CN114901360A - 用于递送核酸的新型脂质纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及阳离子脂质和包含所述阳离子脂质的组合物用于将核酸递送到活细胞中。

Description

用于递送核酸的新型脂质纳米颗粒
技术领域
本发明涉及用作基于mRNA疫苗的包含mRNA的脂质纳米颗粒。另外，本发明涉及包含含有mRNA的脂质纳米颗粒的组合物以及包含mRNA的脂质纳米颗粒或组合物用于制备药物组合物，尤其是疫苗的用途，例如用于预防或治疗传染病、肿瘤或癌症疾病、过敏或自身免疫性疾病。本发明进一步描述了治疗或预防上述疾病的方法。
背景技术
基因治疗和遗传疫苗接种是现代医学中最有前途、发展最快的方法。它们可以为多种疾病的治疗提供高度特异性和个性化的选择。基因疫苗接种允许唤起对选定抗原，例如细菌表面的特征成分、病毒颗粒、肿瘤抗原等的期望免疫应答。一般来说，疫苗接种是现代医学的关键成就之一。然而，有效的疫苗目前只能用于有限数量的疾病。因此，每年仍有数百万人感染疫苗无法预防的感染。
通常，疫苗可分为“第一代”、“第二代”和“第三代”疫苗。“第一代”疫苗通常是全生物体疫苗。它们基于活的、减毒的或杀死的病原体，例如病毒、细菌等。活的、减毒疫苗的主要缺点是有回归到危及生命的变种的风险。因此，尽管这种病原体已被减毒，但在本质上仍可能承担不可预测的风险。杀死的病原体在产生特异性免疫应答方面可能不如预期的有效。为了将这些风险降至最低，研发了“第二代”疫苗。这些疫苗通常是亚单位疫苗，由来自病原体的确定抗原或重组蛋白组分组成。
基因疫苗，即用于基因疫苗接种的疫苗，通常被理解为“第三代”疫苗。它们通常由基因工程核酸分子组成，允许在体内表达病原体或肿瘤抗原特有的肽或蛋白质(抗原)片段。基因疫苗在给患者施用被靶细胞摄取后表达。所施用的核酸的表达导致编码蛋白质的产生。如果患者的免疫系统识别出这些蛋白质为异物，则触发免疫应答。
DNA以及RNA可用作核酸分子用于在基因疫苗接种的背景下的施用。众所周知，DNA相对稳定，易于处理。然而，DNA的使用存在着将所施用的DNA片段意外插入患者基因组的风险，这可能会导致致突变事件，例如受损基因的功能丧失。作为另一种风险，出现了不希望产生的抗DNA抗体。另一个缺点是，DNA施用后可实现的编码肽或蛋白质的表达水平有限，这是因为DNA必须进入细胞核才能转录，然后才能翻译所得mRNA。除其他原因外，施用的DNA的表达水平将取决于调节DNA转录的特定转录因子的存在。缺乏这些因子时，DNA转录将不会产生令人满意的RNA量。因此，获得的翻译肽或蛋白质水平有限。
通过使用RNA代替DNA进行基因疫苗接种，可以最大限度地降低或避免意外的基因组整合和产生抗DNA抗体的风险。然而，RNA被认为是一种相当不稳定的分子种类，很容易被普遍存在的RNA酶降解。
现有技术中已经描述了包含与鱼精蛋白复合的抗原编码mRNA的mRNA疫苗(例如，PMID：27336830、PMID：23159882、EP1083232、WO2010/037539、WO2012/116811、WO2012/116810和WO2015/024665)。WO2016/176330还描述了包含编码不同抗原的核苷修饰RNA的脂质纳米颗粒组合物。
即使在过去几年中取得了很多进展，本领域仍然需要提供一种有效的mRNA疫苗接种方法，该方法允许引发适应性免疫应答，其中，施用不会因抗原的早期降解或由于细胞中mRNA的低效释放而导致mRNA的低效翻译而受到严重损害。此外，迫切需要减少mRNA疫苗的剂量，以减少潜在的安全问题，并使第三世界负担得起疫苗。
为了在生物系统中引起预期的应答，存在许多与核酸递送有关的挑战。以核酸为基础的疗法，如疫苗，具有巨大的潜力，但仍然需要更有效地将核酸递送到细胞或生物体内的适当位置，以实现这一潜力。
然而，在治疗环境中使用核酸目前面临两个问题。首先，游离RNA易受血浆中核酸酶消化的影响。其次，游离RNA进入相关翻译机制所在的细胞内区域的能力有限。由阳离子脂质与其他脂质成分(如中性脂质、胆固醇、PEG、PEG化脂质和寡核苷酸)形成的脂质纳米颗粒已被用于阻断血浆中RNA的降解，并促进细胞对寡核苷酸的摄取。
仍然需要改进的阳离子脂质和脂质纳米颗粒来递送寡核苷酸。优选地，这些脂质纳米颗粒将提供最佳的药物：脂质比，保护核酸不在血清中降解和清除，适合全身或局部递送，并提供核酸的细胞内递送。另外，这些脂质-核酸颗粒应具有良好的耐受性，并提供足够的治疗指数，以便以有效剂量的核酸对患者进行的治疗不会对患者造成不可接受的毒性和/或风险。本发明提供了这些和相关的优点。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及可用于将核酸递送至活细胞中的新型阳离子脂质。阳离子脂质为根据式(I)的化合物：
Ra-A-Rb 式(I)
其中
Ra选自：
Figure BDA0003701042630000031
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure BDA0003701042630000041
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，或-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-S-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立，
任选地前提是，如果R1、R2和R5均为乙烷二基，A是-S-S-，且Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630000042
在这方面，烷烃二基是(-CnH2n-)基团的术语，即，“具有2至8个碳原子的烷烃二基”相应地等于分别具有式-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、-C7H14-、或-C8H16-的烷烃二基基团。换言之，烷烃二基是由脂肪族烃衍生的一系列通式为CnH2n的二价自由基。除非另有规定，此类烷烃二基包括取代的烷烃二基。
在另一个实施方式中，在R1、R2和R5均为乙烷二基，A是-S-S-，且Ra和Rb为相同的情况下，R4不是
Figure BDA0003701042630000051
或者分别地，在一个实施方式中，根据式(I)的脂质不是本文表1中公开的脂质C23或分别如下文所述的脂质SS-EC(为避免疑问，即在一些选定的实施方式中，阳离子脂质
Figure BDA0003701042630000052
SS-EC不适用于与根据式(I)的阳离子脂质相关的实施方式)。
在另一个方面中，本发明提供了包含阳离子脂质，例如上文定义的新型阳离子脂质的新型组合物。
已发现阳离子脂质和组合物在将核酸引入活细胞中特别有效。例如，它们可以使改进的RNA(如mRNA)疫苗，即基于mRNA的疫苗针对某些传染病或肿瘤。
在其他方面中，本发明提供包含阳离子脂质和核酸化合物的组合物作为药物、特别是作为疫苗的用途，以及基于这些疫苗的疫苗接种方法。
在本发明的另一个方面中，本发明还提供一种试剂盒，特别是套组试剂盒，其包括含有本文所定义的mRNA序列的mRNA化合物和至少一种根据本文所定义的式(I)或式(II)的脂质。
定义
为了清晰易读，提供了以下科学背景信息和定义。本文提及或由此公开的任何技术特征可以是本发明的每个实施方式的一部分，也可以在本发明每个实施方式上读取。在本公开的上下文中可提供其他定义和解释。
除非另有定义，或除非特定上下文另有要求，本文中使用的所有技术术语的含义与相关技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
除非上下文另有指示或要求，词语“包括”、“包含”和“含有”以及类似表达应以开放包容性意义在本说明书和权利要求书中解释为“包括但不限于”。
表述“一个实施方式”、“实施方式”、“一个特定实施方式”等意味着在本发明的至少一个实施方式中存在特定的特点、性质或特征，或如与相应表述结合所述的特点、性质或特征的特定组或组合。在整个描述中不同地方出现的这些表述不一定指同一实施方式。此外，可以在一个或多个实施方式中以任何合适的方式组合特定特点、性质或特征。
除非上下文另有明确规定，单数形式“一”、“一个”和“所述”应理解为包括复数含义。
数字中的百分比应理解为相对于各个项目的总数。在其他情况下，除非上下文另有规定，否则百分比应理解为重量百分比(重量％)。
如本文所用，“化合物”是指化学物质，它是由具有基本上相同化学结构和性质的分子组成的材料。对于小分子化合物，分子的原子组成和结构配置通常是相同的。对于大分子或聚合物化合物，化合物的分子高度相似，但并非所有分子都必须相同。例如，指定由50个单体单元组成的聚合物段也可能包含具有例如48或53个单体单元的单个分子。
术语“分子”既可以用作“化合物”的同义词，也可以用作单独(即单个)分子的同义词。
对具有在生理条件下可电离的官能团的化合物或部分的任何提及应理解为包括相应化合物或部分的电离形式。反之亦然，对具有在生理条件下也可能以非电离形式存在的电离官能团的化合物或部分的提及应理解为包括相应化合物或部分的非电离形式。例如，具有羧基基团的化合物的公开应解释为是指具有非电离羧基基团或具有电离羧酸酯基团的相应化合物。
如本文所用，“生理条件”指pH在人类生理学已知pH范围内的水相环境，包括细胞外和细胞内条件。该pH范围的近似值为约pH 1至约pH 9。根据上下文，生理条件也可指近似中性条件，例如约pH 5至约pH 8.5，或约pH 5.5至约pH 8。
类脂化合物，也简称为类脂，是类似脂质的化合物，即具有类脂物理性质的两性分子化合物。在本发明的上下文中，术语脂质被认为包括类脂。
在本发明的上下文中，在术语“选自由”某组元素(即，“A、B和C”)“组成的组”在本发明的上下文中指的是不限于所述组。换言之，该术语并不表示披露不涉及未引用的元素，即，替代含义也包括在在该术语所述的组中。因此，在本发明的上下文中，之后的术语“选自由”某组元素(即，“A、B和C”)“组成的组”应理解为“选自A、B和C”，或者作为选择“是A、B或C”，也包括其他结构和功能相关、不相关但未提及的元素。
当参数或值不一定需要相同时，即100％相同时，使用术语“约”。因此，“约”是指参数或值可偏离0.1％至20％，优选0.1％至10％；特别是，偏离0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。技术人员将知道，例如，某些参数或值可能会根据确定参数的方法略有不同。例如，如果本文中定义的某个参数或值具有例如“约1000个核苷酸”的长度，则该长度可能会偏离0.1％至20％，优选0.1％至10％；特别是，偏离0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。因此，本领域技术人员将知道，在该具体实例中，长度可偏离1至200个核苷酸，优选偏离1至100个核苷酸；特别是，偏离5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个核苷酸。
除非特定上下文中明确了不同的含义，术语“阳离子”是指各自的结构，无论是永久性的还是非永久性的，响应于某些条件，例如pH，带有正电荷。因此，术语“阳离子”涵盖“永久阳离子”和“能阳离子化(cationisable)”。本文使用的术语“能阳离子化”是指化合物、基团或原子在其环境的较低pH带正电荷，在较高pH不带电。此外，在无法测定pH值的非水相环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在高氢离子浓度下带正电荷，在低氢离子浓度或活性下不带电。这取决于可阳离子化或可聚阳离子化的化合物的单独性质，特别是各自可阳离子化基团或原子的pKa，在该pH或氢离子浓度下，其带电或不带电。在稀释的水相环境中，带有正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的比例可使用本领域技术人员熟知的所谓亨德森-哈塞尔巴奇方程来评估。例如，如果化合物或部分可阳离子化，则优选的是其在pH值为约1至9、优选为4至9、5至8或甚至6至8、更优选为pH值等于或小于9、等于或小于8、等于或小于7、最优选为生理pH值(例如约7.3至7.4)，即在生理条件下，特别是在体内细胞的生理盐条件下，带正电。在实施方式中，优选的是可阳离子化的化合物或部分在生理pH值(例如约7.0至7.4)下主要为中性，但在较低pH值下变为带正电。在一些实施方式中，可阳离子化的化合物或部分的pKa的优选范围为约5至约7。在一些实施方式中，可质子化脂质的可质子化基团的pKa在约4至约11的范围内，例如，pKa为约5至约7。
除非特定上下文中明确了不同的含义，术语“阳离子”是指各自的结构，无论是永久性的还是非永久性的，响应于某些条件(例如pH)，带有正电荷。因此，术语“阳离子”涵盖“永久阳离子”和“可阳离子化”。例如，具有一级、二级或三级氨基基团的化合物或部分是阳离子的，更具体地说，是可阳离子化的，因为它在生理条件下可能主要以带正电的状态存在。
如本文中所用，“永久阳离子”指在其环境的任何pH值或氢离子活性下，相应化合物、基团或原子带正电荷。通常，正电荷是由存在的四元氮原子产生的。如果化合物带有多个这样的正电荷，它可以被称为永久性聚阳离子，这是永久性阳离子的一个子类别。
类似地，术语“阴离子”、“可阴离子化”和“永久阴离子”以具有“阳离子”、“可阳离子化”和“永久阳离子”的类似含义使用，不同之处在于相应的化合物、基团或原子的电荷为负而非正。
当表述“中性”应用于化合物如脂质或类固醇、或基团或部分时，表示它既不是阳离子也不是阴离子，例如在生理条件下不具有可电离官能团的化合物，例如烃；或者表示它在典型的生理条件下既是阳离子的又是阴离子的，即两性离子，如典型的天然磷脂酰胆碱。
如本文中所用，“脂质”是指一组有机化合物，其是脂肪酸的衍生物(如酯)，通常以不溶于水但溶于许多有机溶剂为特征。脂质通常分为至少三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪、油和蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂质”，如类固醇。关于糖脂，在某些实施方式中，LNP包含糖脂(例如单唾液酸神经节苷脂GM1)。
在上下文中，前缀“聚”指化合物中具有各自性质的多个原子或基团。如果放在括号中，则复数的存在是任选的。例如，(聚)阳离子是指阳离子和/或聚阳离子。然而，前缀的缺失不应被解释为排除复数。例如，聚阳离子化合物也是阳离子化合物，并且可被称为阳离子化合物。
术语“核酸”是指包含DNA或RNA或由其组成的任何化合物。该术语可用于寡核苷酸或寡核苷酸。本文中无论何处提及编码特定蛋白质和/或肽的核酸或核酸序列，所述核酸或核酸序列分别优选还包括允许其在适当宿主(例如人类)中表达(即编码特定蛋白质或肽的核酸序列的转录和/或翻译)的调控序列。
在本发明的上下文中，术语“核苷修饰”是指核酸，如mRNA化合物或包含核苷(通常不出现在天然mRNA中，优选非天然核苷)的分子。特别是，该术语优选指除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶之外的mRNA核苷。
术语“核苷”通常指由糖(通常为核糖或脱氧核糖)和嘌呤或嘧啶碱组成的化合物。术语“核苷酸”通常指包含连接至糖的磷酸基团的核苷。
“肽”是指至少两个通过肽键连接的氨基酸单体的寡聚物或聚合物。该术语不限制氨基酸聚合物链的长度。例如，肽可以包含少于50个单体单元。较长的肽也称为多肽，通常具有50至600个单体单元，更具体地说是50至300个单体单元。
“蛋白质”包含一种或多种折叠成三维形式的多肽或由其组成，有助于实现生物功能。
当非人类(新型)流感病毒获得有效和持续的人与人之间传播能力，然后在全球传播时，可能会发生“流感大流行”或“大流行性流感”。有可能引起大流行的流感病毒被称为“具有大流行可能性的流感病毒”或“大流行性流感病毒”。
具有大流行可能性的流感病毒包括禽流感A(H5N1)和禽流感A(H7N9)，这是两种不同的“禽流感”病毒。这些是非人类病毒(也就是说，它们在人类中是新的，在世界部分地区的鸟类中传播)，因此人类对这些病毒几乎没有免疫力。人类感染这些病毒的情况很少发生，但如果这些病毒中的任何一种改变为其能够轻易感染人类并在人与人之间传播的方式，就可能导致流感大流行。
大流行性流感/流感的疫苗或大流行性流感/流感疫苗：针对大流行性流感病毒的疫苗在本文中称为大流行性流感/流感的疫苗或大流行性流感/流感疫苗。
流感/流感季节：流感季节是一个每年反复出现的时期，其特征是流感(流感)暴发的流行。这个季节发生在每个半球一年中寒冷的半年。流感活动有时是可以预测的，甚至可以在地理位置上追踪。虽然每个季节主要流感活动的开始时间因地点而异，但在任何特定地点，这些轻微的流行病通常需要约3周达到峰值，再过3周才能显著减少。流感疫苗接种被用来减少流感季节的影响；肺炎疫苗接种还能减少流感季节的影响和并发症。由于北半球和南半球在一年中的不同时间存在冬季，因此实际上每年有两个流感季节。
季节性流感/流感的疫苗或季节性流感/流感疫苗：针对流感季节的季节性发生的流感病毒的疫苗在本文中称为“季节性流感/流感的疫苗或季节性流感/流感疫苗”。
免疫系统：免疫系统可以保护生物体免受感染。如果病原体突破生物体的物理屏障并进入该生物体，则先天性免疫系统会提供即时但非特异性的应答。如果病原体逃避这种先天应答，脊椎动物则拥有第二层保护，即适应性免疫系统。此处，免疫系统在感染期间调整其应答，以改进其对病原体的识别能力。然后，这种改进的应答在病原体被消灭后以免疫记忆的形式保留下来，并允许适应性免疫系统在每次遇到这种病原体时开展更快、更强的攻击。据此，免疫系统包括先天性免疫系统和适应性免疫系统。这两部分中的每一部分都包含所谓的体液和细胞成分。
免疫应答：免疫应答通常可能是适应性免疫系统对特定抗原的特异性反应(所谓的特异性或适应性免疫应答)或先天性免疫系统的非特异性反应(所谓的非特异性或先天性免疫应答)。本发明涉及适应性免疫系统的特定反应(适应性免疫应答)的核心。特别是，它涉及对病毒(例如流感病毒)感染的适应性免疫应答。然而，这种特异性应答可由另一种非特异性反应(先天性免疫应答)支持。因此，本发明还涉及一种同时刺激先天性免疫系统和适应性免疫系统以激发有效的适应性免疫应答的化合物。
适应性免疫系统：适应性免疫系统由高度特化的系统性细胞和过程组成，可消除或防止致病性生长。适应性免疫应答为脊椎动物免疫系统提供识别和记忆特定病原体的能力(产生免疫)，并在每次遇到病原体时开展更强的攻击。由于体细胞超变(体细胞突变频率增加的过程)和V(D)J重组(抗原受体基因片段的不可逆基因重组)，该系统具有高度适应性。这种机制允许少量基因产生大量不同的抗原受体，然后在每个单独的淋巴细胞上唯一表达。由于基因重排导致每个细胞的DNA发生不可逆转的变化，因此该细胞的所有子代(后代)于是将继承编码相同受体特异性的基因，包括记忆B细胞和记忆T细胞，它们是长寿命特异性免疫的关键。免疫网络理论是一种关于适应性免疫系统如何工作的理论，它基于T细胞、B细胞以及由T细胞和B细胞产生的具有可变区的分子的受体的可变区之间的相互作用。
适应性免疫应答：适应性免疫应答通常被理解是抗原特异性的。抗原特异性允许产生针对特定抗原、病原体或病原体感染细胞的应答。通过“记忆细胞”在体内维持这些定制应答的能力。如果病原体感染身体不止一次，这些特定的记忆细胞会被用来迅速消除它。在上下文中，适应性免疫应答的第一步是激活初始的抗原特异性T细胞或能够通过抗原呈递细胞诱导抗原特异性免疫应答的不同免疫细胞。这发生在淋巴组织和器官中，初始T细胞不断通过这些组织和器官。可作为抗原呈递细胞的细胞类型包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。这些细胞中的每一个在诱导免疫应答方面都有不同的功能。树突状细胞通过吞噬和巨噬细胞作用吸收抗原，并通过与例如外源抗原接触而受到刺激，迁移到局部淋巴组织，在那里它们分化成成熟的树突状细胞。巨噬细胞摄取颗粒抗原，如细菌，并被感染因子或其他适当刺激物诱导表达MHC分子。B细胞通过其受体结合和内化可溶性蛋白抗原的独特能力对诱导T细胞也很重要。将抗原呈递在MHC分子上导致T细胞活化，从而诱导其增殖和分化为武装效应T细胞。效应T细胞最重要的功能是CD8+细胞毒性T细胞杀死感染细胞，Th1细胞激活巨噬细胞，二者共同构成细胞介导的免疫，Th2和Th1细胞激活B细胞产生不同类别的抗体，从而驱动体液免疫应答。T细胞通过其T细胞受体识别抗原，T细胞受体不直接识别和结合抗原，而是识别例如病原体衍生的蛋白质抗原的短肽片段，其与其他细胞表面的MHC分子结合。
细胞免疫/细胞免疫应答：细胞免疫通常涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的激活以及对抗原应答的各种细胞因子的释放。以更普遍的方式，细胞免疫与抗体无关，而是与免疫系统细胞的激活有关。细胞免疫应答的特征在于，例如激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，所述T淋巴细胞能够诱导在其表面显示抗原表位的体细胞(例如病毒感染细胞、具有细胞内细菌的细胞和显示肿瘤抗原的癌细胞)凋亡；激活巨噬细胞和自然杀伤细胞，使其能够摧毁病原体；并刺激细胞分泌多种细胞因子，这些细胞因子影响参与适应性免疫应答和先天性免疫应答的其他细胞的功能。
体液免疫/体液免疫应答：体液免疫通常指抗体的产生及其可能伴随的辅助过程。体液免疫应答的典型特征例如是Th2激活和细胞因子产生、生发中心形成和同型转换、亲和力成熟和记忆细胞生成。体液免疫通常也指抗体的效应功能，包括病原体和毒素中和、经典补体激活以及调理素促进吞噬作用和病原体清除。
先天性免疫系统：先天性免疫系统，也称为非特异性免疫系统，包括以非特异性方式保护宿主免受其他生物体感染的细胞和机制。这意味着先天性系统的细胞以一般途径识别和应答病原体，但与适应性免疫系统不同，它不会赋予宿主持久或保护性免疫。先天性免疫系统的激活可通过例如病原体相关分子模式(PAMP)受体的配体，例如Toll样受体(TLR)或其他辅助物质如脂多糖、TNF-α、CD40配体、或细胞因子、单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β、TNF-α、生长因子和hGH，人Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的配体，鼠Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的配体、NOD样受体的配体、RIG-I样受体的配体、免疫刺激核酸、免疫刺激RNA(isRNA)、CpG-DNA、抗菌剂或抗病毒剂。通常，先天性免疫系统的应答包括通过产生化学因子，包括称为细胞因子的特殊化学介质，向感染部位募集免疫细胞；激活补体级联；通过特殊白细胞识别和清除器官、组织、血液和淋巴中的异物；通过称为抗原递呈的过程激活适应性免疫系统；和/或作为传染源的物理和化学屏障。
佐剂/佐剂成分：最广义的佐剂或佐剂组分通常是(例如药理学或免疫学)试剂或组合物，其可修改，例如增强其他试剂(例如药物或疫苗)的效力。在本发明的上下文中，该术语通常指用作免疫原和/或其他药学活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。它应在广义上加以解释，指的是能够增加掺入相关佐剂或与相关佐剂共同施用的抗原的免疫原性的广谱物质。在本发明的上下文中，佐剂将优选地增强本发明活性剂的特异性免疫原性效果。通常，“佐剂”或“佐剂成分”具有相同的含义，可以相互使用。佐剂可分为例如免疫增强剂、抗原递送系统或甚至其组合。
术语“佐剂”通常被理解为不包括自身赋予免疫力的试剂。佐剂通过例如促进抗原呈递给免疫系统或诱导非特异性先天性免疫应答来非特异性地协助免疫系统增强抗原特异性免疫应答。此外，佐剂可优选地例如通过例如将主要的基于Th2的抗原特异性应答转变为更基于Th1的抗原特异性应答来调节抗原特异性免疫应答，或反之亦然。因此，佐剂可有利地调节细胞因子表达/分泌、抗原呈递、免疫应答类型等。
免疫刺激RNA：在本发明的上下文中，免疫刺激RNA(isRNA)通常可以是能够诱导先天性免疫应答本身的RNA。它通常没有开放的阅读框，因此不提供肽抗原或免疫原，而是通过例如与特定种类的Toll样受体(TLR)或其他合适的受体结合的方式引发先天性免疫应答。然而，当然，具有开放阅读框和编码肽/蛋白质(例如抗原功能)的mRNA也可诱导先天性免疫应答。
如本文中所用，术语“抗体”包括完整抗体和抗体片段。通常，完整的“抗体”是特异性结合特定抗原的免疫球蛋白。抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别：IgG、IgM、IgE、IgA和IgD。通常，完整的抗体是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有“轻”链和“重”链。“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'，F(ab')2和Fv片段；三链抗体(tribes)；四链抗体(Tetra)；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，抗体片段包括分离片段、“Fv”片段(由重链和轻链可变区组成)、重组单链多肽分子(其中轻链和重链可变区通过肽连接物(“ScFv蛋白质”)连接在一起)以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双链抗体(diabody)、dAb片段、片段Fd'、Fd片段和分离的互补性决定区(CDR)。可由本发明的治疗性RNA编码的合适抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体混合物或鸡尾酒、人或人源化抗体、嵌合抗体、Fab片段或双特异性抗体。在本发明的上下文中，抗体可由本发明的组合/组合物的至少一种治疗性RNA提供。
在本发明的上下文中，术语“抗原”通常指可被免疫系统识别的物质，优选由适应性免疫系统识别，并且能够触发抗原特异性免疫应答，例如通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分。通常，抗原可以是或可包含可由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白质。在本发明的意义上，抗原可以是所提供的核酸分子(优选如本文所定义的mRNA)的翻译产物。在上下文中，此外，包含至少一个表位的肽和蛋白质的片段、变体和衍生物被理解为抗原。因此，本文使用的术语“抗原”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如意在指可被免疫系统、优选适应性免疫系统识别的物质，并且能够触发抗原特异性免疫应答，例如，通过形成抗体和/或抗原特异性T细胞作为适应性免疫应答的一部分。通常，抗原可以是或可以包含可由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白质。此外，从例如包含至少一个表位的癌抗原衍生的肽或蛋白质的片段、变体和衍生物可理解为抗原。在本发明的上下文中，抗原可以是所提供的治疗性RNA(例如编码RNA、复制子RNA、mRNA)翻译的产物。术语“抗原肽或蛋白质”将被本领域普通技术人员识别和理解，并且例如意指源自(抗原)蛋白质的肽或蛋白质，其可刺激身体的适应性免疫系统以提供适应性免疫应答。因此，“抗原肽或蛋白质”包含其来源的蛋白质的至少一个表位或抗原(例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原)。在本发明的上下文中，抗原可由本发明的组合/组合物的至少一种治疗性RNA提供。
本说明书中在核酸的上下文中使用的术语“源自”，即对于“源自”(另一)核酸的核酸而言，指源自(另一)核酸的核酸与其源自的核酸具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或约99％的序列同一性。本领域技术人员知道，序列同一性通常是针对相同类型的核酸，即针对DNA序列或RNA序列计算的。因此，可以理解，如果DNA“源自”RNA，或者如果RNA“源自”DNA，则在第一步中，将RNA序列转换为相应的DNA序列(特别是通过在整个序列中用T替换U)，或者，反之亦然，将DNA序列转换成相应的RNA序列(特别是通过在整个序列中用U替换T)。此后，确定DNA序列的序列同一性或RNA序列的序列同一性。优选地，“源自”核酸的核酸也指相对于其源自的核酸进行修饰的核酸，例如为了进一步增加RNA稳定性和/或延长和/或增加蛋白质产量。在氨基酸序列的上下文中，术语“源自”是指源自(另一)氨基酸序列的氨基酸序列与其源自的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的序列同一性。
表位(也称为“抗原决定簇”)：在本发明的上下文中，T细胞表位或蛋白质的部分可包括优选具有约6至约20或甚至更多个氨基酸的长度的片段，例如由MHC I类分子处理和呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸的长度，例如8、9或10(或甚至11或12个氨基酸)，或由MHC II类分子处理和呈递的片段，优选具有约13个或更多氨基酸的长度，例如13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更多个氨基酸，其中，这些片段可以选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常以肽片段和MHC分子组成的复合物的形式被T细胞识别。
B细胞表位通常是位于本文定义的(天然)蛋白质或肽抗原外表面的片段，优选具有5至15个氨基酸，更优选具有5至12个氨基酸，甚至更优选具有6至9个氨基酸，其可由抗体识别，即以其天然形式。
这种蛋白质或肽的表位还可以选自本文提到的这种蛋白质或肽的任何变体。在上下文中，抗原决定簇可以是构象的或不连续的表位，其由本文定义的蛋白质或肽的片段组成，这些片段在本文定义的蛋白质或肽的氨基酸序列中不连续，但在三维结构、或由单个多肽链组成的连续或线性表位中聚集在一起。
术语“疫苗”通常被理解为提供至少一种抗原或抗原功能的预防性或治疗性材料。抗原或抗原功能可刺激身体的适应性免疫系统，以提供适应性免疫应答。
在本发明的上下文中，术语“提供抗原的mRNA”通常可以是mRNA，其具有至少一个开放阅读框，可由提供有该mRNA的细胞或生物体翻译。这种翻译的产物是可作为抗原、优选作为免疫原的肽或蛋白质。产物也可以是由一种以上免疫原组成的融合蛋白，例如由两个或更多个源自相同或不同病毒蛋白质的表位、肽或蛋白质组成的融合蛋白，其中表位、肽或蛋白质可以通过连接序列连接。
术语“人工mRNA”(序列)通常可以理解为并非天然存在的mRNA分子。换言之，人工mRNA分子可以理解为非天然mRNA分子。这种mRNA分子可能是非天然的，由于它的单个序列(不是天然存在的)和/或由于其他修饰，例如非天然存在的核苷酸的结构修饰。通常，可以通过基因工程方法设计和/或生成人工mRNA分子，以对应于所需的人工核苷酸序列(异源序列)。在上下文中，人工序列通常是非天然存在的序列，即它与野生型序列至少有一个核苷酸不同。术语“野生型”可以理解为自然界中存在的序列。此外，术语“人工核酸分子”不限于指“单个分子”，而是通常理解为包含相同分子的整体。因此，它可能涉及等分试样中包含的多个相同分子。
在核酸序列或氨基酸序列的上下文中，本说明书通篇使用的术语“异源”或“异源序列”指的是将被本领域的普通技术人员认识和理解的序列(例如DNA、RNA、氨基酸)，是指源自另一个基因，源自另一个等位基因，源自另一个种类的序列。如果两个序列不是源自同一基因或在同一等位基因，则通常认为它们是“异源的”。即，尽管异源序列可能源自同一生物体，但它们天然(在自然界)不会存在于同一核酸分子中，例如，同一RNA或蛋白质中。
双顺反子/多顺反子mRNA：mRNA，通常可具有两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)开放阅读框(ORF)(编码区或编码序列)。在上下文中，开放阅读框架是可以翻译成肽或蛋白质的几个核苷酸三联体(密码子)的序列。这种mRNA的翻译产生两个(双顺反子)或更多个(多顺反子)不同的翻译产物(前提是ORF不相同)。对于在真核生物中的表达，例如，此类mRNAs可包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。
单顺反子mRNA：单顺反子mRNA通常可能是仅包含一个开放阅读框(编码序列或编码区)的mRNA。在上下文中，开放阅读框是可以翻译成肽或蛋白质的几个核苷酸三联体(密码子)的序列。
3'-非翻译区(3’-UTR)：3'-UTR通常是位于mRNA的蛋白质编码区(即开放阅读框)和聚(A)序列之间的mRNA部分。mRNA的3'-UTR没有翻译成氨基酸序列。3'-UTR序列通常由在基因表达过程中转录成相应的mRNA的基因编码。基因组序列首先转录到成熟前(premature)mRNA中，其包含任选的内含子。然后，在成熟过程中，成熟前mRNA进一步加工成成熟的mRNA。该成熟过程包括5′封端、剪接成熟前mRNA以切除任选内含子和3′端修饰的步骤，例如成熟前mRNA 3′端的多聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶或核酸外切酶切割等。在本发明的上下文中，3'-UTR对应于成熟mRNA的序列，该序列位于蛋白质编码区终止密码子的3'处，优选紧邻蛋白质编码区终止密码子3'处，并延伸至聚(A)序列的5'侧，优选至紧邻聚(A)序列5'处的核苷酸。术语“对应于”意味着3'-UTR序列可以是RNA序列，例如在用于定义3'-UTR序列的mRNA序列中，或者是对应于该RNA序列的DNA序列。在本发明的上下文中，术语“基因的3'-UTR”，例如“白蛋白基因的3'-UTR”，是与源自该基因的成熟mRNA的3'-UTR相对应的序列，即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3'-UTR”包括3'-UTR的DNA序列和RNA序列。
5’-非翻译区(5’-UTR)：5'-UTR通常被理解为信使RNA(mRNA)的特定部分。它位于mRNA开放阅读框的5'处。通常，5'-UTR从转录起始位点开始，在开放阅读框的起始密码子之前一个核苷酸结束。5'-UTR可包含用于控制基因表达的元件，也称为调节元件。例如，这种调节元件可以是核糖体结合位点或5'-末端寡嘧啶束。5'-UTR可以转录后修饰，例如通过添加5'-CAP。在本发明的上下文中，5'-UTR对应于位于5'-CAP和起始密码子之间的成熟mRNA序列。优选地，5'-UTR对应于这样的序列，其从位于5’-CAP的3’处的核苷酸，优选从位于紧邻5’-CAP的3’处的核苷酸，延伸至位于蛋白质编码区起始密码子的5’处的核苷酸，优选位于紧邻蛋白质编码区起始密码子的5’处的核苷酸。位于紧邻成熟mRNA的5’-CAP的3'处的核苷酸通常对应于转录起始位点。术语“对应于”意味着5'-UTR序列可以是RNA序列，例如在用于定义5'-UTR序列的mRNA序列中，或者是对应于该RNA序列的DNA序列。在本发明的上下文中，术语“基因的5'-UTR”，例如“TOP基因的5'-UTR”，是与源自该基因的成熟mRNA的5'-UTR相对应的序列，即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的5'-UTR”包括5'-UTR的DNA序列和RNA序列。
5'-末端寡嘧啶束(TOP)：5'-末端寡嘧啶束(TOP)通常是位于核酸分子5'-末端区域的一束嘧啶核苷酸，例如某些mRNA分子的5'-末端区域或功能实体的5'-末端区域，例如某些基因的转录区域。序列从通常对应于转录起始位点的胞苷开始，然后是通常约3至30个嘧啶核苷酸的一段。例如，TOP可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或甚至更多个核苷酸。嘧啶段(因此5’-TOP)结束于位于TOP下游的第一个嘌呤核苷酸5’的一个核苷酸。含有5'-末端寡嘧啶束的信使RNA通常被称为TOP mRNA。因此，提供这种信使RNA的基因被称为TOP基因。例如，在编码肽延伸因子和核糖体蛋白质的基因和mRNA中发现了TOP序列。
TOP基序：在本发明的上下文中，TOP基序是对应于上文定义的5'-TOP的核酸序列。因此，因此，本发明上下文中的TOP基序优选为长度为3至30个核苷酸的一段嘧啶核苷酸。优选地，TOP基序由至少3个嘧啶核苷酸、优选至少4个嘧啶核苷酸、优选至少5个嘧啶核苷酸、更优选至少6个核苷酸、更优选至少7个核苷酸、最优选至少8个嘧啶核苷酸组成，其中，嘧啶核苷酸段优选从其带有胞嘧啶核苷酸的5′端开始。在TOP基因和TOP mRNA中，TOP基序优选从其带有转录起始位点的5′端开始，并在所述基因或mRNA中的第一个嘌呤残基的5′的1个核苷酸结束。本发明意义上的TOP基序优选位于代表5'-UTR的序列的5'-端或编码5'-UTR的序列的5'-端。因此，优选地，如果3个或更多个嘧啶核苷酸的段位于如本发明mRNA、本发明mRNA的5'-UTR元件或源自本文所述TOP基因的5'-UTR的核酸序列各序列的5'端，则在本发明的意义上该段称为“TOP基序”。换言之，不位于5'-UTR或5'-UTR元件的5'-末端，但位于5'-UTR或5'-UTR元件内任何位置的3个或更多个嘧啶核苷酸的段优选不被称为“TOP基序”。
TOP基因：TOP基因的典型特征是存在5'-末端寡嘧啶束。此外，大多数TOP基因的特征是与生长相关的翻译调节。然而，具有组织特异性翻译调控的TOP基因也是已知的。如上所述，TOP基因的5'-UTR对应于源自TOP基因的成熟mRNA的5'-UTR的序列，其优选地从位于5’-CAP的3'处的核苷酸延伸到位于起始密码子的5'处的核苷酸。TOP基因的5'-UTR通常不包含任何起始密码子，优选不包含上游AUG(uAUGs)或上游开放阅读框(UORF)。其中，上游AUG和上游开放阅读框通常被理解为出现在应该翻译的开放阅读框的起始密码子(AUG)5’处的AUG和开放阅读框。TOP基因的5'-UTR通常相当短。TOP基因的5'-UTR的长度可以在20个核苷酸至至多500个核苷酸之间变化，并且通常小于约200个核苷酸、优选小于约150个核苷酸、更优选小于约100个核苷酸。在本发明的意义上，TOP基因的示例性5'-UTR是根据国际专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ IDNO：1422的序列或其同系物或变体中从位置5处的核苷酸延伸至位于紧邻起始密码子(例如ATG)的5’处的核苷酸的核酸序列，其公开内容通过引用并入本文。在上下文中，TOP基因的5'-UTR的特别优选片段是缺乏5'-TOP基序的TOP基因的5'-UTR。术语“TOP基因的5'-UTR”优选地指天然存在的TOP基因的5'-UTR。
核酸序列的片段，特别是mRNA：核酸序列的片段由与全长核酸序列(该片段的核酸序列的基础)中的核苷酸的连续段相对应的核苷酸的连续段组成，其代表全长核酸序列的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％和最优选至少90％。在本发明的意义上，这种片段优选为全长核酸序列的功能片段。
在本发明的上下文中，蛋白质或肽的“片段”或“变体”在该蛋白质或肽的至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少75个或至少100个氨基酸的段上具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性。更优选地，本文所用蛋白质或肽的“片段”或“变体”与衍生变体的蛋白质或肽为至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％相同。
核酸序列的变体，特别是mRNA：核酸序列的变体是指构成核酸序列基础的核酸序列的变体。例如，与衍生变体的核酸序列相比，变体核酸序列可表现出一个或多个核苷酸缺失、插入、添加和/或取代。优选地，核酸序列的变体与衍生该变体的核酸序列为至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％相同。优选地，该变体是一种功能性变体。核酸序列的“变体”在该核酸序列的10、20、30、50、75或100个核苷酸的段上可具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的核苷酸同一性。
稳定化的核酸，优选mRNA：稳定化的核酸，优选是典型的mRNA，表现出对体内降解(例如，通过外切或内切核酸酶降解)和/或体外降解(例如，通过施用疫苗之前的制造过程，例如，在制备待施用的疫苗溶液的过程中)的抗性增强的修饰。例如，可以通过提供5'-CAP结构、聚A尾或任何其他UTR修饰来实现RNA的稳定。也可以通过化学修饰或对核酸的G/C含量的修饰来实现。各种其他方法在本领域中是已知的，并且在本发明的上下文中是可想象的。
RNA体外转录：术语“RNA体外转录”或“体外转录”涉及在无细胞系统(体外)中合成RNA的过程。DNA，特别是质粒DNA，用作生成RNA转录本的模板。RNA可通过适当DNA模板的DNA依赖性体外转录获得，根据本发明，该模板优选为线性化质粒DNA模板。控制体外转录的启动子可以是任何DNA依赖性RNA聚合酶的任何启动子。DNA依赖性RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。用于体外RNA转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是对应于待体外转录的相应RNA的cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体(例如引入质粒DNA)来获得。在本发明的优选实施方式中，DNA模板在体外转录之前用合适的限制性内切酶线性化。cDNA可通过mRNA逆转录或化学合成获得。此外，还可以通过基因合成获得用于体外RNA合成的DNA模板。
体外转录的方法在本领域中是已知的(例如，参见Geall et al.(2013)Semin.Immunol.25(2):152-159；Brunelle et al.(2013)Methods Enzymol.530:101-14)。所述方法中使用的试剂通常包括：
1)线性化DNA模板，其启动子序列对其各自的RNA聚合酶(如噬菌体编码的RNA聚合酶)具有高结合亲和力；
2)四种碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶)的核糖核苷三磷酸(NTPs)；
3)任选地，上文定义的CAP类似物(例如m7G(5’)ppp(5’)G(m7G))；
4)DNA依赖性RNA聚合酶，能够与线性化DNA模板内的启动子序列结合(例如T7、T3或SP6 RNA聚合酶)；
5)任选地，核糖核酸酶(RNase)抑制剂，可使任何污染的RNase失活；
6)任选地，降解焦磷酸盐的焦磷酸酶，可抑制转录；
7)MgCl2，提供Mg2+离子作为聚合酶的辅助因子；
8)保持适当pH值的缓冲液，也可以含有抗氧化剂(如DTT)和/或多胺，如最佳浓度的亚精胺。
全长蛋白质：本文使用的术语“全长蛋白质”通常指基本上包含天然存在的蛋白质的整个氨基酸序列的蛋白质。然而，例如由于蛋白质突变导致的氨基酸取代也包含在术语全长蛋白质中。
蛋白质片段：在本发明的上下文中，蛋白质或肽的“片段”通常可包含本文所定义的蛋白质或肽的序列，关于其氨基酸序列(或其编码的核酸分子)，与原始(天然)蛋白质(或其编码的核酸分子)的氨基酸序列相比，其N末端和/或C末端被截短。因此，这种截短可能发生在氨基酸水平上，或相应地发生在核酸水平上。因此，关于本文所定义的该片段的序列同一性可优选地指本文所定义的整个蛋白质或肽，或指此类蛋白质或肽的整个(编码)核酸分子。
在基因的核酸序列的上下文中，术语“变体”指的是核酸序列变体，即核酸序列或包含核酸序列的基因，该核酸序列的至少一个核酸与参考(或“母本”)核酸或基因的参考(或“母本”)核酸序列不同。因此，与其各自的参考序列相比，变体核酸或基因在其核酸序列中可优选包含至少一种突变、取代、插入或删除。优选地，本文使用的术语“变体”包括核酸序列或基因的天然存在的变体和工程化变体。因此，本文所定义的“变体”可从参考核酸序列衍生、分离、相关、基于或同源于参考核酸序列。“变体”可优选具有与相应天然存在的(野生型)核酸序列或基因的核酸序列，或其同系物、片段或衍生物的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％或甚至97％的序列同一性。
此外，本领域的普通技术人员将认识并理解贯穿本说明书在蛋白质或肽的上下文中使用的术语“变体”，例如，其意图是指具有在一个或多个突变中不同于原始序列的氨基酸序列的蛋白质或肽变体，例如一个或多个经取代的、插入和/或删除的氨基酸。优选地，与全长天然蛋白质相比，这些片段和/或变体具有相同的生物功能或特定活性，例如其特定的抗原性。本文定义的蛋白质或肽的“变体”可包括与其天然(即未突变的生理)序列相比的一个或多个保守氨基酸取代。那些氨基酸序列及其编码核苷酸序列特别属于本文定义的术语变体。源于同一类别的氨基酸相互交换的取代称为保守取代。特别是，这些氨基酸具有脂肪族侧链、带正或负电荷的侧链、侧链中的芳香基或氨基酸，其侧链可以进入氢桥，例如具有羟基功能的侧链。这意味着，例如，具有极性侧链的氨基酸被另一种具有类似极性侧链的氨基酸替代，或者，例如，以疏水侧链为特征的氨基酸被具有类似疏水侧链的另一氨基酸取代(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)取代或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)取代)。插入和取代是可能的，特别是，在那些不会修饰三维结构或不影响结合区的序列位置。通过一个或多个插入或一个或多个删除对三维结构的修饰可以很容易地确定，例如使用CD光谱(圆二色谱)。蛋白质或肽的“变体”可在该蛋白质或肽的至少10、20、30、50、75或100个氨基酸的段上具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性。优选地，蛋白质的变体包含该蛋白质的功能变体，这意味着该变体发挥与其源自的蛋白质相同的作用或功能，或至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的作用或功能。
此外，在核酸序列或基因的上下文中，术语“片段”指全长参考(或“母体”)核酸序列或基因的连续子序列。换言之，“片段”通常可能是全长核酸序列或基因的较短部分。因此，片段通常由与全长核酸序列或基因内的相应段相同的序列组成。该术语包括天然存在的片段以及工程片段。在本发明的上下文中，序列的优选片段由核酸的连续段组成，对应于该片段源自的核酸或基因中实体的连续段，其代表该片段源自的总(即全长)核酸序列或基因的至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％和最优选至少80％。关于这种片段指示的序列同一性优选地指的是整个核酸序列或基因。优选地，“片段”可包含具有与其源自的参考核酸序列或基因为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％且最优选至少95％或甚至97％的序列同一性的核酸序列。
此外，在上下文中，蛋白质片段通常可包含具有与相应的天然存在的全长蛋白质的氨基酸序列为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％、甚至更优选至少90％且最优选至少95％或甚至97％的序列同一性的氨基酸序列。
本领域的普通技术人员将识别和理解贯穿本说明书在核酸序列或氨基酸序列的上下文中使用的术语“同一性”，例如，其旨在指两个序列相同的百分比。为了确定两个序列相同的百分比，例如本文定义的核酸序列或氨基酸(aa)序列，优选由本文定义的核酸序列编码的aa序列或aa序列本身，可以比对这些序列以便随后彼此比较。因此，例如，可以将第一个序列的位置与第二个序列的相应位置进行比较。如果第一个序列中的一个位置与相同情况的第二个序列中的一个位置被相同的残基所占据，那么这两个序列在这个位置是相同的。如果情况并非如此，则序列在该位置不同。如果与第一个序列相比插入发生在第二个序列中，则可以将空位插入第一个序列中以允许进一步比对。如果与第一个序列相比删除发生在第二个序列中，则可以将空位插入第二个序列中以允许进一步比对。然后，两个序列相同的百分比是相同位置数除以位置总数(包括仅在一个序列中被占据的位置)的函数。两个序列相同的百分比可以使用算法来确定，例如BLAST程序中集成的算法。
在本发明上下文中，蛋白质或肽的片段还可包含本文定义的蛋白质或肽序列，其具有例如至少5个氨基酸的长度、优选至少6个氨基酸的长度、优选至少7个氨基酸、更优选至少8个氨基酸、甚至更优选至少9个氨基酸；甚至更优选至少10个氨基酸；甚至更优选至少11个氨基酸；甚至更优选至少12个氨基酸；甚至更优选至少13个氨基酸；甚至更优选至少14个氨基酸；甚至更优选至少15个氨基酸；甚至更优选至少16个氨基酸；甚至更优选至少17个氨基酸；甚至更优选至少18个氨基酸；甚至更优选至少19个氨基酸；甚至更优选至少20个氨基酸；甚至更优选至少25个氨基酸；甚至更优选至少30个氨基酸；甚至更优选至少35个氨基酸；甚至更优选至少50个氨基酸；或最优选至少100个氨基酸。例如，该片段可具有约6至约20或甚至更多个氨基酸的长度，例如由MHC I类分子处理和呈递的片段，优选具有约8至约10个氨基酸的长度，例如8、9或10(或甚至6、7、11或12个氨基酸)，或由MHC II类分子处理和呈递的片段，优选具有约13个或更多个氨基酸的长度，例如13、14、15、16、17、18、19、20或甚至更多个氨基酸，其中，这些片段可以选自氨基酸序列的任何部分。这些片段通常被T细胞以由肽片段和MHC分子组成的复合物的形式识别，即，这些片段通常不以其天然形式识别。蛋白质或肽的片段可包含这些蛋白质或肽的至少一个表位。此外，蛋白质的结构域，如胞外结构域、胞内结构域或跨膜结构域，以及蛋白质的缩短或截短版本，也可以理解为包含蛋白质的片段。
蛋白质的变体：可产生本发明上下文中定义的蛋白质或肽的“变体”，其具有在一个或多个突变中不同于原始序列的氨基酸序列，例如一个或多个经取代、插入和/或删除的氨基酸。优选地，与全长天然蛋白质相比，这些片段和/或变体具有相同的生物功能或特定活性，例如其特定的抗原性。本发明上下文中定义的蛋白质或肽的“变体”可包括与其天然(即未突变的生理)序列相比的一个或多个保守氨基酸取代。那些氨基酸序列及其编码核苷酸序列特别属于本文定义的术语变体。源于同一类别的氨基酸相互交换的取代称为保守取代。特别是，这些氨基酸具有脂肪族侧链、带正或负电荷的侧链、侧链中的芳香基或氨基酸，其侧链可以进入氢桥，例如具有羟基功能的侧链。这意味着，例如，具有极性侧链的氨基酸被另一种具有类似极性侧链的氨基酸取代，或者，例如，以疏水侧链为特征的氨基酸被具有类似疏水侧链的另一氨基酸取代(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)取代或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)取代)。插入和取代是可能的，特别是，在那些不会修饰三维结构或不影响结合区的序列位置。通过一个或多个插入或一个或多个删除对三维结构的修饰可以很容易地确定，例如使用CD光谱(圆二色谱)。(Urry,1985,Absorption,CircularDichroism and ORD of Polypeptides,in:Modern Physical Methods in Biochemistry,Neuberger et al.(ed.),Elsevier,Amsterdam)。
蛋白质或肽的“变体”在该蛋白质或肽的10、20、30、50、75或100个氨基酸的段上可具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性。
此外，本文定义的可由核酸分子编码的蛋白质或肽的变体也可包含这些序列，其中编码核酸序列的核苷酸根据遗传密码的简并进行交换且不会导致蛋白质或肽的相应氨基酸序列的改变，即氨基酸序列或其至少部分不得在在上述含义内的一个或多个突变中与原始序列不同。
序列的同一性：为了确定两个序列相同的百分比，例如本文定义的核酸序列或氨基酸序列，优选由本文定义的聚合物载体的核酸序列编码的氨基酸序列或氨基酸序列本身，序列可以比对以便随后相互比较。因此，例如，可以将第一个序列的位置与第二个序列的相应位置进行比较。如果第一个序列中的一个位置与相同情况下第二个序列中的一个位置被相同成分(残基)占据，那么这两个序列在这个位置是相同的。如果情况并非如此，则序列在该位置不同。如果与第一个序列相比插入发生在第二个序列中，则可以将空位插入第一个序列中以允许进一步比对。如果与第一个序列相比删除发生在第二个序列中，则可以将空位插入第二个序列中以允许进一步比对。然后，两个序列相同的百分比是相同位置数除以位置总数(包括仅在一个序列中被占据的位置)的函数。两个序列相同的百分比可以使用算法来确定。可使用的数学算法的优选但非限制性实例是Karlin et al.(1993),PNASUSA,90:5873-5877或Altschul et al.(1997),Nucleic Acids Res.,25:3389-3402的算法。这种算法集成在BLAST程序中。该程序可以识别在一定程度上与本发明的序列相同的序列。
蛋白质或肽的衍生物：肽或蛋白质的衍生物通常被理解为源自另一分子，例如所述肽或蛋白质的分子。肽或蛋白质的“衍生物”还包括包含本发明中使用的肽或蛋白质的融合物。例如，融合物包含标签，例如表位，例如FLAG表位或V5表位。例如，表位是FLAG表位。例如，这种标签可用于纯化融合蛋白。
药物有效量：本发明上下文中的药物有效量通常被理解为足以诱导免疫应答的量。
载体：本发明上下文中的载体通常可以是促进另一种化合物的运输和/或复合的化合物。所述载体可与所述其他化合物形成复合物。聚合物载体是由聚合物形成的载体。
载体：一种试剂，例如通常可在药物组合物或疫苗中使用的载体，用于促进向个体施用药物组合物或疫苗的成分。
附图说明
图1(HEXA脂质的化学结构)-显示了如本文所述的本发明HEXA脂质化合物的结构，即脂质化合物C1(图1A)HEXA-C4DE-PipSS、脂质化合物C2(图1B)HEXA-C5DE-PipSS、脂质化合物C3(图1C)HEXA-C6DE-PipSS、脂质化合物C4(Fig.1D)HEXA-C7DE-PipSS、脂质化合物C5(图1E)HEXA-C8DE-PipSS、脂质化合物C6(图1F)HEXACA-C3ME-PipSS、脂质化合物C7(图1G)HEXACA-C4ME-PipSS、脂质化合物C8(图1H)HEXACA-C6ME-PipSS、脂质化合物C9(图1I)HEXACA-C8ME-PipSS(完整细节见实施例2.1)。
图2(HEXA脂质的质子化分布/pKa)-显示了本发明HEXA脂质化合物的质子化分布/pKa-通过TNS(染料2-对-甲苯胺基萘-6-磺酸酯)荧光测量质子化程度。图2A在组合物1(DSPC)中LNP1、LNP2、LNP3和LNP4的TNS荧光。图2B在组合物1(DSPC)中LNP5、LNP6、LNP7以及GN01的TNS荧光。图2C在组合物21(DPhyPE或4ME 16:0PE)中LNP8、LNP9、LNP10和LNP11的TNS荧光。图2D在组合物2(DPhyPE)中LNP12、LNP13、LNP14以及GN01的TNS荧光。图2E LNP15(在组合物1-DSPC中)、LNP16(在组合物2-DPhyPE中)、LNP17(在组合物2-DSPC中)、LNP 18(在组合物2-DPhyPE中)和GN01的TNS荧光(完整细节见实施例2.1.2/表Ex-4)。
图3(HEAD脂质的结构)-显示了如本文所述的本发明HEAD脂质化合物的结构(完整细节见实施例2.1/表Ex-6)，即脂质化合物CISE(图3A)、脂质化合物CPZE(图3B)、脂质化合物ESTER(图3C)。
图4(HEXA脂质的质子化分布/pKa)-显示出本发明HEAD脂质化合物的质子化分布/pKa-通过TNS(染料2-对-甲苯胺基萘-6-磺酸酯)荧光测量质子化程度。图4A在组合物A(DSPC)和组合物B(DPhyPE)中的HEAD脂质CISE与GN01比较的TNS荧光。图4B在组合物A(DSPC)和组合物B(DPhyPE)中的HEAD脂质CPZE与GN01比较的TNS荧光。图4C在组合物A(DSPC)和组合物B(DPhyPE)中的HEAD脂质ESTER与GN01比较的TNS荧光(完整细节见实施例2.2.2/表Ex-9)。
图5(HEXA脂质1至7在HeLa和HepG2中的PpLuc表达)-使用组合物1或2将HEXA脂质1至7配制成LNP，并使用PpLuc mRNA将其转染到HeLa细胞或HepG2细胞中。转染24小时后测量相对光单位(RLU)。图5A将LNP1至LNP7(组合物1-DSPC)以及GN01转染到HeLa细胞中。图5B将LNP8至LNP14(组合物2-DPhyPE)以及GN01转染到HeLa细胞中。图5C将LNP1至LNP7(组合物1-DSPC)以及GN01转染到HepG2细胞中。图5D将LNP8至LNP14(组合物2-DPhyPE)以及GN01转染到HepG2细胞中。即，显示用脂质和组合物配制的mRNA在HeLa和小鼠中表现出非常好甚至优越的PpLuc表达(完整细节见实施例3.1.1)。
图6(HEAD脂质在HeLa中的PpLuc表达)-显示，根据实施例3.1.1和图5，包含DPhyPE的组合物再次提供比DSPC明显的优势，迄今为止，DSPC在几乎所有最先进的LNP组合物中用作标准中性脂质-使用组合物A或B将HEAD脂质CISE、CPZE和ESTER配制成LNPs，并使用PpLucmRNA将其转染到HeLa细胞中。转染24小时后测量相对光单位(RLU)(完整细节见实施例3.2.1)。
图7(HEXA脂质1至7在HeLa细胞中的hEPO表达)-显示出治疗后在HeLa细胞中良好的hEpo体外表达-使用组合物2-DphyPE制备为LNPs的HEXA脂质和GN01用编码hEPO的mRNA配制并转染到HeLa细胞中。转染24小时后进行hEpo ELISA，显示转染效率(完整细节见实施例4.1.1)。
图8(脂质1至7在小鼠的hEPO表达)-显示在注射后6小时和24小时本发明组合物的体内分析也给出了明显的高hEpo表达-使用组合物2-DPhyPE制备为LNPs的HEXA脂质和GN01用编码hEPO的mRNA配制并以0.5mg/kg注射到Balb/C小鼠(每组5只)体内。采用ELISA法测定注射后6小时和24小时血浆中HsEpo水平(完整细节见实施例4.1.1)。
图9(HEXA脂质-肝酶的耐受性)-显示，与缓冲液对照组相比，没有一只受试动物显示出显著升高的AST和ALT肝酶活性-为了分析HEXA脂质的耐受性，在向Balb/C小鼠静脉内转染相应的LNP后24小时测量ALT和AST水平。图9A与缓冲液相比，含有HEXA脂质1至9的LNP和GN01的ALT和AST水平。图9B与缓冲液相比，脂质2m/m比率(m/m 20、m/m 30、m/m 40)和GN01的ALT和AST水平(完整细节见实施例4.1.2)。
图10(HEXA脂质的耐受性-免疫刺激)-显示，所测试的脂质化合物均未诱导细胞因子水平显著升高-为了分析HEXA脂质的免疫刺激性质，将含有HEXA脂质的LNPs和GN01 LNPs注射到Balb/C小鼠体内，对6小时后从小鼠抽取的血清样本进行CBA分析。通过ELISA测定血清中IFN-α水平。图10A HEXA脂质1至7和GN01的MCP-1。图10B HEXA脂质1至7和GN01的IL-6。图10C HEXA脂质1至7和GN01的MP1-β。图10D HEXA脂质1至7和GN01的INF-α。图10E HEXA脂质8、9和脂质2m/m比率(m/m 20、m/m 30、m/m 40)和GN01的MCP-1。图10F HEXA脂质8、9和脂质2m/m比率(m/m 20、m/m 30、m/m 40)和GN01的IL-6。图10G HEXA脂质8、9和脂质2m/m比率(m/m 20、m/m 30、m/m 40)和GN01的MP1-β。图10H HEXA脂质8、9和脂质2m/m比率(m/m 20、m/m 30、m/m 40)和GN01的INF-α(完整细节见实施例4.1.2)。
图11(LNP用于预防性和治疗性疫苗方法-肿瘤抗原Trp2皮内注射)-显示，使用含有trp2 mRNA的GN01、GN02和CISE LNP进行的疫苗接种(完整细节见实施例4.2.1)显示出稳定的IgG1和IgG2滴度(图11A和11B)，并且GN01、GN02和CISE LNP显示出低的T细胞应答(图11C和11D)-即，C57/BL6小鼠背部皮内注射编码肿瘤抗原Trp2和GN01、GN02或CISE的配制的mRNA。在第0天、第7天和第14天进行免疫接种。在首次疫苗接种后14小时采集血样，21天采集血液和器官样本。用ELISA检测T细胞应答和体液免疫应答。图11A IgG1终点滴度。图11BIgG2a[b]终点滴度。图11C CD4+细胞的％TNFα+/IFNγ+。图11D CD8+细胞的％TNFα+/IFNγ+(完整细节见实施例4.2.1)。
图12.1(HEXA脂质-肝酶的耐受性)-显示，与缓冲液对照组相比，没有一只受试动物显示出显著升高的AST和ALT肝酶活性-为了分析HEXA脂质的耐受性，在静脉内转染Balb/C小鼠24小时后测量ALT和AST水平。测量HEAD脂质ESTER(m/m 40)和CPZE(m/m 20)的ALT和AST水平，并与CISE/脂质2(m/m 30)、脂质2(m/m 30)、GN01和缓冲液的水平进行比较。使用不同的摩尔/质量(m/m)比(m/m 20、m/m 30、m/m 40)(完整细节见实施例4.2.2)。
图12.2(HEXA脂质的耐受性-免疫刺激)-显示，所测试的脂质化合物均未诱导细胞因子水平显著升高-为了分析HEAD脂质(CPZE，ESTER)与HEXA(脂质2)、GN01以及两者的混合物(CISE/脂质2)的免疫刺激性质，将HEXA脂质注射到Balb/C小鼠体内，6小时后对从小鼠抽取的血清样本进行CBA分析。通过ELISA确定血清中IFN-α水平。图12.2A MCP-1。图12.2BIL-6。图12.2C MP1-β。图12.2D INF-α(完整细节见实施例4.2.2)。
