga ttagaatgat taggc 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

attggccttg acaggcccaa tagag 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

aaacctctat tgggcctgtc aaggc 25

Claims (9)

1.一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：构建CRISPR/Cas9基因编辑载体：将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中；所述sgRNA包含以脂肪酸去饱和酶FAD2或FAD3基因为基础设计获得的靶序列；

步骤二：将步骤一构建好的载体利用农杆菌介导法转化植株，再利用荧光光蛋白报告基因筛选植株转基因后代；

步骤三：利用植株脂肪酸组分的变化确定编辑效率或脱靶频率。

2.如权利要求1所述的一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，其特征在于：所述编辑载体中包含单个或两个sgRNA。

3.如权利要求1所述的一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，其特征在于：步骤三所述利用植株脂肪酸组变化，是通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出被编辑的植株进而确定编辑效率，或计算脱靶频率。

4.一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋白基因和mCherry荧光蛋白基因。

5.如权利要求4所述一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：所述mCherry荧光蛋白基因由种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动。

6.如权利要求4或5所述一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：所述sgRNA包含两条以FDA2基因为基础设计的两条靶序列T1和T2，或者包含两条以FDA3基因为基础设计的两条靶序列T3和T4；其中，T1的碱基序列如SEQ ID NO：01所示，T2的碱基序列如SEQ ID NO：02所示，T3的碱基序列如SEQ ID NO：03所示，T4的碱基序列如SEQ ID NO：04所示。

7.如权利要求6所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑效率上的应用。

8.如权利要求4或5所述一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：所述sgRNA包含碱基序列如SEQ ID NO：05所示的FAD2的靶序列。

9.如权利要求8所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶频率上的应用。