图13(本发明LNP在长期储存后的稳定性)-显示了在4℃和-80℃长期储存的GN01LNP的完整性和生物物理性质分析。很明显，颗粒和RNA是稳定的，未观察到显著差异-即凝胶电泳后琼脂糖凝胶上可以显示LNP的生物物理性质和mRNA完整性的变化。GN01 LNPs以hEPO mRNA配制，并在4℃和-80℃储存1.5或6个月。在凝胶电泳分析中，LNP被破坏，因此加入的mRNA可以显示在凝胶上。1.5个月后(A)，6个月后(B)-分解条件1(肝素和triton组合用于分解LNP；图中C1)，分解条件2(肝素和
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组合并加热至45℃持续15分钟用于分解LNP；图中C2)(完整细节见实施例5.1)。
图14.1(GN01在-80储存10周后的生物活性)-显示了储存10周后对GN01配制的mRNA的分析，与储存1周相比，注射后6小时和24小时的表达效率更高-即通过ELISA评估配制的GN01的生物活性。GN01 LNPs用hEPO mRNA配制，并分别冷冻1周和10周。对Balb/C小鼠(5只/组)进行静脉内注射。在注射后6小时和24小时采集血浆样本并进行分析(完整细节见实施例5.2)。
图14.2(不同F/T循环后GN01 LNP的生物活性)-显示了第二次评估，其中血浆样品在一次冷冻/解冻循环(1F/T)后进行分析，与2F/T循环后的血浆样品(均在-80℃储存1周后)进行比较-结果是HsEpo的生物活性可显示用于所有测试方法，即通过ELISA评估配制的GN01的生物活性。GN01 LNPs用hEPO mRNA配制，冷冻1周，并静脉内注射到Balb/C小鼠(5只/组)体内。在1个F/T循环(A)和2个F/T循环(B)后分析Elisa血浆水平(完整细节见实施例5.2)。
图15.1A和15.1B(磷脂成分的变化及其对本发明组合物的影响)-显示，与标准中性脂质DSPC相比，加入DPhyPE可导致更高的表达-即使用不同的磷脂(DPhyPE、DSPC、DPhyPE+DSPC(1+1))生成LNP。图15.1A脂质1(脂质化合物C1)和GN01 LNPs在PpLuc mRNA中配制并转染到HeLa细胞中。转染后24小时通过测量RLU强度分析转染效率。图15.1B通过GN01和含不同磷脂的包含脂质化合物C1的LNP的TNS(染料2-p-甲苯胺基萘-6-磺酸酯)荧光测量质子化程度点线＝GN01；短划线＝DPhyPE；标准线＝DSPC，从短划线向右的阶梯状线＝DSPC/DPhyPE(完整细节见实施例6)。
图15.2(PEG成分的变化及其对本发明组合物的影响)-显示包含具有较短烷基链(C8尾，C8-神经酰胺-PEG，在图中指示为Cer8)的聚合物结合脂质的组合物比包含较长烷基链(C14＝C14DMG-PEG＝1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000))的聚合物结合脂质的组合物更有效＝在HepG2细胞中的PpLuc表达-填充条显示1小时后的结果，空心条显示4小时后的结果(完整细节见实施例7)。
图16(单次静脉内注射后抗狂犬病mAb表达GN01)-显示单次静脉内注射后在GN01LNP中配制的抗狂犬病单克隆抗体的表达-显然，静脉内注射后6小时和24小时可检测到非常强的抗狂犬病mAb表达(完整细节见实施例8)。
图17(GN01和GN02在体内的免疫原性-T细胞应答-VNT分析)-图17A显示在初次疫苗接种后的第35天，使用5μg GN01-LNP和GN02-LNP配制的RABV-G-mRNA进行单次肌肉内免疫接种，在所有动物中诱导出非常强的VNT，远高于0.5IU/ml的保护滴度。图17B和17C显示本发明的GN01-LNP和GN02-LNP配制的RABV-G mRNA疫苗在疫苗接种后诱导特异性细胞应答，在对照LNP疫苗接种的动物中未观察到这种效应。对mRNA制剂GN01和GN02均观察到RABV-G-特异性CD4+ T细胞(图17B)。RABV-G-特异性CD8+ T(图17C)也是如此(完整细节见实施例9)。
图18(GN01用于monotope疫苗方法)-显示可以观察到GN01配制的RNA的高致反应性；通过GN01 LNP接种含有PADRE的monotope结构，脾细胞数量增加(图18A)。monotope结构与GN01制剂组合并皮内施用，产生了非常有效的CD8 T细胞应答(图18B、18C和18D)(完整细节见实施例10)。
图19(GN01用于流感/流感疫苗接种-H3N2)-显示在初次疫苗接种后的第21天，在所有动物中，用10μg GN01 LNP配制的HA mRNA进行单次肌肉内免疫接种，诱导的保护性HI滴度远高于40的保护性滴度，并用10μg GN01 LNP配制的HA mRNA进行增强，诱导体液免疫应答的倍数增加(完整细节见实施例11)。
图20(GN01在牛犊动物模型中用于狂犬病测试)-显示用GN01配制的RABV-G编码mRNA对牛犊进行肌肉内疫苗接种，在初次疫苗接种后的14天已经产生了非常强的中和抗体诱导，且已经使用仅30μG mRNA的剂量(用短划线表示0.5IU/ml的世界卫生组织标准；空心条＝Rabisin对照，实心条＝GN01配制的mRNA)(完整细节见实施例12)。
图21.1(GN01用于体内疟疾疫苗接种-终点滴度)-通过ELISA分析显示，GN01配制的编码CSP的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了非常强烈的体液免疫应答(图21.1A–包被：[NANP]7肽，初次接种后21天和35天的IgG1和IgG2a终点滴度；图21.1B–包被C末端肽，初次接种后21天和35天的IgG1和IgG2a终点滴度；组1：具有CSP疫苗的GN01-LNP；组2：具有无关mRNA的GN01-LNP)(完整细节见实施例13)。
图21.2(GN01用于体内疟疾疫苗接种-ICS)显示使用细胞内细胞因子染色分析(疫苗接种后35天)，GN01配制的编码CSP的mRNA疟疾疫苗诱导了小鼠的细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。组1：具有CSP疫苗的GN01-LNP；组2：具有无关mRNA的GN01-LNP(完整细节见实施例13)。
图22(GN01用于FGF21的体内表达)显示在通过静脉内注射给小鼠施用0.25mg/kg的低剂量后，在本发明的LNP中配制的FGF21mRNA产生高浓度FGF21(完整细节见实施例14)。
图23(GN01用于FGF21的体内表达)显示在通过静脉内注射给小鼠施用1mg/kg的高剂量后，在本发明的LNP中配制的FGF21mRNA产生极高浓度FGF21(完整细节见实施例14)。
图24(HEXA脂质的化学结构)-显示如本文所述的本发明HEXA脂质化合物的结构，即，脂质化合物C24(图24A)HEXA-C5DE-反向的PipSS和脂质化合物C25(图24B)HEXA-C5DE-Pip-C3硫醚(完整细节见实施例20.1)。
图25(HEAD脂质的结构)-显示了本文所述的本发明HEAD脂质化合物的结构(完整细节见实施例20.2)，即脂质化合物THIOETHER(图25A)和脂质化合物C3SS(图25B)。
图26(含C2的LNP在体内T细胞应答的免疫原性-VNT分析)-该图显示，在初次疫苗接种后的第21天，已经用5μg LNP(包含C2)-配制的RABV-G-mRNA进行单次肌肉内免疫接种在所有动物中诱导出非常强的VNT，远高于0.5IU/ml的保护滴度。完整细节可在实施例21中找到。
图27(含有不同阳离子脂质的LNP在体内的免疫原性-T细胞应答-VNT分析)-图27A显示在初次疫苗接种后的第21天，已经用5μg LNP-配制的RABV-G-mRNA进行单次肌肉内免疫接种在所有动物中诱导了非常强的VNT，远高于0.5IU/ml的保护滴度。如实施例21所示，使用根据本发明的不同阳离子脂质配制LNP。图27B和27C显示，与未受刺激的脾细胞相比，本发明的LNP配制的RABV-G mRNA疫苗在再刺激的脾细胞中进行疫苗接种后诱导特异性细胞应答。对于(i)再刺激和(ii)未刺激设置显示了RABV-G-特异性CD4+ T细胞(图27B)和RABV-G-特异性CD8+ T细胞(图27C)。完整细节可在实施例21中找到。
图28(含THIOETHER的LNP在体内T细胞应答的免疫原性-VNT分析)-该图显示，在初次接种后第21天，使用1μg LNP(包含THIOETHER)配制的RABV-G-mRNA进行单次肌肉内免疫接种在所有动物中诱导出非常强的VNT，远高于0.5IU/ml的保护滴度。完整细节可在实施例21中找到。
图29(GN02样LNP用于体内疟疾疫苗接种-ICS)显示使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，编码CSP的GN02样配制的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD4+T细胞应答)。RABV-G-特异性CD4+ T细胞显示为(i)再刺激和(ii)未刺激设置。完整细节可在实施例22中找到。
图30(GN02样LNPs用于体内疟疾疫苗接种-ICS)显示使用细胞内细胞因子染色试验(疫苗接种后第35天)，编码CSP的GN02样配制的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+T细胞应答)。RABV-G-特异性CD8+ T细胞显示为(i)再刺激和(ii)未刺激设置。完整细节可在实施例22中找到。
图31(GN02样LNPs用于体内疟疾疫苗接种-IgG总滴度)-显示出使用ELISA分析(包被：[NANP]7肽，初次注射后第35天的IgG总终点滴度)，编码CSP的GN02样mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了非常强烈的体液免疫应答(完整细节可在实施例22中找到)。
图32(含有本发明不同阳离子脂质的LNP用于体内疟疾疫苗接种-ICS)显示使用细胞内细胞因子染色分析(疫苗接种后第35天)，编码CSP的LNP配制的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD4+T细胞应答显示为(i)再刺激和(ii)未刺激设置)。完整细节可在实施例22中找到。
图33(含有本发明不同阳离子脂质的LNP用于体内疟疾疫苗接种-ICS)显示使用细胞内细胞因子染色分析(疫苗接种后第35天)，编码CSP的LNP配制的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了细胞免疫应答(CD8+T细胞应答显示为(i)再刺激和(ii)未刺激设置)。完整细节可在实施例22中找到。
图34(含有本发明不同阳离子脂质的LNP用于体内疟疾疫苗接种-IgG总滴度)-显示出使用ELISA分析(包被：[NANP]7肽，初次注射后第35天的IgG总终点滴度)，编码CSP的LNP配制的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了非常强烈的体液免疫应答。(完整细节可在实施例22中找到)。
图35(含有本发明C26-脂质的LNP用于体内疟疾疫苗接种-IgG1滴度)-显示出使用ELISA分析(包被：[NANP]7肽，初次注射后第35天的IgG1终点滴度)，编码CSP的LNP配制的mRNA疟疾疫苗在小鼠中诱导了非常强烈的体液免疫应答。(完整细节可在实施例22中找到)。
具体实施方式
本发明基于本发明人令人惊讶的发现，即新型阳离子脂质和/或脂质纳米颗粒(LNP)的使用在将核酸(如mRNA)递送至活生物体(如人类个体)非常有效。特别是，这种核酸在细胞内的递送得到增强。这使得发明者能够制造出例如改进的疫苗，这种疫苗能够递送编码抗原肽或蛋白质的mRNA化合物，并以极低的剂量非常有效地诱导抗原特异性免疫应答。本发明实现的进一步优点在于，相当令人惊讶的是，根据本发明的方面和实施方式，本发明人发现了一类用于在体内递送mRNA疫苗的制剂，其导致显著增强的、并且在许多方面协同的免疫应答，包括增强的抗原生成和具有中和能力的功能性抗体生成。与其他类基于脂质的制剂中使用的mRNA剂量相比，即使施用显著降低的mRNA剂量时也可以实现这些结果。本发明的制剂已显示出显著的意外体内免疫应答，足以确定功能性mRNA疫苗作为预防剂和治疗剂的效力。通常，自我复制RNA疫苗依靠病毒复制途径将足够的RNA递送至细胞以产生免疫原性应答——本发明的制剂不需要病毒复制来产生足够的蛋白质以产生强烈的免疫应答。因此，优选地，本发明的mRNA不是自我复制的RNA，并且不包含病毒复制所需的成分。
脂质组合物
在第一方面中，本发明涉及包含下文所述阳离子脂质的组合物。公开的阳离子脂质的所有选择和优选项本身也适用于本发明该方面的组合物。换言之，阳离子脂质的具体公开实施方式，特别是优选的阳离子脂质，应理解为也定义了根据本发明的组合物的具体优选实施方式，即，其特征在于其包含根据本文所述的特定选择之一的阳离子脂质的组合物。组合物可包含下文进一步描述的其他活性和/或无活性赋形剂。在一个特定实施方式中，除阳离子脂质外，组合物还包含一种或多种选自由以下物质组成的组的脂质：(a)类固醇；(b)中性脂质；和(C)聚合物结合的脂质，优选聚乙二醇化脂质。
阳离子脂质
阳离子脂质优选可阳离子化，即当pH值降低到脂质可电离基团的pKa以下时，阳离子脂质会质子化，但在较高的pH值下，阳离子脂质会逐渐变得为更中性。当带正电荷时，脂质便能与带负电荷的核酸结合。在某些实施方式中，阳离子脂质包含两性离子脂质，该两性离子脂质在pH降低时带正电荷。
在一个方面中，本发明提供一种新型阳离子脂质，其定义为根据式(I)的化合物：
Ra-A-Rb 式(I)
其中
Ra选自：
Figure BDA0003701042630000371
Figure BDA0003701042630000372
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure BDA0003701042630000373
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，或
-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立，
任选地前提是如果R1、R2和R5均是直链未被取代的乙烷二基，A是-S-S-，且Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630000381
在另一个方面中，本发明涉及可用于将核酸递送至活细胞的新型阳离子脂质。阳离子脂质是根据式(I)的化合物：
Ra-A-Rb 式(I)
其中
Ra选自：
Figure BDA0003701042630000382
Figure BDA0003701042630000383
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure BDA0003701042630000391
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，或
-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-S-C(O)-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立，
任选地前提是如果R1、R2和R5均是乙烷二基，A是-S-S-，且Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630000392
在又一个方面，方面A中，本发明提供一种新型阳离子脂质，其定义为根据式(I)的化合物：
Ra-A-Rb 式(I)
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中
Ra选自：
Figure BDA0003701042630000393
Figure BDA0003701042630000401
或-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure BDA0003701042630000402
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4或-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基，其中每个可取代的碳原子未被取代或被一个或多个C1-C4烷基、C1-C4亚烯基、C3-C8环亚烷基或C3-C8环亚烯基取代；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基，其中具有12至36个碳原子的亲脂性取代基是具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基，或源自α-生育酚；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是与氢原子(CH)结合的碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立；
任选地前提是如果(i)R3作为-R5-C(O)-O-存在，(ii)R1和R2是直链未被取代的乙烷二基，(iii)R5是直链未被取代的乙烷二基、直链未被取代的丙烷二基或直链未被取代的丁烷二基，(iv)A是-S-S-，和(v)Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630000411
且另一个前提是如果(i)R3不存在，(ii)R1和R2是直链未被取代的乙烷二基，(iii)A是-S-S-，和(iv)Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630000412
且不是
Figure BDA0003701042630000413
或者，作为上述前提的替代，任选地前提是阳离子脂质不是选自由以下组成的组的脂质
Figure BDA0003701042630000414
Figure BDA0003701042630000421
在新型阳离子脂质中，可降解/可生物降解部分A连接可能为相同或不同的两种结构Ra和Rb。Ra和Rb中的每一个都包括至少一个碱性(即阳离子)部分，该部分包括三级氮原子。Ra和Rb中的至少一个具有实质上亲脂的尾部结构和至少一个酯基。
可降解/可生物降解部分A可选自以下官能团：-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-。在一个优选实施方式中，A是包含一个或多个硫原子的部分或基团，例如-S-、-S-S-或-S-C(O)-N(H)-。在另一个优选实施方式中，A是二硫基(-S-S-)，其中阳离子脂质可表示为Ra-S-S-Rb，其中Ra和Rb可按照上述定义选择。在另一个优选的实施方式中，特别是以上的方面A，A是-S-，其中阳离子脂质可表示为Ra-S-Rb，其中Ra和Rb可按照上述定义选择。
不希望受到理论的约束，本发明人目前认为部分A的可降解性可能在新脂质的显著的生物学效应中起关键作用。例如，如果A是二硫化物部分，且如果脂质与下文进一步详细描述的其他赋形剂一起使用以形成装载有核酸化合物作为载荷的脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)，则该脂质体或LNP将通过内吞作用有效地被细胞吸收。在胞内小泡内，阳离子脂质的二硫基可能会(可能在谷胱甘肽的存在下)还原为两个硫醇部分，这同时导致阳离子脂质分子分裂为两个较小的阳离子种类。潜在地，细胞中高浓度的硫醇也可能导致脂质进一步降解，例如通过硫酯化作用。
由于Ra和Rb可以任选地彼此不同，因此它们可以独立地选择。如上所述，Ra可选自
Figure BDA0003701042630000431
优选地X为CH，
或-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；且Rb可选自
Figure BDA0003701042630000432
优选地X为CH，
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4或-R1-N(CH3)2。
此外，如上所述，Ra可选自
Figure BDA0003701042630000433
Figure BDA0003701042630000434
优选地X为CH，
且Rb可选自
Figure BDA0003701042630000435
优选地X为CH。
在一个优选实施方式中，Ra和Rb中的至少一个分别在R2和A或R1之间包含哌啶衍生的或哌嗪衍生的六元环结构。这意味着至少有一个三元氮原子存在并位于部分A附近，并通过在任一酯基中的至少一个间隔基(R2)与脂溶性尾部结构R4分离。酯基(或多个基团，如果存在R3)的潜在优势涉及在生理环境中(例如在细胞内环境中)进一步增强的脂质的降解性，这是由一个或多个水解不稳定的酯键提供的。
在另一个实施方式中，Ra和Rb均包含哌啶衍生的或哌嗪衍生的六元环结构。还优选一种阳离子脂质，其中Ra和Rb均为
Figure BDA0003701042630000441
优选地X为CH，
或者独立选择，或者作为选择Ra和Rb为相同。
如前所述，R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基。丙烷二基优选是正丙烷二基，即，-CH2-CH2-CH2-，其中一个或多个氢原子任选地被取代。丁烷二基优选是正丁烷二基，即-CH2-CH2-CH2-CH2-，其中一个或多个氢原子任选地被取代。然而，优选地，乙烷二基、丙烷二基或丁烷二基的不超过一个氢原子被取代。在一些实施方式中，Ra中的R1取代基和Rb中的R1取代基为相同或不同。在一些实施方式中，Ra中的R1取代基和Rb中的R1取代基均为乙烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R1取代基和Rb中的R1取代基均为丙烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R1取代基和Rb中的R1取代基均为丁烷二基。在一些实施方式中，Ra中的R1取代基是乙烷二基，Rb中的R1取代基是丙烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R1取代基是丙烷二基，Rb中的R1取代基是乙烷二基。在一些实施方式中，Ra中的R1取代基是丁烷二基，Rb中的R1取代基是丙烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R1取代基是丁烷二基，Rb中的R1取代基是乙烷二基。在某些其他实施方式中，特别是当涉及R1时，术语“任选地被取代”表示每个可取代的碳原子可独立地被一个或多个C1-C4烷基、C1-C4亚烯基、C3-C8环亚烷基或C3-C8环亚烯基取代。
类似地，在一些实施方式中，Ra中的R2取代基和Rb中的R2取代基为相同或不同。在一些实施方式中，Ra中的R2取代基和Rb中的R2取代基均为乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基、戊烷二基、己烷二基、庚烷二基或辛烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R2取代基是丙烷二基且Rb中的R2取代基是庚烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R2取代基是庚烷二基，Rb中的R2取代基是丙烷二基。在一些实施方式中，特别是以上的方面A，Ra中的R2取代基和Rb中的R2取代基均为乙烷二基。
此外，在一些实施方式中，其中Ra和Rb中均存在R3，Ra中的R5取代基和Rb中的R5取代基为相同或不同。在一些实施方式中，Ra中的R5取代基和Rb中的R5取代基均为甲烷二基、乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基、戊烷二基或己烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R5取代基是乙烷二基，Rb中的R5取代基是己烷二基。在其他实施方式中，Ra中的R5取代基是己烷二基，Rb中的R5取代基是乙烷二基。在一些实施方式中，特别是以上的方面A，其中Ra和Rb中均存在R3，Ra中的R5取代基和Rb中的R5取代基均为乙烷二基。
取代基可以是任何合适的取代基，即任何直链或支链烷基、芳基、杂烷基、杂芳香结构，其可以任选地包含其他官能团，例如酯基或酰胺基。
特别是，如果Ra和/或Rb选择-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，则优选的是R1是被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基，例如被取代的丙烷二基。如果使用本身不包含阳离子部分(例如氨基)的-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，则优选的是R1的取代基包含该氨基；任选地，这种氨基可以是环状结构的一部分，例如源自哌啶或哌嗪的六元环结构。任选地，以阳离子氮原子为特征的环结构通过可降解基团(例如酯基)连接至乙烷二基或丙烷二基。
在一个实施方式中，其中Ra是
Figure BDA0003701042630000451
优选地X为CH，
和/或其中Rb是
Figure BDA0003701042630000452
优选地X为CH，
R2用作各自的碱性哌啶衍生的或哌嗪衍生的环结构和酯基之间的连接物或间隔基。如上所述，R2被定义为具有2至8个碳原子的烷烃二基。R2可以为直链或支链，或相反(即除任何分支外)，它优选是未被取代的。在一个实施方式中，R2是具有2、3、4、5、6、7或8个碳原子的直链未被取代的烷烃二基。在另一个实施方式中，R2是具有2至6个碳原子的直链未被取代的烷烃二基。在进一步优选的实施方式中，R2是直链未被取代的乙烷二基或丙烷二基。例如，Ra和Rb均可以为
Figure BDA0003701042630000461
优选地X为CH，
其中R2选自具有2至6个碳原子的直链未被取代的烷烃二基，例如乙烷二基或丙烷二基。
在另一个实施方式中，其中Ra是
Figure BDA0003701042630000462
Figure BDA0003701042630000463
优选地X为CH，
和/或其中Rb是
Figure BDA0003701042630000464
优选地X为CH，
R2用作各自的碱性哌啶衍生的或哌嗪衍生的环结构和酯基之间的连接物或间隔基。如上所述，R2被定义为具有2至8个碳原子的烷烃二基。R2可以为直链或支链，或相反(即除任何分支外)，它优选是未被取代的。在一个实施方式中，R2是具有2、3、4、5、6、7或8个碳原子的直链未被取代的烷烃二基。在另一个实施方式中，R2是具有2至6个碳原子的直链未被取代的烷烃二基。在进一步优选的实施方式中，R2是直链未被取代的乙烷二基或丙烷二基。例如，Ra和Rb均可以为
Figure BDA0003701042630000471
优选地X为CH，
其中R2选自具有2至6个碳原子的直链未被取代的烷烃二基，例如乙烷二基或丙烷二基。
任选的结构R3包括酯基，其可进一步增强阳离子脂质在生理(例如细胞内)条件下降解为更小分子物质的能力。如上所述，R3(如果存在)被特别定义为-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-，其中R5可以是由具有1至6个碳原子的烷烃二基组成的间隔基。换言之，酯基可以有两种取向。优选地，R5是具有1、2、3、4、5或6个碳原子的未被取代的直链烷烃二基。在另一个优选实施方式中，R3存在，且R5是具有2或3个碳原子、或具有3至6个碳原子的未被取代的直链烷烃二基。
R4被定义为具有12至36个碳原子的亲脂性取代基。Ra和任选Rb(除非Rb是-R1-N(CH3)2)的“尾”末端被认为提供了分子能够穿过生物膜通常所需的亲脂性程度。因此，R4原则上可具有实质上亲脂的任何结构。例如，烃结构是亲脂的。在一个实施方式中，R4在其至少一次出现时可仅由碳原子和氢原子组成。在一个优选的实施方式中，R4表示直链或支链烷基或烯基，优选具有12至25个碳原子。支链烷基或烯基可任选地具有多个侧链，例如2、3、4或更多个甲基侧链。在另一个实施方式中，R4可为烷基或烯基，包括具有例如2至10个碳原子的单烷基或烯基侧链。例如，R4可以是1-正己基-正壬基(或7-正十五烷基)或2-正己基-正癸基。在其他实施方式中，亲脂性取代基可任选地包含一个或多个杂原子，例如O、S或N。在其他实施方式中，亲脂性取代基可任选地包括一个或多个饱和、不饱和或芳香环结构，其可任选地包含一个或多个杂原子，例如O、S或N。
R4还可以包含少量杂原子，例如氧原子，只要保持主要亲脂性。在一个实施方式中，R4包含一个或多个氧原子，不含其他杂原子。R4还可包含环状结构，例如任选地包含一个或多个氧原子的芳香族或脂肪族环结构。如果存在，则优选的是杂原子和/或环状结构朝向任选的R3结构，而不是朝向“尾”的末端。在一个实施方式中，R4是源自生育酚或生育三烯酚的亲脂性结构。在一个实施方式中，R4是源自α-生育酚的亲脂性结构，特别是
Figure BDA0003701042630000481
特别是，如果不是所有R1、R2和R5都是直链未被取代的乙烷二基，则A是-S-S-，且Ra和Rb为相同。
本文所指的“源自生育酚或生育三烯酚的亲脂性基团”包括生育酚和生育三烯酚的衍生物，特别是具有以下方案1所示结构的衍生物，即源自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚的衍生物。
Figure BDA0003701042630000482
Figure BDA0003701042630000483
方案1：生育酚的衍生物具有饱和植基链，而生育三烯酚的衍生物具有多不饱和植基链。对于生育酚的衍生物和生育三烯酚的衍生物这二者，亚型由R1和R2定义，其选自CH3和H。因此，如图所示，如果例如R1为CH3且R2为CH3，则所得衍生物分别为生育酚和生育三烯酚的α亚型(分别称为α-生育酚的衍生物和α-生育三烯酚的衍生物)。OH基团当然不存在于衍生物中，因为这是连接点，如左边的两个结构所示。
在优选的实施方式中，特别是上述方面A，R4是具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基，或是选自由本文中方案1所示的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚的衍生物组成的组的亲脂性基团。
在另一个优选的实施方式中，特别是上述方面A，R4是具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基，或
Figure BDA0003701042630000491
在另一个优选的实施方式中，特别是上述方面A，R4选自由以下物质组成的组
Figure BDA0003701042630000492
如前所述，X是碳原子或氮原子，在每次出现时独立选择。在一个实施方式中，X是碳原子。在另一个实施方式中，Ra和Rb均是包含X的结构，其中优选地X在每次出现时是碳原子。作为选择，X是氮原子；例如，Ra和Rb均是包含X的结构，且在每次出现时，X选择氮原子。每当本文中提及X是碳原子时，这被理解为是指与氢原子，即CH结合的碳原子。在本文的一些实例中，已经提及X是CH。
根据另一个具体实施方式，提供具有式(I)的阳离子脂质，其中Ra选自
Figure BDA0003701042630000501
优选地X为CH，
或-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
其中Rb选自
Figure BDA0003701042630000502
优选地X为CH，
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4或-R1-N(CH3)2；
其中A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
其中R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
其中R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
其中R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
其中R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基；
其中R5是具有3至6个碳原子的烷烃二基；
其中X是碳原子或氮原子；
且其中所有的选择彼此独立。任选地，由R2和/或R5表示的烷烃二基是直链且未被取代的。
根据另一具体实施方式，提供式(I)的阳离子脂质，其中Ra选自
Figure BDA0003701042630000503
优选地X为CH，
或-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
其中Rb选自
Figure BDA0003701042630000511
优选地X为CH，
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4或-R1-N(CH3)2；
其中A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
其中R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
其中R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
其中R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
其中R4是具有12至25个碳原子的烷基或烯基；
其中R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
其中X是碳原子或氮原子；
且其中所有的选择彼此独立。任选地，由R2和/或R5表示的烷烃二基是直链且未被取代的。
此外，在另一个实施方式中，提供根据式(I)的阳离子脂质，其中
Ra和Rb选自：
Figure BDA0003701042630000512
优选地X为CH，或-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立，
任选地前提是，如果R1、R2和R5均为直链未被取代的乙烷二基，A是-S-S-，且Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630000521
在该实施方式中，由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的；任选地，R5包含2至6个碳原子，且Ra和Rb中的每一个是
Figure BDA0003701042630000522
优选地X为CH。
在另一个特定实施方式中，提供根据式(I)的阳离子脂质，其中Ra和Rb的每一个是：
Figure BDA0003701042630000523
优选地X为CH；
A是-S-S-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基；
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立，
任选地前提是，如果R1、R2和R5均为直链未被取代的乙烷二基，A是-S-S-，且Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630000531
同样，由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的。
又一个实施方式提供根据式(I)的阳离子脂质，其中Ra和Rb中的每一个是：
Figure BDA0003701042630000532
优选地X为CH；
A是-S-S-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
R4是具有12至25个碳原子的烷基或烯基；
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
且其中所有的选择彼此独立。
且其中由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的。
在另一个实施方式中，提供根据式(I)的阳离子脂质，其中Ra和Rb中的每一个是：
Figure BDA0003701042630000533
优选地X为CH；
A是-S-S-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
R4是选自以下基团的烷基：
Figure BDA0003701042630000541
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立，且其中由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的。
又一个实施方式涉及根据式(I)的阳离子脂质，其中Ra和Rb中的每一个是：
Figure BDA0003701042630000542
优选地X为CH；
A是-S-S-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
R4是：
Figure BDA0003701042630000543
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中Ra和Rb为相同，且所有的其他选择彼此独立，并且其中由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的。
在另一个实施方式中，本发明提供根据式(I)的阳离子脂质，其中Ra和Rb的每一个是：
Figure BDA0003701042630000551
优选地X为CH；
A是-S-S-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是-R5-C(O)-O-；
R4是：
Figure BDA0003701042630000552
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中Ra和Rb为相同，且所有的其他选择彼此独立，并且其中由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的。
根据又一个实施方式，本发明提供的阳离子脂质是式(I)的化合物，其中Ra和Rb的每一个是：
Figure BDA0003701042630000553
优选地X为CH；
A是-S-S-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是-R5-C(O)-O-；
R4是：
Figure BDA0003701042630000561
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子；
其中Ra和Rb为相同，且所有的其他选择彼此独立，并且其中由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的。
在另一个具体的实施方式中，本发明提供的阳离子脂质是根据式(I)的化合物，其中Ra和Rb的每一个是：
Figure BDA0003701042630000562
优选地X为CH；
A是-S-S-；
R1是乙烷二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是-R5-C(O)-O-；
R4是：
Figure BDA0003701042630000563
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子；
其中Ra和Rb为相同，且所有的其他选择彼此独立，并且其中由R2和/或R5表示的烷烃二基可以是直链且未被取代的；优选地，R1的乙烷二基也是直链且未被取代的。
在另一个优选实施方式中，阳离子脂质具有以下特征中的一个或多个，在每次出现时独立选择：
(i)R1是未被取代的乙烷二基、丙烷二基或丁烷二基；
(ii)R2是具有2至8个碳原子的直链、无支链的烷烃二基；
(iii)R3是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
(iv)R4是具有12至25个碳原子的烷基或烯基；
(v)R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；和/或
(vi)X是碳原子。
在另一个优选实施方式中，特别是上述方面A，R3存在且选自由-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-和R5-NH-C(O)O-组成的组；且R4是具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基。在该实施方式中，特别优选的是R3是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-。在该实施方式中，进一步优选的是R4选自由以下基团组成的组
Figure BDA0003701042630000571
在另一个优选的实施方式中，特别是上述方面A，A是-S-。在该实施方式中，优选的是Ra和Rb为相同，且为
Figure BDA0003701042630000572
X优选为CH。在该实施方式中可进一步优选的是R3存在且选自-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-。在该实施方式中还优选的是R4是
Figure BDA0003701042630000573
在该实施方式中可进一步优选的是Ra的R4和Rb的R4为相同。最后，在该实施方式中还优选的是R1、R2和R3中的一个或全部为具有1至6个碳原子、特别是具有2、3或3个碳原子的烷烃二基。
在又一个实施方式中，阳离子脂质优选选自表1中列出的阳离子脂质。
表1：根据式(I)的优选阳离子脂质-当被称为该表的具体脂质时，即提及脂质C1、脂质化合物1或C1
Figure BDA0003701042630000581
Figure BDA0003701042630000591
Figure BDA0003701042630000601
Figure BDA0003701042630000611
Figure BDA0003701042630000621
Figure BDA0003701042630000631
Figure BDA0003701042630000641
Figure BDA0003701042630000651
Figure BDA0003701042630000661
Figure BDA0003701042630000671
Figure BDA0003701042630000681
因此，本发明涉及包含上述阳离子脂质的组合物。例如，组合物可包含选自表1的化合物C1至C27的阳离子脂质。
在进一步的某些实施方式中，阳离子或阳离子化脂质可以是包含三级或四级氮/氨基或在选择性pH(例如生理pH)携带净正电荷的许多脂质种类中的任何一种。因此，在一个实施方式中，包含三级或四级氮/氨基的阳离子脂质或在生理pH携带净正电荷的阳离子脂质选自但不限于由N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)；N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)N-2-(精胺羧酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)；双十八烷基酰胺基甘氨酰基羧精胺(DOGS)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)；N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基)丙胺(DODMA)；和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)组成的组。
在另一个实施方式中，包含三级或四级氮/氨基的阳离子脂质或在生理pH携带净正电荷的阳离子脂质选自但不限于由氨基脂质组成的组。在另一个实施方式中，合适的氨基脂质包括WO 2012/016184 A2中描述的那些，其通过引用全文并入本文。[0320]在组合物中使用的其他合适的附加阳离子脂质包括基于胆固醇的阳离子脂质。
其他代表性氨基脂质包括但不限于
(i)具有下式的那些：
Figure BDA0003701042630000691
其中R1和R2为相同或不同，且独立地任选地被取代的C10-C24烷基、任选地被取代的C10-C24烯基、任选地被取代的C10-C24炔基或任选地被取代的C10-C24芳基；R3和R4为相同或不同，且独立地任选地被取代的C1-C6烷基、任选地被取代的C2-C6烯基或任选地被取代的C2-C6炔基，或R3和R4可结合形成4至6个碳原子和1或2个选自氮和氧的杂原子的任选地被取代的杂环；R5不存在或存在，且存在时为氢或C1-C6烷基；m、n和p为相同或不同且独立地为0或1，条件是m、n和p不同时为0；q是0、1、2、3或4；Y和Z为相同或不同且独立地为O、S或NH。在一个实施方式中，R1和R2各自为亚油烯基，并且氨基脂质是二亚油烯基氨基脂质；
或
(ii)选自由二亚油烯基氨基脂质；1,2-二亚油烯基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)；1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)；1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)；1,2-二亚油烯基硫基-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)；1-亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)；1,2-二亚油烯基氧基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)；1,2-二亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)；1,2-二亚油烯基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)；3-(N,N-二亚油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)；3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)；1,2-二亚油烯基氧-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)；2,2-二亚油烯基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)；和DLin-KC2-DMA(上述的DLin-K-DMA，其中n是2)组成的组的那些。
本文所述的阳离子脂质可以以盐的形式存在，例如酸加成盐，或者在某些情况下，有机和无机碱的盐，例如羧酸盐、磺酸盐和磷酸盐。所有此类盐均在本发明的范围内，提及的阳离子脂质和式(I)化合物及其亚群包括化合物的盐形式。
在另一个实施方式中，阳离子脂质的商业制剂可用于本发明。这些包括，例如，
Figure BDA0003701042630000701
(市售阳离子脂质体，包含DOTMA和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，来自GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y.)；
Figure BDA0003701042630000702
(市售阳离子脂质体，包含N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-(2-(精胺羧酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)和DOPE，来自GIBCO/BRL)；和
Figure BDA0003701042630000703
(市售阳离子脂质体，包含乙醇中的双十八烷基酰胺基甘氨酰基羧精胺(DOGS)，来自Promega Corp.,Madison,Wis.)。
在另一个实施方式中，组合物包含如WO20192269225 A1第[0320]和[0339]-[0340]段中所公开的咪唑胆固醇酯或“ICE”，其通过引用全文并入本文。其他合适的(阳离子)脂质公开于WO2009/086558、WO2009/127060、WO2010/048536、WO2010/054406、WO2010/088537、WO2010/129709、WO2011/153493、US2011/0256175、US2012/0128760、US2012/0027803、US8158601、WO2016118724、WO2016118725、WO2017070613、WO2017070620、WO2017099823和WO2017112865中；所有这些文献均通过引用全文并入本文。在一些实施方式中，阳离子脂质选自由WO2017049074、US9512073B2、WO2015200465、US20150376144中公开的98N12-5、C12-200和ckk-E12组成的组；所有这些文献均通过引用全文并入本文。
阳离子脂质可占本发明组合物或脂质纳米颗粒中存在的总脂质的从约20mol％至约70mol％或75mol％或从约45mol％至约65mol％或约20mol％、25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％、55mol％、60mol％、65mol％或约70mol％。在另一个实施方式中，脂质纳米颗粒包含约25％至约75％(以阳离子脂质的摩尔计)，例如，从约20％至约70％、从约35％至约65％、从约45％至约65％、约60％、约57.5％、约57.1％、约50％或约40％(以摩尔计)(基于脂质纳米颗粒中脂质的100％总摩尔)。
一般而言，根据本发明的组合物可包含其他赋形剂，例如一种或多种其他脂质。在一个实施方式中，组合物可包含另一阳离子脂质，即第二、第三等阳离子脂质。该另一种阳离子脂质可任选地为本文所公开的阳离子脂质。作为选择，它可以是适用于药物组合物的任何其他阳离子脂质，特别是用于包含选自核酸化合物的活性组分(例如mRNA)的组合物。
在一个特定实施方式中，该另一阳离子脂质是包含至少一个季氮原子的永久阳离子脂质。在上下文中，第一阳离子脂质优选可阳离子化而非永久阳离子化的脂质。
碱性阳离子脂质的药学上可接受的盐可源自无机酸或有机酸。例如，来自无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等，以及来自有机酸的盐，如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双氢萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、萘磺酸、苯磺酸、三氟乙酸等。药学上可接受的盐的进一步实例包括但不限于碱性残基的矿物或有机酸盐，例如胺；酸性残基的碱或有机盐，如羧酸；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐(camphorate)、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、硫酸月桂酯、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸酯、2-萘磺酸酯、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双氢萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲胺、四乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括由例如无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在水或有机溶剂中或二者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的清单见Remington'sPharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418、Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl andC.G.Wermuth(eds.),Wiley-VCH,2008，和Berge et al.,Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)，其中每一项均通过引用全文并入本文。
聚合物结合的脂质，聚乙二醇化脂质
在一些实施方式中，LNP包含脂质结合的，优选聚合物结合的脂质。术语“聚合物结合的脂质”是指同时包含脂质部分和聚合物部分的分子。优选地，聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质或PEG-脂质。术语“聚乙二醇化脂质”或“PEG-脂质”是指同时包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的并且包括PEG-DMG等。
在具体的实施方式中，聚合物结合的脂质定义为根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物或间隔基，且L是脂质部分。
亲水性聚合物部分P
根据式(II)的聚合物结合的脂质中的亲水性聚合物部分P可以是聚乙二醇(“PEG”)部分。在具体的实施方式中，PEG部分的平均分子质量在1kDa和3kDa之间，例如在1.5kDa至2.5kDa之间、1.7kDa至2.3kDa之间、1.8kDa至2.2kDa之间、1.9kDa至2.1kDa之间或2kDa。因此，PEG可以是通常被称为“PEG 2000”或“PEG 2k”的PEG，尽管也可以使用较短的“PEG 1000”和较长的“PEG 3000”。PEG部分通常包含线性聚合物链，但在一些实施方式中，PEG部分可包含支链聚合物链。作为选择，预期的PEG修饰脂质包括但不限于共价连接至脂质的长度高达2kDa、高达3kDa、高达4kDa或高达5kDa的聚乙二醇链。
在另一个实施方式中，聚合物结合的脂质中的亲水性聚合物部分P也可以是与上述亲水性聚合物部分不同的实质上亲水性聚合物，即，聚合物结合的脂质中的亲水性聚合物部分P可基于聚(环氧丙烷)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚-N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、羟乙基淀粉化(HESylation)过程(根据PMID 24681396)、PAS化(PASylation)法(即脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸)、本领域已知的XTEN法(即基于PEG的肽)、聚肌氨酸(polysarcosin)或聚(乙酸乙烯酯)。
任选地连接物或间隔基A
根据式(II)的聚合物结合的脂质中的任选的连接物或间隔基A可以是任何有用的间隔基结构，例如选自那些通常在聚乙二醇化脂质中发现有用的间隔基，例如,但不限于琥珀酰亚胺、胺、醚、酯、酸酐、醛、酮、酰胺、氨基甲酸酯连接物或其组合。
脂质部分L
根据式(II)的聚合物结合的脂质中的脂质部分L可源自磷脂、鞘脂或神经酰胺。如本文中所用，术语“源自磷脂或神经酰胺”包括磷脂和神经酰胺的自由基。实例为包含磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油部分的聚合物结合的脂质。
在具体的实施方式中，聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。在更具体的实施方式中，本发明组合物中包含的聚合物结合的脂质是选自由以下脂质组成的组的聚合物结合的脂质：聚乙二醇化二酰甘油脂质(PEG-DAG)；聚乙二醇化神经酰胺脂质(PEG-Cer)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺脂质(PEG-PE)；聚乙二醇化琥珀酸二酰甘油脂质(PEG-S-DAG)；聚乙二醇化二烷氧基丙基氨基甲酸酯脂质；1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(“PEG-DMG”或“DMG-PEG”)；1,2-二癸酰基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯二醇(C10二酰甘油PEG)；N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}(包含N-辛酰基-D-赤型-鞘氨醇(d18:1/8:0)，也称为PEG-神经酰胺8、C8-神经酰胺-PEG、PEG-Cer8、C8 PEG2000神经酰胺或神经酰胺8PEG)；4-O-(2’,3’-双(十四碳酰基氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；2-mPEG2000-n,n-双十四烷基乙酰胺；N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧(myristyloxl)丙基-3-胺(PEG-c-DMA)；ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-双(十四烷基氧基)丙基)氨基甲酸酯；如WO2018126084、WO2020093061或WO2020219941(所有三个参考文献均通过引用并入本文)中公开的PEG-脂质；如本文所公开的聚乙二醇化胆固醇或聚乙二醇化胆固醇衍生物；以及2,3-双(十四烷基氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在又一个优选的实施方式中，脂质部分L包含1、2、3、4或更多种疏水性脂肪酸(“尾”，对应于包含偶数个碳原子的脂肪链)。在更优选的实施方式中，脂质部分L包含2种疏水性脂肪酸(“尾”)，它们具有相同或不同数量的碳原子。
优选地，脂质部分L包含含有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个碳原子或其组合的脂肪酸(“尾”)。更优选地，脂质部分L包含含有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子或其组合的脂肪酸(“尾”)。在更具体的实施方式中，脂质部分L包含选自由辛酸或辛酸(8:0)；癸酸(10:0)；月桂酸(12:0)；肉豆蔻酸(14:0)；棕榈酸(16:0)；硬脂酸(18:0)；花生酸(20:0)；二十二烷酸(22:0)；二十四烷酸(24:0)；和二十六烷酸(26:0)组成的组的脂肪酸(“尾”)。
在甚至更优选的实施方式中，脂质部分L包含至少一种脂肪酸(“尾”部)，其含有8、10或12个碳原子，优选8或10个碳原子。
在又一个优选的实施方式中，组合物包含聚合物结合的脂质
-1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)
Figure BDA0003701042630000751
优选地，如本领域中所用，“DMG-PEG 2000”被认为是比率为约97:3的1,2-DMGPEG2000和1,3-DMG PEG2000的混合物。
在另一个具体的实施方式中，组合物包含选自由以下物质组成的组的聚合物结合的脂质
-1,2-二癸酰基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯二醇2000(C10-PEG 2000)
Figure BDA0003701042630000752
和
N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}(Cer8-PEG 2000)
Figure BDA0003701042630000761
在另一个实施方式中，组合物包含选自由类似于具有以下化学结构的“C8-PEG2000”的以下结构组成的组的聚合物结合的脂质：
Figure BDA0003701042630000762
在本发明的具体实施方式中，如本文在包含“C10-PEG 2000”的说明书中所公开的每种组合物也可以用“C8-PEG 2000”代替“C10-PEG 2000”来配制。
因此，作为一个实例，聚合物结合的脂质或相应的脂质部分L可具有两个脂肪酸尾，包含饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸或其组合(“尾”)，如Cer8-PEG 2000，其包含一条饱和脂肪酸链(8:0；辛酸或相应的辛酸)和一条长度不同的碳原子数超过8个的不饱和脂肪酸链。
具体地说，本发明人完成的又一个非常令人惊讶的发现是，有利地使用如本文所公开的具有较短烷基链的聚合物结合的脂质(如Cer8)，优选与如本文所公开的本发明脂质(如表1中和/或DPhyPE作为中性脂质代替DSPC)组合，用于在体内递送mRNA疫苗导致免疫应答显著增强，并且类似于本发明的具体方面和实施方式。
类固醇
“类固醇”是一种有机化合物，其具有以特定分子构型排列的四个环。它包含以下碳骨架：
Figure BDA0003701042630000771
类固醇和中性类固醇包括天然存在的类固醇及其类似物(如两亲性脂质胆固醇半琥珀酸酯(CHEMS)，组成为琥珀酸酯化到胆固醇的β-羟基基团作为胆固醇衍生物)。使用如本文所提供的“中性”的定义，中性类固醇可以是在生理条件下不具有可电离的原子或基团的类固醇，或者可以是两性离子类固醇。在一个优选实施方式中，中性类固醇不含在生理条件下可电离的原子或基团。在一些优选的实施方式中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。术语“类固醇”和“中性类固醇”在本文中可交换使用。
在另一个实施方式中，类固醇是咪唑胆固醇酯或“ICE”，如WO 2019226925 A1第[0320]和[0339]-[0340]段所述；其全部内容通过引用并入本文。
中性脂质，中性磷脂
根据本发明的“中性脂质”，也称为“辅助脂质”，优选为磷脂或中性磷脂。如本文中所用，“中性磷脂”是一种两亲性化合物，由由通常具有两个疏水性脂肪酸“尾”和包含磷酸盐基团的亲水性“头”的分子组成。磷酸盐基团可以用简单的有机分子如胆碱、乙醇胺或丝氨酸修饰。磷脂在自然界中大量存在。例如，它们代表了生物膜的赋形剂的很大一部分。如本文中所用，表述“磷脂”或“中性磷脂”既包括天然磷脂，也包括合成磷脂。
本文中互换使用的术语“中性脂质”、“中性磷脂”或“两性离子化合物”是指在生理pH以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质中的任何一种。代表性中性脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂，如下文进一步所述。
根据一个优选实施方式，组合物包含为两性离子的中性脂质，例如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺。合适的磷脂酰胆碱的实例包括天然或纯化的混合物，有时被称为“卵磷脂”或“磷脂酰胆碱”，通常源自蛋黄或大豆；或高度纯化或半合成的化合物，例如具有选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基等的两个脂肪酰基部分的磷脂酰胆碱。
在另一个优选实施方式中，中性脂质或中性磷脂是两性离子化合物，其选自但不限于1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE；也称为1,2-二-(3,7,11,15-四甲基十六碳酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhyPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC；也称为二油酰磷脂酰胆碱)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC，也称为二棕榈酰磷脂酰胆碱)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPEA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺、4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLoPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)、16-O-一甲基磷酸乙醇胺、16-O-二甲基磷脂酰乙醇胺、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、18-1-反式磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1,2-二角鲨酰基(squaleoyl)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSQPE)、1,2-二反油酰基(elaidoyl)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)、1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(SLPE)、1-十三碳酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(POPS)、1-1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(DOPS)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1-O-十六烷基-2-O-(9Z-十八烯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-胆固醇半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PChemsPC)、1,2-二胆固醇半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DChemsPC)、2-((2,3-二(油酰氧基)丙基)二甲铵)乙基磷酸氢盐(DOCP)、2-((2,3-二(油酰氧基)丙基)二甲铵)乙基磷酸乙酯(DOCPe)和1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Edelfosine)的组。
在优选的实施方式中，根据本发明的中性脂质是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在更优选的实施方式中，根据本发明的中性脂质是1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhyPC)。在甚至更优选的特别优选的实施方式中，根据本发明的中性脂质是1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)。与DPhyPE的使用有关的发明优势是，由于其粗大的尾部所致其融合能力高，因此能够与内体的脂质高水平融合。
具体地说，本发明人完成的一个令人惊讶的发现是，有利地使用如本文所公开的1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)，优选与如本文表1所公开的本发明脂质组合，具体地说，用于在体内递送mRNA疫苗导致免疫应答显著增强，并且类似于本发明的具体方面和实施方式。换言之，本发明人惊讶地发现，与迄今为止在本领域中用作几乎所有用于mRNA和siRNA的最先进的LNP组合物中的标准中性脂质的DSPC相比，DPhyPE的使用具有明显的优势，具体地说，但不限于疫苗接种设置。换言之，本发明的组合物在体内具有高度有利和意外的行为，导致高度增强的免疫应答。
有趣的是，本发明人发现含有DPhyPE而非DSPC的组合物在体外和体内表现出优越的表达特征，即使与GN01组合物相比也是如此。因此，令人惊讶地发现，DPhyPE的使用明显优于迄今为止在本领域中用作几乎所有最先进的LNP组合物中的标准中性脂质的DSPC。
重要的是，本发明人发现，本发明组合物和脂质纳米颗粒(如GN01制剂)的一个有利特征是，它能够诱导强烈的CD8+T细胞应答。这是因为这样一个事实，如对于疟疾，由于CD8+T细胞是对抗疟原虫引起的细胞内感染的主要保护性免疫机制，有效的疟疾疫苗应诱导强烈的CD8+T细胞应答。
此外，实施例中呈现的数据证明使用本发明的组合物显著增强免疫应答，即根据本发明，所有本发明的RNA疫苗都是有用的。令人惊讶的是，与显示DSPC是用于脂质纳米颗粒最常见且毫无疑问的中性脂质的现有技术知识相比，本发明人发现在用于生产疫苗的组合物中，优选使用DPhyPE用于mRNA制剂。
本发明人进一步令人惊讶地发现，在上述中性脂质中添加至少一种其他中性脂质，特别是第二种中性脂质，也可以增强免疫应答(参见图28至31和相应的实例)。如上所述，对于本发明的(第一)中性脂质，优选其具有选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基等的两个脂肪酰基部分，这特别意味着脂肪酰基部分是从具有14个碳原子的部分开始的相当长的部分。本发明人发现，添加具有较短脂肪酰基部分的中性脂质可提供有益效果，特别是如果额外的中性脂质具有选自戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基和癸酰基的两个脂肪酸部分，即具有最多10个碳原子的部分。特别优选的额外的中性脂质是1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)，但相关的中性脂质，例如05:0 PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0 PC(1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0 PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、09:0 PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和10:0 PC(1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)也可以使用。
因此，在本发明的一个方面中，本发明的脂质纳米颗粒包含中性脂质或磷脂，其具有至少一个长度为C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14，优选长度为C6、C7、C8、C9或C10，更优选长度为C6、C7、C8，最优选长度为C7的烷基链。在本发明的另一个实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14的长度，优选具有C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度。在优选的实施方式中，本发明的脂质纳米颗粒另外包含DHPC。在另一个实施方式中，一个或多个烷基链可包含碳双键。在其他实施方式中，脂质纳米颗粒包含选自由05:0 PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、04:0 PC(1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0 PC(DHPC，1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0 PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和09:0 PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的另外的磷脂。
脂质纳米颗粒组合物
术语“脂质纳米颗粒组合物”和“组合物”在本文中互换使用。在本发明的上下文中，脂质纳米颗粒不限于任何特定形态，并且应被解释为包括当阳离子脂质和任选的一种或多种其他的脂质结合时产生的任何形态，例如在水相环境和/或在存在核酸化合物的情况下。例如，脂质体、脂质复合物、lipoplex等在脂质纳米颗粒的范围内。
在本发明的上下文中，“组合物”是指任何类型的组合物，其中指定组分可任选地与任何其他赋形剂，通常至少一种药学上可接受的载体或赋形剂结合。因此，组合物可以是干燥组合物，例如粉末或颗粒，或固体单元，例如冻干形式或片剂。作为选择，组合物可以是液体形式，并且每种赋形剂可以以溶解或分散(例如悬浮或乳化)形式独立地加入。在一个优选实施方式中，组合物被配制成无菌固体组合物，例如粉末或冻干形式，用于与水性液体载体重组。对于包含下文进一步详细描述的核酸载荷的那些版本的组合物，也优选这种制剂。
在本发明的组合物中，阳离子脂质可存在于脂质纳米颗粒(LNP)中或作为其一部分。换言之，这种组合物包含脂质纳米颗粒，阳离子脂质存在于脂质纳米颗粒中。
如本文中所用，“纳米颗粒”是具有任何结构或形态的亚微米颗粒。亚微米颗粒也可以称为胶体或胶质。亚微米颗粒也可以称为胶体或胶体。关于纳米颗粒所基于的材料，以及结构或形态，可以将纳米颗粒分类，例如，为纳米胶囊、囊泡、脂质体、脂质纳米颗粒、胶束、交联胶束、lipoplex、多聚物、混合或混合复合物，仅提及特定类型纳米颗粒的几种可能命名。“脂质纳米颗粒”(LNP)是由脂质形成的纳米颗粒，通常包含至少一种两亲性、成膜脂质和任选的其他脂质，进一步任选地包含载荷材料如核酸化合物。如本文中所用，表述“脂质纳米颗粒”或“LNP”包括由脂质形成或共同形成的纳米颗粒的任何亚类型和形态，例如脂质体和lipoplex。
如上文定义，脂质纳米颗粒包括由脂质形成或共同形成的任何类型的纳米颗粒。特别是，脂质纳米颗粒可由包含至少一种两亲性、囊泡形成脂质的脂质组合共同形成。脂质体和lipoplexe是脂质纳米颗粒的实例。
在一些实施方式中，此类脂质纳米颗粒包含阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)和一种或多种选自中性脂质、带电脂质、类固醇和聚合物结合的脂质(例如，聚乙二醇化脂质，如，式(II)的聚乙二醇化脂质)的赋形剂。本发明人目前认为，至少在水相环境中，包含如本文所定义的阳离子脂质、类固醇、中性脂质和根据式(II)的聚合物结合的脂质的组合物通常作为包含由这些赋形剂形成的脂质纳米颗粒的组合物存在。
LNP可包含能够形成连接一个或多个核酸分子，或一个或多个核酸分子封装在其中的颗粒的任何脂质。在一些实施方式中，mRNA或其一部分被封装在脂质纳米颗粒的脂质部分中或被脂质纳米颗粒的部分或全部脂质部分封装的水空间中，从而保护其免受酶降解或由宿主生物体或细胞的机制诱导的其他不良影响(例如，不良免疫应答)。在一些实施方式中，mRNA或其一部分与脂质纳米颗粒相连。
如上所述，包含如本文所述的脂质赋形剂的组合物通常至少在水相环境中形成脂质纳米颗粒。如本文所定义，纳米颗粒主要具有亚微米尺寸。在某些实施方式中，当存在于脂质纳米颗粒中时，mRNA在水溶液中不易被核酸酶降解。如本文中所用，平均直径可用动态光散射确定的z平均值表示。在一个实施方式中，组合物是包含脂质纳米颗粒的无菌液体组合物，其由动态激光散射确定的平均流体动力学直径(或平均尺寸)为约30nm至约800nm。在各种实施方式中，脂质纳米颗粒具有的平均直径为约30nm至约150nm、约50nm至约200nm、约60nm至约200nm、约70nm至约200nm、约80nm至约200nm、约90nm至约200nm、约90nm至约190nm、约90nm至约180nm、约90nm至约170nm、约90nm至约160nm、约90nm至约150nm、约90nm至约140nm、约90nm至约130nm、约90nm至约120nm、约90nm至约100nm、约70至约90nm、约80nm至约90nm、约70nm至约80nm，或约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm，而且基本无毒。在本发明的另一个优选实施方式中，脂质纳米颗粒具有的流体动力学直径在约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、约60nm至约150nm、或约60nm至约120nm、或约80nm至约160nm、或约90nm至约140nm、50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、或约60nm至约200nm、或约70至200nm、或约75nm至约160nm、或约100nm至约140nm、或约90nm至约140nm的范围内。
包括如本文所述的产生本发明的脂质纳米颗粒的脂质赋形剂的组合物可以是相对均匀的。多分散指数(PDI)可用于指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如，纳米颗粒组合物的粒径分布。小的(例如小于0.3)多分散指数通常表示窄粒径分布。本发明的纳米颗粒组合物可具有的多分散指数为约0至约0.35，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34或0.35。在一些实施方式中，纳米颗粒组合物的多分散指数(PDI)可为约0.1至约0.2。
本文总体上描述了与本发明组合物有关的各种任选特点、选择和偏好：所有这些也适用于脂质纳米颗粒，本领域技术人员将清楚地理解这一点。类似地，选项和偏好适用于包含所述脂质纳米颗粒的组合物。
例如，根据一个优选实施方式的脂质纳米颗粒包含如上文定义的阳离子脂质、可为DphyPE的中性脂质，任选地与可为DHPC的第二中性脂质、可为胆固醇的类固醇和可为1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)的聚合物结合的脂质组合；其中阳离子脂质可任选地选自表1中列出的化合物。
在本发明的上下文中，因此，mRNA优选地包含在液体或半液体组合物中，其中mRNA与根据一个优选实施方式的脂质纳米颗粒复合或结合。即，在优选的实施方式中，所述液体或半液体组合物包含复合物，其中复合物包含mRNA，其中复合物优选呈现为本文定义的脂质纳米颗粒。
关于各赋形剂的量，优选阳离子脂质以相较于聚合物结合的脂质存在的摩尔量为相对较高的摩尔量掺入脂质纳米颗粒或根据本发明的组合物中。此外，阳离子脂质的摩尔量也优选分别高于组合物中或纳米颗粒中的中性脂质的摩尔量。此外，类固醇的摩尔量任选地高于聚合物结合的脂质的摩尔量。
在某些实施方式中，相对于纳米颗粒的总脂质含量，聚合物结合的脂质以约1mol％至约10mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，聚合物结合的脂质以约1mol％至约5mol％的量存在于LNP中。在一个实施方式中，聚合物结合的脂质以约1mol％至约1.5mol％存在于LNP中。
在各种实施方式中，阳离子脂质(例如式(I)的脂质)与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100:1至约25:1、约50:1至约25:1或约40:1至约25:1的范围内。
在某些实施方式中，LNP包含一种或多种其他的脂质，它们在其形成过程中稳定颗粒的形成。合适的稳定脂质包括中性脂质和阴离子脂质。在各种实施方式中，阳离子脂质(例如，式(I)的脂质)与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1、约3:1至约7:1或约4:1至约6:1的范围内。
如本文中所用，对本发明组合物中脂质赋形剂的摩尔量的提及应理解为也描述了组合物中所含脂质纳米颗粒中各赋形剂的摩尔量，因为脂质纳米颗粒通常由这些赋形剂形成，并且反映出与包含纳米颗粒的整体组合物相同的赋形剂定量比。
一般而言，相对于组合物(或纳米颗粒)中所有脂质赋形剂的总摩尔量，组合物(以及脂质纳米颗粒)中阳离子脂质的量通常至少为约20mol％。在另一个实施方式中，阳离子脂质的量分别为至少约25mol％或至少30mol％。在其他优选实施方式中，组合物中阳离子脂质的量分别为约30mol％至约70mol％，或约40mol％至约70mol％，或约45mol％至约65mol％；例如分别为约30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％、55mol％、60mol％、65mol％或70mol％，或约40mol％至约60mol％；例如分别为约40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％、55mol％、56mol％、57mol％、58mol％、59mol％或60mol％。
组合物中类固醇的量可任选地为至少约10mol％，或其可分别在约10mol％至约60mol％、或约20mol％至约50mol％、或约25mol％至约45mol％的范围内；例如分别约10mol％、15mol％、20mol％、25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％、55mol％或60mol％。同样，为避免疑问，摩尔百分比是相对于组合物中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
中性脂质可任选地以至少约5mol％的量存在。在一些实施方式中，使用相同的摩尔百分比基础，组合物中的中性脂质的量分别在约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约15mol％、或约8mol％至约12mol％的范围内；例如分别为约5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％、15mol％、16mol％、17mol％、18mol％、19mol％、20mol％、21mol％、22mol％、23mol％、24mol％或25mol％。这个量是中性脂质总量，即，它可以是两种中性脂质，例如DPhyPE和DHPC的总量。
组合物或脂质纳米颗粒中聚合物结合的脂质的量可例如选为约0.1mol％或更高。在某些实施方式中，再次使用所有脂质赋形剂的总摩尔量作为摩尔百分比的基础，聚合物结合的脂质的量在约0.5mol％至约5mol％、或约1mol％至约3mol％的范围内，例如分别为约0.1mol％、0.3mol％、0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％或5mol％。在其他某些实施方式中，组合物或脂质纳米颗粒可包含0.1mol％、0.2mol％、0.3mol％、0.4mol％、0.5mol％、0.6mol％、0.7mol％、0.8mol％、0.9mol％、1.0mol％、1.1mol％、1.2mol％、1.3mol％、1.4mol％、1.5mol％、1.6mol％、1.7mol％、1.8mol％、1.9mol％、2.0mol％、2.1mol％、2.2mol％、2.3mol％、2.4mol％、2.5mol％、2.6mol％、2.7mol％、2.8mol％、2.9mol％、3.0mol％、3.1mol％、3.2mol％、3.3mol％、3.4mol％、3.5mol％、3.6mol％、3.7mol％、3.8mol％、3.9mol％、4.0mol％、4.1mol％、4.2mol％、4.3mol％、4.4mol％、4.5mol％、4.6mol％、4.7mol％、4.8mol％、4.9mol％、5.0mol％、5.1mol％、5.2mol％、5.3mol％、5.4mol％、5.5mol％、5.6mol％、5.7mol％、5.8mol％、5.9mol％、6mol％、6.1mol％、6.2mol％、6.3mol％、6.4mol％、6.5mol％、6.6mol％、6.7mol％、6.8mol％、6.9mol％、7mol％或超过7mol％的聚合物结合的脂质。在优选的实施方式中，聚合物结合的脂质或聚乙二醇化脂质的含量为制剂的总脂质含量的约1mol％至5mol％。作为非限制性实例，脂质纳米颗粒包含1.5％的聚合物结合的脂质。作为另一非限制性实例，脂质纳米颗粒包含1.7％的聚合物结合的脂质。作为另一个非限制性实例，脂质纳米颗粒包含3％的聚合物结合的脂质。作为又一实例，脂质纳米颗粒包含5％的聚合物结合的脂质。
在一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其包含：
(a)根据式(I)或如本文所述的阳离子脂质，其量为30mol％至70mol％；
(b)类固醇，其量为20mol％至50mol％；
(c)中性脂质，其量为5mol％至25mol％；和
(d)聚合物结合的脂质，其量为0.5mol％至5mol％；
每个量均相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在另一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其包含：
(a)根据式(I)或如本文所述的阳离子脂质，其量为40mol％至70mol％；
(b)类固醇，其量为20mol％至50mol％；
(c)中性脂质，其量为5mol％至15mol％；和
(d)聚合物结合的脂质，其量为0.5mol％至5mol％；
每个量均相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其包含：
(a)根据式(I)或如本文所述的阳离子脂质，其量为20mol％至60mol％；
(b)类固醇，其量为25mol％至55mol％；
(c)中性脂质，其量为5mol％至25mol％；和
(d)聚合物结合的脂质，其量为0.5mol％至15mol％；
每个量均相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在另一个实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其包含：
(a)根据式(I)或如本文所述的阳离子脂质，其量为45mol％至65mol％；
(b)类固醇，其量为25mol％至45mol％；
(c)中性脂质，其量为8mol％至12mol％；和
(d)聚合物结合的脂质，其量为1mol％至3mol％；
每个量均相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在又一个优选的实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其包含：
(a)根据式(I)或如本文所述的阳离子脂质，其量为45mol％至65mol％；
(b)胆固醇，其量为25mol％至45mol％；
(c)中性脂质，其量为8mol％至12mol％；和
(d)聚合物结合的脂质，其量为1mol％至3mol％；
每个量均相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在又一个优选的实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其包含：
(a)根据式(I)或如本文所述的阳离子脂质，其量为45mol％至65mol％；
(b)胆固醇，其量为25mol％至45mol％；
(c)DPhyPE，其量为8mol％至12mol％和任选地DHPC，其量为1mol％至10mol％；和
(d)聚合物结合的脂质，其量为1mol％至3mol％；
每个量均相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在又一个优选的实施方式中，组合物包含脂质纳米颗粒，其包含：
(a)根据式(I)或如本文所述的阳离子脂质，其量为45mol％至65mol％；
(b)胆固醇，其量为25mol％至45mol％；
(c)DPhyPE，其量为8mol％至12mol％和任选地DHPC，其量为1mol％至10mol％；和
(d)PEG-DMG 2000，其量为1mol％至3mol％；
每个量均相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在这些实施方式中，阳离子脂质优选是根据本文公开的任一优选项选择的化合物。例如，阳离子脂质可选自表1所列化合物。此外，这些实施方式还可包含根据本文所公开的任一优选项选择的类固醇、中性脂质和/或聚合物结合的脂质。在所有实施方式中，其中列举了本文所述的组合物或脂质纳米颗粒，并且给出了每种赋形剂的mol％值，每个量应视为相对于脂质纳米颗粒中所有脂质赋形剂的总摩尔量。
在又一个优选的实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的中性脂质、29.3mol％的类固醇和1.7mol％的聚合物结合的脂质。
在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％10mol％的DPhyPE、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的DMG-PEG 2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DPhyPE、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的C10-PEG 2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DPhyPE、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的Cer8-PEG 2000。
在另一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含47.4mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的中性脂质、40.9mol％的类固醇和1.7mol％的聚合物结合的脂质。
在另一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含47.4mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DPhyPE、40.9mol％的胆固醇和1.7mol％的DMG-PEG2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含47.4mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DPhyPE、40.9mol％的胆固醇和1.7mol％的C10-PEG 2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含47.4mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DPhyPE、40.9mol％的胆固醇和1.7mol％的Cer8-PEG 2000。
在另一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、11mol％的中性脂质、28.3mol％的类固醇和1.7mol％的聚合物结合的脂质。
在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DphyPE和1mol％的DHPC、28.3mol％的胆固醇和1.7mol％的DMG-PEG 2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DphyPE和1mol％的DHPC、28.3mol％的胆固醇和1.7mol％的C10-PEG 2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含59mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DphyPE和1mol％的DHPC、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的Cer8-PEG 2000。
在另一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含49mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、20mol％的中性脂质、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的聚合物结合的脂质。
在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含49mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DphyPE和10mol％的DHPC、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的DMG-PEG 2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含49mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DphyPE和10mol％的DHPC、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的C10-PEG 2000。在一个实施方式中，本文描述的组合物或脂质纳米颗粒包含49mol％的根据本发明式(I)的阳离子脂质、10mol％的DphyPE和10mol％的DHPC、29.3mol％的胆固醇和1.7mol％的Cer8-PEG 2000。
在本节中的上述任何实施方式中(公开了具有不同％值的赋形剂的特定组合物或脂质纳米颗粒)，如果提及1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)作为中性脂质，则在其他实施方式中，DPhyPE可以与另一中性脂质，优选1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhyPC)交换。此外，在本节中的上述任何实施方式中(公开了具有不同％值的赋形剂的特定组合物或脂质纳米颗粒)，如果提及1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)作为中性脂质，则在另一些实施方式中，DPhyPE可以与另一中性脂质，优选1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC；也称为二油酰磷脂酰胆碱)或作为选择1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)交换。
根据本发明进一步具体实施方式的进一步优选脂质组合物包含如本文表E中所公开的至少四种脂质赋形剂。例如，优选的脂质组合物包含如第“E1”行中所公开的多种赋形剂，为作为阳离子脂质的“C1”(如表1中所公开)、作为中性脂质的DPhyPE、作为类固醇的胆固醇和作为聚合物结合的脂质赋形剂的DMG-PEG 2000。作为另一个实例，优选的脂质组合物包含第“E35”行中所公开的多种赋形剂，为作为阳离子脂质的“C12”(如表1中所公开)、作为中性脂质的DPhyPE、作为类固醇的胆固醇和作为聚合物结合的脂质赋形剂的C10-PEG2000。
表E：用于本发明优选组合物的脂质赋形剂组合(Chol＝胆固醇；DMG-PEG2K＝DMG-PEG2000；C10-PEG2K＝C10-PEG2000；Cer8-PEG2K＝Cer8-PEG2000；表分为两个表格)。
Figure BDA0003701042630000911
Figure BDA0003701042630000921
Figure BDA0003701042630000931
此外，表F中显示了本发明的优选脂质制剂，其显示出本发明组合物的至少四种脂质赋形剂的不同mol百分比。例如，优选的脂质组合物包含第“F1”行中公开的脂质的mol百分比，即，59mol％的阳离子脂质、29.3mol％的类固醇、10mol％的中性脂质和1.7mol％的聚合物结合的脂质。作为另一个实例，优选的脂质组合物包含第“F31”行中公开的脂质的mol百分比，即，45mol％的阳离子脂质、43.5mol％的类固醇、10mol％的中性脂质和1.5mol％的聚合物结合的脂质。
表F：制剂包含本发明优选组合物的赋形剂的mol百分比(表分为两个表格)。
Figure BDA0003701042630000941
Figure BDA0003701042630000951
**不言而喻，表F中最后四种制剂F57、F58、F59和F60的总和[mol％]被定义为100mol％。即，本领域的技术人员自然能够从四种赋形剂的给定范围中选择一个值，从而使本发明优选组合物的每种赋形剂的mol百分比总和达到100％。
因此，在本发明进一步优选的实施方式中，本发明的组合物包含表E中公开的赋形剂，其选自赋形剂组合命名组成的组
E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20、E21、E22、E23、E24、E25、E26、E27、E28、E29、E30、E31、E32、E33、E34、E35、E36、E37、E38、E39、E40、E41、E42、E43、E44、E45、E46、E47、E48、E49、E50、E51、E52、E53、E54、E55、E56、E57、E58、E59、E60、E61、E62、E63、E64、E65、E66、E67、E68、E69、E70、E71、E72、E73、E74、E75、E76、E77、E78、E79、E80、E81、E82、E83、E84、E85、E86、E87、E88、E89、E90、E91、E92、E93、E94、E95、E96、E97、E98、E99、E100、E101、E102、E103、E104、E105、E106、E107和E108；
以表F中公开的不同mol百分比，其选自由以下制剂命名组成的组
F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13、F14、F15、F16、F17、F18、F19、F20、F21、F22、F23、F24、F25、F26、F27、F28、F29、F30、F31、F32、F33、F34、F35、F36、F37、F38、F39、F40、F41、F42、F43、F44、F45、F46、F47、F48、F49、F50、F51、F52、F53、F54、F55、F56、F57、F58、F59、F60、F61和F62。
当根据表E和表F的组合F1×E23用于配制脂质纳米颗粒时，给出了本发明脂质纳米颗粒的特别优选的实施方式，即，59mol％的表1中公开的阳离子脂质C23，即
Figure BDA0003701042630000961
SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15，如实施例部分所示；日本东京NOF株式会社)、29.3mol％的胆固醇(作为类固醇)、10mol％的DPhyPE(作为中性脂质/磷脂)和1.7mol％的DMG-PEG 2000(作为聚合物结合的脂质)。所述LNP组合物在本文和工作例中称为“GN01”。SS-EC在pH为4时带正电荷，在pH为7时带中性电荷，这对本发明的LNP和制剂/组合物有利。对于“GN01”，N/P(脂质与mRNA的mol比)优选为14，总脂质/mRNA质量比优选为约20至约60，更优选为约30至约50，最优选为40(m/m)。
当根据表E和表F的组合F1×E2用于配制脂质纳米颗粒时，给出了本发明脂质纳米颗粒的另一个特别优选的实施方式，即，59mol％的如表1中公开的C2脂质作为阳离子脂质(即，HEXA-C5DE-PipSS，从实施例部分，图1B可以明显看出)、29.3mol％的胆固醇(作为类固醇)、10mol％的DPhyPE(作为中性脂质/磷脂)和1.7mol％的DMG-PEG 2000(作为聚合物结合的脂质)。所述LNP组合物在本文和工作例中称为“GN02”。对于“GN02”，N/P(脂质与mRNA的mol比)优选为17.5，总脂质/mRNA质量比优选为约20至约60，更优选为约30至约50，最优选为40(m/m)。
当根据表E和表F的组合F1×E23用于配制脂质纳米颗粒时，给出了本发明脂质纳米颗粒的另一个特别优选的实施方式，即，59mol％的表1中公开的阳离子脂质C23，即
Figure BDA0003701042630000962
SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15，从实施例部分可以明显看出；日本东京NOF株式会社)、26mol％的胆固醇(作为类固醇)、10mol％的DPhyPE(作为中性脂质/磷脂)和5mol％Cer8(作为包含较短烷基链的聚合物结合的脂质)。所述LNP组合物在本文和工作例中称为“GN01-C8”。对于“GN01-C8”，N/P(脂质与mRNA的mol比)优选为14，总脂质/mRNA质量比优选为约20至约60，更优选为约30至约50，最优选为40(m/m)。
当根据表E和表F的组合F1×E72用于配制脂质纳米颗粒时，给出了本发明脂质纳米颗粒的另一个特别优选的实施方式，即，59mol％的表1中公开的脂质C26作为阳离子脂质(即，THIOETHER，从实施例部分，图25A可以明显看出)、29.3mol％的胆固醇(作为类固醇)、10mol％的DPhyPE(作为中性脂质/磷脂)和1.7mol％的DMG-PEG 2000(作为聚合物结合的脂质)。所述LNP组合物在本文和工作例中称为“LNP28”。对于“LNP28”，N/P(脂质与mRNA的mol比)优选为14，总脂质/mRNA质量比优选为约20至约60，更优选为约30至约50，且最优选为40(m/m)。
此外，对于优选的组合物，所述
(i)阳离子脂质可选自表1的化合物；和/或所述
(ii)中性脂质或中性磷脂是两性离子化合物，其选自由1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE；也称为1,2-二-(3,7,11,15-四甲基十六碳酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhyPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC；也称为二油酰磷脂酰胆碱)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC，也称为二棕榈酰磷脂酰胆碱)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPEA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺、4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLoPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)、16-O-一甲基磷酸乙醇胺、16-O-二甲基磷脂酰乙醇胺、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、18-1-反式磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1,2-二角鲨酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSQPE)、1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)、1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(SLPE)、1-十三碳酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(POPS)、1-1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)(DOPS)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)、1-O-十六烷基-2-O-(9Z-十八烯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-胆固醇半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PChemsPC)、1,2-二胆固醇半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DChemsPC)、2-((2,3-二(油酰氧基)丙基)二甲铵)乙基磷酸氢盐(DOCP)、2-((2,3-二(油酰氧基)丙基)二甲铵)乙基磷酸乙酯(DOCPe)和1-O-十八烷基-2-O-甲基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Edelfosine)；任选地结合1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)组成的组；和/或
(iii)聚合物结合的脂质可选自由聚乙二醇化二酰甘油脂质(PEG-DAG)；聚乙二醇化神经酰胺脂质(PEG-Cer)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺脂质(PEG-PE)；聚乙二醇化琥珀酸二酰甘油脂质(PEG-S-DAG)；聚乙二醇化二烷氧基丙基氨基甲酸酯脂质；1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(“PEG-DMG”或“DMG-PEG”)；1,2-二癸酰基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯二醇(C10二酰甘油PEG)；N-辛酰基-鞘氨醇-1-琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)](PEG-神经酰胺8或PEG-Cer8)；4-O-(2’,3’-双(十四碳酰基氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；2-mPEG2000-n,n-双十四烷基乙酰胺；N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧丙基-3-胺(PEG-c-DMA)；ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-双(十四烷基氧基)丙基)氨基甲酸酯；和2,3-双(十四烷基氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯组成的组。
作为选择，组合物可以以固体形式提供。特别是，它可以作为无菌固体组合物提供，用于与无菌液体载体重组；在这种情况下，固体组合物可进一步包含一种或多种选自pH改性剂、填充剂、稳定剂、非离子表面活性剂和抗氧化剂的非活性组分。在该实施方式中，无菌液体载体优选为水性载体。
纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。例如，ζ电位可以描述纳米颗粒组合物的表面电荷。由于存在带负电和带正电的化合物所致根据本发明的脂质纳米颗粒可表现出相对中性的ζ电位。ζ电位(有时缩写为“电荷”)可与颗粒的粒径一起确定，例如，通过动态光散射和激光多普勒微电泳，例如使用Malvern Zetasizer Nano(MalvernInstruments Ltd.；Malvern，英国)。取决于脂质纳米颗粒中带电化合物的量和性质，可通过ζ电位对纳米颗粒进行表征。在优选的实施方式中，ζ电位在约-50mV至约+50mV的范围内。在其他优选实施方式中，ζ电位在约-25mV至约+25mV的范围内。在一些实施方式中，本发明脂质纳米颗粒的ζ电位可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
在某些实施方式中，LNP包含一个或多个能够将LNP靶向细胞或细胞群的靶向部分。例如，在一个实施方式中，靶向部分是将LNP导向细胞表面发现的受体的配体。
在某些实施方式中，LNP包括一个或多个内化域。例如，在一个实施方式中，LNP包含一个或多个与细胞结合以诱导LNP内化的结构域。例如，在一个实施方式中，一个或多个内化域与细胞表面发现的受体结合，以诱导受体介导的LNP摄取。在某些实施方式中，LNP能够在体内结合生物分子，其中LNP结合的生物分子可以被细胞表面受体识别以诱导内化。例如，在一个实施方式中，LNP结合系统性ApoE，导致LNP和相连载荷的摄取。在本发明的某些实施方式中，可以将ApoE补充给所使用的培养基或药物组合物。
优选地，在一个实施方式中，本发明的组合物还包含生物活性组分。
生物活性组分
如本文中所用，生物活性组分是指具有生物活性的任何化合物或材料，由于该活性，化合物或材料可用于受试者(如动物，特别是人类受试者)的疾病或状况的预防、管理、改善、治疗或疗法。
在一个优选实施方式中，活性组分是核酸化合物。可能对实施本发明有用的核酸化合物的实例包括选自由化学修饰或未修饰的信使RNA(mRNA)、化学修饰或未修饰的RNA、单链或双链RNA、编码或非编码RNA、病毒RNA、复制子RNA和自我复制RNA，或其任何组合组成的组的核酸化合物；优选地，其中生物活性组分为mRNA。
在优选的实施方式中，核酸化合物与一种或多种脂质(例如阳离子脂质和/或中性脂质)复合或结合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、lipoplex和/或纳米脂质体。在上下文中，术语“复合”或“结合”是指第一方面的核酸化合物与一种或多种脂类基本上稳定的组合成未共价结合的更大的复合物或组装体。
在具体的实施方式中，活性组分可包括CRISPR RNA(crRNA)加示踪RNA(tracrRNA)、指导RNA(gRNA)或单一指导RNA(sgRNA)和/或结合CRISPR内切酶的供体DNA。适宜地，CRISPR核酸内切酶可作为蛋白质或多肽或作为编码所述CRISPR核酸内切酶的mRNA提供。包含该组合的组合物或制剂适于向靶细胞传递CRISPR基因编辑活性。在一个实施方式中，根据本发明的组合物可提供编码CRISPR内切酶的gRNA和mRNA，用于单独、相继或同时施用。也就是说，gRNA和mRNA可在根据本发明的同一制剂或脂质纳米颗粒中提供，或者可以在单独的脂质纳米颗粒中提供，用于单独、同时或相继施用。例如，用于施用的gRNA与mRNA的比率适当地为1:1、1:3、1:9、1:19(即50％、25％、10％和5％的引导RNA)。在一个实施方式中，将编码CRISPR内切酶(例如cas9)的gRNA和mRNA共加载到根据本发明的制剂中。有利的是，共加载能够获得更好的封装效率(EE)。适当地，根据本发明的制剂或药物组合物(其中gRNA和mRNA被共同加载到其中)包含平均直径为80nm至160nm的LNP。在一个实施方式中，gRNA可以是修饰的gRNA序列。适当的修饰例如如WO2016/089433和PCT/GB2016/053312所述。本领域技术人员将熟悉其他合适的修饰。
“CRISPR核酸内切酶”是指可用于CRISPR基因编辑组合物中的核酸内切酶。合适的“CRISPR核酸内切酶”包括cas9及其突变体和修饰形式。因此，与gRNA结合使用的mRNA是编码CRISPR内切酶的mRNA，优选cas9。例如，其他“CRISPR核酸内切酶”包括cpf1。技术人员将知道，gRNA与特定的“CRISPR核酸内切酶”配对。因此，本发明设想了使用合适的gRNA/核酸内切酶配对的组合物。适宜地，gRNA对靶基因是特异性的，优选地，其中靶基因是与肝脏疾病相关的基因。
在另一个实施方式中，由核酸化合物表达的肽或蛋白质是治疗性蛋白质或其片段或变体，其中治疗性蛋白质有益于治疗或预防任何遗传性或后天性疾病，或改善个体的状况。特别是，治疗性蛋白质在设计新的治疗剂方面发挥着关键作用，这些治疗剂可以修饰和修复遗传缺陷、摧毁癌细胞或病原体感染的细胞、治疗或预防免疫系统病症、或治疗或预防代谢或内分泌病症，以及其他功能。
在另一个实施方式中，由核酸化合物表达的肽或蛋白质是抗原。如上文中更详细地定义，抗原是可由免疫系统、优选由适应性免疫系统识别的化合物或材料，以触发抗原特异性免疫应答。
在一些实施方式中，活性组分是siRNA。siRNA是小干扰RNA，例如，如国际专利申请PCT/EP03/08666所述。这些分子通常由双链RNA结构组成，双链RNA结构由15至25个核苷酸对、优选18至23个核苷酸对组成，这些核苷酸对能够彼此进行碱基配对，即基本上彼此互补，通常由沃森-克里克碱基配对介导。这种双链RNA分子的一条链基本上与靶核酸(优选mRNA)互补，然而，所述双链RNA分子的第二条链基本上与所述靶核酸的一段相同。siRNA分子可能在每一侧和每一段的两侧分别有许多额外的核苷酸，但这些核苷酸不一定必须彼此为碱基对。
在一些实施方式中，活性组分是RNAi。RNAi基本上与siRNA具有相同的设计，然而，与siRNA相比，这些分子明显更长。RNAi分子通常分别包含50个或更多个核苷酸和碱基对。
在一些实施方式中，活性组分是反义核酸。如本文优选使用的反义核酸是基于与靶RNA(优选mRNA)的碱基互补性杂交的寡核苷酸，从而激活RNaseH。RNaseH被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶联的DNA激活。然而，磷酸二酯偶联的DNA可被细胞核酸酶迅速降解，而硫代磷酸偶联的DNA则不能。因此，反义多核苷酸仅作为DNA-RNA杂交复合物有效。反义核酸的优选长度为16至23个核苷酸。除其他外，美国专利5,849,902和美国专利5,989,912中描述了此类反义寡核苷酸的实例。
在一些实施方式中，活性组分是核酶。核酶是具有催化活性的核酸，优选由基本上包含两部分的RNA组成。第一部分显示出催化活性，而第二部分负责与靶核酸的特定相互作用。当靶核酸与核酶的所述部分相互作用时，通常通过两条杂交链上基本互补的碱基段的杂交和沃森-克里克碱基配对，催化活性部分可能变得活跃，这意味着如果核酶的催化活性为磷酸二酯酶活性，则其在分子内或分子间切割靶核酸。核酶，其用途和设计原则为本领域技术人员所知，例如，描述于Doherty和Doudna(Annu.Ref.Biophys.Biomolstruct.2000；30:457-75)中。
在一些实施方式中，活性组分是适体。适体是单链或双链的D-核酸，具体地说，与靶分子相互作用。例如，欧洲专利EP 0 533 838中描述了适体的制造或选择。与RNAi、siRNA、反义核苷酸和核酶相比，适体不降解任何靶mRNA，而是，特异性地与靶化合物(如蛋白质)的二级和三级结构相互作用。在与靶相互作用时，靶通常表现出其生物活性的变化。适体的长度通常在15至80个核苷酸的范围内，优选在约20至约50个核苷酸的范围内。
在一些实施方式中，活性组分是镜像异构适体(spiegelmer)。例如，镜像异构适体描述于国际专利申请WO 98/08856中。镜像异构适体是类似于适体的分子。然而，与适体相比，镜像异构适体完全或大部分由L-核苷酸，而不是D-核苷酸组成。除此之外，特别是关于镜像异构适体的可能长度，这同样适用于如适体所述的镜像异构适体。
mRNA
在一个优选实施方式中，核酸化合物是mRNA或mRNA化合物。正如本发明人所发现的，根据本发明的脂质和组合物特别适合于表达抗原的mRNA化合物的体内递送，从而能够以中等成本快速开发高效、有效、通用和安全的疫苗。下文更详细地描述用于实施本发明的感兴趣的特定抗原。根据本发明的mRNA化合物封装在脂质纳米颗粒中或与脂质纳米颗粒相连。
编码脂质纳米颗粒(LNP)中包含的至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA的优点是：
-诱导强烈的体液免疫应答
-诱导B细胞记忆
-更快开始免疫保护
-诱导的免疫应答的长久性
-诱导广泛的细胞T细胞应答
-诱导(局部和暂时)促炎环境
-不诱导全身细胞因子或趋化因子应答
-良好的耐受性、无副作用、无毒
-有利的稳定性特征
-与多种不同抗原相容的制剂：基于相同(生产)技术，更大的抗原鸡尾酒是可行的
-无载体免疫，即技术可用于针对多种(不同)抗原对同一受试者进行多次接种
-生产的速度、适应性、简单性和可扩展性。
在某些实施方式中，脂质纳米颗粒至少包含：
(i)如上定义的阳离子脂质和/或聚合物结合的脂质；和
(ii)包含编码抗原肽或蛋白质的mRNA序列的mRNA化合物。
在其他具体的实施方式中，脂质纳米颗粒包含：
(a)如本文所述根据式(I)的阳离子脂质。
(b)类固醇；
(c)中性脂质；
(d)聚合物结合的脂质，其中所述聚合物结合的脂质是如本文所述的根据式(II)的化合物；和
(e)编码肽或蛋白质的mRNA化合物。
关于阳离子脂质、类固醇、中性脂质、聚合物结合的脂质和编码肽或蛋白质的mRNA化合物，应用相同的选项、优选项和替代，正如上文关于这些特征已经描述的。例如，在一个优选实施方式中，由mRNA化合物表达的肽或蛋白质是抗原。
相对于脂质纳米颗粒中mRNA化合物的阳离子脂质的量也可以表示为重量比(缩写为“m/m”)。例如，脂质纳米颗粒包含mRNA化合物，其量可实现约20至约60或约10至约50范围内的脂质与mRNA的重量比。在其他实施方式中，质量比在约30至约50的范围内。在其他实施方式中，阳离子脂质与核酸或mRNA的比率为约3至约15，例如约5至约13、约4至约8或约7至约11。在本发明非常优选的实施方式中，总脂质/mRNA质量比为约40或40，即质量过剩约40或40倍，以确保mRNA封装。另一优选RNA/脂质比率为约1至约10、约2至约5、约2至约4，或优选约3。
此外，阳离子脂质的量可考虑核酸载荷(例如mRNA化合物)的量来选择。在一个实施方式中，N/P比可在约1至约50的范围内。在另一个实施方式中，范围为约1至20、约1至10、约1至5。在一个优选的实施方式中，选择这些量以使脂质纳米颗粒或组合物的N/P比在约10至约20的范围内。在另一个非常优选的实施方式中，N/P为14(即，正电荷mol过量14倍，以确保mRNA封装)。在另一个非常优选的实施方式中，N/P为17.5(即，正电荷mol过量17.5倍，以确保mRNA封装)。
在上下文中，N/P比定义为阳离子脂质的碱性含氮基团的氮原子(“N”)与作为生物活性载荷并入脂质纳米颗粒或与脂质纳米颗粒相连的核酸的磷酸基团(“P”)的摩尔比。N/P比可基于以下计算：例如，1μg RNA通常含有约3nmol磷酸残基，前提是RNA呈现碱基的统计分布。阳离子脂质或类脂质的“N”值可根据其分子量和阳离子基团的相对含量计算。如果存在不止一种阳离子脂质，则应基于脂质纳米颗粒中包含的所有阳离子脂质计算N值。
脂质纳米颗粒中的mRNA的总量各不相同，可根据mRNA与总脂质w/w的比率来定义。在本发明的一个实施方式中，mRNA与总脂质之比为小于0.06w/w，优选为0.03至0.04w/w。
优选地，mRNA化合物或其编码序列的长度为约50至约20000、或100至约20000个核苷酸、优选约250至约20000个核苷酸、更优选约500至约10000、甚至更优选约500至约5000。
如上所述，由mRNA化合物表达的肽或蛋白质可以是抗原。换言之，组合物包含mRNA化合物，其包含编码抗原肽或蛋白质的mRNA序列，或其片段、变体或衍生物。此类抗原或抗原肽或蛋白质可源自致病性抗原、肿瘤抗原、过敏性抗原或自身免疫性自体抗原，或其片段或变体，优选如本文所定义。
致病性抗原
致病性抗原源自致病性生物体，特别是细菌、病毒或原生动物(多细胞)致病性生物体，其引起受试者，特别是哺乳动物受试者，更特别是人类的免疫应答。更具体地说，致病性抗原优选为表面抗原，例如位于病毒或细菌或原生动物有机体表面的蛋白质(或蛋白质片段，例如表面抗原的外部部分)。
因此，在一些优选的实施方式中，人工核酸(RNA)分子可在其至少一个编码区中编码选自细菌、病毒、真菌或原生动物抗原的至少一种致病性抗原。编码的(多)肽或蛋白质可由致病性抗原或其片段、变体或衍生物组成或包含致病性抗原或其片段、变体或衍生物。
致病性抗原是优选源自与传染病相关的病原体的肽或蛋白质抗原，其优选选自但不限于WO 2018/078053 A1第21至35页中公开的源自病原体的抗原组；WO 2018/078053通过引用全文并入本文。此外，致病性抗原是优选源自与传染病相关的病原体的肽或蛋白质抗原，其优选选自但不限于WO 2019/077001 A1第57页第3段-第63页第2段中公开的源自病原体的抗原组；WO 2019/077001通过引用全文并入本文。
甚至进一步的致病性抗原是优选源自与传染病相关的病原体的肽或蛋白质抗原，其优选选自源自病原体的抗原，其选自(但不限于)WO 2013120628 A1第32页第26行至第34页第27行中公开的源自病原体的抗原组。此外，在这方面，致病性抗原(源自与传染病相关的病原体的抗原)可优选地选自以下抗原：其优选选自但不限于WO 2013120628 A1中第34页第29行至第59页第5行(括号中是特定病原体或衍生一种或多种抗原的病原体家族以及与该病原体相关的传染病)所公开的抗原组；WO 2013120628通过引用全文并入本文。
在由并入本发明组合物中的mRNA化合物表达的优选抗原中，病原体选自但不限于由SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起沙眼的衣原体细菌)和疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。在另一个优选实施方式中，致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、疟原虫、流感病毒或狂犬病病毒。
此外，致病性抗原可进一步优选选自源自病原体的抗原，其选自但不限于由鲍曼不动杆菌、无形体属、嗜吞噬细胞无形体、巴西钩口线虫、十二指肠钩口线虫、溶血隐秘杆菌、人蛔虫、曲霉属、星状病毒科、巴倍虫属、炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、汉赛巴尔通体、BK病毒、人酵母菌、皮炎芽生菌、百日咳博德特氏菌、博氏疏螺旋体、包柔氏螺旋体菌属、包柔体属、布鲁氏菌属、马来丝虫、布尼亚病毒科、洋葱伯克霍尔德菌和其他伯克霍尔德菌属、鼻疽伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌、杯状病毒科、弯曲菌属、白念珠菌、念珠菌属、沙眼衣原体、肺炎嗜衣原菌、鹦鹉热嗜衣原体、CJD朊病毒、华支睾吸虫、肉毒梭菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、产气荚膜梭菌、梭菌属、破伤风梭菌、球孢菌属、冠状病毒、白喉棒状杆菌、伯氏考克斯氏体、刚果出血热病毒、新生隐球菌、隐孢子虫属、巨细胞病毒(CMV)、脆弱双核阿米巴、埃博拉病毒(EBOV-例如包膜糖蛋白)、棘球绦虫属、恰菲埃里希氏体、埃翁氏埃里希氏体(Ehrlichia ewingii)、埃里希氏体属、溶组织内阿米巴、肠球菌属、肠道病毒属、肠道病毒、主要是柯萨奇A病毒和肠道病毒71(EV71)、表面癣菌属、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌01 57:H7、01 1 1和O1 04:H4、肝片吸虫和巨大片吸虫、FFI朊病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、丝虫总科、黄病毒、图拉氏弗朗西斯菌、梭杆菌属、白地霉、肠贾第虫、颚口线虫属、GSS朊病毒、瓜那利托病毒、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、亨利帕病毒(亨克莱病毒-尼帕病毒)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、荚膜组织胞浆菌、韦尼克黑酵母(Hortaea Wernicke)、人博卡病毒(HBoV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人类副流感病毒(HPIV)、日本脑炎病毒、JC病毒、鸠宁(Junin)病毒、金氏金氏菌、肉芽肿克雷伯菌、库鲁病朊病毒、拉沙病毒、嗜肺军团菌、利什曼原虫属、钩端螺旋体属、单核细胞增生李斯特菌、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、马丘波病毒、马拉色菌属、马尔堡病毒、麻疹病毒、横川后殖吸虫、微孢(子)虫门、人传染性软疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、麻风分枝杆菌和弥漫型麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、福氏耐格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri)、美洲钩虫、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、星状诺卡氏菌、诺卡氏菌属、旋盘尾丝虫、恙虫病立克次氏体、正粘病毒科(流感)、巴西副球孢子菌、并殖吸虫属、卫氏并殖吸虫、细小病毒B19、巴氏杆菌属、疟原虫属、耶氏肺孢子虫、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、鼻病毒属、小蛛立克次氏体、立克次氏体属、普氏立克次氏体、立氏立克次氏体、斑疹伤寒立克次氏体、裂谷热病毒、轮状病毒(优选如V8抗原)、风疹病毒、萨比亚病毒、沙门氏菌属、疥螨、SARS冠状病毒、血吸虫属、志贺氏菌属、辛诺柏病毒、汉坦病毒、申克孢子丝菌、葡萄球菌属、葡萄球菌属、无乳链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、粪类圆线虫、绦虫属、猪带绦虫、蜱传脑炎病毒(TBEV)、犬弓首线虫或猫弓首线虫、弓形虫、梅毒螺旋体、旋毛虫、阴道毛滴虫、毛癣菌属、毛首鞭形线虫、布氏锥虫、克鲁兹锥虫、解脲脲原体、痘苗病毒(优选如免疫逃避蛋白E3、K3或B18)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、大天花或小天花、vCJD朊病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、霍乱弧菌、西尼罗河病毒、西部马脑炎病毒、班氏丝虫、小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌、寨卡病毒、ZikaSPH2015-巴西、Z1106033-苏里南、MR766-乌干达或Natal RGN，或这些蛋白质的亚型、同系物、片段、变体或衍生物组成的组。特别优选的致病性抗原是源自病原体SARS冠状病毒的抗原，特别是SARS冠状病毒的棘突蛋白(S)。
在另一个实施方式中，可用于治疗感染的致病性抗原可选自以下抗原(相关感染和相关病原体在各自抗原后的括号中指示-当然，也可根据本发明衍生和使用可源自括号中的以下病原体的其他抗原)：
棘突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核衣壳蛋白(N)，或其中任何一种的免疫原性片段或变体(传染病为“COVID-19疾病”；病原体：SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV))；
棘突蛋白(S)、棘突S1片段(S1)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)或核衣壳蛋白(N)(传染病为MERS感染；病原体：中东呼吸综合征冠状病毒(MERS冠状病毒/MERS冠状病毒))；
复制蛋白E1、调节蛋白E2、蛋白E3、蛋白E4、蛋白E5、蛋白E6、蛋白E7、蛋白E8、主要衣壳蛋白L1、次要衣壳蛋白L2(传染病是人乳头瘤病毒(HPV)感染；病原体：人乳头瘤病毒(HPV)或HPV16)；
融合蛋白F、血凝素神经氨酸酶(neuramidase)HN、糖蛋白G、基质蛋白M、磷蛋白P、核蛋白N、聚合酶L、血凝素神经氨酸酶、融合(F)糖蛋白F0、F1或F2、重组PIV3/PIV1融合糖蛋白(F)和血凝素(HN)、C蛋白、磷蛋白、D蛋白、基质蛋白(M)、核壳体蛋白(N)、病毒复制酶(L)、非结构V蛋白(传染病是人类副流感病毒感染；病原体：人副流感病毒(HPIV/PIV)hPIV-1、hPIV-2、hPIV-3或hPIV-4血清型，优选hPIV-3血清型，优选PIV3)；
融合(F)糖蛋白、糖蛋白G、磷蛋白P、核蛋白N、核衣壳蛋白(传染病：hMPV感染；病原体：人类偏肺病毒(hMPV))；
血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白(NEP蛋白：核输出蛋白)、PA蛋白、PB1蛋白(聚合酶碱性1蛋白)、PB1-F2蛋白和PB2蛋白、H10N8、H7N9、H10、H1N1、H3N2(X31)、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18、HA的抗原子域：HA1，HA2，神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)，基质蛋白1(M1)、基质蛋白2(M2)、非结构蛋白1(NS 1)、非结构蛋白2(NS2)、HA7抗原、H7或H10和B，病原体：正粘病毒科，流感病毒(流感))；
核蛋白N、大结构蛋白L、磷蛋白P、基质蛋白M、糖蛋白G、G蛋白(传染病为狂犬病；病原体：狂犬病病毒)；
HIV p24抗原、HIV包膜蛋白(Gp120、Gp41、Gp160)、多蛋白GAG、负因子蛋白Nef、转录反式激活剂Tat、Brec1(传染病HIV；病原体：人类免疫缺陷病毒)；
主要外膜蛋白MOMP、可能的外膜蛋白PMPC、外膜复合蛋白B OmcB、热休克蛋白Hsp60 HSP10、蛋白IncA、III型分泌系统蛋白、核糖核苷酸还原酶小链蛋白NrdB、质粒蛋白Pgp3、衣原体外蛋白N CopN、抗原CT521、抗原CT425、抗原CT043、抗原TC0052、抗原TC0189、抗原TC0582、抗原TC0660、抗原TC0726、抗原TC0816、抗原TC0828(传染病：沙眼衣原体感染；病原体：沙眼衣原体)；
pp65抗原、膜蛋白pp15、衣壳近端皮层(tegument)蛋白pp150、蛋白M45、DNA聚合酶UL54、螺旋酶UL105、糖蛋白gM、糖蛋白gN、糖蛋白H、糖蛋白B gB、蛋白UL83、蛋白UL94、蛋白UL99、HCMV糖蛋白(选自gH-gL、gB、gO、gN和gM)、HCMV蛋白(选自UL83、UL123、UL128、UL130和UL131A)、表皮蛋白pp150(pp150)、皮层蛋白pp65/下基质磷蛋白(pp65)、包膜糖蛋白M(UL100)、调节蛋白IE1(UL123)、包膜蛋白(UL128)、包膜糖蛋白(130)、包膜蛋白(UL131A)、包膜糖蛋白B(UL55)、结构糖蛋白N gpUL73(UL73)、结构糖蛋白O gpUL74(UL74)(传染病是巨细胞病毒感染；病原体：巨细胞病毒(CMV/HCMV))；
衣壳蛋白C、膜前蛋白prM、膜蛋白M、包膜蛋白E(结构域I、结构域II、结构域II)、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白NS2B、蛋白NS3、蛋白NS4A、蛋白2K、蛋白NS4B、蛋白NS5(传染病登革热；病原体：登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4))；
EBOV糖蛋白(GP)、表面EBOV GP、野生型EBOV pro GP、成熟EBOV GP、分泌型野生型EBOV pro GP、分泌型成熟EBOV GP、EBOV核蛋白(NP)、RNA聚合酶L和EBOV基质蛋白(选自VP35、VP40、VP24和VP30)(传染病：EBOV；病原体：EBOV病毒)；
乙型肝炎表面抗原HBsAg、乙型肝炎核心抗原HbcAg、聚合酶、蛋白Hbx、前S2中表面蛋白、表面蛋白L、大S蛋白、病毒蛋白VP1、病毒蛋白VP2、病毒蛋白VP3、病毒蛋白VP4(传染病是乙型肝炎；病原体：乙型肝炎病毒(HBV))；
融合蛋白F、F蛋白、核蛋白N、基质蛋白M、基质蛋白M2-1、基质蛋白M2-2、磷蛋白P、小疏水蛋白SH、主要表面糖蛋白G、聚合酶L、非结构蛋白1NS1、非结构蛋白2NS2、RSV附着蛋白(G)(糖蛋白G)、融合(F)糖蛋白(糖蛋白F)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、基质蛋白(M，M2)、小疏水蛋白(SH)、非结构蛋白1(NS1)、非结构蛋白2(NS2)、膜结合RSV F蛋白、膜结合DS Cavl(稳定的融合前RSV F蛋白)(传染病是呼吸道合胞病毒(RSV)感染)；病原体：呼吸道合胞病毒(RSV))；
分泌抗原SssA(葡萄球菌属，葡萄球菌食物中毒)；分泌抗原SssA(葡萄球菌属，如金黄色葡萄球菌、葡萄球菌感染)；分子伴侣DnaK、细胞表面脂蛋白Mpt83、脂蛋白P23、磷酸转运系统渗透蛋白pstA、14kDa抗原、纤维连接蛋白结合蛋白C FbpC1、丙氨酸脱氢酶TB43、谷氨酰胺合成酶1、ESX-1蛋白、蛋白CFP10，TB10.4蛋白质、蛋白MPT83、蛋白MTB12、蛋白MTB8、Rpf样蛋白质、蛋白MTB32、蛋白MTB39、晶体蛋白、热休克蛋白HSP65、蛋白PST-S(传染病是结核；病原体：结核分枝杆菌)；
基因组多蛋白、蛋白E、蛋白M、衣壳蛋白C、蛋白酶NS3、蛋白NS1、蛋白NS2A、蛋白AS2B、蛋白NS4A、蛋白NS4B、蛋白NS5(传染病是黄热病；病原体：黄热病病毒)；
环孢子蛋白(CSP)(传染病是疟疾；病原体为恶性疟原虫和间日疟原虫)；和
根据WO 2017/140905 A1的寨卡病毒蛋白质，即，寨卡病毒衣壳蛋白(c)、寨卡病毒膜前蛋白(prM)、寨卡病毒pr蛋白(pr)、寨卡病毒膜蛋白(M)、寨卡病毒包膜蛋白(E)、寨卡病毒非结构蛋白、寨卡病毒prME抗原、寨卡病毒衣壳蛋白、膜前/膜蛋白、ZIKV包膜蛋白、ZIKV非结构蛋白1、ZIKV非结构蛋白2A、ZIKV非结构蛋白2B、ZIKV非结构蛋白3、ZIKV非结构蛋白4A、ZIKV非结构蛋白4B、ZIKV非结构蛋白5或寨卡病毒包膜蛋白(e)，其中根据WO 2017/140905 A1对域II中的融合环进行突变；WO 2017/140905通过引用全文并入本文(传染病是寨卡病毒感染；病原体：寨卡病毒)；
在本发明的一些实施方式中，本公开提供了一种诱导受试者抗原特异性免疫应答的方法，包括向受试者施用本文所提供的任何RNA(例如mRNA)疫苗，其量可有效产生抗原特异性免疫应答。
在一些实施方式中，RNA(例如mRNA)疫苗为SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)和疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。在另一个优选实施方式中，致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、疟原虫、流感病毒或狂犬病病毒。在其他实施方式中，RNA(如mRNA)疫苗是2019冠状病毒疾病、狂犬病、流感或疟疾疫苗。
在一些实施方式中，RNA(例如，mRNA)疫苗是包含流感疫苗组合(广谱流感疫苗)的组合疫苗。在一些实施方式中，抗原特异性免疫应答包括T细胞应答或B细胞应答。
在一些实施方式中，产生抗原特异性免疫应答的方法包括向受试者施用单剂量(即无增强剂量)SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)和疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。在另一个优选实施方式中，致病性抗原源自本公开的SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、疟原虫、流感病毒或狂犬病病毒(如mRNA)疫苗。
在一些实施方式中，方法还包括向受试者施用第二(增强)剂量的SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)和疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。在另一个优选实施方式中，致病抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、疟原虫、流感病毒或狂犬病病毒RNA(例如mRNA)疫苗，可以被施用。
在一些实施方式中，受试者在第一剂量或第二(增强剂)剂量的疫苗后显示出血清转化率为至少80％(例如，至少85％、至少90％或至少95％)。血清转化是特定抗体产生并在血液中检测到的时间段。发生血清转化后，病毒可以在对抗体的血液检测中检测到。在感染或免疫过程中，抗原进入血液，免疫系统开始产生抗体做出应答。在血清转化之前，抗原本身可能检测到，也可能检测不到，但抗体被认为是不存在的。在血清转化过程中，抗体存在，但尚未检测到。血清转换后的任何时候，都可以在血液中检测到抗体，表明先前或当前感染。在一些实施方式中，RNA(如mRNA)疫苗通过皮内注射、肌肉内注射或通过鼻内施用的方式施用给受试者。在一些实施方式中，RNA(如mRNA)疫苗通过肌肉内注射施用给受试者。
本公开的一些实施例提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫应答的方法，包括对受试者施用SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)和疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。在另一个优选实施方式中，致病性抗原源自有效量的SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、疟原虫、流感病毒或狂犬病病毒RNA(如mRNA)疫苗，以在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
受试者的抗原特异性免疫应答，在一些实施方式中，可如下确定：在对受试者施用本公开的SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)RNA(例如mRNA)疫苗之后，测定抗体滴度(与SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)抗原多肽)结合的抗体的滴度)确定。在一些实施方式中，受试者产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于对照组增加至少1log。在一些实施方式中，受试者产生的抗抗原多肽抗体滴度相对于对照组增加1log至3log。
肿瘤抗原
在又一个优选的实施方式中，包含mRNA的mRNA化合物编码肿瘤抗原(优选如本文所定义)或其片段或变体，其中，肿瘤抗原优选地选自但不限于由WO 2018/078053 A1第47-51页中公开的肿瘤抗原组成的组；WO 2018/078053 A1通过引用全文并入本文。
此外，对本发明有用的(如用于癌症治疗)细胞因子、趋化因子、自杀酶和基因产物、凋亡诱导剂、内源性血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、天然免疫激活剂、针对与肿瘤或癌症发展相关的蛋白质的抗体可选自但不限于如WO 2016/170176的表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11和表12中公开的细胞因子、趋化因子、自杀酶和基因产物、凋亡诱导剂、内源性血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、天然免疫激活剂、针对与肿瘤或癌症发展相关的蛋白质的抗体的组；WO 2016/170176，尤其是表1-12，具体地说，通过引用全文并入本文。
治疗性蛋白质以及用于治疗或预防任何遗传性或后天性疾病的用途
在另一个实施方式中，活性组分是包含至少一个编码序列的核酸化合物，其中至少一个编码序列编码肽或蛋白质，其中蛋白质是治疗性蛋白质，或治疗性蛋白质的片段或变体。在上下文中，治疗性肽、蛋白质或其片段可以是可用于预防、管理、改善、治疗或治疗受试者(例如动物，特别是人类受试者)的疾病或状况的任何肽化合物。
因此，在一个实施方式中，包含至少一个编码序列的mRNA可编码
(a)肽或蛋白质或其片段或变体，其中肽或蛋白质是抗原，其中抗原优选源自致病性抗原、肿瘤抗原、过敏性抗原或自身免疫性自体抗原或其片段或变体；或
(b)治疗性蛋白质或其片段或变体。治疗性蛋白可例如选自由以下蛋白质组成的组
(i)用于治疗代谢、内分泌或氨基酸紊乱的酶替代疗法或用于替代缺失、缺陷或突变蛋白质的治疗性蛋白质；
(ii)用于治疗血液疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白质；
(iii)用于治疗癌症或肿瘤疾病的治疗性蛋白质；
(iv)用于激素替代治疗的治疗性蛋白质；
(v)用于将体细胞重新编程为多能干细胞或全能干细胞的治疗性蛋白质；
(vi)用作佐剂或免疫刺激的治疗性蛋白质；
(vii)作为治疗性抗体的治疗性蛋白质；
(viii)作为基因编辑剂的治疗性蛋白质；和
(ix)用于治疗或预防选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病的治疗性蛋白质。
在具体的实施方式中，治疗性蛋白质或其片段或变体选自：
用于治疗代谢、内分泌或氨基酸紊乱的酶替代疗法或用于替代缺失、缺失或突变蛋白质的治疗性蛋白质，包括酸性鞘磷脂酶、脂肪酸、无糖苷酶β、白葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、α-葡萄糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、双调蛋白、血管生成素(Ang1、Ang2、Ang3、Ang4、ANGPTL2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6、ANGPTL7)、ATP酶、Cu(2+)-转运β多肽(ATP7B)、精氨琥珀酸合成酶(ASS1)、β细胞素、β-葡萄糖醛酸酶、骨形态发生蛋白BMP(BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10、BMP15)、CLN6蛋白、表皮生长因子(EGF)、表观蛋白、表观调节素、成纤维细胞生长因子(FGF、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-16、FGF-17、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)、加硫酯酶、生长激素释放肽、葡萄糖脑苷酶、GM-CSF、肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)、肝细胞生长因子HGF、肝细胞生成素、人白蛋白、白蛋白丢失增加、艾度硫酸酯酶(艾度糖-2-硫酸酯酶)、整联蛋白αVβ3、αVβ5和α5β1、Iuduronate硫酸酯酶、拉罗尼酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB；加硫酶、芳香基硫酸酯酶A(ARSA)、芳香基硫酸酯酶B(ARSB))、N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶、神经生长因子(NGF，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)和神经营养素4/5(NT-4/5)、神经调节蛋白(NRG1、NRG2、NRG3、NRG4)、神经纤毛蛋白(NRP-1、NRP-2)、肥胖抑制素、苯丙氨酸羟化酶(PAH)，苯丙氨酸氨解水解酶(PAL)、血小板源生长因子(PDGF(PDFF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D))、TGFβ受体(内皮素、TGFβ1受体、TGFβ2受体、TGFβ3受体)、血小板生成素(THPO)(巨核细胞生长和发育因子(MGDF))、转化生长因子(TGF(TGF-a、TGF-β(TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)))、VEGF(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF)、奈西立肽、胰蛋白酶、促肾上腺皮质激素(ACTH)、心钠肽(ANP)、胆囊收缩素、胃泌素、瘦素、催产素、生长抑素、加压素(抗利尿激素)、降钙素、艾塞那肽、生长激素(GH)、生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1IGF-1、美卡西芬酯、IGF-1类似物、培维索孟、普兰林肽、特立帕肽(人甲状旁腺激素残基1-34)、贝卡普勒明、Dibotermin-α(骨形态生成蛋白2)、醋酸组氨瑞林(促性腺激素释放激素；GnRH)、奥曲肽、肝细胞核因子4α(HNF4A)、CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPA)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、细胞外基质蛋白酶或人胶原酶MMP1、肝细胞生长因子(HGF)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、阿片生长因子受体样1(OGFRL1)、梭菌II型胶原酶、松弛素1(RLN1)、松弛素2(RLN2)、松弛素3(RLN3)和帕利夫明(角质形成细胞生长因子；KGF)；
用于治疗血液疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、癌症或肿瘤疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白质，包括阿替普酶(组织纤溶酶原激活剂；tPA)、阿尼普酶、抗凝血酶III(AT-III)、比伐卢定、达贝泊汀-α、Drotrecogin-α(活化蛋白C)、促红细胞生成素、阿法依泊汀-α、红细胞生成素、erthropoyetin、因子IX、因子VIIa、因子VIII、重组水蛭素、蛋白C浓缩物、瑞替普酶(tPA的缺失突变蛋白)、链激酶、替奈普酶、尿激酶、血管增生抑制素、抗-CD22免疫毒素、地尼白介素、免疫花青、MPS(锌指蛋白)、阿柏西普、内皮他丁、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、L-天冬酰胺酶、Peg-天冬酰胺酶、拉布立酶、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、人卵泡刺激素(FSH)、促黄体素-α、催乳素、α-1-蛋白酶抑制因子、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)、腺苷脱氨酶(牛培格脱氨酶，PEG-ADA)、阿贝西普、阿法赛特、阿那白滞素、依那西普、白细胞介素-1(IL-1受体拮抗剂)、阿那白滞素、胸腺九肽、TNF-α拮抗剂、恩夫韦地和胸腺肽α1；
用于治疗癌症或肿瘤疾病的治疗性蛋白质，包括细胞因子、趋化因子、自杀基因产物、免疫原性蛋白或肽、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、热休克蛋白、肿瘤抗原、β-连环蛋白抑制剂、STING通路激活剂、检查点调节剂、天然免疫激活剂、抗体、显性负性受体和诱饵受体、髓源性抑制细胞(MDSCs)抑制剂、IDO途径抑制剂和结合凋亡抑制剂的蛋白质或肽；
选自佐剂或免疫刺激蛋白的治疗性蛋白质，包括人类辅助蛋白，特别是模式识别受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11；NOD1、NOD2、NOD3、NOD4、NOD5、NALP1、NALP2、NALP3、NALP4、NALP5、NALP6、NALP6、NALP7、NALP7、NALP8、NALP9、NALP10、NALP11、NALP12、NALP13、NALP14,l IPAF、NAIP、CIITA、RIG-I、MDA5和LGP2、TLR信号的信号转导子，包括衔接蛋白(包括如Trif和Cardif)；小GTPases信号的成分(RhoA、Ras、Rac1、Cdc42、Rab等)、PIP信号的成分(PI3K、Src激酶等)、MyD88依赖信号的成分(MyD88、IRAK1、IRAK2、IRAK4、TIRAP、TRAF6等)、MyD88独立信号的成分(TICAM1、TICAM2、TRAF6、TBK1、IRF3、TAK1、IRAK1等)；活化激酶，包括例如Akt、MEKK1、MKK1、MKK3、MKK4、MKK6、MKK7、ERK1、ERK2、GSK3、PKC激酶、PKD激酶、GSK3激酶、JNK、p38MAPK、TAK1、IKK和TAK1；活化转录因子，包括例如NF-kB、c-Fos、c-Jun、c-Myc、CREB、AP-1、Elk-1、ATF2、IRF-3、IRF-7、热休克蛋白如HSP10、HSP60、HSP65、HSP70、HSP75和HSP90、gp96、纤维蛋白原、纤维连接蛋白的III型重复额外结构域；或补体系统的成分包括C1q、MBL、C1r、C1s、C2b、Bb、D、MASP-1、MASP-2、C4b、C3b、C5a、C3a、C4a、C5b、C6、C7、C8、C9、CR1、CR2、CR3、CR4、C1qR、C1INH、C4bp、MCP、DAF、H、I、P和CD59，或诱导靶基因包括例如β-防御素、细胞表面蛋白；或人类辅助蛋白，包括trif、flt-3配体、Gp96或纤维连接蛋白、诱导或增强先天免疫应答的细胞因子包括IL-1α、IL1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF；趋化因子包括IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、RANTES、Eotaxin、CCL21；巨噬细胞释放的细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α；以及IL-1R1和IL-1α；
细菌(佐剂)蛋白，包括细菌热休克蛋白或伴侣(包括Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100)；革兰氏阴性菌OmpA(外膜蛋白)；OspA；细菌孔蛋白，包括OmpF；细菌毒素，包括百日咳杆菌的百日咳毒素(PT)、百日咳杆菌的百日咳腺苷酸环化酶毒素CyaA和CyaC、百日咳毒素PT-9K/129G突变体、百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素CyaA和CyaC、破伤风毒素、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位、霍乱毒素CTK63突变体、CT的CTE112K突变体、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、毒性降低的不耐热肠毒素(LTB)大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的B亚单位包括LTK63、LTR72；酚溶性调节蛋白；幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)；表面活性蛋白D；伯氏疏螺旋体外表面蛋白A脂蛋白、结核分枝杆菌的Ag38(38kDa抗原)；细菌菌毛蛋白、霍乱弧菌肠毒素CT、革兰氏阴性菌菌毛的菌毛蛋白和表面活性蛋白A以及细菌鞭毛蛋白；
原生动物(佐剂)蛋白质，包括克氏锥虫的Tc52、刚地锥虫的PFTG、原生动物热休克蛋白、利什曼原虫的LeIF、刚地弓形虫的类谱蛋白；
病毒(佐剂)蛋白质，包括呼吸道合胞病毒融合糖蛋白(F蛋白)、MMT病毒包膜蛋白、小鼠白血病病毒蛋白、野生型麻疹病毒血凝素蛋白；
真菌(佐剂)蛋白质，包括真菌免疫调节蛋白(FIP；LZ-8)；
动物源性蛋白质，包括钥孔血蓝蛋白(KLH)；
用于激素替代治疗的治疗性蛋白质，其中激素包括雌激素、孕酮或黄体酮以及睾酮；以及
用于将体细胞重编程为多能或全能干细胞的治疗性蛋白质，包括Oct-3/4、Sox基因家族(Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)、Klf家族(Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族(c-Myc、L-Myc和N-Myc)、Nanog和LIN28。
本发明包括预防、改善或治疗需要的受试者的疾病或状况的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的组合物。本发明的组合物可用于治疗人体或动物体。
在上下文中，特别优选的可特别用于治疗代谢或内分泌疾病的治疗蛋白质选自WO2017/191274表A(结合表C)中公开的蛋白质。此外，优选可使用本发明组合物治疗的疾病，优选选自传染病、肿瘤(例如癌症或肿瘤疾病)、血液和造血器官疾病、内分泌、营养和代谢疾病、神经系统疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病，消化系统疾病、皮肤和皮下组织疾病、肌肉骨骼系统和结缔组织疾病以及泌尿生殖系统疾病在WO 2017/191274第95页第4行至第103页第24行中公开。WO 2017/191274的表1中公开了可特别用于治疗代谢或内分泌疾病的进一步特别优选的治疗蛋白质，其也指通过引用并入本文的特定靶点/疾病组合，以及序列。WO 2017/191274(包括表A/C和表1)通过引用全文并入本文。
在优选的实施方式中，人工核酸(RNA)分子、(药物)组合物或疫苗或试剂盒用于治疗或预防传染病。术语“感染”或“传染病”涉及通常不存在于体内的微生物(如细菌、病毒和寄生虫)的入侵和繁殖。感染可能不会引起任何症状且为亚临床，也可能会引起症状并具有临床表现。感染可能仍然局限于局部，也可能通过血液或淋巴系统传播成为全身性感染。在上下文中传染病优选包括病毒、细菌、真菌或原生动物传染病。特别是，传染病选自WO2019/077001 A1第157页“传染病”一节(结束于第160页)公开的组；WO 2019/077001 A1通过引用全文并入本文。
在上下文中，US 2019/0002906的表2中公开了本发明组合物或本发明可翻译分子可用于治疗的疾病和/或状况的进一步特别优选的实例；US 2019/0002906，包括表2，通过引用全文并入本文。
动物(更特别是人类)的肝病或肝脏相关疾病可能包括但不限于先天性疾病或后天性疾病，例如病毒和寄生虫传染病、肿瘤病理学，例如原发性肿瘤和转移、代谢、氨基酸和/或内分泌失调以及炎症和免疫以及自身免疫状况。可优选使用本发明的组合物治疗的肝病选自但不限于由丙型肝炎、乙型肝炎、肝炎、甲型肝炎、肝硬化、肝癌、肝细胞癌、肝性脑病、自身免疫性肝炎、威尔逊病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AAT缺乏)、丁型肝炎、苯丙酮尿症(PKU)，Wilson病(肝豆状核变性)、I型酪氨酸血症(FAH缺乏)、Alagille综合征、门静脉高压症、脂肪性肝炎、慢性肝炎和戊型肝炎组成的组。
在又一个优选的实施方式中，本发明的组合物可用于治疗或预防失调的方法，其中失调是肝病，优选选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组。因此，包含至少一个编码序列的mRNA可编码治疗性蛋白质或其片段或变体，其用于治疗或预防选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病。此外，优选地，用于治疗或预防肝病或选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病的mRNA编码选自由肝细胞核因子4α(HNF4A)、CCAAT/增强子结合蛋白α(CEBPA)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、细胞外基质蛋白酶或人胶原酶MMP1、肝细胞生长因子(HGF)、TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、阿片样生长因子受体样1(OGFRL1)、梭菌II型胶原酶、松弛素1(RLN1)、松弛素2(RLN2)和松弛素3(RLN3)组成的组的肽或蛋白质。关于这点，通过引用将WO 2018/104538 A1的肝病特定公开以及WO 2018/104538 A1中公开的序列并入本文。
其他抗原
对本发明有用的其他抗原列于WO 2018/078053第48至51页；WO 2018/078053通过引用全文并入本文。
过敏性抗原和自身免疫性自体抗原
如上所述，根据一些实施方式，本发明组合物中包含的mRNA化合物可编码表示过敏原或过敏性抗原或自体抗原(也称为自体抗原或自身免疫抗原)的抗原。
与过敏或过敏性疾病相关的此类抗原和自体抗原(过敏原或过敏性抗原)源自或优选选自但不限于WO 2018/078053 A1第59至73页公开的抗原组；WO 2018/078053 A1通过引用全文并入本文。
检查点调节剂/检查点抑制剂
在本发明的上下文中，免疫检查点蛋白、检查点调节剂或检查点抑制剂通常是分子，例如蛋白质(例如抗体)、显性负性受体、诱饵受体或配体或其片段或变体，其调节免疫检查点蛋白的功能，例如其抑制或降低检查点抑制剂(或抑制性检查点分子)的活性，或刺激或增强检查点刺激物(或刺激性检查点分子)的活性。因此，本文定义的检查点调节剂影响检查点分子的活性。在上下文中，抑制性检查点分子被定义为检查点抑制剂并可同义使用。另外，刺激性检查点分子被定义为检查点刺激物并可同义使用。
在又一个优选的实施方式中，包含mRNA的mRNA化合物编码免疫检查点蛋白、检查点调节剂或检查点抑制剂(优选如本文所定义)，或其片段或变体，其中，免疫检查点蛋白质、检查点调节剂或检查点抑制剂优选选自但不限于WO 2018/078053 A1第51至56页中公开的由免疫检查点蛋白质、检查点调节剂或检查点抑制剂组成的组；WO 2018/078053 A1通过引用全文并入本文。
RNA元件、mRNA元件
根据本发明的某些实施方式，mRNA序列为单顺反子、双顺反子或多顺反子，优选如本文所定义。双顺反子或多顺反子mRNA中的编码序列优选编码如本文所定义的独特的肽或蛋白质或其片段或变体。优选地，编码两个或更多个肽或蛋白质的编码序列可在双顺反子或多顺反子mRNA中通过至少一个IRES(内部核糖体进入位点)序列分离，如下所述。因此，术语“编码两个或更多个肽或蛋白质”可意指，但不限于此，双顺反子或甚至多顺反子mRNA可在本文提供的定义范围内编码例如至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个(优选不同的)肽或蛋白质或其片段或变体。更优选地，在不限于此的情况下，双顺反子甚至多顺反子mRNA可编码，例如，至少两个、三个、四个、五个、六个或更多个(优选不同)肽或蛋白质(如本文所定义)，或其片段或变体(如本文所定义)。在上下文中，上文定义的所谓IRES(内部核糖体进入位点)序列可以作为唯一的核糖体结合位点发挥作用，但也可以提供如上文定义的双顺反子甚至多顺反子mRNA，其编码若干肽或蛋白质，这些肽或蛋白质将由核糖体相互独立地翻译。可根据本发明使用的IRES序列的实例是来自小核糖核酸病毒(例如FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、小鼠白血病病毒(MLV)的序列，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些。
根据另一个实施方式，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区可编码至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个和更多个肽或蛋白质(或其片段和衍生物)，其如本文所定义且与氨基酸连接子序列连接或不连接，其中所述连接子序列可包含刚性连接子、柔性连接子、可切割连接子(例如，自切割肽)或其组合。其中，肽或蛋白质可以相同或不同或其组合。特定的肽或蛋白质组合可由所述mRNA编码，所述mRNA编码如本文所述的至少两个肽或蛋白质(本文也称为“多抗原构建体/mRNA”)。
在另一个优选实施方式中，组合物中包含的mRNA化合物编码其氨基酸序列相对于相应野生型氨基酸序列未修饰的致病性抗原。在上下文中，mRNA化合物还可包含其核酸序列相对于相应野生型mRNA序列未被修饰的编码区。例如，mRNA化合物可以是天然的且未修饰的mRNA。如本文中所用，天然且未修饰的mRNA包括体外产生的mRNA，无化学修饰或序列变化。
mRNA修饰和序列
在本发明的另一个实施方式中，mRNA化合物包含人工mRNA。在上下文中，人工mRNA包括具有化学修饰、序列修饰或非自然序列的mRNA。
化学修饰
根据本发明的另一实施方式，组合物中包含的mRNA化合物包含至少一种化学修饰。在一个实施方式中，化学修饰可选自由碱基修饰、糖修饰、主链修饰和脂质修饰组成的组。与本发明相关的主链修饰是一种修饰，其中在包含本文所定义的mRNA序列的mRNA化合物中包含的核苷酸骨架的磷酸盐被化学修饰。与本发明有关的糖修饰是对包含如本文所定义的mRNA序列的mRNA化合物的核苷酸的糖的化学修饰。此外，与本发明有关的碱基修饰是对包含mRNA序列的mRNA化合物的核苷酸碱基部分的化学修饰。在上下文中，核苷酸类似物或修饰优选选自适用于转录和/或翻译的核苷酸类似物。
糖修饰
可在糖部分中修饰修饰的核苷和核苷酸，其可并入包含如本文所述的mRNA序列的修饰的mRNA化合物中。例如，2’羟基基团(OH)可以被许多不同的“氧”或“脱氧”取代基修饰或取代。“氧”-2'羟基基团修饰的实例包括但不限于烷氧基或芳氧基(-OR，例如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、-O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2'羟基例如通过亚甲基桥连接至同一核糖的4'碳；和氨基(-O-氨基，其中氨基，例如NRR，可以是烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)或氨基烷氧基。
“脱氧”修饰包括氢、氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、双杂芳基氨基或氨基酸)；或氨基可通过连接物连接至糖，其中连接物包含一个或多个原子C、N和O。
糖基还可以包含一个或多个碳，这些碳的立体化学构型与核糖中相应碳的立体化学构型相反。因此，修饰的mRNA可包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
主链修饰
主链的磷酸酯基团可以通过用不同的取代基取代一个或多个氧原子来修饰。此外，修饰的核苷和核苷酸可包括如本文所述用修饰的磷酸酯完全取代未修饰的磷酸酯部分。修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫逐磷酸酯、硫逐硒酸酯、borano磷酸盐、borano磷酸酯、氢磷酸酯、磷酰胺、烷基或芳基磷酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫取代。还可以通过用氮(桥联磷酰胺)、硫(桥联硫代磷酸酯)和碳(桥联亚甲基膦酸酯)取代连接氧来修饰磷酸酯连接物。
脂质修饰
脂质修饰的mRNA通常包含本文定义的mRNA。如本文所定义的这种脂质修饰的mRNA通常还包含至少一个与该mRNA共价连接的连接物，以及至少一个与相应连接物共价连接的脂质。作为选择，脂质修饰的mRNA包含如本文所定义的至少一个mRNA和至少一个与该mRNA共价连接(无连接物)的(双官能)脂质。根据第三备选方案，脂质修饰的mRNA包含如本文所定义的mRNA分子、至少一个与该mRNA共价连接的连接物、至少一个与相应连接物共价连接的脂质，以及至少一个与该mRNA共价连接(无连接物)的(双官能)脂质。在上下文中，特别优选的是脂质修饰存在于线性mRNA序列的末端。
在另一个优选实施方式中，mRNA化合物不包含核苷修饰，特别是无碱基修饰。在另一个实施方式中，mRNA化合物不包含1-甲基假尿苷、假尿苷或5-甲氧基尿苷修饰。在一个优选的实施方式中，mRNA仅包含天然存在的核苷。在又一个优选的实施方式中，mRNA化合物不包含任何化学修饰，并且任选地包含序列修饰。在本发明的另一优选实施方式中，mRNA化合物仅包含天然存在的核苷腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶。
碱基修饰
在替代性的实施方式中，mRNA化合物包含至少一个碱基修饰。
可并入包含本文所述mRNA序列的修饰的mRNA化合物中的修饰的核苷和核苷酸可在碱基部分中进一步修饰。在mRNA中发现的碱基包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。例如，本文所述的核苷和核苷酸可在大沟面上进行化学修饰。在一些实施方式中，大沟化学修饰可包括氨基基团、巯基基团、烷基基团或卤基。
在本发明特别优选的实施方式中，核苷酸类似物/修饰选自碱基修饰，其优选选自2-氨基-6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸酯、2-氨基嘌呤-核苷-5’-三磷酸酯；2-氨基腺苷-5’-三磷酸酯、2’-氨基-2’-脱氧胞苷-三磷酸酯、2-巯基胞苷-5’-三磷酸酯、2-硫脲核苷-5’-三磷酸酯、2’-氟胸苷-5’-三磷酸酯、2’-O-甲基-肌苷-5’-三磷酸酯、4-硫脲核苷-5’-三磷酸酯、5-氨基烯丙基胞苷-5’-三磷酸酯、5-氨基烯丙基尿苷-5’-三磷酸酯、5-溴胞苷-5’-三磷酸酯、5-溴尿苷-5’-三磷酸酯、5-溴-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、5-溴-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯、5-碘胞苷-5’-三磷酸酯、5-碘-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、5-碘尿苷-5’-三磷酸酯、5-碘-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯、5-甲基胞苷-5’-三磷酸酯、5-甲基尿苷-5’-三磷酸酯、5-丙炔基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、5-丙炔基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯、6-氮杂胞苷-5’-三磷酸酯、6-氮杂尿苷-5’-三磷酸酯、6-氯嘌呤核苷-5’-三磷酸酯、7-脱氮腺苷-5’-三磷酸酯、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸酯、8-氮杂腺苷-5’-三磷酸酯、8-叠氮腺苷-5’-三磷酸酯、苯并咪唑-核苷-5’-三磷酸酯、N1-甲基腺苷-5’-三磷酸酯、N1-甲基鸟苷-5’-三磷酸酯、N6-甲基腺苷-5’-三磷酸酯、O6-甲基鸟苷-5’-三磷酸酯、假尿苷-5’-三磷酸酯或嘌呤霉素-5’-三磷酸酯、黄苷-5’-三磷酸酯。对于选自由5-甲基胞苷-5’-三磷酸酯、7-脱氮鸟苷-5’-三磷酸酯、5-溴胞苷-5’-三磷酸酯和假尿苷-5’-三磷酸酯成的组的碱基修饰的核苷酸组的碱基修饰，特别优先考虑核苷酸。在一些实施方式中，修饰的核苷包括吡啶-4-酮核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-taurino甲基尿苷、1-taurino甲基-假尿苷、5-taurino甲基-2-硫代-尿苷、1-taurino甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷和4-甲氧基-2-硫代-假尿苷。在一些实施方式中，修饰的核苷包括5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、扎布拉林、5-氮杂-扎布拉林、5-甲基-扎布拉林、5-氮杂-2-硫代-扎布拉林、2-硫代-扎布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷和4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷。在其他实施方式中，修饰的核苷包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酸氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤。在其他实施方式中，修饰的核苷包括肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在一些实施方式中，核苷酸可以在主沟面上进行修饰，并且可包括用甲基基团或卤基取代尿嘧啶C-5上的氢。在具体的实施方式中，修饰的核苷是5’-O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-鸟苷、5’-O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5’-O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷。
在另一特定实施方式中，修饰的mRNA可包含选自6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、6-甲基-鸟苷、5-甲基-胞苷、8-氧代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基-腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、假-异-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮-腺苷、7-脱氮-腺苷的核苷修饰。
在其他的实施方式中，化学修饰选自假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-0-甲基尿苷。
在具体的实施方式中，化学修饰选自由假尿嘧啶(ψ)、N1-甲基假尿嘧啶(N1Mψ)、1-乙基假尿嘧啶、2-硫脲嘧啶(s2U)、4-硫脲嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶及其任何组合组成的组。
序列修饰
根据另一个实施方式，mRNA化合物包含修饰的mRNA序列。例如，mRNA序列的修改可能导致mRNA序列的稳定。在一个实施方式中，mRNA化合物包含稳定的mRNA序列，其包含至少一个如本文所定义的编码区。特别是，如本文所述的本发明的组合物可包含mRNA化合物，其包含编码肽或蛋白质的编码区，如本文所述的任何实施方式中所定义，其中所述编码区展示序列修饰。
根据一个实施方式，mRNA化合物包含“稳定的mRNA序列”，即作为基本上抵抗体内降解(例如通过外切或内切核酸酶)的mRNA。例如，通过本发明mRNA的修饰的磷酸主链可以实现这种稳定。与本发明有关的主链修饰是一种修饰，其中mRNA中所含核苷酸主链的磷酸盐被化学修饰。在这方面可优选使用的核苷酸包含例如硫代磷酸酯修饰的磷酸主链，优选磷酸主链中包含的至少一个磷酸氧被硫原子取代。稳定的mRNAs可进一步包括，例如：非离子磷酸酯类似物，例如，烷基和芳基膦酸酯，其中带电荷的膦酸盐氧被烷基或芳基、或磷酸二酯和烷基磷酸三酯取代，其中带电荷的氧残基以烷基化形式存在。这种主链修饰通常包括但不意味着任何限制，来自由甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和磷硫酰(例如，胞苷-5'-O-(1-硫代磷酸酯))组成的组的修饰。
在下文中，描述了优选能够“稳定”本文定义的mRNA的特定修饰。
G/C含量修饰
根据一个实施方式，mRNA化合物包含通过修饰其鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量而修饰并因此稳定的mRNA序列。这种修饰或这些修饰中的至少一种位于mRNA化合物的编码区。
在一个优选的实施方式中，与相应野生型mRNA(即未修饰的mRNA)编码区的G/C含量相比，mRNA化合物编码区的G/C含量增加。同时，与相应野生型mRNA编码的氨基酸序列相比，优选不修饰由mRNA编码的氨基酸序列。例如，如上所述的组合物可包含编码致病性抗原的mRNA化合物，其氨基酸序列相对于相应野生型核酸的编码氨基酸序列未进行修饰。
本发明mRNA序列的这种修饰基于以下事实：任何待翻译的mRNA区域的序列对于该mRNA的有效翻译都很重要。因此，mRNA的组成和各种核苷酸的序列很重要。特别是，G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量增加的序列比A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量增加的序列更稳定。根据本发明，因此，与相应的野生型mRNA相比，mRNA的密码子是不同的，同时保留翻译的氨基酸序列，以致它们包含更多量的G/C核苷酸。关于多个密码子编码同一个氨基酸的事实(所谓的遗传密码退化)，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子用法)。取决于将被mRNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，mRNA序列有不同的修饰可能性。对于由密码子编码的氨基酸(其只包含G或C核苷酸)，无需对密码子进行修饰。因此，Pro(CCC或CCG)、Arg(CGC或CGG)、Ala(GCC或GCG)和Gly(GGC或GGG)的密码子不需要修饰，因为不存在A或U。相反，包含A和/或U核苷酸的密码子可以通过取代其他密码子来修饰，这些密码子编码相同的氨基酸，但不包含A和/或U。这些实例是：Pro的密码子可由CCU或CCA修饰为CCC或CCG；Arg的密码子可由CGU或CGA或AGA或AGG修饰为CGC或CGG；Ala的密码子可由GCU或GCA修饰为GCC或GCG；Gly的密码子可由GGU或GGA修饰为GGC或GGG。在其他情况下，虽然不能从密码子中消除A或U核苷酸，但可以通过使用含有较低A和/或U核苷酸含量的密码子来降低A和U含量。这些实例是：Phe的密码子可由UUU修饰为UUC；Leu的密码子可由UUA、UUG、CUU或CUA修饰为CUC或CUG；Ser的密码子可由UCU或UCA或AGU修饰为UCC、UCG或AGC；Tyr的密码子可由UAU修饰为UAC；Cys的密码子可由UGU修饰为UGC；His的密码子可由CAU修饰为CAC；Gln的密码子可由CAA修饰为CAG；Ile的密码子可由AUU或AUA修饰为AUC；Thr的密码子可由ACU或ACA修饰为ACC或ACG；Asn的密码子可由AAU修饰为AAC；Lys的密码子可由AAA修饰为AAG；Val的密码子可由GUU或GUA修饰为GUC或GUG；Asp的密码子可由GAU修饰为GAC；Glu的密码子可由GAA修饰为GAG；终止密码子UAA可修饰为UAG或UGA。另一方面，在Met(AUG)和Trp(UGG)密码子的情况下，不存在序列修饰的可能性。以上列出的取代可以单独使用或以所有可能的组合使用，以增加本发明mRNA序列相对于其特定野生型mRNA(即原始序列)的G/C含量。因此，例如，在野生型序列中出现的所有Thr密码子都可以修饰为ACC(或ACG)。然而，优选地，例如，使用上述替代可能性的组合：
将原始序列(野生型mRNA)中编码Thr的所有密码子取代为ACC(或ACG)和
将原始编码Ser的所有密码子取代为UCC(或UCG或AGC)；
将原始序列中编码Ile的所有密码子取代为AUC和
将原始编码Lys的所有密码子取代为AAG和
将原始编码Tyr的所有密码子取代为UAC；
将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC(或GUG)和
将原始编码Glu的所有密码子取代为GAG和
将原始编码Ala的所有密码子取代为GCC(或GCG)和
将原始编码Arg的所有密码子取代为CGC(或CGG)；
将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC(或GUG)和
将原始编码Glu的所有密码子取代为GAG和
将原始编码Ala的所有密码子取代为GCC(或GCG)和
将原始编码Gly的所有密码子取代为GGC(或GGG)和
将原始编码Asn的所有密码子取代为AAC；
将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC(或GUG)和
将原始编码Phe的所有密码子取代为UUC和
将原始编码Cys的所有密码子取代为UGC和
将原始编码Leu的所有密码子取代为CUG(或CUC)和
将原始编码Gln的所有密码子取代为CAG和
将原始编码Pro的所有密码子取代为CCC(或CCG)；等。
优选地，与野生型RNA编码区(其编码本文定义的抗原或其片段或变体)的G/C含量相比，包含本发明mRNA序列的mRNA化合物编码区的G/C含量增加至少7％、更优选至少15％、特别优选至少20％。根据特定实施方式，对编码本文所定义的肽或蛋白质或其片段或变体的区域或野生型mRNA序列的整个序列中的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％、最优选至少90％、95％、甚至100％的可取代密码子被取代，从而增加所述序列的G/C含量。在上下文中，与野生型序列相比，特别优选的是将本发明的mRNA序列、优选根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区的G/C含量增加到最大值(即100％的可取代密码子)。根据本发明，本发明mRNA序列的另一优选修饰基于以下发现，即翻译效率也由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，如果本发明的mRNA序列中存在所谓的“稀有密码子”的程度增加，则相应的修饰mRNA序列的翻译程度明显低于存在编码相对“频繁”tRNA的密码子的情况。根据本发明，在本发明的经修饰的mRNA序列中，与野生型mRNA序列的相应区域相比，对编码本文所定义的肽或蛋白质或其片段或变体的区域进行修饰，使得编码细胞中相对罕见的tRNA的野生型序列的至少一个密码子与编码在细胞中相对频繁的tRNA并携带与相对罕见的tRNA相同的氨基酸的密码子交换。通过这种修饰，本发明的mRNA序列被修饰，从而插入可获得频繁出现的tRNA的密码子。换言之，根据本发明，通过这种修饰，野生型序列的所有密码子(编码细胞中相对罕见的tRNA)在每种情况中都可以与编码细胞中相对频繁的tRNA且在每种情况下都携带与相对罕见的tRNA相同氨基酸的密码子交换。本领域技术人员已知哪些tRNA在细胞中出现相对频繁，而哪些tRNA相对很少出现；例如参见Akashi,Curr.Opin.Genet.Dev.2001,11(6):660-666。特别优选使用对于特定氨基酸使用最频繁出现的tRNA的密码子，例如，使用在(人类)细胞中最频繁出现的tRNA的Gly密码子。根据本发明，特别优选的是，在不修饰由mRNA序列的编码区编码的蛋白质的氨基酸序列的情况下，将在本发明的经修饰的mRNA序列中增加(特别是最大化)的相继的G/C含量与“频繁”密码子相连接。该优选实施方式允许提供本发明的特别有效的翻译和稳定(修饰)的mRNA序列。如上所述，可以使用WO02/098443中解释的计算机程序来确定本发明的经修饰mRNA序列(增加的G/C含量；tRNAs的交换)，其公开内容包括在本发明的全部范围内。使用该计算机程序，可借助遗传密码或其退化性质修饰任何所需mRNA序列的核苷酸序列，从而结合使用编码细胞中尽可能频繁出现的tRNA的密码子产生最大的G/C含量，与未经修饰的序列相比，由经修饰的mRNA序列编码的氨基酸序列优选未被修饰、作为选择，与原始序列相比，也可以只修饰G/C含量或密码子用法。WO02/098443中还描述了Visual Basic 6.0(使用的开发环境：Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0with Service Pack 3)中的源码。在本发明的另一优选实施方式中，与其相应野生型mRNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量相比，本发明mRNA序列的核糖体结合位点环境中的A/U含量增加。这种修饰(核糖体结合位点周围的A/U含量增加)提高了核糖体与mRNA结合的效率。核糖体与核糖体结合位点(Kozak序列：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，或最小Kozak序列ACC，其中AUG形成起始密码子)的有效结合反过来又具有mRNA有效翻译的效果。根据本发明的另一实施方式，本发明的mRNA序列可以相对于潜在的不稳定序列元件进行修饰。特别是，与相应野生型mRNA相比，该mRNA序列的编码区和/或5'和/或3'非翻译区可被修饰，以使其不包含不稳定序列元件，与其相应野生型mRNA相比，经修饰mRNA序列的编码氨基酸序列优选未被修饰。众所周知，例如在真核mRNAs序列中，会出现信号蛋白与之结合的不稳定序列元件(DSE)，其调节体内mRNA的酶降解。为了进一步稳定经修饰的mRNA序列，任选地在编码本文所定义的至少一种肽或蛋白质或其片段或变体的区域中，因此可进行与野生型mRNA的相应区域相比的一个或多个此类修饰，因此，不包含或基本上不包含不稳定序列元件。根据本发明，存在于未翻译区(3’-和/或5’-UTR)中的DSE也可通过此类修饰从本发明的mRNA序列中消除。这种不稳定序列是例如富AU序列(AURES)，其出现在许多不稳定mRNAs的3’-UTR片段中(Caputet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986,83:1670-1674)。因此，与相应的野生型mRNA相比，优选修饰本发明的mRNA序列，使得本发明的mRNA序列不包含此类不稳定序列。这也适用于那些被可能的核酸内切酶识别的序列基序，例如GAACAAG序列，它包含在编码转铁蛋白受体的基因的3’-UTR片段中(Binderet al.，EMBO J.1994,13:1969-1980)。这些序列基序也优选在本发明的mRNA序列中移除。
根据另一实施方式，mRNA化合物包含mRNA序列，该mRNA序列包含编码区，所述编码区包含如WO 2018/078053的表1至5、图20至24或序列表中所公开的RNA序列中的任一个或由其组成；WO 2018/078053通过引用全文并入。
适合人类密码子用法的序列
mRNA化合物的进一步优选修饰基于以下发现：编码相同氨基酸的密码子通常以不同频率出现。根据本实施方式，根据人类密码子用法，例如如表2(人类密码子用法表)所示，编码mRNA化合物编码区中相同氨基酸的密码子的频率不同于该密码子的自然出现频率。例如，在氨基酸丙氨酸(Ala)的情况下，野生型编码区优选地以这样的方式进行适配：密码子“GCC”的使用频率为0.40，密码子“GCT”的使用频率为0.28，密码子“GCA”的使用频率为0.22，密码子“GCG”的使用频率为0.10等(见表2)。
表2：人类密码子用法表，最常见的密码子用星号标记
Figure BDA0003701042630001341
Figure BDA0003701042630001351
*最频繁密码子
密码子优化序列
在一个实施方式中，编码tRNA(在细胞中相对罕见)的野生型序列的所有密码子都被交换为编码tRNA(在细胞中相对频繁，并且在每种情况下都携带与相对罕见的tRNA相同的氨基酸)的密码子。因此，对于每个编码的氨基酸，特别优选使用最频繁的密码子(见表2)。这样的优化过程增加了密码子适应指数(CAI)，并最终使CAI最大化。在本发明的上下文中，CAI增加或最大化的序列通常称为“密码子优化”序列和/或CAI增加和/或最大化序列。根据优选的实施方式，包含本发明mRNA序列的mRNA化合物包含至少一个编码区，其中编码区/序列是如本文所述优化的密码子。更优选地，至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为至少0.5、至少0.8、至少0.9或至少0.95。最优选地，至少一个编码序列的密码子适应指数(CAI)为1。
例如，在氨基酸丙氨酸(Ala)存在于由根据本发明的RNA的至少一个编码序列编码的氨基酸序列中的情况下，野生型编码序列以最频繁的人类密码子“GCC”始终用于所述氨基酸或氨基酸半胱氨酸(Cys)的方式适应，野生型序列以最频繁的人类密码子“TGC”始终用于所述氨基酸等的方式适应。
C-优化序列
根据另一个实施方式，mRNA化合物包含一个mRNA序列，与相应野生型mRNA(即未修饰的mRNA)编码区的C含量相比，该mRNA序列(优选该mRNA序列的编码区)具有修饰的，特别是增加的胞嘧啶(c)含量。同时，与相应野生型mRNA编码的氨基酸序列相比，由本发明mRNA序列的至少一个编码区编码的氨基酸序列优选不被修饰。
在本发明的优选实施方式中，仅修饰的mRNA序列经修饰以致达到理论上可能的最大胞嘧啶含量或甚至最大胞嘧啶含量的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，或至少90％。
在其他优选的实施方式中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至100％的靶mRNA野生型序列密码子(其是“胞嘧啶含量可优化的”)被胞嘧啶含量高于野生型序列中存在的胞嘧啶含量的密码子所取代。
在又一个优选的实施方式中，野生型编码序列的一些密码子可额外修饰，以使细胞中相对罕见的tRNA的密码子由细胞中相对频繁的tRNA的密码子交换，前提是相对频繁的tRNA的替代密码子携带与原始野生型密码子中相对罕见的tRNA相同的氨基酸。优选地，相对罕见的tRNA的所有密码子都被细胞中相对频繁的tRNA的密码子所取代，但编码氨基酸的密码子除外，其仅由不含任何胞嘧啶的密码子编码，或编码谷氨酰胺(Gln)的密码子除外，其由两个各自含有相同数目的胞嘧啶的密码子编码。
在本发明的又一个优选实施方式中，对修饰的靶mRNA进行修饰，使得通过密码子实现理论上可能的最大胞嘧啶含量或甚至最大胞嘧啶含量的至少80％或至少90％，该密码子编码细胞中相对频繁的tRNA，其中氨基酸序列保持不变。
由于遗传密码的自然发生的退化，可能有一个以上的密码子编码特定的氨基酸。因此，20种天然氨基酸中有18种由一个以上密码子编码(Tryp和Met除外)，例如由2个密码子(例如Cys、Asp、Glu)、3个密码子(例如Ile)、4个密码子(例如Al、Gly、Pro)或6个密码子(例如Leu、Arg、Ser)编码。然而，并非所有编码相同氨基酸的密码子在体内条件下都以相同的频率被利用。取决于每个单独的生物体，建立了典型的密码子用法概况。
在本发明上下文中使用的术语“胞嘧啶含量可优化密码子”指的是表现出比编码相同氨基酸的其他密码子更低胞嘧啶含量的密码子。因此，任何野生型密码子，其可被编码相同氨基酸的另一密码子所取代，并且在该密码子中显示出更多的胞嘧啶，则被认为是胞嘧啶可优化的(C-可优化的)。任何此类由野生型编码区内的特定C优化密码子取代C可优化野生型密码子的行为都会增加其总C含量，并反映出富含C的修饰的mRNA序列。根据优选的实施方式，本发明的mRNA序列，优选本发明的mRNA序列的至少一个编码区包含C-最大化mRNA序列(其包含所有潜在C-可优化密码子的C-优化密码子)或由其组成。因此，在编码区的整个长度上，100％或所有理论上可取代的C-可优化密码子优选地被C-优化密码子取代。
在上下文中，胞嘧啶含量可优化密码子是一种密码子，与编码相同氨基酸的其他密码子相比，它包含的胞嘧啶数量较少。
氨基酸Ala的任何密码子GCG、GCA、GCU可由编码相同氨基酸的密码子GCC交换，和/或
编码Cys的密码子UGU可由编码相同氨基酸的密码子UGC交换，和/或
编码Asp的密码子GAU可由编码相同氨基酸的密码子GAC交换，和/或
编码Phe的密码子UUU可由编码相同氨基酸的UUC密码子交换，和/或
编码Gly的任何密码子GGG、GGA、GGU可由编码相同氨基酸的密码子GGC交换，和/或
编码His的密码子CAU可由编码相同氨基酸的密码子CAC交换，和/或
编码Ile的任何密码子AUA、AUU可由密码子AUC交换，和/或
编码Leu的任何密码子UUG、UUA、CUG、CUA、CUU可由编码相同氨基酸的密码子CUC交换，和/或
编码Asn的密码子AAU可由编码相同氨基酸的密码子AAC交换，和/或
编码Pro的任何密码子CCG、CCA、CCU可由编码相同氨基酸的密码子CCC交换，和/或
编码Arg的任何密码子AGG、AGA、CGG、CGA、CGU可由编码相同氨基酸的密码子CGC交换，和/或
编码Ser的任何密码子AGU、AGC、UCG、UCA、UCU可由编码相同氨基酸的密码子UCC交换，和/或
编码Thr的任何密码子ACG、ACA、ACU可由编码相同氨基酸的密码子ACC交换，和/或
编码Val的任何密码子GUG、GUA、GUU可由编码相同氨基酸的密码子GUC交换，和/或
编码Tyr的密码子UAU可与编码相同氨基酸的密码子UAC交换。
在上述任何一种情况下，每交换一个密码子，胞嘧啶的数量增加1。编码区的所有非C-优化密码子(对应于C-可优化密码子)的交换导致C-最大化编码序列。在本发明的上下文中，根据本发明的mRNA序列的至少一个编码区内的至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的非C优化密码子被C优化密码子取代。
对于某些氨基酸，优选的是被C-优化密码子取代的C-可优化密码子的百分比为小于70％，而对于其他氨基酸，被取代的密码子的百分比高于70％，以满足C-优化的总体百分比为编码区所有C-可优化野生型密码子的至少70％的。
优选地，在C-优化mRNA序列中，对于任何给定的氨基酸，至少50％的C-可优化野生型密码子被C-优化密码子取代，例如，任何经修饰的富含C的mRNA序列优选在编码上述氨基酸Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val和Tyr中任何一种的C-可优化野生型密码子位置包含至少50％的C-优化密码子，优选至少60％。
在上下文中，可在无需任何进一步选择过程的情况下使用编码不是胞嘧啶含量可优化的，然而由至少两个密码子编码的氨基酸的密码子。然而，编码细胞(例如人类细胞)中相对罕见的tRNA的野生型序列的密码子可由编码细胞中相对频繁的tRNA的密码子交换，其中两者编码相同的氨基酸。因此，编码Glu的相对罕见的密码子GAA可由编码相同氨基酸的相对频繁的密码子GAG交换，和/或
编码Lys的相对罕见的密码子AAA可由编码相同氨基酸的相对频繁的密码子AAG交换，和/或
编码Gln的相对罕见的密码子CAA可由编码相同氨基酸的相对频繁的密码子CAG交换。
在上下文中，仅由一个密码子各自编码的氨基酸Met(AUG)和Trp(UGG)保持不变。终止密码子不是胞嘧啶含量优化的，然而，相对罕见的终止密码子amber，ochre(UAA、UAG)可由相对频繁的终止密码子opal(UGA)交换。
上述单个取代可单独使用，也可在所有可能的组合中使用，以优化与野生型mRNA序列相比的经修饰的mRNA序列的胞嘧啶含量。
因此，与相应野生型mRNA的编码区相比，可以以这样的方式改变本文定义的至少一个编码序列，从而使由至少两个或更多个密码子编码的氨基酸(其中一个密码子包含一个额外的胞嘧啶)，这样的密码子可由包含一个额外的胞嘧啶的C-优化密码子交换，其中与野生型序列相比，氨基酸优选未改变。
根据又一个优选实施方式，本发明组合物包含一种mRNA化合物，其编码区的G/C含量比相应野生型mRNA的相应编码区的G/C含量高，和/或C含量比相应野生型mRNA的相应编码区的C含量高，和/或其中编码区中的密码子适合人类密码子用法，其中，密码子适应指数(CAI)优选增加或最大化，并且其中，与相应野生型mRNA编码的氨基酸序列相比，由mRNA序列编码的氨基酸序列优选未被修饰。
在本发明的一个优选实施方式中，组合物包含mRNA化合物，其包含编码肽或蛋白质的编码区，其中编码区展示选自序列的G/C含量修饰、密码子修饰、密码子优化或C-优化的序列修饰。
在另一个优选实施方式中，如本文所定义的组合物或脂质纳米颗粒包含包含编码如本文所定义的肽或蛋白质的编码区的mRNA，其中，与相应野生型mRNA的编码区相比，
-编码区的G/C含量增加；
-编码区的C含量增加；
-编码区中的密码子用法与人类密码子用法相适应；和/或密码子适应指数(CAI)在编码区中增加或最大化。
5’-CAP结构
根据本发明的另一个优选实施方式，mRNA化合物可具有通过添加所谓的“5’-CAP结构”而修饰的序列，其优选如本文所述稳定mRNA。5’-CAP是一个实体，通常是一个修饰的核苷酸实体，通常“加帽”成熟mRNA的5’-端。5’-CAP通常可由修饰的核苷酸形成，特别是由鸟嘌呤核苷酸的衍生物形成。优选地，5’-CAP通过5’-5’-三磷酸酯键连接到5’-末端。5’-CAP可被甲基化，例如m7GpppN，其中N是携带5’-CAP的核酸的末端5’-核苷酸，通常是mRNA的5’-端。m7GpppN是5’-CAP结构，其天然存在于由聚合酶II转录的mRNA中，因此在本文中优选不被视为经修饰的mRNA中包含的修饰。因此，本发明的经修饰的mRNA序列可包含作为5’-cap的m7GpppN，但另外，经修饰的mRNA序列通常包含如本文所定义的至少一个进一步修饰。在一个优选的实施方式中，本发明的mRNA化合物包含5’-CAP结构，其中所述5’-CAP结构是m7GpppN。在最优选的实施方式中，5’-CAP结构选自由m7G(5’)、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)或相应地m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG组成的组。
在本发明的上下文中，也可以使用CAP类似物在化学RNA合成或RNA体外转录(共转录加帽)中形成5’-CAP结构，或者可以使用加帽酶在体外形成CAP结构。包含加帽酶的试剂盒可在市场上买到(例如，ScriptCapTM加帽酶和ScriptCapTM 2'-0-甲基转移酶(二者均来自CellScript))。因此，RNA转录本优选按照制造商的说明进行处理。
因此，CAP类似物是指具有CAP功能的不可聚合双核苷酸，其有助于翻译或定位，和/或防止RNA分子在并入RNA分子的5’-端时降解。不可聚合意味着CAP类似物将仅在5′端并入，因为它不具有5′三磷酸酯，因此不能通过依赖模板的RNA聚合酶在3′方向上延伸。
CAP类似物包括但不限于选自由m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；非甲基化CAP类似物(例如GpppG)；二甲基化CAP类似物(例如m2,7GpppG)、三甲基化CAP类似物(例如m2,2,7GpppG)、二甲基化对称CAP类似物(例如m7Gpppm7G)、或反逆向CAP类似物(例如ARCA；m7,2’OmeGpppG、m7,2’dGpppG、m7,3’OmeGpppG、m7,3’dGpppG及其四磷酸酯衍生物)(Stepinskietal.,2001.RNA 7(10):1486-95)组成的组的化学结构。
5’-CAP结构的其他实例包括甘油基、反式脱氧无碱性残基(部分)、4’,5’-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤式呋喃酰)核苷酸、4’-硫核苷酸、碳环核苷酸、1.5-脱水己醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰碱基核苷酸、苏式-五呋喃酰核苷酸、无环3’,4’-seco核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3’-3’-反式核苷酸部分、3’-3’-反式无碱性部分、3’-2’-反式核苷酸部分、3’-2’-反式无碱性部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3’-磷酰胺、磷酸己酯、磷酸氨基己酯、3’-磷酸酯、3’-硫逐磷酸酯、二硫代磷酸酯或桥联或非桥联甲基膦酸部分。这些经修饰的5’-CAP结构在此上下文中被视为至少一种修饰，并且可在本发明上下文中用于修饰本发明组合物的mRNA序列。
特别优选的经修饰的5’-CAP结构是CAP1(m7G相邻核苷酸的核糖甲基化)、cap2(m7G下游第二核苷酸的核糖额外甲基化)、cap3(m7G下游第三核苷酸的核糖的额外甲基化)、cap4(m7G下游第四核苷酸的核糖的甲基化)、ARCA(反逆向CAP类似物、修饰ARCA(例如硫代磷酸修饰的ARCA)、CleanCap或相应的m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG或m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(TriLink)和或WO2017053297A1(通过引用并入本文)中公开的CAP-结构、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮鸟苷。特别是，可从WO2017/053297的权利要求1至5中公开的结构衍生的任何CAP结构可适当用于共转录生成修饰的CAP1结构。此外，可从WO2018/075827的权利要求1或权利要求21中定义的结构衍生的任何CAP结构可适当用于共转录生成修饰的CAP1结构。
此外，CAP类似物已在前面描述过(US7074596、WO2008/016473、WO2008/157688、WO2009/149253、WO2011/015347和WO2013/059475)。最近描述了N7-(4-氯苯氧乙基)取代的二核苷酸CAP类似物的合成(Koreet al.(2013)Bioorg.Med.Chem.21(15):4570-4)。该情况下其他合适的CAP类似物描述于WO2017/066793、WO2017/066781、WO2017/066791、WO2017/066789、WO2017/066782、WO2018075827和WO2017/066797中，其中关于CAP类似物的具体公开通过引用并入本文。
聚(A)序列/聚A-尾
聚A尾也称为“3’-聚(A)尾”、“聚A序列”或“聚(A)序列”，其通常是最多约400个腺苷核苷酸的长序列，例如10至200、10至100、40至80、50至70、约25至约400、优选约50至约400、更优选约50至约300、甚至更优选约50至约250、最优选约60至约250个腺苷核苷酸，或约40至约150个腺苷核苷酸，或约70至90个腺苷核苷酸，添加至RNA的3’-端。在特别优选的实施方式中，聚(A)序列包含约64个腺苷核苷酸。在另一个特别优选的实施方式中，聚(A)序列包含约100个腺苷核苷酸。此外，聚(A)序列或聚(A)尾可通过RNA的酶促多聚腺苷酸化在体外生成，例如使用源自大肠杆菌或酵母的聚(A)聚合酶。适当地，编码RNA的聚(A)序列可以足够长，以结合至少2、3、4、5或更多个聚(A)结合蛋白单体。
多聚腺苷酸化通常被理解为将聚(A)序列添加到核酸分子(例如RNA分子)中，例如添加到成熟前mRNA中。多聚腺苷酸化可由所谓的多聚腺苷酸化信号诱导。该信号优选位于待多聚腺苷酸化的核酸分子(例如RNA分子)3’端的一段核苷酸内。多聚腺苷酸化信号通常包含由腺嘌呤和尿嘧啶/胸腺嘧啶核苷酸组成的六聚体，优选六聚体序列AAUAAA。还可以设想其他序列，优选六聚体序列。多聚腺苷酸化通常发生在前mRNA(也称为成熟前mRNA)的加工过程中。通常，RNA成熟(从前mRNA到成熟mRNA)包括多聚腺苷酸化步骤。
因此，根据又一个优选实施方式，组合物包含mRNA化合物，所述mRNA化合物包含mRNA序列，该mRNA序列在3’末端通常包含约10至200个腺苷核苷酸、优选约10至100个腺苷核苷酸、更优选约40至80个腺苷核苷酸、还优选约70至约90个腺苷核苷酸或甚至更优选约50至70个腺苷核苷酸的聚A尾。优选地，聚(A)序列通过RNA体外转录源自DNA模板。作为选择，聚(A)序列也可以通过常用的化学合成方法在体外获得，而不必从DNA祖代转录。此外，聚(A)序列或聚(A)尾可通过使用市售多聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案对根据本发明的RNA进行酶促多聚腺苷酸化来生成。
作为选择，如本文所述的mRNA任选地包含多聚腺苷酸化信号，其在本文中被定义为一种信号，其通过特定蛋白质因子(例如切割和多聚腺苷酸化特异性因子(CPSF)、切割刺激因子(CstF)、切割因子I和II(CF I和CF II)、聚(A)聚合酶(PAP))将多聚腺苷酸化传递到(转录的)RNA。在上下文中，共有多聚腺苷酸化信号优选包含NN(U/T)ANA共有序列。在特别优选的方面中，多聚腺苷酸化信号包含以下序列之一：AA(U/T)AAA或A(U/T)(U/T)AAA(其中尿苷通常存在于RNA中，胸腺嘧啶通常存在于DNA中)。
聚(C)序列
聚(C)-序列通常是胞嘧啶核苷酸的长序列，通常约10至约200个胞嘧啶核苷酸、优选约10至约100个胞嘧啶核苷酸、更优选约10至约70个胞嘧啶核苷酸、或更优选约20至约50或甚至约20至约30个胞嘧啶核苷酸。聚(C)序列可优选位于由核酸组成的编码区的3′。
因此，根据又一个优选实施方式，本发明的组合物包含mRNA化合物，该mRNA化合物在3’-末端通常包含约10至200个胞嘧啶核苷酸、优选约10至100个胞嘧啶核苷酸、更优选约20至70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优选约20至60或甚至10至40个胞嘧啶核苷酸的聚(C)尾。
在一个优选的实施方式中，mRNA化合物优选在5’-至3’-方向上包含：
a)5’-CAP结构，优选CAP1或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；
b)任选地5’-UTR元件，
c)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，
d)任选地，3'-UTR元件，
e)任选地，聚(A)序列，优选包含64个腺苷；
f)任选地，聚(c)序列，优选包含30个胞嘧啶。
UTRs
在优选的实施方式中，组合物包含mRNA化合物，其包含至少一个5’-或3’-UTR元件。在上下文中，UTR元件包含核酸序列或由其组成，该核酸序列源自任何天然存在的基因的5’-或3’-UTR，或源自基因的5’-或3’-UTR的片段、同系物或变体。优选地，根据本发明使用的5’-或3’-UTR元件与本发明mRNA序列的至少一个编码区异源。即使优选源自天然存在的基因的5’-或3’-UTR元件，也可在本发明的上下文中使用合成工程UTR元件。
术语“3’-UTR元件”通常指核酸序列，其包含源自3’-UTR或3’-UTR变体的核酸序列或由其组成。本发明意义上的3’-UTR元件可表示RNA(优选mRNA)的3’-UTR。因此，在本发明的意义上，优选地，3’-UTR元件可以是RNA(优选mRNA)的3’-UTR，或者它可以是RNA的3’-UTR的转录模板。因此，3’-UTR元件优选为与RNA的3’-UTR相对应的核酸序列，优选与mRNA的3’-UTR相对应，例如通过基因工程载体构建物的转录获得的mRNA。优选地，3’-UTR元素实现3’-UTR的功能，或编码实现3’-UTR功能的序列。
优选地，至少一个3’-UTR元件包含源自脊索动物基因(优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人类基因)的3’-UTR，或源自脊索动物基因(优选脊椎动物基因、更优选哺乳动物基因、最优选人类基因)的3’-UTR变体的核酸序列或由其组成。
优选地，组合物包含mRNA化合物，该化合物包含3’-UTR元件，所述3’-UTR元件可源自与半衰期增强(提供稳定mRNA)的mRNA相关的基因，例如下文定义和描述的3’-UTR元件。优选地，3’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自基因3’-UTR(其优选编码稳定的mRNA)，或源自所述基因的同系物、片段或变体。
在一个优选的实施方式中，WO 2019/077001 A1的表1、权利要求1和权利要求4、权利要求6至8和权利要求9中公开的UTR组合是本发明mRNA化合物的优选UTR组合。此外，优选地，WO 2019/077001 A1第24页表1后第二整段和第24页最后一段至第29页第二段中公开的UTR组合是本发明mRNA化合物的优选UTR组合。WO 2019/077001 A1通过引用全部并入本文。
在又一个优选的实施方式中，该3’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自基因的3’-UTR，其选自由选自PSMB3、ALB或ALB7、α-珠蛋白(称为“muag”，即，突变α-珠蛋白3’-UTR)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR组成的组，或源自这些基因中任何一种的同系物、片段或变体(例如，如WO2013/143700的SEQ ID NO:1369公开的白蛋白7/alb7 3’-UTR，通过引用全文并入本文)，或源自其同系物、片段或变体。在又一个优选的实施方式中，3’-UTR元件包含源自根据WO2013/143700的SEQ ID NO：1376的人类白蛋白基因片段的核酸序列(白蛋白7/alb73’-UTR)。在又一个优选的实施方式中，3’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自白蛋白基因的3’-UTR，优选脊椎动物白蛋白基因、更优选哺乳动物白蛋白基因、最优选人类白蛋白基因，例如根据GenBank登录号NM\U 000477.5(SEQ ID NO：13-18)的人类白蛋白基因的3’-UTR，或其片段或变体。在另一个优选实施方式中，3’-UTR元件包含以下部分或由其组成：α-珠蛋白基因3’-UTR的中心α-复合物结合部分，例如人类α-珠蛋白基因，或α-珠蛋白基因的同系物、片段或变体，优选根据SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6-8，或α-珠蛋白基因3’-UTR的α-复合物结合部分(本文中称为“muag”)GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG(SEQ ID NO：11或SEQID NO：12，对应专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1393)。
在另一个优选实施方式中，3’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自α-或β-珠蛋白基因的3’-UTR，优选脊椎动物α-或β-珠蛋白基因，且优选哺乳动物α-或β-珠蛋白基因，优选根据SEQ ID NOs：5、7、9、11、13、15、17、19的人类α-或β-珠蛋白基因或相应的RNA序列SEQ ID NOs：6、8、10、12、14、16、18、20，即(SEQ ID NO：5；DNA；HBA1 3’-UTR)；(SEQ ID NO：7；DNA；HBA2 3’-UTR)；(SEQ ID NO：9；DNA；HBB 3'-UTR)；(SEQ ID NO：11；DNA；muag 3'-UTR)；(SEQ ID NO：13；DNA；白蛋白3'-UTR)；(SEQ ID NO：15；DNA；白蛋白73'-UTR)；(SEQ ID NO：17；DNA；ALB7 3'-UTR)；(SEQ ID NO：19；DNA；PSMB3 3'-UTR)；(SEQID NO:6；RNA；HBA1 3'-UTR)；(SEQ ID NO：8；RNA；HBA2 3'-UTR)；(SEQ ID NO：10；RNA；HBB3'-UTR)；(SEQ ID NO：12；RNA；muag 3'-UTR)；(SEQ ID NO：14；RNA；白蛋白3'-UTR)；(SEQID NO：16；RNA；白蛋白7 3'-UTR)；(SEQ ID NO：18；RNA；ALB73'-UTR)；(SEQ ID NO：20；RNA；PSMB3 3'-UTR)。
在上下文中，还优选的是根据本发明mRNA序列的3’-UTR元件包含如SEQ ID NO：12所示的根据SEQ ID NO：11的核酸序列的相应RNA序列，或其同系物、片段或变体，或由其组成。
术语“源自[…]的3’-UTR的核酸序列基因”优选是指基于[…]基因的3’-UTR序列或其一部分的核酸序列，例如基于白蛋白基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原α基因(例如胶原α1(i)基因)的3’-UTR，优选白蛋白基因的3’-UTR或基于其一部分。该术语包括对应于整个3’-UTR序列的序列，即，基因的全长3’-UTR序列，以及与基因的3’-UTR序列片段相对应的序列，例如白蛋白基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂肪氧化酶基因或胶原α基因(例如胶原α1(i)基因)，优选白蛋白基因。
术语“源自[…]基因3’-UTR变体的核酸序列”优选是指核酸序列，其基于基因3’-UTR序列的变体，例如基于白蛋白基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因、酪氨酸羟化酶基因、脂氧合酶基因或胶原α基因(例如胶原蛋白α1(i)基因)的3’-UTR变体的核酸序列，或基于如上所述的其一部分。该术语包括对应于基因的3’-UTR变体的整个序列的序列，即基因的全长变体3’-UTR序列，以及与基因的变体3’-UTR序列片段相对应的序列。上下文中片段优选由与全长变体3’-UTR中核苷酸的连续段相对应的核苷酸的连续段，其代表至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％、最优选至少90％的全长变体3’-UTR。在本发明的意义上，变体的这种片段优选如本文所述的变体的功能片段。
根据优选的实施方式，根据本发明的包含mRNA序列的mRNA化合物包含5’-CAP结构和/或至少一个3’-非翻译区元件(3’-UTR元件)，优选如本文所定义。
在一个优选的实施方式中，mRNA化合物优选在5’-至3’-方向上包含：
a)5’-CAP结构，优选CAP1或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；
b)任选地，5’-UTR元件，
c)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，
d)任选地，3’-UTR元件，其优选包含一个核酸序列由其组成，该核酸序列源自α-珠蛋白基因，优选包含如SEQ-ID-NO：12所示的根据SEQ-ID-NO：11的核酸序列的相应RNA序列、其同系物、片段或变体；
e)任选地，聚(A)序列，优选包含64个腺苷或100个腺苷；
f)任选地，聚(C)序列，优选包含30个胞嘧啶。
在又一个优选的实施方式中，mRNA化合物优选在5’-至3’-方向上包含：
a)5’-CAP结构，优选CAP1或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；
b)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，优选源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)或其片段或变体的蛋白质，
c)任选地，3’-UTR元件，优选包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自α-珠蛋白基因，优选包含如SEQ-ID-NO：12所示的根据SEQ-ID-NO：11的核酸序列的相应RNA序列、其同系物、片段或变体；
d)任选地，聚(A)序列，优选包含64个腺苷；
e)任选地，聚(C)序列，优选包含30个胞嘧啶。
在又一个优选的实施方式中，组合物包含mRNA化合物，其包含至少一个5’-非翻译区元件(5’-UTR元件)。优选地，至少一个5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自TOP基因的5’-UTR或源自TOP基因的5’-UTR的片段、同系物或变体。优选的是，5’-UTR元件不包含上面定义的TOP基序或5’-TOP。
在一些实施方式中，源自TOP基因的5’-UTR的5’-UTR元件的核酸序列终止于其3’端，核苷酸位于其源自的基因或mRNA的起始密码子(例如A(U/T)G)上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位。因此，5’-UTR元件不包含蛋白质编码区的任何部分。因此，优选地，至少一个mRNA序列的唯一蛋白质编码部分由编码区提供。
源自TOP基因5’-UTR的核酸序列优选源自真核TOP基因、优选植物或动物TOP基因、更优选脊索动物TOP基因、甚至更优选脊椎动物TOP基因、最优选哺乳动物TOP基因，例如人类TOP基因。
例如，5’-UTR元件可选自包含一个核酸序列或由其组成的5’-UTR元件，该核酸序列源自选自由专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422组成的组的核酸序列，其公开内容通过引用并入本文，源自专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422的同系物，源自其变体，或优选源自相应的RNA序列。术语“专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422的同系物”是指除智人以外的其他物种的序列，其与根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422的序列同源。
在优选的实施方式中，mRNA化合物的5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自从核苷酸位置5(即位于序列中位置5的核苷酸)延伸至紧邻起始密码子(位于序列的3’端)的核苷酸位置5’的核酸序列，例如，核酸序列的紧邻ATG序列的核苷酸位置5’，核酸序列选自专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ IDNO：1421和SEQ ID NO：1422，选自专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ IDNO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422的同系物，选自其变体或相应的RNA序列。特别优选的是5’-UTR元件源自从紧邻5’-TOP的核苷酸位置3’延伸至紧邻起始密码子(位于序列的3’端)的核苷酸位置5’的核酸序列，例如，核酸序列的紧邻ATG序列的核苷酸位置5’，该核酸序列选自专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO：1422，选自专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1-1363、SEQ ID NO：1395、SEQ ID NO：1421和SEQ ID NO:1422的同系物、选自其变体或相应的RNA序列。
在又一个优选的实施方式中，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，其源自编码核糖体蛋白的TOP基因的5’-UTR或编码核糖体蛋白的TOP基因的5’-UTR变体。例如，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，其源自根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：67、170、193、244、259、554、650、675、700、721、913、1016、1063、1120、1138和1284-1360中任一个的核酸序列的5’-UTR、相应的RNA序列、其同系物或其变体，如本文所述，优选缺乏5’-TOP基序。如上所述，从位置5延伸至紧邻ATG(位于序列的3′端)的核苷酸5′的序列对应于所述序列的5′-UTR。
优选地，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，其源自编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5’-UTR或编码核糖体大蛋白(RPL)的TOP基因的5’-UTR的同系物或变体。例如，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，其源自根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：67、259、1284-1318、1344、1346、1348-1354、1357、1358、1421和1422的任一个的核酸序列的5’-UTR、相应的RNA序列、其同系物或其变体，如本文所述，优选缺乏5’-TOP基序。
在特别优选的实施方式中，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，其源自核糖体蛋白大32基因的5’-UTR，优选源自脊椎动物核糖体蛋白大32(L32)基因、更优选源自哺乳动物核糖体蛋白大32(L32)基因、最优选源自人核糖体蛋白大32(L32)基因，或源自核糖体蛋白大32基因5'-UTR的变体，优选源自脊椎动物核糖体蛋白大32(L32)基因、更优选源自哺乳动物核糖体蛋白大32(L32)基因、最优选源自人核糖体蛋白大32(L32)基因，其中优选地，5’-UTR元件不包含所述基因的5’-TOP。
因此，在优选的实施方式中，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，其与根据SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24(缺乏5’-末端寡核苷酸束的人类核糖体蛋白大32的5’-UTR：GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC；对应专利申请WO2013/143700的SEQ IDNO：1368)的核酸序列或优选与相应RNA序列具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或其中至少一个5’-UTR元件包含一个核酸序列的片段或由其组成，其与根据SEQ ID NO：23的核酸序列或更优选与相应RNA序列(SEQ ID NO：24)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中，优选地，该片段如上所述，即为代表全长5’-UTR至少20％等的核苷酸的连续段。优选地，该片段显示至少约20个核苷酸或更多、优选至少约30个核苷酸或更多、更优选至少约40个核苷酸或更多的长度。优选地，该片段是如本文所述的功能片段。
在极为优选的实施方式中，根据本发明的mRNA序列的5’-UTR元件包含根据SEQ IDNO：21或SEQ ID NO：22)的核酸序列的相应RNA序列或由其组成，即HSD17B4。此外，在极为优选的实施方式中，根据本发明的mRNA序列的3’-UTR元件包含根据SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20)的核酸序列的相应RNA序列或由其组成，即PSMB3。在另一个极为优选的实施方式中，根据本发明的mRNA序列的5’-UTR元件和3’-UTR元件包含前述HSD17B4和PSMB3-UTR的组合或由其组成。
在一些实施方式中，mRNA化合物包含5’-UTR元件，其包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自脊椎动物TOP基因的5’-UTR，例如哺乳动物，例如人类TOP基因，选自RPSA、RPS2、RPS3、RPS3A、RPS4、RPS5、RPS6、RPS7、RPS8、RPS9、RPS10、RPS11、RPS12、RPS13、RPS14、RPS15、RPS15A、RPS16、RPS17、RPS18、RPS19、RPS20、RPS21、RPS23、RPS24、RPS25、RPS26、RPS27、RPS27A、RPS28、RPS29、RPS30、RPL3、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPL9、RPL10、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL27A、RPL28、RPL29、RPL30、RPL31、RPL32、RPL34、RPL35、RPL35A、RPL36、RPL36A、RPL37、RPL37A、RPL38、RPL39、RPL40、RPL41、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPLP3、RPLP0、RPLP1、RPLP2、EEF1A1、EEF1B2、EEF1D、EEF1G、EEF2、EIF3E、EIF3F、EIF3H、EIF2S3、EIF3C、EIF3K、EIF3EIP、EIF4A2、PABPC1、HNRNPA1、TPT1、TUBB1、UBA52、NPM1、ATP5G2、GNB2L1、NME2、UQCRB或选自其同系物或变体，其中优选地5’-UTR元件不包含TOP基序或所述基因的5’-TOP，且其中5’-UTR元件从其5’-端开始，核苷酸位于5’-末端寡核苷酸束(TOP)下游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位，且其中进一步任选地，源自TOP基因的5’-UTR的5’-UTR元件在其3’-端终止，核苷酸位于其源自的基因的起始密码子(A(U/T)G)上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位。
在其他优选的实施方式中，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自核糖体蛋白大32基因(RPL32)、核糖体蛋白大35基因(RPL35)、核糖体蛋白大21基因(RPL21)、ATP合酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单元1、心肌(ATP5A1)基因、羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、雄激素诱导1基因(AIG1)、细胞色素c氧化酶亚单元VIc基因(COX6C)或N-酰基鞘氨醇氨基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)的5’-UTR或其变体，优选源自脊椎动物核糖体蛋白大32基因(RPL32)、脊椎动物核糖体蛋白大35基因(RPL35)、脊椎动物核糖体蛋白大21基因(RPL21)、脊椎动物ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单元1、心肌(ATP5A1)基因、脊椎动物羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、脊椎动物雄激素诱导1基因(AIG1)、脊椎动物细胞色素c氧化酶亚单元VIc基因(COX6C)或脊椎动物N-酰基鞘氨醇氨基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)的5’-UTR或其变体,更优选源自哺乳动物核糖体蛋白大32基因(RPL32)、核糖体蛋白大35基因(RPL35)、核糖体蛋白大21基因(RPL21)、哺乳动物ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单元1、心肌(ATP5A1)基因、哺乳动物羟基类固醇(17β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、哺乳动物雄激素诱导1基因(AIG1)，哺乳动物细胞色素c氧化酶亚单单元VIc基因(COX6C)或哺乳动物N-酰基鞘氨醇氨基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)的5’-UTR或其变体，最优选源自人核糖体蛋白大32基因(RPL32)、人核糖体蛋白大35基因(RPL35)、人核糖体蛋白大21基因(RPL21)、人ATP合成酶、H+转运、线粒体F1复合物、α亚单元1、心肌(ATP5A1)基因、人羟基类固醇(17β)脱氢酶4基因(HSD17B4)、人雄激素诱导1基因(AIG1)，人细胞色素c氧化酶亚单位VIc基因(COX6C)或人N-酰基鞘氨醇氨基水解酶(酸性神经酰胺酶)1基因(ASAH1)的5’-UTR或其变体，其中优选地5’-UTR元件不包含所述基因的5’-TOP。
因此，在优选的实施方式中，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列与根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1368或SEQ ID NO：1412-1420的核酸序列或相应的RNA序列具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或其中至少一个5’-UTR元件包含一个核酸序列的片段或由其组成，该片段与根据专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO：1368或SEQ ID NO：1412-1420的核酸序列具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中，优选地，该片段如上所述，即为代表全长5’-UTR至少20％等的核苷酸的连续段。优选地，该片段显示至少约20个核苷酸或更多、优选至少约30个核苷酸或更多、更优选至少约40个核苷酸或更多的长度。优选地，该片段是如本文所述的功能片段。
因此，在优选的实施方式中，5’-UTR元件包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列与根据SEQ ID NO：25(缺乏5’-末端寡核苷酸束的ATP5A1的5’-UTR：GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCGGAGTAACTGCAAAG；对应专利申请WO2013/143700的SEQ ID NO:224289)的核酸序列或优选与相应的RNA序列(SEQ ID NO：26)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，或其中至少一个5’-UTR元件包含一个核酸序列的片段或由其组成，该片段与根据SEQ ID NO：25的核酸序列或更优选的相应RNA序列(SEQ ID NO：26)具有至少约40％、优选至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、更优选至少约90％、甚至更优选至少约95％、甚至更优选至少约99％的同一性，其中，优选地，该片段如上所述，即为代表全长5’-UTR至少20％等的核苷酸的连续段。优选地，该片段显示至少约20个核苷酸或更多、优选至少约30个核苷酸或更多、更优选至少约40个核苷酸或更多的长度。优选地，该片段是如本文所述的功能片段。
在另一个优选实施方式中，mRNA化合物包含5’-UTR元件，其包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自60S核糖体蛋白L31(RPL31)基因，其中所述5’-UTR元件包含根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO：13的DNA序列或相应地根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO：14的RNA序列，或由其组成。在另一个优选实施方式中，mRNA化合物包含3’-UTR元件，其包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自40S核糖体蛋白S9(RPS9)基因，其中所述3’-UTR元件包含根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO：33的DNA序列或相应地根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO：34的RNA序列，或由其组成。在其他优选的实施方式中，mRNA化合物包含如WO2019077001A1中所公开的UTR组合，即5’-UTR元件(其包含源自RPL31基因的核酸序列或由其组成)和3’-UTR元件(其包含源自RPS9基因的核酸序列或由其组成)二者。
在另一个优选实施方式中，mRNA化合物包含5’-UTR元件，其包含源自阳离子氨基酸转运蛋白3(溶质载体家族7成员3，SLC7A3)基因的核酸序列或由其组成，其中所述5’-UTR元件包含根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO：15的DNA序列或相应地根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO：16的RNA序列，或由其组成。在另一个优选实施方式中，mRNA化合物包含3’-UTR元件，其包含源自蛋白酶体亚单元β3型(PSMB3)基因的核酸序列或由其组成，其中所述3’-UTR元件包含根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO:23的DNA序列或相应地根据如WO2019077001A1中所公开的SEQ ID NO:24的RNA序列，或由其组成。在其他优选的实施方式中，mRNA化合物包含如WO2019077001A1中所公开的UTR组合，即，5’-UTR元件(其包含源自SLc7a3基因的核酸序列或由其组成)和3’-UTR元件(其包含源自PSMB3基因的核酸序列或由其组成)二者。
优选地，至少一个5’-UTR元件和至少一个3’-UTR元件协同作用以增加来自上述至少一个mRNA序列的蛋白质产量。
根据优选的实施方式，本发明的组合物包含mRNA化合物，其优选在5’-至3’-方向上包含：
a)5’-CAP结构，优选CAP1或m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；
b)任选地，5’-UTR元件，其优选包含一个核酸序列或由其组成，该核酸序列源自TOP基因的5’-UTR，更优选包含根据SEQ ID NO：21、23、25或相应地SEQ ID NO：22、24或26的核酸序列的相应RNA序列、其同系物、片段或变体，或由其组成；
c)至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质或其片段或变体的编码区，该抗原肽或蛋白质优选源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、流感病毒或狂犬病病毒的蛋白质，优选地包含序列表中所公开的核酸序列中的任何一个或由其组成，该序列表具有数字标识符<223>，其始于“衍生的和/或修饰的CDS序列(重量)”或“衍生的和/或修饰的CDS序列(opt1)”、“衍生的和/或修饰的CDS序列(opt2)”、“衍生的和/或修饰的CDS序列(opt3)”、“衍生的和/或修饰的CDS序列(opt4)”或“衍生的和/或修饰的CDS序列(opt5)”，或相应地图20至24的表1至5的“B栏”或“C栏”或相应地PCT/EP2016/075843或WO 2018/078053的序列表；或SEQ ID NO：27-40，或71中包含的ORF，或这些序列中任何一个的片段或变体的ORF；至少一个编码至少一种抗原肽或蛋白质的编码区，该抗原肽或蛋白质优选源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)；
d)任选地，3’-UTR元件，其优选包含源自提供稳定mRNA的基因的核酸序列或由其组成，优选包含根据SEQ ID NO：5、7、9、11、13、15、17或19(优选根据SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：17)的核酸序列的相应RNA序列或其同系物、片段或变体，或由其组成；
e)任选地，聚(A)序列优选包含64个腺苷；和
f)任选地，聚(C)序列优选包含30个胞嘧啶。
根据一个实施方式，mRNA化合物包含miRNA序列。miRNA(microRNA)通常是一种长度为约20至25个核苷酸的小型非编码单链RNA分子，可在基因调节中发挥作用，例如，但不限于通过mRNA降解或翻译抑制或抑制。miRNA通常由发夹状前体RNA(前miRNA)产生，且它们可与蛋白质形成功能复合物。此外，miRNA可与靶mRNA的3'-UTR区域结合。优选地，microRNA结合位点用于选自由miR-126、miR-142、miR-144、miR-146、miR-150、miR-155、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27、miR-26a或其任何组合组成的组的microRNA。
在一个实施方式中，miRNA序列是天然存在的miRNA序列。在另一实施方式中，miRNA序列可以是天然存在的miRNA序列的模拟物或修饰物。
根据一个优选实施方式，根据本发明包含mRNA序列的mRNA化合物可进一步包含，如本文所定义：
a)5’-CAP结构；
b)至少一个miRNA序列，优选地其中microRNA结合位点用于选自由miR-126、miR-142、miR-144、miR-146、miR-150、miR-155、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27、miR-26a或其任何组合组成的组的microRNA；
c)至少一个5'-UTR元件；
d)至少一个3’-UTR元件；
e)至少一个聚(A)序列；
f)至少一个聚(C)序列；
或其任何组合。
组蛋白茎环(HSL)/组蛋白3'UTR茎环
在又一个优选的实施方式中，组合物包含含有组蛋白茎环序列/结构(HSL)的mRNA化合物。在所述实施方式中，mRNA序列可包含至少一个(或多个)组蛋白茎环序列或结构。此类组蛋白茎环序列优选选自WO 2012/019780 A1中公开的组蛋白茎环序列，其公开内容通过引用并入本文。可在本发明中使用的组蛋白干环序列可优选源自WO 2012/019780 A1的式(I)或(II)。根据另一优选实施方式，编码RNA可包含至少一个组蛋白茎环序列，该序列源自专利申请WO 2012/019780 A1的特定式(Ia)或(IIa)中的至少一个。根据另一优选实施方式，编码RNA可包含至少一个组蛋白茎环序列，该序列源自专利申请WO 2018/104538 A1中式(I)、式(II)、式(Ia)下或第49至52页的“组蛋白茎环”部分，以及WO 2018/104538 A1中公开的WO 2018/104538 A1-SEQ ID NOs：1451-1452所公开的组蛋白茎环；WO 2018/104538A1，通过引用全文并入本文，尤其是SEQ ID NOs：1451-1452。
在特别优选的实施方式中，本发明的RNA包含至少一个组蛋白茎环序列，其中所述组蛋白茎环序列包含与SEQ ID NOs：3或4相同或至少70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列或其片段或变体。
信号肽
根据另一个实施方式，本发明的组合物包含mRNA化合物，该mRNA化合物可额外或作为选择，编码分泌信号肽。此类信号肽为序列，其通常显示约15至30个氨基酸的长度，且优选位于编码肽的N末端，但不限于此。如本文所定义的信号肽优选地允许将由至少一个mRNA序列编码的抗原、抗原蛋白或抗原肽运输到所定义的细胞室，优选细胞表面、内质网(ER)或内质体溶酶体室。本文所定义的分泌信号肽序列的实例包括但不限于经典或非经典MHC分子的信号序列(例如MHC I和II分子的信号序列，例如MHC I类分子HLA-A*0201的信号序列)、如本文所定义的细胞因子或免疫球蛋白的信号序列、如本文所定义的免疫球蛋白或抗体的不变链的信号序列、Lamp1、Tapasin、Erp57、钙网蛋白、钙结合蛋白和其他膜相关蛋白或内质网(ER)或内质体溶酶体室相关蛋白的信号序列。最优选地，根据本发明，可使用MHC I类分子HLA-A*0201的信号序列。例如，优选使用源自HLA-A的信号肽以促进本文所定义的编码抗原或其片段或变体的分泌。更优选地，HLA-A信号肽融合为本文所定义的编码抗原或其片段或变体。
拟并入本发明组合物中的mRNA化合物可使用本领域已知的任何方法，包括合成方法，例如固相RNA合成，以及体外方法，例如RNA体外转录反应来制备，具体如实施例所述。
制备脂质纳米颗粒组合物的方法
本发明还涉及制备所述脂质纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供：
a)本文所定义的式(I)的阳离子脂质或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体；
b)本文所定义的聚合物结合的脂质；
c)至少一种mRNA化合物，其包含编码至少一种抗原肽或蛋白质的mRNA序列；
d)任选地，类固醇；
e)任选地，中性脂质；
(ii)将阳离子脂质和/或聚合物结合的脂质和任选的中性脂质和/或类固醇或类固醇衍生物溶解在醇(如乙醇)中
(iii)将醇性脂质溶液与包含mRNA多核苷酸的水溶液混合
(iv)去除醇以形成封装或结合mRNA多核苷酸的脂质纳米颗粒；和任选地
(v)分离或纯化脂质纳米颗粒。
可通过任何适当的方法去除醇，该方法不会对脂质或形成的脂质纳米颗粒产生负面影响。在本发明的一个实施方式中，醇通过渗析去除。在替代性实施方式中，醇通过渗滤去除。
脂质纳米颗粒的分离和选择性纯化也可以通过任何合适的方法进行。优选地，过滤脂质纳米颗粒，更优选通过无菌过滤器过滤分离或纯化脂质纳米颗粒。
在一些实施方式中，溶液在微流控混合器中混合以获得组合物。适当地，选择微流控混合条件以便以80％以上、优选90％以上、更优选94％以上的封装效率(EE)获得药学活性化合物的封装。
药物组合物和试剂盒
本发明还涉及包含至少一种根据本发明的脂质纳米颗粒的药物组合物。脂质纳米颗粒可包含mRNA化合物，其包含编码至少一种如本文所定义的抗原肽或蛋白质的序列。
在本发明的一个实施方式中，mRNA序列编码一种抗原肽或蛋白质。在本发明的替代性实施方式中，mRNA序列编码一种以上的抗原肽或蛋白质。
在本发明的一个实施方式中，药物组合物包含根据本发明的脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒包含一种以上的mRNA化合物，每种化合物包含编码抗原肽或蛋白质的不同mRNA序列。
在本发明的一个替代性实施方式中，药物组合物包含第二脂质纳米颗粒，其中由第二脂质纳米颗粒组成的mRNA化合物不同于由第一脂质纳米颗粒组成的mRNA化合物。
在另一个方面中，本发明涉及一种包含mRNA的组合物，其包含脂质纳米颗粒，其中mRNA包含含有至少一个如本文所定义的编码区的mRNA序列和药学上可接受的载体。根据本发明的组合物优选作为药物组合物或疫苗提供。
根据本发明的组合物还可以包含合适的药学上可接受的佐剂。在优选的实施方式中，优选添加佐剂以增强组合物的免疫刺激性。在上下文中，佐剂可理解为任何化合物，其适于支持根据本发明的组合物的施用和递送。此外，这种佐剂可以在不与之结合的情况下启动或增加先天免疫系统的免疫应答，即非特异性免疫应答。换言之，施用时，根据本发明的组合物通常因本文所定义的抗原或其片段或变体而引发适应性免疫应答，该抗原或其片段或变体由本发明组合物中包含的本发明mRNA的至少一个编码序列编码。另外，根据本发明的组合物可由于在根据本发明的组合物中添加了本文所定义的佐剂而产生(支持性)天然免疫应答。
在一些实施方式中，本发明提供了一种诱导受试者免疫应答的方法，该方法包括对受试者使用本发明疫苗，其量有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。在其他实施方式中，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文所述的组合物或试剂盒或套组试剂盒，以用于对受试者进行疫苗接种，其包含有效剂量的编码病毒抗原的mRNA。
此类佐剂可选自技术人员已知且适用于本方面情况的任何佐剂，即支持在哺乳动物中诱导免疫应答。优选地，佐剂可选自由如WO 2018/078053 A1第160页第3行至第161页第8行所公开的佐剂组成的组，但不限于此；WO 2018/078053 A1通过引用全部并入本文。
特别优选的是，佐剂可选自以下佐剂，其支持Th1免疫应答的诱导或先天性T细胞的成熟，例如GM-CSF、IL-12、FNγ、如上文定义的任何免疫刺激核酸，优选免疫刺激RNA、CpGDNA等。
在另一个优选的实施方式中，本发明组合物除含有提供抗原的mRNA外，还可能含有其他成分，这些组分选自包括以下的组：其他抗原(例如，以肽或蛋白质的形式)或其他编码抗原的核酸；其他免疫治疗剂；一种或多种辅助物质；或任何其他化合物，已知由于其与人类Toll样受体的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激作用；和/或辅助核酸，优选免疫刺激RNA(isRNA)。
如果需要，本发明的组合物还可以含有一种或多种辅助物质，以增加其免疫原性或免疫刺激能力。本文所定义的mRNA和可任选地包含在本发明组合物中的辅助物质的协同作用优选地由此实现。取决于各种类型的辅助物质，在这方面可以考虑各种机制。例如，允许树突状细胞(DC)成熟的化合物，例如脂多糖、TNFα或CD40配体，形成第一类合适的辅助物质。一般来说，可以使用以“危险信号”(LPS、GP96等)的方式影响免疫系统的任何试剂或细胞因子(如GM-CFS)作为辅助物质，以有针对性的方式增强和/或影响免疫应答。特别优选的辅助物质是细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，它们进一步促进先天免疫应答，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IFN-α、IFN-α、IFN-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生长因子，如hGH。
合适的佐剂还可选自具有式GlXmGn的核酸，其中G是鸟苷、尿嘧啶或鸟苷或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；l是1至40的整数，其中当l＝1时，G是鸟苷或其类似物，当l>1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物；m是整数且至少为3；其中当m＝3时，X是尿嘧啶或其类似物，当m>3时，出现至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；n是1至40的整数，其中n＝1时，G是鸟苷或其类似物，当n>1时，至少50％的核苷酸是鸟苷或其类似物，或具有式：(NuGlXmGnNv)a，其中G是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)或鸟苷(鸟嘌呤)或尿苷(尿嘧啶)的类似物，优选鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；X是鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸的类似物(核苷)，优选尿苷(尿嘧啶)或其类似物；N是长度为约4至50、优选为约4至40、更优选为约4至30或4至20个核酸的核酸序列，每个N独立地选自鸟苷(鸟嘌呤)、尿苷(尿嘧啶)、腺苷(腺嘌呤)、胸苷(胸腺嘧啶)、胞苷(胞嘧啶)或这些核苷酸(核苷)的类似物；a是1至20、优选1至15、最优选1至10的整数；l是1至40的整数，其中当l＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当l>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；m是整数且至少为3；其中当m＝3时，X是尿苷(尿嘧啶)或其类似物，且当m>3时，出现至少3个连续尿苷(尿嘧啶)或尿苷(尿嘧啶)的类似物；n是1至40的整数，其中当n＝1时，G是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物，当n>1时，至少50％的这些核苷酸(核苷)是鸟苷(鸟嘌呤)或其类似物；u、v可彼此独立地为0至50的整数，优选地其中当u＝0时，v≥1，或当v＝0时，u≥1；其中式(NuGlXmGnNv)a的核酸分子的长度为至少50个核苷酸、优选至少100个核苷酸、更优选至少150个核苷酸、甚至更优选至少200个核苷酸、最优选至少250个核苷酸。其他合适的佐剂还可选自具有式ClXmCn的核酸，其中：C是胞嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶，腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述核苷酸的类似物；l是1至40的整数，其中当l＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，当l>1时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；m是整数且至少为3；其中当m＝3时，X是尿嘧啶或其类似物，当m>3时，出现至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；n是1至40的整数，其中当n＝1时，C是胞嘧啶或其类似物，当n>1时，至少50％的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。
在上下文中，WO 2008/014979(全部公开，尤其是权利要求1、权利要求2、权利要求3、权利要求4和权利要求5的主题)和WO 2009/095226的公开也通过引用全部并入本文。
在另一个方面中，本发明提供一种疫苗，其基于根据本发明的包含mRNA的脂质纳米颗粒，该脂质纳米颗粒包含至少一种mRNA化合物，该mRNA化合物包含如本文所定义的编码区的mRNA序列。根据本发明的疫苗优选如本文所定义的(药物)组合物。
因此，根据本发明的疫苗基于与本文所述(药物)组合物相同的成分。到目前为止，可以提及本文所提供的(药物)组合物的描述。优选地，根据本发明的疫苗包含至少一种含mRNA的脂质纳米颗粒的，所述脂质纳米颗粒包含至少一个如本文所定义的mRNA序列和药学上可接受的载体。在实施方式中，如果疫苗包含封装在含mRNA的脂质纳米颗粒中的一个以上的mRNA序列(例如根据本发明的多个RNA序列，其中每个序列编码不同的抗原肽或蛋白质)，则疫苗可以以物理上单独的形式提供，并且可以通过单独的施用步骤进行施用。根据本发明的疫苗可对应于如本文所述的(药物)组合物，尤其是当mRNA序列由一种单一组合物提供时。然而，本发明的疫苗也可以以物理上分离的形式提供。例如，在实施方式中，其中疫苗包含一个以上的封装在本文定义的含mRNA的脂质纳米颗粒中的mRNA序列/物种，则可以提供这些RNA物种，以致例如提供两个、三个、四个、五个或六个单独的组合物，每个组合物可包含至少一个mRNA物种/序列(例如三个不同的mRNA物种/序列)，每个mRNA物种/序列编码不同的抗原肽或蛋白质，可以组合也可以不组合。此外，本发明的疫苗可以是至少两种不同组合物的组合，每种组合物包含至少一种编码本文定义的抗原肽或蛋白质中的至少一种的mRNA。作为选择，疫苗可作为至少一种mRNA的组合提供，优选至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种mRNA，每种mRNA编码本文定义的抗原肽或蛋白质中的一种。疫苗可在使用前组合以提供一种单一组合物，或可使用以致需要一次以上施用以施用不同的mRNA序列/物种，其编码封装在本文所定义的含mRNA的脂质纳米颗粒中的任何抗原肽或蛋白质。如果疫苗包含至少一种含mRNA的脂质纳米颗粒，其通常包含至少两个mRNA序列(编码本文定义的抗原组合)，则可以例如通过一次单一施用(结合所有mRNA物种/序列)，通过至少两次单独施用来施用。因此，作为单独实体(包含一种mRNA物种)或作为组合实体(包含一种以上mRNA物种)提供的编码至少一种抗原肽或蛋白质或本文定义的抗原的任何组合(以及可选的进一步抗原)的单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA的任何组合被理解为根据本发明的疫苗。根据本发明疫苗的特别优选的实施方式，提供至少一种抗原，优选如本文所定义的作为整体的由本发明组合物编码的至少两种、三种、四种、五种、六种或更多抗原的组合作为单独施用的单个(单顺反子)mRNA。
与根据本发明的(药物)组合物一样，疫苗的实体可以以液体和或干燥(例如冻干)形式提供。它们可能含有其他成分，特别是允许其药用的其他成分。例如，疫苗或(药物)组合物可另外包含药学上可接受的载体和/或其他辅助物质和添加剂和/或佐剂。
疫苗或(药物)组合物通常包含安全有效量的如本文所定义的根据本发明的mRNA化合物，其编码如本文所定义的抗原肽或蛋白质或其片段或变体或抗原组合，封装在脂质纳米颗粒内和/或与脂质纳米颗粒相关。如本文中所用，“安全有效量”是指足以显著诱导癌症或与癌症相关的疾病或紊乱的阳性修饰的mRNA量。然而，同时，“安全有效的量”足够小，可以避免严重的副作用，也就是说，可以在优势和风险之间建立合理的关系。这些限制的确定通常在合理的医学判断范围内。关于本发明的疫苗或(药物)组合物，表述“安全有效量”优选地是指适于刺激适应性免疫系统的mRNA的量(以及由此编码的抗原的量)，所述方式使得不会产生过度或破坏性的免疫应答，但是，优选地，也没有低于可测量水平的免疫应答。此外，还可以根据mRNA的类型(例如单顺反子、双顺反子甚至多顺反子mRNA)选择本文所定义的(药物)组合物或疫苗的mRNA的这种“安全有效量”，这是因为双顺反子甚至多顺反子mRNA可能导致一种或多种编码抗原的表达显著高于使用等量的单顺反子mRNA。此外，上文定义的(药物)组合物或疫苗的mRNA的“安全有效量”将在陪护医生的知识和经验范围内随着待治疗的特定状况以及待治疗患者的年龄和身体状况、状况的严重程度、治疗的持续时间、伴随疗法的性质、使用的具体药学上可接受载体的性质以及类似因素而变化。根据本发明的疫苗或组合物可根据本发明用于人类以及用于兽医目的，作为药物组合物或疫苗。
在优选的实施方式中，以冻干形式提供根据本发明的(药物)组合物、疫苗或套组试剂盒的含mRNA的脂质纳米颗粒。优选地，在施用之前，将冻干的含mRNA的脂质纳米颗粒在合适的缓冲液中重组，该缓冲液有利地基于水性载体，例如乳酸林格溶液、林格溶液、磷酸盐缓冲溶液。在优选的实施方式中，根据本发明的(药物)组合物、疫苗或套组试剂盒包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多mRNA化合物，其可作为单一种类的脂质纳米颗粒提供，或单独用于每个LNP种类，任选地以冻干形式(任选地与至少一种另外的添加剂一起)，并且在使用之前优选地在合适的缓冲液(例如乳酸林格溶液)中单独重组，以便允许单独施用每种(单顺反子)mRNA。
根据本发明的疫苗或(药物)组合物通常可包含药学上可接受的载体或赋形剂。合适的载体和赋形剂的实例是本领域技术人员已知的，包括但不限于防腐剂、填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、香料、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂，取决于施用方式和剂型的性质。本发明上下文中的术语“药物组合物”是指包含活性剂且另外包含一种或多种药学上可接受的载体的组合物。组合物可进一步包含选自例如选自稀释剂、赋形剂、载体、防腐剂、填料、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、香料、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂的组分，取决于施用方式和剂型的性质。
如本文所使用的表达“药学上可接受的载体”优选地包括本发明疫苗的液体或非液体基础。如果本发明的疫苗以液体形式提供，载体将是水，通常是无热原的水；等渗盐水或缓冲(水)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。特别是对于本发明疫苗的注射，可使用水或优选缓冲液，更优选水性缓冲液，其含有钠盐，优选至少50mM的钠盐，钙盐，优选至少0.01mM的钙盐，以及任选的钾盐，优选至少3mM的钾盐。根据优选的实施方式，钠盐、钙盐和任选地钾盐可能以卤化物的形式出现，例如氯化物、碘化物或溴化物，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐的形式出现。不限于此，钠盐的实例包括例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，任选的钾盐的实例包括例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，钙盐的实例包括例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外，缓冲液中可含有上述阳离子的有机阴离子。根据更优选的实施方式，适于如上所定义的注射目的的缓冲液可包含选自化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)和任选地氯化钾(KCl)的盐，其中，除氯化物外，还可能存在其他阴离子。CaCl2也可以被另一种盐代替，如KCl。通常，注射缓冲液中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl)、至少3mM氯化钾(KCl)和至少0.01mM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。注射缓冲液可参考特定参考介质为高渗、等渗或低渗，即缓冲液可参考特定参考介质具有更高、相同或更低的盐含量，其中优选地，可使用上述盐的此类浓度，其不会由于渗透作用或其他浓度效应而导致细胞损伤。参考介质是例如在“体内”方法中出现的液体，如血液、淋巴、细胞溶质液体或其他体液，或例如液体，可在“体外”方法中用作参考介质，如普通缓冲液或液体。这种常见的缓冲液或液体为技术人员所知。
然而，也可使用一种或多种适于给人施用的相容固体或液体填料或稀释剂或封装化合物。本文使用的术语“相容性”是指本发明疫苗的赋形剂能够以不会发生相互作用的方式与本文定义的根据本发明的mRNA混合，而相互作用将大大降低本发明疫苗在典型使用条件下的药物效力。当然，药学上可接受的载体、填料和稀释剂必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适合给待治疗的人施用。可用作其药学上可接受的载体、填料或赋形剂的化合物的一些实例是糖，如，例如，乳糖、葡萄糖、海藻糖和蔗糖；淀粉，如，例如，玉米淀粉或马铃薯淀粉；葡萄糖；纤维素及其衍生物，如，例如，羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；牛脂；固体润滑剂，如，例如，硬脂酸，硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如，例如，花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如，例如，聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；褐藻酸。
原则上，通过施用根据本发明的药物组合物或疫苗的方式来确定药学上可接受载体的选择。组合物或疫苗可通过例如，全身或局部施用。
全身施用的一般途径包括：例如，透皮、口服、肠外途径，包括皮下、静脉、肌肉内、动脉内、皮内和腹腔内注射和/或鼻内施用途径。根据本发明用于疫苗施用的优选施用途径是肌肉内注射和皮内注射。
局部施用的途径一般包括：例如，局部施用途径，还包括皮内、透皮、皮下或肌肉内注射，或病灶内、颅内、肺内、心内和舌下注射。更优选地，根据本发明的组合物或疫苗可通过皮内、皮下或肌肉内途径投与，优选通过注射来施用，其可为无针和/或针头注射。
根据优选的实施方式，人工核酸(RNA)分子、(药物)组合物或疫苗或试剂盒通过肠外途径施用，优选经由皮内、皮下或肌肉内途径施用。优选地，所述人工核酸(RNA)分子、(药物)组合物或疫苗或试剂盒可通过注射施用，例如皮下注射、肌肉内注射或皮内注射，其可为无针注射和/或针头注射。因此，在优选的实施方式中，根据本发明的医疗用途和/或治疗方法涉及通过皮下、肌肉内或皮内注射，优选通过肌肉内或皮内注射，更优选通过皮内注射，施用所述人工核酸(RNA)分子、(药物)组合物或疫苗或试剂盒。此类注射可通过使用常规针头喷射或(无针)喷射注射进行，优选地通过使用(无针)喷射注射进行。
如本文中所用术语“喷射注射”指的是一种无针注射方法，其中，迫使含有至少一个本发明mRNA序列和任选地，其他合适的赋形剂的流体通过孔口，从而产生能够穿透哺乳动物皮肤和皮下组织或肌肉组织(取决于注射设置)的超精细高压液体流。原则上，液体流在皮肤上形成孔，液体流通过该孔被推入目标组织。优选地，喷射注射用于根据本发明的mRNA序列的皮内、皮下或肌肉内注射。在优选的实施方式中，喷射注射用于根据本发明的mRNA序列的肌肉内注射。在又一个优选的实施方式中，喷射注射用于根据本发明的mRNA序列的皮内注射。
因此，组合物/疫苗优选以液体或固体形式配制。可通过常规实验(例如通过使用动物模型)确定要施用的根据本发明的疫苗或组合物的适当量。此类模型包括(但无任何限制)兔子、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。注射用优选单位剂量形式包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。应将此类溶液的pH调整至生理上可耐受的pH，例如约7.4。合适的注射用载体包括水凝胶、控释或缓释装置、聚乳酸和胶原基质。用于局部施用的合适的药学上可接受的载体包括那些适合用于乳液、乳膏、凝胶等的载体。如果本发明组合物或疫苗将经口施用，片剂、胶囊等是优选的单位剂量形式。用于制备可用于口服施用的单位剂量形式的药学上可接受的载体在现有技术中是众所周知的。其选择将取决于次要考虑因素，例如味道、成本和可储存性，这些对于本发明的目的并不重要，并且可由本领域技术人员毫不费力地选择。
本发明的疫苗或组合物可另外含有一种或多种辅助物质，以进一步提高免疫原性。本发明组合物中所含mRNA和辅助物质(可任选地与如上所述的本发明疫苗或组合物共同配制(或单独配制))的协同作用优选由此实现。取决于各种类型的辅助物质，各种机制可能在这方面发挥作用。例如，允许树突状细胞(DC)成熟的化合物，例如脂多糖、TNF-α或CD40配体，形成第一类合适的辅助物质。一般来说，可以使用以“危险信号”(LPS、GP96等)的方式影响免疫系统的任何试剂或细胞因子(如GM-CFS)作为辅助物质，其允许以有针对性的方式增强和/或影响根据本发明的免疫刺激佐剂产生的免疫应答。特别优选的辅助物质是细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白细胞介素或趋化因子，其除了通过编码的至少一种抗原诱导适应性免疫应答外，促进先天性免疫应答，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生长因子，如hGHP。优选地，此类免疫原性增强剂或化合物单独提供(不与本发明疫苗或组合物共同配制)并单独施用。
本发明疫苗或组合物中可包含其他添加剂为乳化剂，如，例如，吐温；润湿剂，如，例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；增味剂、药物载体；片剂成型剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
本发明的疫苗或组合物还可另外含有任何其他化合物，已知该化合物因其与人类Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激作用，或因其对小鼠Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12或TLR13的结合亲和力(作为配体)而具有免疫刺激作用。
在上下文中可添加到发明的疫苗或组合物中的另一类化合物可能是CpG核酸，特别是CpG RNA或CpG DNA。CpG RNA或CpG DNA可以是单链CpG DNA(ss CpG-DNA)、双链CpGDNA(dsDNA)、单链CpG RNA(ss CpG RNA)或双链CpG RNA(ds CpG RNA)。CpG核酸优选为CpGRNA的形式，更优选为单链CpG RNA(ss CpG RNA)的形式。CpG核酸优选包含至少一个或多个(有丝分裂)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。根据第一优选替代方式，这些序列中包含的至少一个CpG基序，即CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)未甲基化。这些序列中任选包含的所有其他胞嘧啶或鸟嘌呤可以甲基化或未甲基化。然而，根据另一个优选的替代方式，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)也可以以甲基化形式存在。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供试剂盒，特别是套组试剂盒，其包括如本文所定义的含mRNA序列的mRNA化合物和如本文所定义的根据式(I)或式(II)的至少一种脂质。根据本发明的另一个方面，本发明还提供试剂盒，特别是套组试剂盒，其包括如本文所定义的含mRNA序列的mRNA化合物和至少一种DPhyPE作为中性脂质/磷脂。在另一实施方式中，试剂盒包括如上所定义的脂质纳米颗粒或如上定义的包含脂质纳米颗粒的(药物)组合物，和/或根据本发明的疫苗，任选地用于溶解的液体载体和任选地技术说明(关于含有mRNA的脂质纳米颗粒、组合物和/或疫苗的施用和剂量的信息)。技术说明可包括关于含有mRNA的脂质纳米颗粒、组合物和/或疫苗的施用和剂量的信息。此类试剂盒，优选套组试剂盒，可例如用于上述任何应用或用途，优选地，用于使用根据本发明的脂质纳米颗粒(用于制备本发明的药物，优选疫苗)，用于治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与之相关的疾病或紊乱。
试剂盒也可用于使用本文定义的脂质纳米颗粒、组合物或疫苗(用于制备本发明的疫苗)用于治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与之相关的疾病或紊乱，其中脂质纳米颗粒、组合物和/或疫苗能够诱导或增强如上文定义的哺乳动物的免疫应答。
此类试剂盒还可用于使用如本文定义的脂质纳米颗粒、组合物或疫苗(用于制备本发明的疫苗)，以调节、优选诱导、例如诱导或增强如上文定义的哺乳动物的免疫应答，并优选用于支持治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与之相关的疾病或紊乱。
作为试剂盒的一种特殊形式，套组试剂盒可在试剂盒的不同部分包括如本文所述的一种或多种相同或不同的组合物和/或一种或多种相同或不同的疫苗。套组试剂盒还可在试剂盒的不同部分包括(例如一种)组合物、(例如一种)疫苗和/或包含本发明的含mRNA的脂质纳米颗粒，例如，试剂盒的每个部分包含如本文定义的包含mRNA的脂质纳米颗粒，优选编码不同抗原。优选地，试剂盒或套组试剂盒包括用于溶解根据本发明的mRNA的载体作为部件，所述载体任选为林格乳酸溶液。上述任何试剂盒可用于上文定义的治疗或预防。
在该方面的另一个实施方式中，根据本发明的试剂盒可另外包括至少一种佐剂。在另一个实施方式中，根据本发明的试剂盒可另外包括至少一种其他药物活性成分，优选适于治疗和/或预防癌症或相关疾病的治疗性化合物。此外，在另一实施方式中，试剂盒可另外包括用于施用根据本发明的组合物或疫苗所需或适合的部件和/或装置，包括针头、涂药器、贴片、注射装置。
施用途径
原则上，根据本发明的药物组合物或疫苗的施用方式，确定药学上可接受的载体的选择。本发明的组合物或疫苗可通过例如，全身或局部施用。全身施用的一般途径包括，例如，透皮、口服、肠外途径，包括皮下、静脉、肌肉内、动脉内、皮内和腹腔内注射和/或鼻内施用途径。局部施用的途径一般包括，例如，局部施用途径，还包括皮内、透皮、皮下或肌肉内注射，或病灶内、颅内、肺内、心内、肿瘤内和舌下注射。对呼吸系统的施用可通过喷雾施用进行，或特别可通过对肺、支气管、细支气管、肺泡或鼻窦的喷雾施用进行吸入。
在其他优选的实施方式中，施用途径选自由对受试者血管外施用，例如通过血管外注射、输注或植入；皮肤或粘膜局部施用；吸入，例如将组合物输送至呼吸系统；或通过经皮或由皮施用组成的组。在更进一步的优选实施方式中，本发明的组合物或疫苗可经由局部或限于局部注射、输注或植入来施用，特别是皮内、皮下、肌肉内、房内、结膜下、脉络膜上注射、视网膜下、眼筋膜囊内、球后、局部、后巩膜施用、或肺内吸入、间质、局部、玻璃体内、瘤内、淋巴管内、节内、关节内、滑膜内、关节周围、腹膜内、腹内、心内、病灶内、心包内、心室内、胸膜内、神经周围、胸内、硬膜外、硬膜内、硬脊膜外、鞘内、髓内、脑内、海绵体内、intracorporus海绵体、前列腺内、睾丸内、软骨内、骨内、椎间盘内、脊柱内、尾部内、法式囊内、牙龈内、卵巢内、子宫内、眼周、牙齿周围、眼球后、蛛网膜下、结膜下或脉络膜上注射、输注或植入。
此外，对皮肤或粘膜的局部施用可通过皮肤或皮肤、鼻、颊、舌下、耳或耳、眼、结膜、阴道、直肠、宫颈内、鼻窦内、喉、口咽、输尿管、尿道施用进行。疫苗的更优选施用途径是肌肉内、皮内、鼻内和口服施用(例如，通过包含本文所公开的多核苷酸、RNA或mRNA的片剂)。
优选地，根据本发明的组合物或疫苗可通过皮内、皮下或肌肉内途径施用，优选通过注射施用，其可为无针和/或针头注射。因此，根据本发明的组合物或疫苗优选以液体或固体形式配制。可通过常规实验(例如通过使用动物模型)确定要施用的根据本发明的疫苗或组合物的适当量。此类模型包括(但无任何限制)兔子、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长类动物模型。
注射用优选单位剂量形式包括水、生理盐水或其混合物的无菌溶液。应将此类溶液的pH调整至生理上可耐受的pH，例如约7.4。合适的注射用载体包括水凝胶、控释或缓释装置、聚乳酸和胶原基质。用于局部施用的合适的药学上可接受的载体包括那些适合用于乳液、乳膏、凝胶等的载体。如果本发明组合物或疫苗将经口施用，片剂、胶囊等是优选的单位剂量形式。用于制备可用于口服施用的单位剂量形式的药学上可接受的载体在现有技术中是众所周知的。其选择将取决于次要考虑因素，例如味道、成本和可储存性，这些对于本发明的目的并不重要，并且可由本领域技术人员毫不费力地选择。
组合物的用途
根据本发明的组合物作为药物特别有用，从活性组分的描述中可以清楚地看出，活性组分可以通过组合物和/或其中所含的脂质纳颗粒粒并入组合物中并递送给受试者，例如人类受试者。因此，本发明的另一方面是如上所述的组合物作为药物的用途。这种用途也可以表示为组合物用于制造药物的用途。根据相关方面，本发明提供一种治疗方法，该方法包括向受试者(例如有需要的人类受试者)施用组合物的步骤。
在优选的实施方式中，本发明的组合物用作药物，其中该药物是疫苗。
在另一个优选实施方式中，本发明的组合物用作药物，其中该药物用于或适用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下的疾病：传染病(包括病毒、细菌或原生动物传染病)、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、单基因疾病(包括遗传性疾病、一般遗传性疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病)；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌肉骨骼紊乱、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。
在另一个优选实施方式中，本发明的组合物用作药物，其中该药物用于或适用于防止、预防、治疗和/或改善传染病，包括病毒、细菌或原生动物传染病的，其中该药物是疫苗。
在另一个实施方式中，本发明的疫苗包含如本文所述的组合物或试剂盒或套组试剂盒，用于防止、预防、治疗和/或改善选自传染病(包括病毒、细菌或原生动物传染病)、癌症或肿瘤疾病的疾病。
在本发明的另一方面中，提供一种治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；或紊乱或状况的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供如本文所述的mRNA、组合物、疫苗、试剂盒或套组试剂盒；和
b)对组织或生物体应用或施用mRNA、组合物、疫苗、或试剂盒或套组试剂盒。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种方法，其中mRNA、组合物、疫苗或试剂盒或套组试剂盒通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或皮内注射施用给组织或生物体。
在又一个实施方式中，提供一种诱导受试者免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用本发明的疫苗，其量能够有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
在另一个实施方式中，提供一种包含如本文所述的组合物的药物组合物或试剂盒或套组试剂盒，用于或适合用于对受试者进行疫苗接种，包含有效剂量的编码病毒抗原的mRNA。
在另一个优选实施方式中，提供一种包含如本文所述的组合物的药物组合物或试剂盒或套组试剂盒的用途，用于(i)诱导免疫应答或(ii)诱导CD8+T细胞应答。
在具体的实施方式中，提供一种用于预防、改善或治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的组合物或或试剂盒或套组试剂盒。
此外，在具体的实施方式中，提供一种方法，其中施用组合物导致由mRNA编码的抗原在受试者的淋巴细胞中表达。此外，提供一种方法，其中施用组合物导致抗原特异性抗体反应，优选地其中通过血清中抗原特异性抗体的存在来测量抗原特异性抗体反应。
在特定的实施方式中，药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下的疾病：癌症或肿瘤疾病、传染病(包括病毒、细菌或原生动物传染病)、自身免疫性疾病、过敏、单基因疾病(包括遗传性疾病、一般遗传性疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病)；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌肉骨骼紊乱、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、氨基酸紊乱、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。在一个优选实施方式中，该药物是SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)疫苗。
在替代性的实施方式中，本发明涉及药物组合物或包含mRNA的脂质在药物制造中的用途。特别是，所述药物用于治疗性或预防性地提高需要其的受试者的免疫应答。
在优选的实施方式中，该药物用于预防或治疗癌症或肿瘤疾病、传染病、过敏或自身免疫疾病或与之相关的紊乱。
特别是，该药物用于治疗受试者，优选脊椎动物。在优选实施方式中，受试者是哺乳动物，优选选自包括山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿、啮齿动物(例如小鼠、仓鼠、兔子)和特别是人类的组。
因此，在一个优选的实施方式中，本文所述组合物适合用作药剂。在另一优选实施方式中，所述药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下疾病的疾病传染病(包括病毒、细菌或原生动物传染病)、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、单基因疾病(包括遗传性疾病、一般遗传性疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病)；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌肉骨骼紊乱、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。在又一个优选的实施方式中，用作药物的组合物优选是疫苗。
关于向受试者，特别是人类受试者施用组合物，可以使用任何合适的途径。在一个实施方式中，组合物适于通过注射或输注施用。如本文中所用，表述“适用于”意味着所述组合物的配制和处理应适合于各自的施用途径。
在又一个优选的实施方式中，组合物适于对受试者进行血管外施用，例如通过血管外注射、输注或植入；通过对皮肤或粘膜进行局部施用；通过吸入，例如将组合物递送至呼吸系统；或通过经皮或由皮施用。在上下文中，血管外注射、输注或植入可通过局部或局部注射、输注或植入进行，特别是皮内、皮下、肌肉内、间质、局部、玻璃体内、瘤内、淋巴管内、节内、关节内、滑膜内、关节周围、腹膜内、腹内、心内、病灶内、心包内、心室内、胸膜内、神经周围、胸内、硬膜外、硬膜内、硬脊膜外、鞘内、髓内、脑内、海绵体内、intracorporus海绵体、前列腺内、睾丸内、软骨内、骨内、椎间盘内、脊柱内、尾部内、法式囊内、牙龈内、卵巢内、子宫内、眼周、牙齿周围、眼球后、蛛网膜下、结膜下或脉络膜上注射、输注或植入。此外，对皮肤或粘膜的局部施用可通过皮肤或皮肤、鼻、颊、舌下、耳或耳、眼、结膜、阴道、直肠、宫颈内、鼻窦内、喉、口咽、输尿管或尿道施用进行。通过吸入对呼吸系统的施用特别可通过对肺部、支气管、细支气管、肺泡或副鼻窦的气溶胶施用来进行。
根据本发明的一个方面，包含mRNA的脂质纳米颗粒、(药物)组合物或疫苗可根据本发明(用于制备药物)用在
(i)治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；混乱或状况中；和/或
(ii)酶替代疗法中，用于治疗代谢、氨基酸或内分泌失调，或用于替代缺失、缺陷或突变的蛋白质。
在上下文中，特别优选的是治疗或预防疟疾、流感病毒或狂犬病病毒感染，或与此类感染相关的疾病。
进一步特别优选的是治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与这种感染有关的紊乱。
此外，本发明还包括治疗或预防癌症或肿瘤疾病、传染病、过敏或自身免疫疾病或与其相关的紊乱的方法，优选如本文所定义，通过向需要的受试者施用药物有效量的根据本发明的包含mRNA的脂质纳米颗粒、(药物)组合物或疫苗。此类方法通常包括制备本发明的包含mRNA的脂质纳米颗粒、组合物或疫苗的任选的第一步，以及包括向需要的患者/受试者施用(药物有效量)所述组合物或疫苗的第二步。有需要的患者通常是哺乳动物。在本发明的上下文中，哺乳动物优选选自包括(但不限于)例如山羊、牛、猪、狗、猫、驴、猴、猿、啮齿动物(例如小鼠、仓鼠、兔子)和特别是人类的组。在本发明的一些实施方式中，受试者是鸟，优选是鸡。
在一个实施方式中，根据本发明的组合物、制剂或药物组合物优先靶向肝脏中的细胞，而不是其他器官(例如肺、肾、心脏)中的细胞。例如，肝细胞包括肝(实质)细胞和肝细胞前体、星状细胞/周细胞、内皮细胞、库普弗细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。在一个实施方式中，当组合物、制剂或药物组合物包含gRNA与编码CRISPR内切酶(如cas9)的mRNA组合时，该组合物优先靶向肝(实质)细胞、中央周围肝(实质)细胞(在健康肝脏中充当干细胞)和或适当地靶向肝(实质)细胞干细胞。肝脏中细胞的优先靶向性是由于脂质纳米颗粒的大小和中性电荷所致。在某些情况下，肝细胞的靶向可能对身体其他器官产生次要影响，或影响身体其他器官。因此，将理解的是本发明的组合物、制剂或药物组合物在治疗与肝脏相关的疾病以外的疾病中也具有用途。
适当地，所述药物组合物用于但不限于治疗肝病或肝脏中的蛋白质表达对脊椎动物病理学有影响的疾病。如上所述，本文所述的药物组合物也可用于治疗与肝脏无关的疾病。
适当地，使用本发明的组合物或制剂可以靶向任何转录本、转录本家族或不同转录本系列或基因组染色体或线粒体序列，包括但不限于涉及任何肝病或肝脏相关紊乱的基因和调节元件的外显子和内含子。此类任何转录本、转录本家族或不同转录本系列可被本文所述的任何生物活性化合物靶向。在一个实施方式中，生物活性化合物是一种核酸分子，可识别与病理学相关的转录本，mRNA、gRNA、siRNA、saRNA等，如本文所述。
适当地，可使用根据本发明的组合物或制剂靶向涉及任何肝病的任何基因。这种基因可被本文所述的任何生物活性化合物靶向。在一个实施方式中，生物活性化合物是一种核酸分子，其识别肝病基因，例如mRNA、gRNA、siRNA等，如本文所述。
本发明还包括如本文所定义的根据本发明的含mRNA的脂质纳米颗粒、(药物)组合物或疫苗的用途，用于调节、优选用于诱导或增强如本文所定义的哺乳动物的免疫应答，更优选用于防止和/或治疗SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与之相关的疾病或紊乱。
在上下文中，支持治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染可以是常规SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)治疗方法的任意组合，例如使用诸如神经氨酸酶抑制剂(例如奥司他韦和扎那米韦)和M2蛋白抑制剂(例如金刚烷衍生物)等抗病毒药物的疗法，以及使用如本文所定义的RNA或药物组合物的疗法。
支持治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染也可以在本文定义的任何其他实施方式中设想。因此，根据本发明的含mRNA的脂质纳米颗粒、(药物)组合物或疫苗在与任何其他方法、优选上述一种或多种治疗方法的联合治疗中的任何用途，特别是与抗病毒药物的结合，都在本发明的范围内。
对于施用，优选地可以使用本文定义的任何施用途径。特别是，使用的施用途径适合于治疗或防止如本文所定义的SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与之相关的疾病或紊乱，通过诱导或增强基于根据本发明的含mRNA的脂质纳米颗粒编码的抗原的适应性免疫应答。
然后，根据本发明的组合物和/或疫苗的施用可在施用本文所定义的另一组合物和/或疫苗之前、同时和/或之后进行，另外，后者还可包含另一含mRNA的脂质纳米颗粒或含mRNA的脂质纳米颗粒的组合(其编码不同抗原或抗原组合)，其中由根据本发明的mRNA序列编码的每一种抗原优选适合于治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染及与之相关的疾病或紊乱。
在上下文中，本文所定义的治疗还可包括调节与SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染相关的疾病及调节与之相关的疾病或紊乱。
根据本发明该方面的优选实施方式，根据本发明的(药物)组合物或疫苗通过注射施用。可以采用本领域已知的任何合适的注射技术。优选地，本发明的组合物通过注射施用，优选通过无针注射施用，例如通过喷射注射施用。
在一个实施方式中，本发明组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种如本文所定义的mRNA，其中每种mRNA优选单独注射，优选通过无针注射。作为选择，本发明组合物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种mRNA，其中至少一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种、九种、十种、十一种或更多种mRNA作为混合物优选通过本文定义的注射施用。
在另一个方面中，本发明涉及一种针对抗原或抗原组合对受试者进行免疫的方法。
针对如本文所定义的抗原或至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种抗原的组合对受试者进行免疫的免疫方案通常包括一系列单剂量或多剂量的根据本发明的(药物)组合物或疫苗。如本文中所用，单剂量分别指初始/第一剂量、第二剂量或任何进一步的剂量，其优选被施用以“增强”免疫应答。在上下文中，每个单剂量优选包括施用本文定义的相同抗原或相同抗原组合，其中两次单剂量施用之间的间隔可以从至少一天、优选2、3、4、5、6或7天变化到至少一周、优选2、3、4、5、6、7或8周。单剂量之间的间隔可以是恒定的，也可以在免疫方案的整个过程中变化，例如，间隔在方案开始时可能较短，在方案结束时可能较长。取决于单剂量的总数和单剂量之间的间隔，免疫方案可延长一段时间，该时间段优选持续至少一周、更优选几周(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周)、甚至更优选几个月(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月)。每个单剂量优选包括如本文所定义的抗原，优选至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种抗原的组合的施用，并且因此可涉及至少一次，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次注射。在一些情况下，根据本发明的组合物或疫苗通常在一次注射中作为单剂量施用。在该情况下，如果根据本发明的疫苗包含如本文定义的编码不同抗原的单独mRNA制剂，则在单剂量施用期间进行的最小注射次数对应于疫苗的单一成分的数量。在某些实施方式中，单剂量施用可包括针对疫苗的每种成分的不止一次注射(例如，特定的mRNA制剂，其包含编码例如，本文定义的一种抗原肽或蛋白质的mRNA)。例如，疫苗单个成分总体积的一部分可注射到身体的不同部位，因此涉及不止一次注射。在更具体的实例中，包含四种单独mRNA制剂的单剂量疫苗(每种制剂在两个不同的身体部位施用)包括八次注射。通常，单剂量包括施用疫苗所有成分所需的所有注射，其中单个组分可能涉及如上所述的不止一次注射。在该情况下，如果根据本发明的单剂量疫苗的施用包括不止一次注射，则注射基本上同时或同时进行，即通常在从业者相继执行单次注射步骤所需的时限内以错时方式进行。因此，单剂量的施用优选延长几分钟的一段时间，例如2、3、4、5、10、15、30或60分钟。
如本文所定义的包含mRNA的脂质纳米颗粒、根据本发明的(药物)组合物或疫苗的施用可在错时治疗中进行。时间交错治疗可以是例如在常规治疗SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与之相关的疾病或紊乱之前、同时和/或之后施用包含mRNA的脂质纳米颗粒、组合物或疫苗,例如通过在适合于治疗或预防SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)感染或与之相关的疾病或紊乱的疗法或治疗剂的施用之前、同时和/或之后施用包含mRNA的脂质纳米颗粒、组合物或疫苗。这种错时治疗的可以使用例如试剂盒、优选本文定义的套组试剂盒来执行。
错时治疗还可额外或替代性地包括以如下形式施用本文所定义的包含mRNA的脂质纳米颗粒、根据本发明的(药物)组合物或疫苗，其中，编码本文定义的抗原肽或蛋白质或其片段或变体的mRNA，优选形成组合物或疫苗的一部分，在如上文定义的另一包含mRNA的脂质纳米颗粒之前或之后平行施用，优选形成相同的本发明的组合物或疫苗的一部分。优选地，(所有包含mRNA的脂质纳米颗粒)的施用发生在一小时内，更优选在30分钟内，甚至更优选在15、10、5、4、3或2分钟内或甚至在1分钟内。这种错时处理可以使用例如试剂盒，优选本文定义的套组试剂盒来执行。
在优选的实施方式中，重复施用本发明的药物组合物或疫苗，其中每次施用优选包括单独施用本发明组合物或疫苗的包含至少一种mRNA的脂质纳米颗粒。在施用的每个时间点，至少一种mRNA可不止一次施用(例如2或3次)。在本发明的特别优选的实施方式中，在每个时间点施用封装在如上文定义的含mRNA的脂质纳米颗粒中或与其相关联的至少两个、三个、四个、五个、六个或更多mRNA序列(每个序列编码本文定义的不同抗原之一)，其中所述mRNA序列是相同或不同脂质纳米颗粒的mRNA化合物的一部分，其中每种mRNA通过注射施用两次，分布于四肢。
在另一个优选实施方式中，提供了包含本发明的组合物或本发明的试剂盒或套组试剂盒的药物组合物用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选用于(iii)诱导CD8+T细胞应答的用途。用于在受试者中(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答，或优选用于(iii)诱导的CD8+T细胞应答的所述方法；包括向需要的受试者施用至少一次有效量的如本文所述的组合物，所述组合物包含编码至少一种免疫原性肽或多肽的mRNA，也如本文所述。在另一个实施方式中，与参考(脂质纳米颗粒)制剂或组合物相比时，提供包含本发明的组合物或本发明的试剂盒或套组试剂盒的药物组合物用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选用于(iii)诱导CD8+T细胞应答的用途。优选实施方式中的所述参考(脂质纳米颗粒)制剂或组合物不包含DPhyPE和/或根据式(I)的阳离子脂质。
第一和第二/进一步的医疗用途：
另一方面涉及所提供的核酸、组合物、多肽、疫苗或试剂盒的第一医疗用途，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。值得注意的是，与核酸、组合物、多肽、疫苗或试剂盒或套组试剂盒相关的实施方式同样可以阅读并理解为本发明医疗用途的合适实施方式。
因此，本发明提供至少一种核酸(例如DNA或RNA)，优选地，第一方面中定义的RNA用作药物、组合物用作药物、本文所定义的多肽用作药物、本文所定义的疫苗用作药物，以及试剂盒或套组试剂盒用作药物，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。
本发明还提供了核酸、组合物、多肽、疫苗或试剂盒的若干应用和用途，即特别是，核酸(优选RNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒可用于人类医疗目的，也可用于兽医目的，优选用于人类医疗目的，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。
特别是，核酸(优选RNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒或套组试剂盒用作人类医疗用途的药物，其中所述核酸(优选RNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒或套组试剂盒可适用于幼儿、新生儿、免疫功能低下的接受者以及孕妇和哺乳期妇女和老年人。特别是，核酸(优选RNA，最优选mRNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒或套组试剂盒用作人类医疗用途的药物，其中所述核酸(优选RNA，最优选mRNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒或套组试剂盒特别适用于老年人受试者。
所述核酸(优选RNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒用作人类医疗目的的药物，其中所述RNA、组合物、疫苗或试剂盒或套组试剂盒可能特别适合肌肉内注射或皮内注射。
在又一个方面中，本发明涉及所提供的核酸、组合物、多肽、疫苗或试剂盒的第二医疗用途。
因此，本发明提供至少一种核酸，其中核酸包含在本发明的组合物中，该组合物包含用于递送所述核酸、优选RNA、最优选mRNA的本发明的一种或多种脂质赋形剂以用于治疗或预防冠状病毒，优选β-冠状病毒，更优选严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染，或与此类感染相关的紊乱或疾病，例如2019冠状病毒疾病(COVID-19)；包含于一种组合物中，其用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2冠状病毒的感染，或与此类感染有关的疾病或紊乱，如COVID-19；包含于一种多肽中，其用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2冠状病毒的感染，或与此类感染有关的疾病或紊乱，如COVID-19；包含于一种疫苗中，其用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2冠状病毒的感染，或与此类感染有关的疾病或紊乱，如COVID-19；包含于一种试剂盒或套组试剂盒中，其用于治疗或预防冠状病毒，优选SARS-CoV-2冠状病毒的感染，或与此类感染有关的疾病或紊乱，如COVID-19。
在其他实施方式中，核酸(优选RNA、最优选mRNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒或套组试剂盒用于治疗或预防冠状病毒感染，优选SARS-CoV-2冠状病毒感染，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。
特别是，核酸(优选RNA、最优选mRNA)、组合物、多肽、疫苗或试剂盒或套组试剂盒可用在预防性(暴露前预防或暴露后预防)和/或治疗性治疗由SARS-CoV-2冠状病毒感染引起的COVID-19疾病的方法中，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。
核酸、组合物、多肽或疫苗可优选局部施用。特别是，组合物或疫苗可通过皮内、皮下、鼻内或肌肉内途径施用，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。在其他实施方式中，所述核酸、组合物、多肽、疫苗可通过常规针头注射或无针喷射注射施用。在上下文中，优选肌肉内注射。
在其他实施方式中，本发明的组合物(包含本发明的一种或多种脂质赋形剂，用于递送本文所定义的核酸)中包含的所述核酸以约100ng至约500μg的量、约1μg至约200μg的量、约1μg至约100μg的量、约5μg至约100μg的量、优选约10μg至约50μg的量提供，具体而言，以约1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg或100μg的量提供。
在一个实施方式中，用于治疗或预防受试者针对冠状病毒(优选SARS-CoV-2冠状病毒)的免疫方案包括一次剂单剂量的组合物或疫苗。
在一些实施方式中，有效量是在对受试者进行一次疫苗接种时施用的1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、20μg、30μg、40μg、50μg、75μg、100μg或200μg的剂量，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。在优选的实施方式中，用于治疗或预防冠状病毒、优选SARS-CoV-2冠状病毒感染的免疫方案包括一系列单剂量或多剂量的组合物或疫苗，优选总剂量为两剂量，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。如本文中所用，单剂量分别指初始/第一剂量、第二剂量或任何进一步剂量，其优选被施用以“增强”免疫应答，其中包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。
在优选的实施方式中，疫苗/组合物使受试者免疫冠状病毒，优选SARS-CoV-2冠状病毒感染(如本文所定义施用)至少1年，优选至少2年，其中对于免疫，包含本发明的一种或多种脂质赋形剂的本发明的组合物用于递送所述核酸。
标准疗法
更优选地，接受包含本发明RNA的药物组合物或疫苗、其组合或包含所述一种或多种RNA的药物组合物或疫苗的受试者是患有本文所述肿瘤或癌症疾病并已接受或接受化疗(例如一线或二线化疗)、放疗，放化疗/放化疗(放化疗结合)、激酶抑制剂、抗体疗法和/或检查点调节剂(例如CTLA4抑制剂、PD1通路抑制剂)的患者，或接受上述一种或多种治疗后取得部分反应或稳定病情的患者。更优选地，受试者是患有本文所述肿瘤或癌症疾病并已接受或接受本文所述任何此类疾病中常规使用的化合物的患者，更优选是接受或已接受检查点调节剂的患者。
优选用于标准疗法且可与包含本发明RNA的药物组合物或疫苗组合应用的化合物包括但不限于WO 2018/078053 A1第56至58页中公开的那些化合物；WO 2018/078053 A1通过引用全部并入本文。
肿瘤指征
如本文中所用，术语“肿瘤”、“癌症”或“癌症疾病”是指恶性疾病，其优选地选自但不限于WO 2018/078053 A1第58至59页中公开的恶性疾病组；WO 2018/078053 A1通过引用全部并入本文。
示例性实施方式
在下文中，公开了本发明的几组不同实施方式。此处目的在于源于一组实施方式的每个实施方式都可以彼此组合，即第一组实施方式的实施方式1可以与第二组实施方式的实施方式3组合。
第一组实施方式
1.一种根据式(I)的阳离子脂质：
Ra-A-Rb 式(I)
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中
Ra选自：
Figure BDA0003701042630001881
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure BDA0003701042630001882
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，或-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基，
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立。
2.根据实施方式1的阳离子脂质，其中R5是具有3至6个碳原子的烷烃二基，在每次出现时独立选择。
3.根据实施方式1至实施方式2的阳离子脂质，其中R4是具有12至25个碳原子的烷基或烯基，在每次出现时独立选择。
4.根据实施方式1至实施方式3的阳离子脂质，其中
Ra和Rb独立地选自
Figure BDA0003701042630001891
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4。
5.根据实施方式1至实施方式4的阳离子脂质，其中
Ra和Rb中的每一个是：
Figure BDA0003701042630001892
在每次出现时独立选择；和
R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基，在每次出现时独立选择。
6.根据实施方式5的阳离子脂质，其中A是-S-S-。
7.根据实施方式6的阳离子脂质，其中R4是具有12至25个碳原子的烷基或烯基，在每次出现时独立选择。
8.根据实施方式7的阳离子脂质，其中
每个R4是烷基，在每次出现时独立地选自：
Figure BDA0003701042630001893
Figure BDA0003701042630001901
9.根据实施方式8的阳离子脂质，其中
R3是-R5-C(O)-O-or-R5-O-C(O)-；
R4是：
Figure BDA0003701042630001902
并且中Ra和Rb为相同。
10.根据实施方式9的阳离子脂质，其中R3是-R5-C(O)-O-。
11.根据实施方式10的阳离子脂质，其中X是碳原子。
12.根据实施方式11的阳离子脂质，其中R1是乙烷二基。
13.根据前述实施方式中任一项的阳离子脂质，所述阳离子脂质还显示以下特征的一个或多个，在每次出现时独立选择：
(i)R1是未被取代的乙烷二基、丙烷二基或丁烷二基；
(ii)R2是具有2至8个碳原子的直链、无支链的烷烃二基；
(iii)R3是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
(iv)R4是具有12至25个碳原子的烷基或烯基；
(v)R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；和/或
(vi)X是碳原子。
14.根据实施方式1的阳离子脂质，所述阳离子脂质选自表1中所列的化合物。
15.一种组合物，所述组合物包含
(i)根据实施方式1至14中任一项的阳离子脂质；或
(ii)表1中所列的阳离子脂质C15。
16.根据实施方式15的组合物，所述组合物还包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)类固醇，优选胆固醇；
(ii)中性脂质；
其中所述中性脂质优选为1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)，任选地组合中性脂质1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)；或其中所述中性脂质是两性离子化合物，任选地具有选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基和油酰基的两个脂肪酸部分的两性离子化合物，组合具有选自戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基和癸酰基的两个脂肪酸部分的两性离子化合物；
和/或
(iii)聚合物结合的脂质；
其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。
17.一种组合物，所述组合物包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)根据实施方式1至14中任一项所述的阳离子脂质或包含三级或四级氮/氨基基团的阳离子脂质或在生理pH时带净正电荷的阳离子脂质；
(ii)类固醇，优选胆固醇；
(iii)如实施方式16的分项(ii)中所述的中性脂质；和/或
(iv)聚合物结合的脂质，其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质；
更优选地，其中脂质部分L包含至少一种脂肪酸(“尾”)，其包含8、10或12个碳原子，优选8或10个碳原子；
乃至更优选地，其中聚乙二醇化脂质选自由1,2-二癸酰基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000(C10-PEG 2000)；和N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}(Cer8-PEG 2000)组成的组。
18.一种组合物，所述组合物包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)如实施方式17的分项(i)中所述的阳离子脂质；
(ii)类固醇，优选胆固醇；
(iii)如实施方式16的分项(ii)中所述的中性脂质；和/或
(iv)聚合物结合的脂质，其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质；
更优选地其中聚乙二醇化脂质选自由1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)组成的组。
19.根据实施方式15至18中任一项所述的组合物，其中
优选地所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(a-i)30mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-ii)40mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至15mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iii)20mol％至60mol％的量的阳离子脂质；25mol％至55mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的磷脂；和0.5mol％至15mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iv)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的类固醇；8mol％至12mol％的量的磷脂；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-v)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的中性脂质；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；和
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的PEG-DMG 2000；或
更优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(b-i)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-ii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iv)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的C10-PEG 2000；和
(b-v)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000；
每个量均相对于脂质纳米颗粒的所有脂质赋形剂的总摩尔量；
更优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(c-i)脂质赋形剂组合，选自由表E中公开的E1至E69组成的组，其mol百分比选自由表F中公开的F1至F60组成的组。
20.根据实施方式15至19中任一项所述的组合物，其中优选地所述组合物包含以下比率的赋形剂
(i)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C23、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(ii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C2、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；或
(iii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C15、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000。
21.根据实施方式15至20中任一项所述的组合物，所述组合物还包含生物活性组分。
22.根据实施方式21所述的组合物，其中其中所述生物活性组分是选自由人工mRNA、包含至少一个编码序列的化学修饰或未修饰的信使RNA(mRNA)、自复制RNA、环状RNA、病毒RNA和复制子RNA组成的组的核酸化合物；或其任何组合，优选地其中所述生物活性组分是mRNA或mRNA化合物。
23.根据实施方式15至22中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含mRNA
(i)其量可使N/P比率达到10至20的范围；或
(ii)其量可使脂质：mRNA的重量比达到20至60的范围，优选约3至约15、5至约13、约4至约8或约7至约11。
24.根据实施方式15至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物是用于用无菌液体载体重组的无菌固体组合物，并且其中所述组合物还包含一种或多种选自pH改性剂、填充剂、稳定剂、非离子表面活性剂和抗氧化剂的无活性组分，并且其中无菌液体载体是水性载体。
25.根据实施方式15至24中任一项所述的组合物，其中所述组合物是无菌液体组合物，并且其中所述脂质纳米颗粒的平均流体动力学直径由动态激光散射确定为约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、或约60nm至约200nm、或约70nm至200nm、或约75nm至约160、或约90nm至约140nm、或约100nm至约140nm。
26.根据实施方式15至25中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒显示的ζ电位范围为-50mV至+50mV。
27.根据实施方式22至26中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物是单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。
28.根据实施方式22至26中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含至少一个化学修饰。
29.根据实施方式28所述的组合物，其中所述化学修饰选自由碱基修饰、糖修饰、主链修饰和脂质修饰组成的组，优选地其中所述化学修饰是碱基修饰，更优选地其中所述碱基修饰选自由假尿嘧啶(ψ)、N1-甲基假尿嘧啶(N1Mψ)、1-乙基假尿嘧啶、2-硫脲嘧啶(s2U)、4-硫脲嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶及其任何组合组成的组。
30.根据实施方式22至29中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含编码肽或蛋白质的编码区，其中所述编码区显示序列修饰。
31.根据实施方式30所述的组合物，其中所述序列修饰选自G/C含量修饰、密码子修饰、密码子优化或序列的C-优化；优选地其中
与相应野生型mRNA的编码区相比
-编码区的G/C含量增加；
-编码区的C含量增加；
-编码区中的密码子用法与人类密码子用法相适应；和/或密码子适应指数(CAI)在编码区增加或最大化。
32.根据实施方式22至31中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物还包含
a)5’-CAP结构；
b)至少一个miRNA序列，优选地其中microRNA结合位点用于选自由miR-126、miR-142、miR-144、miR-146、miR-150、miR-155、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27、miR-26a或其任何组合组成的组的microRNA；
c)至少一个5'-UTR元件；
d)至少一个聚(A)序列；
e)至少一个聚(C)序列；
f)至少一个3’-UTR元件；
或其任何组合。
33.根据实施方式22至32中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含5’-CAP结构，优选地m7G、CAP0、CAP1、CAP2、修饰的CAP0或修饰的CAP1结构。
34.根据实施方式22至33中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含至少一个异源5’-UTR和/或至少一个异源3’-UTR，优选地其中至少一个异源5’-UTR包含源自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5’-UTR的核酸序列，或源自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的的5’-UTR核酸序列；和/或
优选地其中至少一个异源3’-UTR包含源自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR的核酸序列，或源自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的的3’-UTR核酸序列。
35.根据实施方式22至34中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含(i)HSD17B4 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR或(ii)RPL32 5’-UTR和ALB7 3’-UTR。
36.根据实施方式22至35中任一项所述的组合物，其中组合物包含5'至3'方向的以下元件：
a)5’-CAP结构，优选地选自由m7G(5’)、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)组成的组；
b)5'-UTR元件，其包含源自TOP基因的5'-UTR的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：22、24、26的核酸序列的RNA序列，或其同系物、片段或变体；
c)至少一个编码序列；
d)3'-UTR元件，其包含源自α-珠蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；和/或3'-UTR元件，其包含源自白蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：18的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；
e)任选地，至少一个聚(A)序列，优选地由10至200、10至100、40至80、或50至70个腺苷核苷酸组成；
f)任选地，至少一个聚(C)序列，优选地由10至200、10至100、20至70、20至60或10至40个胞嘧啶核苷酸组成；和
g)任选地，至少一个组蛋白茎环，优选地包含根据SEQ ID NO：4的RNA序列。
37.根据实施方式21至36中任一项所述的组合物，其中所述生物活性组分是
(a)mRNA，其包含至少一个编码肽或蛋白质或其片段或变体的编码序列，其中肽或蛋白质是抗原，其中所述抗原优选地源自致病性抗原、肿瘤抗原、致敏性抗原或自身免疫性自体抗原，或其片段或变体；
(b)mRNA，其包含至少一个编码治疗性蛋白质或其片段或变体的编码序列，其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组
(i)用于治疗代谢、内分泌或氨基酸紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变蛋白质的治疗性蛋白质；
(ii)用于治疗血液疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白质；
(iii)用于治疗癌症或肿瘤疾病的治疗性蛋白质；
(iv)用于激素替代疗法的治疗性蛋白质；
(v)用于将体细胞重新编程为多功能或全能干细胞的治疗性蛋白质；
(vi)用作佐剂或免疫刺激的治疗性蛋白质；
(vii)作为治疗性抗体的治疗性蛋白质；
(viii)作为基因编辑剂的治疗性蛋白质；和
(ix)用于治疗或防止选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病的治疗性蛋白质。
38.根据实施方式37的分项(a)所述的组合物，其中所述抗原编码选自由细菌、病毒、真菌和原生动物抗原组成的组的致病性抗原。
39.根据实施方式38所述的组合物，其中所述致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。
40.实施方式15至39中任一项所述的组合物用于
(i)治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况；和/或
(ii)用于治疗代谢或内分泌紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变的蛋白质。
41.根据实施方式15至39中任一项所述的组合物用于治疗或预防传染病。
42.根据实施方式40或41的组合物，所述组合物包含至少一个编码RNA，其中所述至少一个编码RNA包含至少一个编码至少一种用于治疗或防止疾病、紊乱或状况的肽或蛋白质的编码序列，其中所述组合物通过肌肉内注射或皮内注射施用给有需要的受试者。
43.一种试剂盒或套组试剂盒，其包括实施方式21至42的组合物的任一种，任选地包括用于溶解的液体载体，以及任选地包括提供关于各成分的施用和剂量的信息的技术说明书。
44.实施方式21至42中任一项所述的组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒用作药物。
45.根据实施方式44所述的用作药物的组合物，其中所述药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下疾病的疾病：包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、包括遗传性疾病、一般遗传性疾病的单基因疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌骨失常、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。
46.根据实施方式44或45所述的用作药物的组合物，其中所述药物是疫苗。
47.一种包含实施方式15至42中任一项所述组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒的疫苗用于防止、预防、治疗和/或改善选自包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病的疾病。
48.一种治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供如上述实施方式中任一项所述的mRNA、如上述实施方式中任一项所述的组合物、实施方式47所述的疫苗、实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒；和
b)将所述mRNA、所述组合物、所述疫苗或所述试剂盒或套组试剂盒应用或施用给组织或生物体。
49.根据实施方式48所述的方法，其中所述mRNA、实施方式15至42中任一项所述的组合物、实施方式47所述的疫苗或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或皮内注射施用给组织或生物体。
50.一种诱导受试者产生免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用如实施方式47所述的疫苗，其量能有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
51.一种包含实施方式15至42中任一项所述组合物的药物组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒，以用于对受试者进行疫苗接种，所述药物组合物包含有效量的编码病毒抗原的mRNA。
52.包含实施方式15至42中任一项所述的组合物的药物组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒的用途，用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选地用于(iii)诱导CD8+ T细胞应答。
53.实施方式52所述的药物组合物用于预防传染病或制造用于预防传染病的药物的用途，其中所述药物优选是疫苗。
54.一种用于防止、改善或治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，所述方法包括对所述受试者施用实施方式15至42中任一项所述的组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒。
55.根据前述方法实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致受试者淋巴细胞中由mRNA编码的抗原表达。
56.根据前述方法实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致抗原特异性抗体反应，优选地其中所述抗原特异性抗体反应通过血清中抗原特异性抗体的存在来测量。
第二组实施方式
1.一种包含根据式(I)的阳离子脂质：
Ra-A-Rb 式(I)
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体的组合物，其中
Ra选自：
Figure BDA0003701042630002001
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure BDA0003701042630002002
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，或-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是任选地被取代的乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立
所述组合物还包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)胆固醇；
(ii)1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)；
和/或
(iii)选自由1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)、1,2-二癸酰基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯二醇(C10二酰甘油PEG)；和N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}(Cer8-PEG 2000)组成的组的聚乙二醇化脂质。
2.根据实施方式1所述的组合物，其中
优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(a-i)30mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-ii)40mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至15mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iii)20mol％至60mol％的量的阳离子脂质；25mol％至55mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的磷脂；和0.5mol％至15mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iv)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的类固醇；8mol％至12mol％的量的磷脂；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-v)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的中性脂质；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；和
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的PEG-DMG 2000；或
更优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(b-i)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-ii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iv)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的C10-PEG 2000；和
(b-v)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000；
每个量均相对于脂质纳米颗粒的所有脂质赋形剂的总摩尔量；
优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(c-i)脂质赋形剂组合，其选自由表E中公开的E1至E69组成的组，其mol百分比选自由表F中公开的F1至F60组成的组。
3.根据实施方式1至2中任一项所述的组合物，其中
优选地所述组合物包含以下比率的赋形剂
(i)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C23、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(ii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C2、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；或
(iii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C15、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000。
4.根据实施方式1至3中任一项所述的组合物，所述组合物还包含生物活性组分。
5.根据实施方式4所述的组合物，其中所述生物活性组分是选自由人工mRNA、包含至少一个编码序列的化学修饰或未修饰的信使RNA(mRNA)、自复制RNA、环状RNA、病毒RNA和复制子RNA组成的组的核酸化合物；或其任何组合，优选地其中所述生物活性组分是mRNA或mRNA化合物。
6.根据实施方式1至5中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含mRNA
(i)其量可使N/P比率达到10至20的范围；
或
(ii)其量可使脂质：mRNA的重量比达到20至60的范围，优选约3至约15、5至约13、约4至约8或约7至约11。
7.根据实施方式1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物是用于用无菌液体载体重组的无菌固体组合物，并且其中所述组合物还包含一种或多种选自pH改性剂、填充剂、稳定剂、非离子表面活性剂和抗氧化剂的无活性组分，并且其中无菌液体载体是水性载体。
8.根据实施方式1至7中任一项所述的组合物，其中所述组合物是无菌液体组合物，并且其中所述脂质纳米颗粒的平均流体动力学直径由动态激光散射确定为约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、或约60nm至约200nm、或约70nm至200nm、或约75nm至约160、或约90nm至约140nm、或约100nm至约140nm。
9.根据实施方式1至8中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒显示的ζ电位范围为-50mV至+50mV。
10.根据实施方式5至9中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物是单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。
11.根据实施方式5至10中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含至少一个化学修饰。
12.根据实施方式11所述的组合物，其中所述化学修饰选自由碱基修饰、糖修饰、主链修饰和脂质修饰组成的组，优选地其中所述化学修饰是碱基修饰，更优选地其中所述碱基修饰选自由假尿嘧啶(ψ)、N1-甲基假尿嘧啶(N1Mψ)、1-乙基假尿嘧啶、2-硫脲嘧啶(s2U)、4-硫脲嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶及其任何组合组成的组。
13.根据实施方式5至12中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含编码肽或蛋白质的编码区，其中所述编码区显示序列修饰。
14.根据实施方式13所述的组合物，其中所述序列修饰选自G/C含量修饰、密码子修饰、密码子优化或序列的C-优化；优选地其中
与相应野生型mRNA的编码区相比
-编码区的G/C含量增加；
-编码区的C含量增加；
-编码区中的密码子用法与人类密码子用法相适应；和/或密码子适应指数(CAI)在编码区增加或最大化。
15.根据实施方式5至14中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物还包含
a)5’-CAP结构；
b)至少一个miRNA序列，优选地其中microRNA结合位点用于选自由miR-126、miR-142、miR-144、miR-146、miR-150、miR-155、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27、miR-26a或其任何组合组成的组的microRNA；
c)至少一个5'-UTR元件；
d)至少一个聚(A)序列；
e)至少一个聚(C)序列；
f)至少一个3’-UTR元件；
或其任何组合。
16.根据实施方式5至15中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含5’-CAP结构，优选地m7G、CAP0、CAP1、CAP2、修饰的CAP0或修饰的CAP1结构。
17.根据实施方式5至16中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含至少一个异源5’-UTR和/或至少一个异源3’-UTR，优选地其中至少一个异源5’-UTR包含源自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5’-UTR的核酸序列，或源自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的5’-UTR的核酸序列；和/或
优选地其中至少一个异源3’-UTR包含源自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR的核酸序列，或源自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的3’-UTR的核酸序列。
18.根据实施方式5至17中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含(i)HSD17B4 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR或(ii)RPL32 5’-UTR和ALB7 3’-UTR。
19.根据实施方式5至18中任一项所述的组合物，所述组合物包含5'至3'方向的以下元件：
a)5’-CAP结构，优选地选自由m7G(5’)、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)组成的组；
b)5'-UTR元件，其包含源自TOP基因的5'-UTR的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：22、24、26的核酸序列的RNA序列，或其同系物、片段或变体；
c)至少一个编码序列；
d)3'-UTR元件，其包含源自α-珠蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；和/或3'-UTR元件，其包含源自白蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：18的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；
e)任选地，至少一个聚(A)序列，优选地由10至200、10至100、40至80、或50至70个腺苷核苷酸组成；
f)任选地，至少一个聚(C)序列，优选地由10至200、10至100、20至70、20至60或10至40个胞嘧啶核苷酸组成；和
g)任选地，至少一个组蛋白茎环，优选地包含根据SEQ ID NO：4的RNA序列。
20.根据实施方式4至19中任一项所述的组合物，其中所述生物活性组分是
(a)mRNA，其包含至少一个编码肽或蛋白质或其片段或变体的编码序列，其中肽或蛋白质是抗原，其中所述抗原优选地源自致病性抗原、肿瘤抗原、致敏性抗原或自身免疫性自体抗原，或其片段或变体；或
(b)mRNA，其包含至少一个编码治疗性蛋白质或其片段或变体的编码序列，其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组
(i)用于治疗代谢、内分泌或氨基酸紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变蛋白质的治疗性蛋白质；
(ii)用于治疗血液疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白质；
(iii)用于治疗癌症或肿瘤疾病的治疗性蛋白质；
(iv)用于激素替代疗法的治疗性蛋白质；
(v)用于将体细胞重新编程为多功能或全能干细胞的治疗性蛋白质；
(vi)用作佐剂或免疫刺激的治疗性蛋白质；
(vii)作为治疗性抗体的治疗性蛋白质；
(viii)作为基因编辑剂的治疗性蛋白质；和
(ix)用于治疗或防止选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病的治疗性蛋白质。
21.根据实施方式20的分项(a)所述的组合物，其中所述抗原编码选自由细菌、病毒、真菌和原生动物抗原组成的组的致病性抗原。
22.根据实施方式21所述的组合物，其中所述致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。
23.实施方式5至22中任一项所述的组合物用于
(i)治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况；和/或
(ii)用于治疗代谢或内分泌紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变的蛋白质。
24.实施方式5至23中任一项所述的组合物用于治疗或预防传染病。
25.根据实施方式5或24的组合物，所述组合物包含至少一个编码RNA，其中所述至少一个编码RNA包含至少一个编码至少一种用于治疗或防止疾病、紊乱或状况的肽或蛋白质的编码序列，其中所述组合物通过肌肉内注射或皮内注射施用给有需要的受试者。
26.一种试剂盒或套组试剂盒，其包括实施方式4至26的组合物的任一种，任选地包括用于溶解的液体载体，以及任选地包括提供关于各成分的施用和剂量的信息的技术说明书。
27.实施方式4至25中任一项所述的组合物或实施方式26所述的试剂盒或套组试剂盒用作药物。
28.根据实施方式27所述的用作药物的组合物，其中所述药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下疾病的疾病：包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、包括遗传性疾病、一般遗传性疾病的单基因疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌骨失常、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。
29.根据实施方式27或28的用作药物的任何先前实施方式的组合物，其中所述药物是疫苗。
30.一种包含实施方式5至25中任一项所述组合物或实施方式26所述试剂盒或套组试剂盒的疫苗用于防止、预防、治疗和/或改善选自包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病的疾病。
31.一种治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供如上述实施方式中任一项所述的mRNA、如上述实施方式中任一项所述的组合物、实施方式30所述的疫苗、实施方式26所述的试剂盒或套组试剂盒；和
b)将所述mRNA、所述组合物、所述疫苗或所述试剂盒或套组试剂盒应用或施用给组织或生物体。
32.根据实施方式31所述的方法，其中所述mRNA、实施方式5至29中任一项所述的组合物、实施方式30所述的疫苗或实施方式26所述的试剂盒或套组试剂盒通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或皮内注射施用给组织或生物体。
33.一种诱导受试者产生免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用如实施方式30所述的疫苗，其量能有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
34.一种包含实施方式4至29中任一项所述组合物的药物组合物或实施方式26所述的试剂盒或套组试剂盒用于对受试者进行疫苗接种，其包含有效量的编码病毒抗原的mRNA。
35.包含实施方式4至29中任一项所述组合物的药物组合物或实施方式26所述的试剂盒或套组试剂盒的用途，用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选地用于(iii)诱导CD8+ T细胞应答。
36.实施方式34所述的药物组合物用于预防传染病或制造用于预防传染病的药物的用途，其中所述药物优选是疫苗。
37.一种用于防止、改善或治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，所述方法包括对所述受试者施用实施方式4至29中任一项所述的组合物或实施方式26所述的试剂盒或套组试剂盒。
38.根据前述方法实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致受试者淋巴细胞中由mRNA编码的抗原表达。
39.根据前述方法实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致抗原特异性抗体反应，优选地其中所述抗原特异性抗体反应通过血清中抗原特异性抗体的存在来测量。
第三组实施方式
1.一种组合物，所述组合物包含根据式(I)的阳离子脂质和1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)，任选地结合1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)，所述组合物还包含生物活性组分，优选地，所述生物活性组分是mRNA，其中
(a)mRNA，其包含至少一个编码肽或蛋白质或其片段或变体的编码序列，其中肽或蛋白质是抗原，其中所述抗原优选地源自致病性抗原、肿瘤抗原、致敏性抗原或自身免疫性自体抗原，或其片段或变体；或
(b)mRNA，其包含至少一个编码治疗性蛋白质或其片段或变体的编码序列，其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组
(i)用于治疗代谢、内分泌或氨基酸紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变蛋白质的治疗性蛋白质；
(ii)用于治疗血液疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白质；
(iii)用于治疗癌症或肿瘤疾病的治疗性蛋白质；
(iv)用于激素替代疗法的治疗性蛋白质；
(v)用于将体细胞重新编程为多功能或全能干细胞的治疗性蛋白质；
(vi)用作佐剂或免疫刺激的治疗性蛋白质；
(vii)作为治疗性抗体的治疗性蛋白质；
(viii)作为基因编辑剂的治疗性蛋白质；和
(ix)用于治疗或防止选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病的治疗性蛋白质。
2.根据实施方式1的分项(a)所述的组合物，其中所述抗原编码选自由细菌、病毒、真菌和原生动物抗原组成的组的致病性抗原。
3.根据实施方式2所述的组合物，其中所述致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。
4.前述实施方式中任一项所述的组合物用于
(i)治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况；和/或
(ii)用于治疗代谢或内分泌紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变的蛋白质。
5.前述实施方式中任一项所述的组合物用于治疗或预防传染病。
6.根据前述实施方式使用的组合物，所述组合物包含至少一个编码RNA，其中所述至少一个编码RNA包含至少一个编码至少一种用于治疗或防止疾病、紊乱或状况的肽或蛋白质的编码序列，其中所述组合物通过肌肉内注射或皮内注射施用给有需要的受试者。
7.一种试剂盒或套组试剂盒，其包括前述实施方式中任一项所述组合物的任一种，任选地包括用于溶解的液体载体，以及任选地，提供关于各成分的施用和剂量的信息的技术说明书。
8.前述实施方式中任一项所述的组合物或实施方式7所述的试剂盒或套组试剂盒用作药物。
9.根据前述实施方式中任一项所述的用作药物的组合物，其中所述药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下疾病的疾病：包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、包括遗传性疾病、一般遗传性疾病的单基因疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌骨失常、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。
10.根据前述实施方式中任一项所述的用作药物的组合物，其中所述药物是疫苗。
11.一种包含前述实施方式中任一项所述组合物或实施方式7所述的试剂盒或套组试剂盒的疫苗用于防止、预防、治疗和/或改善选自包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病的疾病。
12.一种治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供如上述前述实施方式中任一项所述的mRNA、如前述实施方式中任一项所述的组合物、实施方式11所述的疫苗、实施方式7所述的试剂盒或套组试剂盒；和
b)将所述mRNA、所述组合物、所述疫苗或所述试剂盒或套组试剂盒应用或施用给组织或生物体。
13.根据实施方式12所述的方法，其中所述mRNA、前述实施方式中任一项所述的组合物、实施方式11所述的疫苗或实施方式7所述的试剂盒或套组试剂盒通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或皮内注射施用给组织或生物体。
14.一种诱导受试者产生免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用如实施方式11所述的疫苗，其量能有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
15.一种用于对受试者进行疫苗接种的包含前述实施方式中任一项所述组合物的药物组合物或实施方式7所述的试剂盒或套组试剂盒，包含有效量的编码病毒抗原的mRNA。
16.包含前述实施方式中任一项所述的组合物的药物组合物或实施方式7所述的试剂盒或套组试剂盒的用途，用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选地用于(iii)诱导CD8+ T细胞应答。
17.实施方式15所述的药物组合物用于预防传染病或制造用于预防传染病的药物的用途，其中所述药物优选是疫苗。
18.一种用于防止、改善或治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，所述方法包括对所述受试者施用前述实施方式中任一项所述的组合物或实施方式7所述的试剂盒或套组试剂盒。
19.根据前述方法实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致受试者淋巴细胞中由mRNA编码的抗原表达。
20.根据前述方法实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致抗原特异性抗体反应，优选地其中所述抗原特异性抗体反应通过血清中抗原特异性抗体的存在来测量。
第四组实施方式
1.一种组合物，所述组合物包含根据式(I)的阳离子脂质和1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)，任选地结合1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)，所述组合物还包含mRNA，其包含至少一个编码蛋白质或肽或其片段或变体的编码序列，其中肽或蛋白质是抗原，其中所述抗原优选地源自致病性抗原、肿瘤抗原、致敏性抗原或自身免疫性自体抗原，或其片段或变体；其中优选地，抗原编码选自由细菌、病毒、真菌和原生动物抗原组成的组的致病性抗原。
2.根据实施方式1所述的组合物，其中所述致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。
3.根据前述实施方式中任一项所述的组合物用于治疗或预防传染病。
4.根据前述实施方式中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少一个编码RNA，其中所述至少一个编码RNA包含至少一个编码至少一种用于治疗或防止疾病、紊乱或状况的肽或蛋白质的编码序列，其中所述组合物通过肌肉内注射或皮内注射施用给有需要的受试者。
5.一种试剂盒或套组试剂盒，其包括前述实施方式中任一项的组合物的任一种，任选地包括用于溶解的液体载体，以及任选地包括提供关于各成分的施用和剂量的信息的技术说明书。
6.根据前述实施方式中任一项所述的组合物或实施方式5所述的试剂盒或套组试剂盒用作药物。
7.根据前述实施方式中任一项所述的用作药物的组合物，其中所述药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下疾病的疾病：包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、包括遗传性疾病、一般遗传性疾病的单基因疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌骨失常、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。
8.根据前述实施方式中任一项所述的用作药物的组合物，其中所述药物是疫苗。
9.一种包含前述实施方式中任一项所述组合物或实施方式5所述试剂盒或套组试剂盒的疫苗用于防止、预防、治疗和/或改善选自包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病的疾病。
10.一种治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供如上述实施方式中任一项所述的mRNA、如上述实施方式中任一项所述的组合物、实施方式9所述的疫苗、实施方式5所述的试剂盒或套组试剂盒；和
b)将所述mRNA、所述组合物、所述疫苗或所述试剂盒或套组试剂盒应用或施用给组织或生物体。
11.根据实施方式10所述的方法，其中所述mRNA、前述实施方式中任一项所述的组合物、实施方式9所述的疫苗或实施方式5所述的试剂盒或套组试剂盒通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或皮内注射施用给组织或生物体。
12.一种诱导受试者产生免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用如实施方式9所述的疫苗，其量能有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
13.一种用于对受试者进行疫苗接种的包含前述实施方式中任一项所述组合物的药物组合物或实施方式5所述的试剂盒或套组试剂盒，包含有效量的编码病毒抗原的mRNA。
14.包含前述实施方式中任一项所述的组合物的药物组合物或实施方式5所述的试剂盒或套组试剂盒的用途，用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选地用于(iii)诱导CD8+ T细胞应答。
15.实施方式13所述的药物组合物用于预防传染病或制造用于预防传染病的药物的用途，其中所述药物优选是疫苗。
16.一种用于防止、改善或治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，所述方法包括对所述受试者施用前述实施方式中任一项所述的组合物或实施方式5所述的试剂盒或套组试剂盒。
17.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致受试者淋巴细胞中由mRNA编码的抗原表达。
18.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致抗原特异性抗体反应，优选地其中所述抗原特异性抗体反应通过血清中抗原特异性抗体的存在来测量。
第五组实施方式
1.一种根据式(I)的阳离子脂质：
Ra-A-Rb 式(I)
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中
Ra选自：
Figure BDA0003701042630002151
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure BDA0003701042630002161
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，或-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基，其中每个可取代的碳原子未被取代或被一个或多个C1-C4烷基、C1-C4亚烯基、C3-C8环亚烷基或C3-C8环亚烯基取代；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基，其中所述具有12至36个碳原子的亲脂性取代基是(i)具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基，或(ii)源自生育酚或生育三烯酚；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是与氢原子(CH)结合的碳原子或氮原子；
其中所有的选择彼此独立。
2.根据实施方式1所述的阳离子脂质，其中R4是(i)具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基或(ii)选自方案1中所示的生育酚和生育三烯酚的衍生物的组。
3.根据实施方式1或实施方式2所述的阳离子脂质，其中R4在每次出现时独立地选自由以下组成的组
Figure BDA0003701042630002162
Figure BDA0003701042630002171
4.根据实施方式1至3中任一项所述的阳离子脂质，前提是如果(i)R3作为-R5-C(O)-O-存在，(ii)R1和R2是直链未被取代的乙烷二基，(iii)R5是直链未被取代的乙烷二基、直链未被取代的丙烷二基或直链未被取代的丁烷二基，(iv)A是-S-S-，和(v)Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630002172
且另一个前提是如果(i)R3不存在，(ii)R1和R2是直链未被取代的乙烷二基，(iii)A是-S-S-，和(iv)Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure BDA0003701042630002173
且不是
Figure BDA0003701042630002174
5.根据实施方式1至3中任一项所述的阳离子脂质，其中A是-S-。
6.根据实施方式1或实施方式2所述的阳离子脂质，其中R3存在且选自由-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-和R5-NH-C(O)O-组成的组；且R4是具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基。
7.根据实施方式1至6中任一项所述的阳离子脂质，其中Ra和Rb独立地选自
Figure BDA0003701042630002181
X为CH或-R1-N(H)-C(O)-R3-R4。
8.根据实施方式1至7中任一项所述的阳离子脂质，其中Ra和Rb中的每一个是：
Figure BDA0003701042630002182
X为CH；且
R3存在，且R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基，每次出现时独立选择。
9.根据实施方式1至8中任一项所述的阳离子脂质，其中
R3存在且为-R5-C(O)-O-or-R5-O-C(O)-；
R4是：
Figure BDA0003701042630002183
并且其中Ra和Rb为相同。
10.根据实施方式1至8中任一项所述的阳离子脂质，其中
R3存在且为-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
R4是：
Figure BDA0003701042630002184
并且其中Ra和Rb为相同。
11.根据实施方式9或实施方式10所述的阳离子脂质，其中R3是-R5-C(O)-O-。
12.根据实施方式7或8所述的阳离子脂质，其中R1是乙烷二基。
13.根据前述实施方式中任一项所述的阳离子脂质，所述阳离子脂质还显示以下特征的一个或多个，在每次出现时独立选择：
(i)R1是未被取代的乙烷二基、丙烷二基或丁烷二基；
(ii)R2是具有2至8个碳原子的直链、无支链的烷烃二基；
(iii)R3是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
(iv)R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；和/或
(vi)X是CH。
14.根据实施方式1所述的阳离子脂质，所述阳离子脂质选自如表1中所列化合物的一种。
15.一种组合物，所述组合物包含
(i)根据实施方式1至14中任一项所述的阳离子脂质；
(ii)如表1中所列的阳离子脂质C15；
(iii)如表1中所列的阳离子脂质C2；或
(iv)如表1中所列的阳离子脂质C26。
16.根据实施方式15所述的组合物，所述组合物还包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)类固醇，优选胆固醇；
(ii)中性脂质；
其中所述中性脂质优选为1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)，任选地组合中性脂质1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)；或其中所述中性脂质是两性离子化合物，任选地具有选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基和油酰基的两个脂肪酸部分的两性离子化合物，组合具有选自戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基和癸酰基的两个脂肪酸部分的两性离子化合物；
和/或
(iii)聚合物结合的脂质；
其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。
17.一种组合物，所述组合物包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)根据实施方式1至14中任一项所述的阳离子脂质或包含三级或四级氮/氨基基团的阳离子脂质或在生理pH值时带净正电荷的阳离子脂质
(ii)类固醇，优选胆固醇；
(iii)如实施方式16的分项(ii)中所述的中性脂质；和/或
(iv)聚合物结合的脂质，其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质；
更优选地，其中脂质部分L包含至少一种脂肪酸(“尾”)，其包含8、10或12个碳原子，优选8或10个碳原子；
乃至更优选地，其中聚乙二醇化脂质选自由1,2-二癸酰基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000(C10-PEG 2000)；和N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}(Cer8-PEG 2000)组成的组。
18.一种组合物，所述组合物包含以下赋形剂中的一种或多种；
(i)如实施方式17的分项(i)中所述的阳离子脂质；
(ii)类固醇，优选胆固醇；
(iii)如实施方式16的分项(ii)中所述的中性脂质，或优选地两种中性脂质的组合，其中该组合包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有优选C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，进而最优选选自由05:0 PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、04:0 PC(1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0 PC(DHPC，1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0 PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和09:0 PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂；和/或
(iv)聚合物结合的脂质，其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质；
更优选地其中聚乙二醇化脂质是1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)。
19.根据实施方式15至18中任一项所述的组合物，其中
优选地所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(a-i)30mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-ii)40mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至15mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iii)20mol％至60mol％的量的阳离子脂质；25mol％至55mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的磷脂；和0.5mol％至15mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iv)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的类固醇；8mol％至12mol％的量的磷脂；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-v)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的中性脂质；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；和
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的PEG-DMG 2000；或
更优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(b-i)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-ii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iv)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的C10-PEG 2000；
(b-v)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000；
(b-vi)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；11％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-vii)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；11％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-viii)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和1mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-ix)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和1mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的C10-PEG 2000；和
(b-x)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和1mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000；
(b-xi)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；20％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-xii)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；20％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-xiii)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和10mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-xiv)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和10mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的C10-PEG 2000；和
(b-xv)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和10mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000；
每个量均相对于脂质纳米颗粒的所有脂质赋形剂的总摩尔量；
更优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(c-i)脂质赋形剂组合，选自由表E中公开的E1至E108组成的组，其mol百分比选自由表F中公开的F1至F62组成的组。
20.根据实施方式15至19中任一项所述的组合物，其中优选地所述组合物包含以下比率的赋形剂
(i)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C23(
Figure BDA0003701042630002231
SS-EC)、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(ii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C2、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(iii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C15、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(iv)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C26、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(v)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C23(
Figure BDA0003701042630002232
SS-EC)、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE/1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(vi)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C2、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(vii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C15、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG2000；
(viii)如表1中公开的59mol％的阳离子脂质C26、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG2000；
(ix)如表1中公开的49mol％的阳离子脂质C23(
Figure BDA0003701042630002241
SS-EC)、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(x)如表1中公开的49mol％的阳离子脂质C2、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(xi)如表1中公开的49mol％的阳离子脂质C15、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；或
(xii)如表1中公开的49mol％的阳离子脂质C26、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000。
21.根据实施方式15至20中任一项所述的组合物，所述组合物还包含生物活性组分。
22.根据实施方式21所述的组合物，其中所述生物活性组分是选自由人工mRNA、包含至少一个编码序列的化学修饰或未修饰的信使RNA(mRNA)、自复制RNA、环状RNA、病毒RNA和复制子RNA组成的组的核酸化合物；或其任何组合，优选地其中所述生物活性组分是mRNA或mRNA化合物。
23.根据实施方式15至22中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含mRNA
(i)其量可使N/P比率达到10至20的范围；或
(ii)其量可使脂质：mRNA的重量比达到20至60的范围，优选约3至约15、5至约13、约4至约8或约7至约11。
24.根据实施方式15至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物是用于用无菌液体载体重组的无菌固体组合物，并且其中所述组合物还包含一种或多种选自pH改性剂、填充剂、稳定剂、非离子表面活性剂和抗氧化剂的无活性组分，并且其中无菌液体载体是水性载体。
25.根据实施方式15至24中任一项所述的组合物，其中所述组合物是无菌液体组合物，并且其中所述脂质纳米颗粒的平均流体动力学直径由动态激光散射确定为约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、或约60nm至约200nm、或约70nm至200nm、或约75nm至约160、或约90nm至约140nm、或约100nm至约140nm。
26.根据实施方式15至25中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒显示的ζ电位范围为-50mV至+50mV。
27.根据实施方式22至26中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物是单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。
28.根据实施方式22至26中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含至少一个化学修饰。
29.根据实施方式28所述的组合物，其中所述化学修饰选自由碱基修饰、糖修饰、主链修饰和脂质修饰组成的组，优选地其中所述化学修饰是碱基修饰，更优选地其中所述碱基修饰选自由假尿嘧啶(ψ)、N1-甲基假尿嘧啶(N1Mψ)、1-乙基假尿嘧啶、2-硫脲嘧啶(s2U)、4-硫脲嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶及其任何组合组成的组。
30.根据实施方式22至29中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含编码肽或蛋白质的编码区，其中所述编码区显示序列修饰。
31.根据实施方式30所述的组合物，其中所述序列修饰选自G/C含量修饰、密码子修饰、密码子优化或序列的C-优化；优选地其中
与相应野生型mRNA的编码区相比
-编码区的G/C含量增加；
-编码区的C含量增加；
-编码区中的密码子用法与人类密码子用法相适应；和/或密码子适应指数(CAI)在编码区增加或最大化。
32.根据实施方式22至31中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物还包含
a)5’-CAP结构；
b)至少一个miRNA序列，优选地其中microRNA结合位点用于选自由miR-126、miR-142、miR-144、miR-146、miR-150、miR-155、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27、miR-26a或其任何组合组成的组的microRNA；
c)至少一个5'-UTR元件；
d)至少一个聚(A)序列；
e)至少一个聚(C)序列；
f)至少一个3’-UTR元件；
或其任何组合。
33.根据实施方式22至32中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含5’-CAP结构，优选地m7G、CAP0、CAP1、CAP2、修饰的CAP0或修饰的CAP1结构。
34.根据实施方式22至23中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含至少一个异源5’-UTR和/或至少一个异源3’-UTR，优选地其中至少一个异源5’-UTR包含源自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5’-UTR的核酸序列，或源自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的5’-UTR的核酸序列；和/或
优选地其中至少一个异源3’-UTR包含源自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR的核酸序列，或源自这些基因中任一个的同系物、片段或变体的3’-UTR的核酸序列。
35.根据实施方式22至34中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含(i)HSD17B4 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR或(ii)RPL32 5’-UTR和ALB7 3’-UTR。
36.根据实施方式22至35中任一项所述的组合物，所述组合物包含5'至3'方向的以下元件：
a)5’-CAP结构，优选地选自由m7G(5’)、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)组成的组；
b)5'-UTR元件，其包含源自TOP基因的5'-UTR的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：22、24、26的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；
c)至少一个编码序列；
d)3'-UTR元件，其包含源自α-珠蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；和/或3'-UTR元件，其包含源自白蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：18的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；
e)任选地，至少一个聚(A)序列，优选地由10至200、10至100、40至80、或50至70个腺苷核苷酸组成；
f)任选地，至少一个聚(C)序列，优选地由10至200、10至100、20至70、20至60或10至40个胞嘧啶核苷酸组成；和
g)任选地，至少一个组蛋白茎环，优选地包含根据SEQ ID NO：4的RNA序列。
37.根据实施方式21至36中任一项所述的组合物，其中所述生物活性组分是
(a)mRNA，其包含至少一个编码肽或蛋白质，或其片段或变体的编码序列，其中肽或蛋白质是抗原，其中所述抗原优选地源自致病性抗原、肿瘤抗原、致敏性抗原或自身免疫性自体抗原，或其片段或变体；或
(b)mRNA，其包含至少一个编码治疗性蛋白质，或其片段或变体的编码序列，其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组
(i)用于治疗代谢、内分泌或氨基酸紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变蛋白质的治疗性蛋白质；
(ii)用于治疗血液疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白质；
(iii)用于治疗癌症或肿瘤疾病的治疗性蛋白质；
(iv)用于激素替代疗法的治疗性蛋白质；
(v)用于将体细胞重新编程为多功能或全能干细胞的治疗性蛋白质；
(vi)用作佐剂或免疫刺激的治疗性蛋白质；
(vii)作为治疗性抗体的治疗性蛋白质；
(viii)作为基因编辑剂的治疗性蛋白质；和
(ix)用于治疗或防止选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病的治疗性蛋白质。
38.根据实施方式37的分项(a)所述的组合物，其中所述抗原编码选自由细菌、病毒、真菌和原生动物抗原组成的组的致病性抗原。
39.根据实施方式38所述的组合物，其中所述致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。
40.根据实施方式15至39中任一项所述的组合物用于
(i)治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况；和/或
(ii)用于治疗代谢或内分泌紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变的蛋白质。
41.根据实施方式15至39中任一项所述的组合物用于治疗或预防传染病。
42.根据实施方式40或41使用的组合物，所述组合物包含至少一个编码RNA，其中所述至少一个编码RNA包含至少一个编码至少一种用于治疗或防止疾病、紊乱或状况的肽或蛋白质的编码序列，其中所述组合物通过肌肉内注射或皮内注射施用给有需要的受试者。
43.一种试剂盒或套组试剂盒，其包括实施方式21至42的组合物的任一种，任选地包括用于溶解的液体载体，以及任选地包括提供关于各成分的施用和剂量的信息的技术说明书。
44.根据实施方式21至42中任一项所述的组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒用作药物。
45.根据实施方式44所述的用作药物的组合物，其中所述药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下疾病的疾病：包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、包括遗传性疾病、一般遗传性疾病的单基因疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌骨失常、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。
46.根据实施方式44或45所述的用作药物的组合物，其中所述药物是疫苗。
47.一种包含实施方式15至42中任一项所述组合物的疫苗或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒用于防止、预防、治疗和/或改善选自包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病的疾病。
48.一种治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供如上述实施方式中任一项所述的mRNA、如上述实施方式中任一项所述的组合物、实施方式47所述的疫苗、实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒；和
b)将所述mRNA、所述组合物、所述疫苗或所述试剂盒或套组试剂盒应用或施用给组织或生物体。
49.根据实施方式48所述的方法，其中所述mRNA、实施方式15至42中任一项所述的组合物、实施方式47所述的疫苗或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒通过静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或皮内注射施用给组织或生物体。
50.一种诱导受试者产生免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用如实施方式47所述的疫苗，其量能有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
51.一种用于对受试者进行疫苗接种的包含实施方式15至42中任一项所述组合物的药物组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒，包含有效量的编码病毒抗原的mRNA。
52.包含实施方式15至42中任一项所述的组合物的药物组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒的用途，用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选地用于(iii)诱导CD8+ T细胞应答。
53.实施方式52所述的药物组合物用于预防传染病或制造用于预防传染病的药物的用途，其中所述药物优选是疫苗。
54.一种用于防止、改善或治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，所述方法包括对所述受试者施用实施方式15至42中任一项所述的组合物或实施方式43所述的试剂盒或套组试剂盒。
55.根据实施方式48至50和54中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致受试者淋巴细胞中由mRNA编码的抗原表达。
56.根据实施方式48至50、54和55中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致抗原特异性抗体反应，优选地其中所述抗原特异性抗体反应通过血清中抗原特异性抗体的存在来测量。
57.根据实施方式15至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含具有至少一个长度为C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14，优选长度为C6、C7、C8、C9或C10，更优选长度为C6、C7、C8，最优选长度为C7的烷基链的中性脂质或磷脂，或进一步最优选地其中所述组合物包含两种中性脂质的组合，其中所述组合包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有优选C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，进而最优选选自由DHPC(1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、05:0 PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、04:0 PC(1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0 PC(DHPC，1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0 PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和09:0 PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂。
58.根据实施方式15至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14的长度，优选具有C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，或进而最优选地其中所述组合物包含两种中性脂质的组合，其中所述组合包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有优选C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，进而最优选选自由DHPC(1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、05:0 PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、04:0 PC(1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0 PC(DHPC，1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0 PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和09:0 PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂。
实施例
在下一节中，给出了说明本发明的各种实施方式和方面的具体实例。然而，本发明在范围上不受示例性实施方式的限制，示例性实施方式仅用作本发明单个方面的图示，并且功能等效的方法在本发明的范围内。事实上，除了本文所述的修改之外，根据前面的描述、附图和下面的实施例本发明的各种修改将对于本领域技术人员来说变得显而易见。所有这些修改都属于本文公开的权利要求的范围。
实施例1：生成RNA构建体
本实施例提供了获得本发明RNA的方法。
实施例1.1：制备DNA模板
制备了编码所需蛋白质(如Photinus pyralis荧光素酶(PpLuc))的DNA序列，并用于随后的RNA体外转录。示例性地，本文使用编码Photinus pyralis荧光素酶(PpLuc)的G/C优化mRNA序列，即5'-CAP-32L-5'-UTR(RPL32)-GC-优化Photinus pyralis荧光素酶ORF-白蛋白7-3'-UTR-聚(A)序列-聚(C)序列-组蛋白茎环序列；3’-末端的64x腺苷(聚A-尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C-尾)和5个额外的核苷酸(SEQ ID NO：27)。
所述(DNA)序列是通过引入GC优化的CDS选择性地修饰野生型CDS序列来制备的。将序列导入包含UTR序列、一段腺苷、任选地组蛋白茎环结构以及任选地一段30个胞嘧啶的质粒载体中。获得的质粒DNA使用常见的方法在细菌中转化和繁殖，质粒DNA经提取、纯化，并用于后续的RNA体外转录，如下所述。
实施例1.2：质粒DNA模板的RNA体外转录-mRNA的制备
根据实施例1.1制备的DNA质粒使用限制性内切酶/EcoRI进行酶促线性化，并在适当的缓冲条件下在核苷酸混合物(ATP/GTP/CTP/UTP)和cap类似物(例如，m7GpppG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG或m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG))的存在下，使用T7 RNA聚合酶进行DNA依赖性RNA的体外转录。获得的RNA使用RP-HPLC(
Figure BDA0003701042630002321
根据WO2008/077592)纯化，并用于进一步的实验。获得的mRNA使用商用多聚腺苷酸化试剂盒进行酶促多聚腺苷酸化。
实施例2：合成HEXA和HEAD脂质
本实施例提供了获得本发明脂质化合物的方法和信息，以及生成和分析本发明组合物的方法。
实施例2.1：HEXA脂质-合成HEXA脂质
HEXA脂质是根据ChiroBlock GmbH(德国Bitterfeld Wolfen)的通用协议合成的。合成了表Ex-1和图1所示的九种HEXA脂，其他脂质如以上表1所示。
表Ex-1：合成的HEXA脂质的综述
Figure BDA0003701042630002331
***表Ex-1中所示脂质的命名如下获得：基本命名由三部分组成：“尾-连接物-头”。尾可以如表示己基癸酸(己基-1-癸醇)的“HEXA”或表示2-己基癸酸(羧酸)的“HEXACA”。连接物可以是，例如C4DE＝指包含二酯连接物的C4基团(C4＝具有两个酯的连接物的4个碳原子)或如C3ME，指包含单酯连接物的C3基团。提及头“PIPS”表示通过二硫键连接的哌啶残基；本申请中进一步提到的PipC3SS涉及在哌啶/哌嗪环和二硫键之间具有3个碳原子的结构。
通过核磁共振波谱(H-NMR，500.13MHz)和质谱(电喷雾电离ESI或大气压化学电离APCI，通过直接注射)证实HEXA脂质的纯度和结构特性。
实施例2.1.1：使用NanoAssemblrTM微流控系统制备LNP
LNP是根据标准协议使用NanoAssemblrTM微流控系统(Precision NanoSystemsInc.,Vancouver,BC)制备的，该系统通过能够实现纳米颗粒成分在纳升尺度上的毫秒级混合的定制工程微流控混合芯片实现纳米颗粒的受控、自下而上、分子自组装。
含有阳离子脂质
Figure BDA0003701042630002332
SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15；NOFCorporation，Tokyo，Japan；见表1中的化合物C23，见表Ex-2)的GN01 LNPs在皮下注射后可有效激活T细胞(数据未显示)。在工作例的上下文中，只要指示“SS-EC”，则提及的是上述
Figure BDA0003701042630002341
SS-EC。
在本实施例中，使用表1中公开的阳离子脂质C1-C22(ChiroBlock GmbH,Bitterfeld-Wolfen,Germany,custom synthesis)和C24-C27(Symeres,Groningen,TheNetherlands,custom synthesis)或相应的HEXA脂质或
Figure BDA0003701042630002342
SS-EC(日本东京NOF株式会社；表1中的化合物C23)制备脂质纳米颗粒组合物。此外，使用胆固醇(AvantiPolar Lipids；Alabaster，AL)、中性脂质/磷脂DPhyPE(Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL)和DMG-PEG 2000(日本东京NOF株式会社)。
在工作例和本发明公开的背景下，只要指示“DMG-PEG”/“DSG-PEG”或“DMG-mPEG”/“DSG-mPEG”，则本文中分别提及的是1,2-二肉豆蔻基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-(m)PEG2000)和二硬脂酰基-rac-甘油PEG2000(DSG-(m)PEG 2000)。
按照标准程序将脂质溶解在醇溶液(乙醇)中。相应的脂质纳米颗粒组合物详见下表Ex-2。
具体而言，通过将乙醇缓冲液中适当量的脂质原液与含有适当量如本文所示mRNA的水相(50mM乙酸钠，pH 4.0)混合制备LNP；胆固醇、磷脂和聚合物结合的脂质(20mg/ml，乙醇中)、除GN01外的阳离子脂质(20mg/ml，EtOH中)、GN01脂质(30mg/ml，叔丁醇中)和脂质C24、C25、C26和C27也溶解在30mg/ml叔丁醇中，并添加到脂质乙醇预混物中。
简而言之，在pH为4的10mM至50mM醋酸盐缓冲液中，将mRNA稀释至0.05mg/ml至0.2mg/ml。注射泵安装在NanoAssemblrTM(Precision NanoSystems Inc.，Vancouver，BC)的入口部分，用于将乙醇脂质溶液与mRNA水溶液以约1:5至1:3(体积/体积)的比率混合，总流率为约14ml/min至约18ml/min。
然后通过渗析(Slide-A-LyzerTM Dialysis Cassettes,ThermoFisher)去除乙醇，并用PBS/蔗糖缓冲液(pH 7.4，75mM NaCl、10mM磷酸盐、150mM蔗糖)替换外部缓冲液。最后，滤脂质纳米颗粒通过孔径为0.2μm的无菌过滤器过滤。通过使用Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments Ltd.；Malvern,UK)由准弹性光散射测定脂质纳米颗粒的粒径为约90nm至约140nm。对于本说明书中提及的其他阳离子脂质化合物，其配制过程类似。然后去除乙醇，并用10mM PBS(pH 7.4，含9％蔗糖)替换缓冲液。
表Ex-2：工作例的脂质纳米颗粒组合物的制备摘要/概述-包含HEXA脂质的制剂-如果此处提及特定组合物(即组合物1/2)，则在相应的工作例中指示相应的HEXA脂质
Figure BDA0003701042630002351
如上所述，术语“GN01”类似于包含59mol％如表1中所公开的阳离子脂质C23(即，
Figure BDA0003701042630002352
SS-EC(曾用名：SS-33/4PE-15，))、29.3mol％的胆固醇(作为类固醇)、10mol％的DPhyPE(作为中性脂质/磷脂)和1.7mol％的DMG-PEG 2000(作为聚合物结合的脂质)的脂质纳米颗粒。对于“GN01”，N/P(脂质与mRNA的摩尔比)优选为14，总脂质/mRNA的摩尔比优选为40。
此外，如上所述，“GN02”类似于包含59mol％如表1中所公开的阳离子脂质C2(即，HEXA-C5DE-PipSS，从本实施例部分、图1B可明显看出)、29.3mol％的胆固醇(作为类固醇)、10mol％的DPhyPE(作为中性脂质/磷脂)和1.7mol％的DMG-PEG 2000(作为聚合物结合的脂质)的脂质纳米颗粒。对于“GN02”，N/P(脂质与mRNA的摩尔比)优选为17.5，总脂质/mRNA的摩尔比优选为40。
实施例2.1.2：脂质纳米颗粒组合物/HEXA脂质的生物物理特性
根据粒径、ζ电位、封装效率/封装％(EE)、RNA含量(基本上与本发明上下文中的mRNA含量相对应)和质子化分布/pKa对每个LNP进行表征。
为测量HEXA脂质的质子化分布/pKa，使用不同的脂质组合物(如表Ex-3中所示)将表Ex-1中公开的脂质1至9制备为LNP。因此，由表Ex-1显而易见的HEXA脂质组合物1中9与不同比率的中性磷脂DPhyPE(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、中性类固醇胆固醇(Chol)和聚合物结合的脂质DMG-PEG 2000混合。
表Ex-3：HEXA脂质的制剂摘要-在本文中提及了表1中公开的阳离子脂质
Figure BDA0003701042630002361
Figure BDA0003701042630002371
为了将感兴趣的mRNA(例如，如上所述的PpLuc)配制成HEXA脂质LNP，使用的RNA/脂质的比率为3以及硝酸盐/磷酸盐(N/P)的比率为14。
pKa是溶液的酸解离常数(Ka)的以10为底的负对数，即pKa＝-log(Ka)。pKa值根据标准程序，使用荧光染料2-对甲苯胺基基萘-6-磺酸酯(TNS)进行测量。HEXA脂质化合物的质子化分布/pKa显示在图2中或相应地表Ex-4中。
此外，渗析后LNP的平均直径和ζ电位使用Malvern Zetasizer Nano(MalvernInstruments Ltd；Malvern，UK)分别通过动态光散射和激光多普勒微电泳测定。封装效率(EE[％])通过以下公式计算：％-封装＝(Ft-Fi)/Ft x 100；其中Fi＝通过向LNP等分试样中添加RiboGreen(分子探针，Eugene,OR,USA)确定的游离未封装RNA，Ft＝通过将RiboGreen(分子探针，Eugene,OR,USA)添加到荧光值＝Fi)通过用0.25％Triton X-100孵育获得的溶解LNP的等分试样中测得的总含量RNA含量。
这些分析的结果本文中显示在下表Ex-4和表Ex-5中。
表Ex-4：HEXA脂质的生物表征
Figure BDA0003701042630002381
表Ex-5：TNS荧光：HEXA脂质的质子化程度
Figure BDA0003701042630002382
Figure BDA0003701042630002391
实施例2.2：HEAD脂质-合成HEAD脂质
HEAD脂质根据ChiroBlock GmbH(德国，比特菲尔德-沃尔芬)的一般协议合成。在此工作例中，合成了三种HEAD脂质(如表Ex-6和图3所示)。
表Ex-6：合成的HEAD脂质的综述
Figure BDA0003701042630002392
Figure BDA0003701042630002401
通过核磁共振波谱(H-NMR，500.13MHz)和质谱(电喷雾电离ESI或大气压化学电离APCI，通过直接注射)证实HEAD脂质的纯度和结构特性。
实施例2.2.1：使用NanoAssemblrTM微流控系统/HEAD脂质制备LNPs
与HEXA脂质类似，根据标准协议使用NanoAssemblrTM微流控系统(PrecisionNanoSystems Inc.,Vancouver,BC)将HEAD脂质配制为LNP(参见上文实施例2.1.1)。
实施例2.2.2：脂质纳米颗粒组合物/HEAD脂质的生物物理特性
类似于前面描述的脂质纳米颗粒组合物的生物物理特性(参见上文实施例2.1.2)，根据粒径、ζ电位、封装效率(封装％；EE)、RNA含量和质子化分布/pKa对每个LNP进行表征。
为测量HEAD脂质的质子化分布/pKa，使用不同的脂质组合物(如表Ex-7和表Ex-8中所示)将HEAD脂质制备为LNP，并与GN0一起测量。
表Ex-7：工作例的脂质纳米颗粒组合物的制备总结/概述-包含HEAD脂质的制剂-如果本文中提及特定组合物(即组合物A或B)，则相应的工作例中指示相应的HEAD脂质
Figure BDA0003701042630002411
表Ex-8：HEAD脂质的配制总结
Figure BDA0003701042630002412
所得HEAD脂质化合物的质子化分布/pKa显示在图4或相应地表Ex-9中。
如上所述，通过动态光散射和激光多普勒微电泳测定渗析后LNP的平均直径和ζ电位。
为将mRNA(例如，如上所述的PpLuc和感兴趣的其他mRNA)配制成HEAD脂质LNP，使用的RNA/脂质比为3以及硝酸盐/磷酸盐(N/P)比为14。
这些分析的结果本文中显示在下表Ex-9中。
表Ex-9：HEAD脂质的生物表征
Figure BDA0003701042630002421
实施例3：HEXA脂质和HEAD脂质的体外分析
本实施例提供了本发明组合物和脂质的体外分析细节。
实施例3.1：HEXA脂质的体外分析
实施例3.1.1：使用HEXA脂质PpLuc在HeLa和HepG2中的表达
为了确定根据本发明的包含HEXA脂质的各种LNP组合物的体外表达、转染和表达效率，将PpLuc mRNA与HepG2细胞、肝细胞癌细胞系和HeLa细胞、宫颈永生癌细胞系中的阳性和阴性对照进行比较。
为了分析HEXA脂质的表达效率，所述的不同脂质组合物以PpLuc mRNA(序列见实 施例1.1，在50mM pH 4的醋酸盐中)配制。HeLa或HepG2细胞在12孔板中以100.000个细胞/孔接种，并孵育过夜，然后以LNPs和PpLuc 0.125μg/ml(每孔125ng)转染。转染24小时后读取PpLuc(见图5)。制剂细节如表Ex-3中所述。
结果：
在HeLa细胞中，与GN01相比时，LNP1至LNP6的PpLuc表达较低。然而，与GN01相比，LNP8至LNP13(包含相同的脂质，但中性脂质不同，即DPhyPE代替DSPC)在HeLa中表现出非常好甚至更好的表达。在HepG2细胞中，与GN01相比时，LNP1至LNP5表现出良好的表达。然而，同样，与GN01相比，LNP8至LNP13的表达更强(LNP8至LNP12甚至更优)。即，同样，LNP1至LNP5和LNP8至LNP12之间的唯一区别是使用DPhyPE而不是DSPC。
因此，DPhyPE的使用再次提供了DSPC的明显优势，迄今为止，DSPC在几乎所有最先进的LNP组合物中作为标准中性脂质使用。
实施例3.2：HEAD脂质的体外分析
实施例3.2.1：使用HEAD脂质的HEAD脂质在HeLa和HepG2中的PpLuc表达
该实施例显示了与HeLa细胞中的阳性和阴性对照相比，包含HEAD脂质和PpLucmRNA的根据本发明的各种LNP组合物的转染效率。
为了分析HEAD脂质的表达效率，不同脂质组合物以PpLuc mRNA(序列见实施例 1.1，在50mM pH 4的醋酸盐中)配制。HeLa细胞在12孔板中以100.000个细胞/孔接种，并孵育过夜，然后以LNPs和PpLuc 0.125μg/ml(每孔125ng)转染。转染24小时后读取PpLuc(见图6)。
结果：
因此，对于所有三种HEAD脂质，组合物B显示了较高表达率。含有组合物B的GN01和CPZP的表达率最高(1x106RLU)。因此，DPhyPE的使用再次提供了DSPC的明显优势，迄今为止，DSPC在几乎所有最先进的LNP组合物中作为标准中性脂质使用。
实施例4：HEXA脂质和HEAD脂质的体内和体外分析
本实施例提供了本发明组合物和脂质的体内和体外分析的细节。
实施例4.1：HEXA脂质的体内和体外分析
实施例4.1.1：使用包含HEXA脂质的GN01在HeLa细胞和小鼠中的hEPO表达
为确定根据本发明的包含HEXA脂质和HEAD脂质的各种LNP组合物的体外和体内表达、转染和表达效率，将下文所述的不同mRNA与下文详述的某些对照进行比较。
对于体内分析，使用人类促红细胞生成素编码mRNA(hEpo)(SEQ ID NO：28)。
根据标准程序，对hEpo mRNA进行酶促封端；在第二步中添加甲基基团以获得CAP1，并使用商用多聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案进一步对mRNA进行酶促多聚腺苷酸化。
LNP的制备如上所述，如表Ex10中所示。作为对照，将含有hEpo mRNA的LNPs转染到HeLa细胞中。对于体外转染分析，将HeLa细胞在12孔板中以100.000个细胞/孔接种，并孵育过夜，然后以配制的LNP(每孔最终浓度0.125μg/ml)转染。转染24小时后进行hEpo ELISA。
表Ex-10：用于分析HeLa和小鼠中hEpo表达的包含HEXA脂质C1至C5和GN01的HEXA制剂概述
Figure BDA0003701042630002441
总的来说，所有制剂均在HeLa细胞中显示出稳定的hEpo表达(图7)。
为进行体内分析，向6至8周龄的Balb/C小鼠(每组5只)注射0.5mg/kg LNP配制的hEpo(见表Ex-10)。注射后6小时和24小时进行EDTA血浆取样。
结果：
对LNP8至LNP12(HEXA脂质C1至C5)和GN01的体内分析证实了体外实验的结果，该结果表明在注射后6小时和24小时，hEpo表达明显较高(图8)。
实施例4.1.2：HEXA脂质的耐受性-ALT/AST和细胞因子测量
HEXA脂质化合物C1至C9和SS-EC的耐受性(见表Ex-1)通过测定转氨酶ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的活性进一步分析。为此，将含有HEXA脂质和SS EC的LNP(0.5mg/kg)静脉内注射到Balb/C中，并根据标准程序，通过测量注射后24小时的ALT和AST活性进行分析(图9)。对于脂质化合物C2，还测量了不同m/m比率的耐受性(图10)。
结果1：
与缓冲液对照组相比，没有一只动物显示出显著升高的AST和ALT肝酶活性(图9)。此外，受治疗动物的体重减轻小于5％(数据未显示)。
为了分析HEXA脂质C1至C9在早期时间点的免疫刺激特性，注射后6小时进行EDTA血浆细胞因子分析。因此，用HEXA脂质治疗6小时后的小鼠血清样本进行CBA分析，发现以下细胞因子/趋化因子水平：MCP-1、MIP-1、MIP-1、RANTES、IL-12p70、IL-6、TNF、IL-1β、IFN-γ。此外，通过ELISA测定血清中IFN-α水平。根据制造商的说明，使用试剂稀释液(1:20)中的50μl血清分析血清中的小鼠IFN-α(图10A-D)。还测定了脂质化合物2测量的不同m/m比的免疫刺激特性(图10E-H)。
结果2：
从所示附图中可以明显看出，所测试的脂质化合物均未诱导显著升高的细胞因子水平。
实施例4.2：HEXA和HEAD脂质的体内分析
实施例4.2.1：预防性和治疗性疫苗方法-使用HEXA脂质、HEAD脂质、GN01和GN02LNPs的小鼠肿瘤抗原trp2
为测试包含HEXA和HEAD脂质的LNP(包括GN01和GN02 LNP)的预防性和治疗性能力，进行了体内分析。为此，根据上述程序生成trp2 mRNA(编码肿瘤抗原trp2)，产生包含trp2 mRNA的CleanCap AG，32L4-5’-UTR核糖体5’顶部UTR(32L4)；3’-末端的64x腺苷(聚A-尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C-尾)和5个额外的核苷酸(SEQ ID NO：29)。
在上文中，例如实施例2.1.1、实施例2.2.2、表Ex-2和表Ex-6C中描述了LNP的组合物和制剂程序。
为进行免疫接种，根据表Ex-11所示的组合物细节，将7至8周龄雌性C57/BL6小鼠(每组5只)背部皮内注射(i.d)编码如上所示的肿瘤抗原Trp2的配制的mRNA。
表Ex-11：组合物和制剂细节。其他提及的描述在实施例2.1.1、实施例2.2.2、表Ex-2和表Ex-6下，其中描述了各指定，即，GN01、GN02、CISE和组合物的mol％比
图中的组名 阳离子脂质 mRNA剂量[μg]
GN01 1μg SS-EC 1
GN01 5μg SS-EC 5
GN02 1μg HEXA-C5DE-PipSS 1
GN02 5μg HEXA-C5DE-PipSS 5
CISE 1μg CISE[HEAD脂质] 1
CISE 5μg CISE[HEAD脂质] 5
trp2 5μg 无(未配制) 5
缓冲液 无 0
免疫接种在第0天、第7天和第14天进行。在14小时采集血样，在21天采血；首次疫苗接种后21天采集器官样品。用ELISA检测T细胞应答和体液免疫应答(结果显示在图11A、11B、11C和11D中)。
结果：
根据图11A和11B，使用含有trp2 mRNA的GN01、GN02和CISE LNPs进行的疫苗接种显示出稳定的IgG1和IgG2滴度。此外，根据图11C和11D，GN01、GN02和CISE LNPs显示出低T细胞应答。
实施例4.2.2：HEAD脂质的耐受性-ALT/AST和细胞因子测量
HEAD脂质CISE、CPZE和ESTER的耐受性(见表Ex-6)通过测定转氨酶ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的活性进一步分析。为此，将含有HEAD脂质的LNP和含有SS-EC的LNP(0.5mg/kg)静脉内注射到Balb/C中，并通过注射后24小时测量ALT和AST进行分析。对于脂质化合物C2，还测量了不同m/m比率的耐受性。
结果：
与缓冲液对照组相比，没有一只动物显示出显著升高的AST和ALT(图12.1)。此外，受治疗动物的体重减轻小于2％(数据未显示)。
与上文所述HEXA脂质的细胞因子测量类似，对HEAD脂质进行细胞因子分析。很明显，所测试的脂质化合物均未诱导显著升高的细胞因子水平(图12.2A-D)。
实施例5：本发明组合物/LNP(GN01)的稳定性数据
为分析本发明组合物/LNP的稳定性，如在长时间储存后，测量不同性质和生物活性，如下所述。
实施例5.1：GN01配制的hEPO mRNA的完整性和生物物理性质分析
GN01 LNPs如上文实施例4.1.1所述用hEPO mRNA配制(使用HEXA脂质(包括GN01LNPs)在HeLa细胞和小鼠中的hEPO表达)，并在4℃和-80℃储存1.5个月和6个月。为了通过凝胶电泳分析LNP内包含的mRNA，LNP被变形/破坏，以便根据本领域已知的常规程序将并入的mRNA显示在凝胶上。
结果：
测量了粒径、多分散指数(PDI)、电荷/ζ电位和EE％以及RNA含量。GN01 LNPs在储存1.5个月和6个月后显示出稳定的粒径、ζ电位和EE％值。琼脂糖凝胶电泳显示，mRNA的完整性保存了6个月。在-80℃储存1.5个月后，检测LNP中mRNA的活性，并与新制备的LNP进行比较。
显示了在4℃和-80℃储存1.5个月(图13A)和6个月(图13B)的结果。对于LNPs的分解，使用了两种条件：分解条件1(肝素和triton组合用于分解LNPs；图中C1)或分解条件2(肝素和
Figure BDA0003701042630002471
组合并加热至45℃保持15分钟用于分解LNPs；图中C2)。对于6个月的分析，采用条件C1。
结果：
未观察到显著差异(详细结果见下表Ex-12和实施例5.2)。
表Ex-12：生物物理性质和GN01 LNP mRNA完整性
Figure BDA0003701042630002481
实施例5.2：GN01 LNPs在-80℃储存10周后的生物活性
为评估在GN01 LNPs中配制的mRNA储存后的生物活性，所述GN01 LNPs以hEpomRNA配制并冷冻1周，之后静脉内注射给Balb/C小鼠(10μg mRNA，5只小鼠/组)。施用所述LNPs后，采集血样并处理EDTA血浆(施用后6小时和24小时)。剩余的GN01 LNP被冷冻并在-80℃储存长达10周。在此期间之后，LNPs被注射给一组新的动物。
结果：
储存10周后，GN01 LNPs显示出类似的水平，表明储存不会损害LNPs的生物活性(与储存1周相比，注射后6小时和24小时；见图14.1)。
在第二次评估中，血浆样品在一次冷冻/解冻循环(1F/T)后进行分析，并与2F/T循环后的血浆样品进行比较；均在-80℃储存1周后。所有测试方法都显示出良好的HsEpo生物活性再现性(见图14.2A和14.2B)。
实施例6:磷脂对LNP转染的影响
为分析不同磷脂对LNP转染的影响，DPhyPE、DSPC和DPhyPE+DSPC的1:1混合物用1号脂质化合物(见表Ex-1)和表Ex-13中所示的GN01配制。上述的PpLuc用作LNPs的载荷(0.125μg/ml，125ng/孔)。将所得组合物转染到HeLa细胞中。因此，100.000个HeLa细胞/孔接种到12孔板中。
表Ex-13：磷脂DPhyPE、DSPC、DPhyPE+DSPC(1:1混合物)对LNP转染的影响。磷脂化合物编号C1(见表Ex-1)。N/P ratio for GN01基LNPs的N/P比设为14，含C1的LNPs的N/P比设为17；所有组合物的脂质/mRNA质量比设为40(m/m)。
Figure BDA0003701042630002491
根据前面所述的标准程序，在24小时后测量PpLuc活性。结果显示在图15.1A中。根据标准程序以荧光染料2-对甲苯胺基基萘-6-磺酸酯(TNS)测量中性磷脂对LNPs的pKa的影响。HEXA脂质化合物的质子化分布/pKa显示在图15.1B或相应地表Ex-13中的pKa。
结果：
对于阳离子脂质C1和GN01二者，并入DPhyPE或DPhyPE与DSPC的1:1组合显示出比中性脂质DSPC更高的表达。如上文所示，发明人惊奇地发现融合磷脂与DSPC相比表现更好；DSPC是一种磷脂，在本领域的大多数脂质纳米颗粒中使用。此外，显示了磷脂对pKa的巨大影响(表Ex-13)。
实施例7：聚合物结合的成分的作用
为了分析PEG成分及其烷基尾对LNP转染的影响，将不同量的神经酰胺8PEG(即包含C8尾；Cer8 PEG；包含N-辛酰基-D-赤式-鞘氨醇)和C14-DMG-PEG(即包含C14尾，DMG-PEG2000)及其组合(1％Cer8和0.7％C14-DMG-PEG)用SS-EC、胆固醇和DPhyPE配制(基本上使用上述GN01制剂，同时改变聚合物结合的脂质赋形剂)，随后转染到HepG2细胞中；成分如表Ex-14所示。所有组合物的N/P比设为14；所有组合物的脂质/mRNA质量比设为40。
表Ex-14：PEG成分的变化(依据：GN01制剂)；用Cer8(神经酰胺8-PEG)、C14-DMG-PEG(表Ex-14中的C14)和混合物制备的LNP。
Figure BDA0003701042630002501
为此，10.000个HepG2细胞/孔接种在96孔板中。如上所述的PpLuc mRNA(0125μg/ml；25ng/孔)在LNPs中配制，并在OptiMEM或完全培养基中与HepG2细胞孵育1小时或4小时。
1小时或4小时后测量HepG2细胞的PpLuc活性(结果如图15.2所示)。
结果：
显而易见，本发明的发明人惊奇地发现，包含具有较短烷基链的聚合物结合的脂质的组合物(如Cer8)比包含具有较长烷基链的聚合物结合的脂质的组合物(如C14-DMG-PEG)更有效。令人惊讶的是，使用5％Cer8聚合物结合的脂质甚至可以增强PpLuc活性。
实施例8：单次静脉内注射后在GN01 LNP中表达抗狂犬病单克隆抗体
为进一步分析GN01 LNP中配制的mRNA的表达效率，NIH瑞士白化小鼠(n＝6)被注射编码抗狂犬病单克隆抗体的mRNA(1mg/kg)(mAb；S057，Thranet al.，EMBO Mol Med(2017)9:1434-1447)。抗狂犬病mAb mRNA包含HSD17B4的5’-UTR、PSMB3的3’-UTR、3’-末端的64x腺苷(聚A-尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C-尾)和5个额外的核苷酸。根据制造商的说明，使用ScriptCapTM m7G Capping System(CellScript，Madison，WI，USA)对mRNA进行进一步酶促封端，并使用商用多聚腺苷酸化试剂盒(SEQ ID NO：30＝重链，SEQ IDNO：31＝轻链)进行酶促多聚腺苷酸化。
如上所述，将mRNA配制到GN01 LNP中。
小鼠被静脉内注射(i.v.)20μg LNP配制的抗狂犬病mAb编码mRNA，并在6小时和24小时放血。使用IgG血清ELISA进行基于1:5000稀释度的抗体滴度分析(结果如图16所示)。
结果：
如图16可以明显看出，静脉内注射后6小时和24小时可检测到非常强的抗狂犬病mAb表达。
实施例9：GN01-和GN02配制的LNPs使用肌肉施用进行RABV-G疫苗接种
为分析GN01和GN02配制的LNP的免疫原性，按照上述程序生产RABV-G(或RAV-G，狂犬病病毒糖蛋白)mRNA，产生RABV-G mRNA，其包含mCap，muag-3’-UTR；3’-末端的64x腺苷(聚A尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C尾)和5个额外的核苷酸(SEQ ID NO：32)：
7周龄雌性Balb/C小鼠(n＝6)在第0天和第21天肌肉内注射根据表Ex-15的含有上述RABV-G mRNA的制剂。为了比较的目的，还配制了含KC2脂质的LNP。KC2对照LNP包含57.1mol％地DLin KC2-DMA作为阳离子脂质、7.1mol％的DPPC(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL)、34.4mol％的胆固醇(Sigma-Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)和1.4mol％的PEG-C-DMA。
表Ex-15：组合物和制剂细节；其他提及的描述在实施例2.1.1、实施例2.2.2、表Ex-2和表Ex-6下，其中描述了各指定，即，GN01、GN02和组合物的mol％比
Figure BDA0003701042630002511
Figure BDA0003701042630002521
为确定血清中抗狂犬病病毒的抗体水平，进行了经典的病毒中和试验(荧光抗体病毒中和(FAVN)试验)。
因此，首次mRNA施用后35天，处死小鼠，采集血液和器官样品(肝脏)用于进一步分析，即通过FAVN分析进行病毒中和抗体(VNA)分析。对于所述免疫原性分析，VNT如前所述进行测量，即血清中的抗狂犬病病毒中和滴度(VNT)根据世界卫生组织协议使用FAVN分析和标准挑战病毒CVS-11由德国
Figure BDA0003701042630002522
Hygiene-Labor GmbH进行分析。
此外，采集肝脏样本进行T细胞应答(CD4和CD8)分析，即评估CD4 T细胞免疫应答(IFNу/TNFα产生CD4 T细胞)和CD8 T细胞免疫应答(IFNу/TNFα产生CD8 T细胞和CD107+IFNу产生CD8 T细胞)；使用细胞内细胞因子染色(ICS)测定抗原特异性T细胞的诱导。如前所述进行分析；结果如图17A、17B和17C所示。
结果：
图17A显示在初次疫苗接种后的第35天，使用5μg GN01-和GN02 LNP配制的RABV-g-mRNA进行单次肌肉内注射免疫接种，在所有动物中诱导出非常强的VNT，远高于0.5IU/ml的保护滴度。
图17B和17C显示本发明的GN01和GN02-LNP配制的RABV-G mRNA疫苗在疫苗接种后诱导特异性细胞应答，在对照LNP疫苗接种的动物中未观察到这种效应。对mRNA制剂GN01和GN02均观察到RABV-G-特异性CD4+ T细胞(图17B)。RABV-G-特异性CD8+ T(图17C)也是如此。
实施例10：用于monotope方法的GN01用作疫苗
为在疫苗接种背景下进一步分析GN01，设计了一种编码肽huCTLA4(1-35)、辅助脂质PADRE、连接物(G4S)2的mRNA(细节显示在表Ex-16中)。
表Ex-16：单表位RNA构建物
Figure BDA0003701042630002531
PpLuc mRNA(SEQ ID NO：33)用作对照。如上所述，将相应的mRNA配制到GN01 LNP中，然后注射给C57Bl/6小鼠(实验细节如表Ex-17所示)。
表Ex-17：关于组1至7的实验细节如表Ex-16所示，对照组包括＝PpLuc mRNA
组[编号] RNA RNA剂量[μg] 小鼠[编号]
1 Pmel/gp100(PADRE) 5 7
2 Trp1(PADRE) 5 7
3 Obsl1(PADRE) 5 7
4 PpLuc 5 7
对于第1天的首次疫苗接种，C57Bl/6小鼠皮内接种5μg GN01LNP配制的RNA。在第7天，C57Bl/6小鼠第二次皮内接种5μg GN01LNP配制的RNA，并在出血后收集血清。对于第14天的第三次接种，C57Bl/6小鼠再次进行接种。在第21天进行分析，其中从脾脏中分离脾细胞，并用所有相应的表位肽(29mers)再刺激或用对照组中的所有肽再刺激(ELISPOT/ICS)。使用酶联免疫吸附斑点(ELISpot)法定量测量单个细胞的细胞因子分泌频率。为了在单细胞水平上鉴定抗原特异性、分泌细胞因子的T细胞(CD107a和INFγ及TNF)，使用了基于流式细胞术方法的ICS(细胞内细胞因子染色)分析方法。
结果：
观察到GN01配制的RNA的高反应性。通过GN01 LNP用含有PADRE的monotope构建物进行疫苗接种可增加脾细胞数量(见图18A)。monotope构建物与GN01制剂和皮内应用相结合，通常在诱导CD8 T细胞对合并的强抗原的反应方面非常有效。可以检测到针对Pmel、Trp1和Obsl1的强CD8 T细胞应答(见图18B、18C和18D)。
实施例11：GN01用于流感/流感疫苗接种-H3N2
为分析GN01配制的LNPs的免疫原性，根据上述程序制备HA(H3N2 A/Hongkong/4801/2014)mRNA，产生HA mRNA，其包含mCap，muag-3’-UTR；3’-末端的64x腺苷(聚A尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C尾)；组蛋白茎环和5个额外的核苷酸(SEQ ID NO：37)。
根据表Ex-18中所示的疫苗接种方案，在第0天和第21天(初始/增强)对7周龄雌性Balb/C小鼠(n＝5)进行肌肉内注射。如上所述获得了mRNA的GN01制剂；对照组接受氯化钠缓冲液。在第21天和第35天采集血清样品，以测定体液免疫应答。
表Ex-18：实施例11的疫苗接种方案
Figure BDA0003701042630002541
对于免疫原性分析，在启动后3周和增强后2周分析血清中的血凝抑制(HI)滴度。
血凝抑制试验：
血凝抑制(HI)试验用于分析功能性抗HA抗体滴度。小鼠血清经热灭活(56℃，30min)，与高岭土(德国卡尔·罗斯)孵育，并预吸附至鸡红细胞(CRBC；德国洛曼·蒂尔祖赫特)。将50μl 2倍稀释的预处理血清与灭活甲型/香港/4801/2014(H3N2)流感病毒(英国NIBSC)的4个血凝单位(HAU)孵育45分钟，并添加50μl 0.5％的CRBC。HI滴度由能够抑制血凝的血清最高稀释度的倒数确定。HI分析结果如图19所示。
结果：
图19显示在初次疫苗接种后的第21天，在所有动物中，用10μg GN01 LNP配制的HAmRNA进行单次肌肉内注射免疫接种，诱导的保护性HI滴度远高于40的保护性滴度，并用10μg GN01 LNP配制的HA mRNA进行增强，诱导体液免疫应答的倍数增加。
实施例12：GN01用于大型动物(小牛)体内狂犬病疫苗接种
为在大型动物的狂犬病疫苗中分析GN01 LNPs，使用RABV-G mRNA对体重约100kg的小牛进行了研究。为分析GN01配制的LNP的免疫原性，按照上述程序生产RABV-G mRNA，产生RABV-G mRNA，其包含mCap，muag-3’-UTR；3’-末端的64x腺苷(聚A尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C尾)；组蛋白茎环和5个额外的核苷酸(SEQ ID NO：32)。
如前所述，将所得mRNA配制到GN01 LNP中，并在第0天和第21天将其肌肉内注射给小牛(详细方案见表Ex-19)。作为阳性对照，使用
Figure BDA0003701042630002551
(灭活狂犬病病毒，MerialGmbH)。在第0、7、14、21、28和35天采集血样。每个时间点分析VNT。实验结果如图20所示。
表Ex-19：实施例12的疫苗接种/治疗方案和实验设计
Figure BDA0003701042630002552
结果：
如图20所证明的，用GN01配制的RABV-G编码mRNA对小牛进行肌内疫苗接种，导致非常强的中和抗体诱导，令人惊讶的是，在初次接种14天后，已经使用仅30μg mRNA的剂量。图中用短划线表示0.5IU/ml的世界卫生组织标准。因此，剂量为0.3μg/kg的GN01配制的RABV-g mRNA诱导的反应，与初始接种后采用未配制的mRNA的先前实验相比，显著更高(数据未显示)。增强疫苗接种后，VNT甚至增加(图20)；数据显示用Mann-Whitney测试的中值。
实施例13：GN01用于体内疟疾疫苗接种
本实施例显示，编码CSP的疟疾mRNA疫苗在小鼠体内诱导强烈的体液和细胞免疫应答。
CSP mRNA包含HSD17B4的5’-UTR、PSMB3的3’-UTR、3’-末端的64x腺苷(聚A尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C尾)；组蛋白茎环和5个额外的核苷酸。根据制造商的说明，使用ScriptCapTM m7G Capping System(CellScript，Madison，WI，USA)对mRNA进行进一步酶促封端，并使用商用多聚腺苷酸化试剂盒进行酶促多聚腺苷酸化，导致SEQ ID NO：38。
如前所述，在GN01脂质纳米颗粒中配制所得mRNA构建物。
GN01-LNP制剂在第0天和第21天以RNA制剂的剂量肌肉内(i.m.；胫骨肌)应用，对照组显示在表Ex-20中。阴性对照组接受GN01 LNPs中配制的无关RNA的疫苗接种。在第21天和第35天采集血清样品用于ELISA。
表Ex-20：实施例13的疫苗接种方案
Figure BDA0003701042630002561
通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
使用疟疾[NANP]7肽或C-末端肽进行包被，进行ELISA。使用各自的血清稀释液对经包被的的板进行孵育，并使用生物素化的同型特异性抗小鼠抗体，然后使用链霉亲和素HRP(辣根过氧化物酶)并以AmplexTM Red试剂作为底物检测特定抗体与各自的疟疾[NANP]7或C-末端肽的结合。在包被后的21天和35天，通过ELISA测定针对疟疾[NANP]7或C-末端肽的抗体(IgG1、IgG2a)的终点滴度。结果如图21.1A和21.1B所示。
细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准方案，在第35天分离疫苗接种小鼠的脾细胞。简单地说，分离的脾脏通过细胞过滤器研磨，在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红细胞溶解。在用PBS/1％FBS进行广泛洗涤步骤后，将脾细胞接种到96孔板中(2x106个细胞/孔)。在37℃，在2.5μg/ml抗CD28抗体(BD Biosciences)和蛋白质转运抑制剂的存在下，用CSP肽混合物(1μg/ml)刺激细胞6小时。刺激后，洗涤细胞并根据制造商的说明，使用Cytofix/CytopermTM试剂(BDBiosciences)对细胞内细胞因子进行染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1:100)、CD8-PE-Cy7(1:200)、TNF-PE(1:100)、IFNγ-APC(1:100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1:200)(BD Biosciences)并与1:100稀释的Fcγ-block孵育。Aqua染料用于区分活/死细胞(Invitrogen)。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)获取细胞。使用FlowJo软件(Tree Star，Inc.)分析流式细胞术数据。结果如图21.2所示。
结果：
如图21.2所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠体内诱导强烈的体液免疫应答。在试验条件下，应用于A组的LNP配制的疫苗(1ug剂量)诱导了非常强的免疫应答。
如图21.2所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导细胞免疫应答(CD8+和/或CD4+T细胞应答)。
由于CD8+T细胞是针对疟原虫引起的细胞内感染的主要保护性免疫机制，因此有效的疟疾疫苗应能诱导强烈的CD8+T细胞应答。因此，这些发现突出了本发明GN01制剂的一个有利特点。
实施例14：静脉内注射LNP配制的mRNA后体内FGF21的表达
为确定具有不同HEXA脂质的各种LNP组合物的转染、体内表达和表达效率(如表Ex-21所示)，配制了编码成纤维细胞生长因子21(FGF21)的mRNA，并将其静脉内注射给CD-1小鼠。另外，还测定了毒性、细胞因子释放以及表达和细胞因子释放的相关性。
为此，将几种用于更高稳定性和更少蛋白质降解的氨基酸交换引入人FGF21(L126R、P199G、A208E；类似于WO 2018/104538 A1中公开的，通过引用并入本文)。相应的mRNA序列包含HSD17B4的5’-UTR和PSMB3的3’-UTR(SEQ ID NO：39)。
此外，根据标准程序，对mRNA进行酶促封端；在第二步中添加甲基基团以获得CAP1，并使用商用多聚腺苷酸化试剂盒和本领域已知的相应方案进一步酶促腺苷酸化。另外，mRNA被化学修饰(即用假尿苷(ψ)完全替换尿苷)。如上所述和表Ex-21所示，将mRNA配制到LNPs中。
给CD-1小鼠(每组4只)注射单次静脉内注射低或高mRNA剂量(0.25mg/kg和1mg/kg)，并在注射后6小时放血。使用抗FGF21蛋白ELISA对FGF21蛋白表达进行分析(结果如图22和23所示)。
通过测量转氨酶ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的活性，进一步分析各种LNP组合物的耐受性(见表Ex-21)。注射后6小时和24小时测定ALT和AST水平。
为分析细胞因子释放，在注射后6小时进行EDTA血浆细胞因子分析。因此，在用各种LNP制剂治疗6小时后，对小鼠血清样本进行CBA分析(见表Ex-21)，发现以下细胞因子/趋化因子水平：MCP-1、MIP-1、MIP-1、RANTES、IL-12p70、IL-6、TNF、IL-1β、IFN-γ。此外，通过ELISA测定血清中IFN-α水平。根据制造商的说明，使用试剂稀释液(1:20)中的50μl血清分析血清中的小鼠IFN-α。
表Ex-21：HEXA脂质的制剂概述
Figure BDA0003701042630002581
结果：
低剂量静脉内注射(0.25mg/kg)LNP配制的mRNA 6小时后，所有制剂均可检测到FGF21蛋白水平的表达(图22)。LNP-C14、LNP-C15、LNP-21和LNP-GN01低静脉内注射编码FGF21的mRNA后，显示FGF12蛋白的高表达水平。用1mg/kg的剂量治疗后，LNP-C14、LNP-C15、LNP-21和LNP-GN01制剂中检测到非常强的蛋白质表达(图23)。与载体相比，所有LNP制剂均显示出更高的蛋白质水平。用LNP-C15测定出最高蛋白质水平。令人惊讶的是，蛋白质水平比低剂量治疗高大约35倍。
实施例15：合成HEXA-C4DE-PipSS
Figure BDA0003701042630002591
实施例15.1
合成
Figure BDA0003701042630002592
4-(2-己基去氧)-4-氧代-丁酸
于室温将2-己基-1-癸醇(10g)溶解于100ml干燥二氯甲烷中。添加琥珀酸酐(4.99g)和二甲氨基吡啶(6.1g)，并于室温在氮气下搅拌反应混合物过夜。蒸发溶剂，通过二氧化硅快速色谱法纯化粗残渣，用梯度二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇95:5洗脱。将含有产物的馏分合并并浓缩，得到目标化合物，为淡黄色油(9.32g，收率65.8％)。
实施例15.2
合成
Figure BDA0003701042630002601
O1-[2-(1-叔丁氧基羰基-4-哌啶基)乙基]O4-(2-己基癸基)丁二酸酯
将来自实施例15.1的产物(2.5g)和4-(2-羟乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(1.852g)于室温溶解在30ml干燥二氯甲烷中，得到澄清溶液。添加N,N'-二环己基碳二亚胺(1.666g)，并于室温搅拌反应混合物过夜。滤除形成的白色沉淀物，并用少量石油醚洗涤。合并的滤液在真空中浓缩，残渣通过二氧化硅快速色谱法纯化，溶剂梯度为纯汽油醚到汽油醚：乙酸乙酯80:20。将产物的纯馏分合并并浓缩，得到目标化合物，为微黄色油(3.31g，收率81.4％)。
实施例15.3
合成
Figure BDA0003701042630002602
O4-(2-己基癸基)O1-[2-(4-哌啶基)乙基]丁二酸酯
于室温将来自实施例15.2的产物(3.3g)溶解在10ml干燥二氯甲烷中。添加三氟乙酸(4ml)，并于室温将混合物搅拌2小时。混合物用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，水相用二氯甲烷反萃取。合并的有机溶液用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩，得到目标化合物作为三氟乙酸盐(黄色油3.08g，收率91％)。产物无需进一步纯化用在下一步中。
实施例15.4
合成
Figure BDA0003701042630002603
O4-(2-己基癸基)O1-[2-[1-(2-硫烷基乙基)-4-哌啶基]乙基]丁二酸酯
将来自实施例15.3的粗产物(1.3g)溶解在10ml干燥甲苯中。于室温添加N,N-二异丙基乙胺(0.526ml)，得到澄清的溶液。将混合物转移到压力瓶中，并添加0.7ml环硫乙烷。将小瓶密封，并在65℃的油浴中加热过夜。冷却至室温后，浓缩复杂反应混合物，并在后续步骤中使用获得的混合物。
实施例15.5
合成
Figure BDA0003701042630002611
O1-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[4-(2-己基去氧)-4-氧代-丁酰基]氧乙基]-1-哌啶基]乙基二硫烷基]乙基]-4-哌啶基]乙基]O4-(2-己基癸基)丁二酸酯
将来自实施例15.4的粗产物混合物溶解在15ml乙腈中。于室温逐滴加入碘在乙腈：水9:1的溶液中，同时搅拌直到保留棕色。反应混合物浓缩并吸收在乙酸乙酯中。该溶液随后用碳酸氢钠溶液、硫代硫酸钠溶液和盐水洗涤。有机相在无水硫酸钠上干燥，过滤并在真空中浓缩。目标化合物硅胶上通过快速色谱法分离，用梯度氯仿→氯仿：甲醇80:20洗脱。合并各馏分并蒸发溶剂，以提供纯目标化合物，为黄色油(272mg，两步收率11％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：4.15ppm(4H),4.01ppm(4H),3.2-2.5ppm(20H),2.2-1.9ppm(4H),1.8-1.5ppm(10H),1.5-1.1ppm(54H),0.91(12H)。
实施例16：合成HEXA-C5DE-PipSS
Figure BDA0003701042630002621
实施例16.1
合成
Figure BDA0003701042630002622
5-(2-己基去氧)-5-氧代-戊酸
向2-己基-1-癸醇(150g)和戊二酸酐(74.13g)的溶液中加入1000ml干燥二氯甲烷二甲氨基吡啶(90.71g)，反应混合物于室温在氮气下搅拌65小时。滤除并排出已形成的白色沉淀物。滤液在真空中浓缩，并与200ml石油醚混合40分钟，形成白色悬浮液。将沉淀物滤除并浓缩滤液。粗产物在300ml 1N盐酸和500ml乙酸乙酯之间分配。分离有机相，用500ml水洗涤，并在无水硫酸钠上干燥。滤除硫酸钠，并在真空中蒸发溶剂。粗残渣在二氧化硅上通过快速色谱法纯化，用梯度二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇90:10洗脱。将含有产物的馏分合并并浓缩，得到纯目标化合物，为黄色油(123.9g，收率56.1％)。
实施例16.2
合成
Figure BDA0003701042630002623
O1-[2-(1-叔丁氧基羰基-4-哌啶基)乙基]O5-(2-己基癸基)戊二酸酯
将来自实施例16.1的产物(52.6g)和4-(2-羟乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(37.2g)于室温溶解在600ml二氯甲烷中，得到澄清的黄色溶液。加入N,N'-二环己基碳二亚胺(33,48.6g)，反应混合物于室温搅拌22小时。加入更多的N,N'-二环己基碳二亚胺(15.2g)，于室温再搅拌混合物42小时。滤除形成的白色沉淀物，并用少量石油醚洗涤。合并的滤液在真空中浓缩，残渣通过二氧化硅快速色谱法纯化，溶剂梯度为纯石油醚到石油醚：乙酸乙酯90:10。将产物的纯馏分合并并浓缩，得到目标化合物，为油(32.8g，收率39.2％)。
实施例16.3
合成
Figure BDA0003701042630002631
O5-(2-己基癸基)O1-[2-(4-哌啶基)乙基]戊二酸酯
于室温将来自实施例16.2的产物(32.8g)溶解于1000ml二氯甲烷中。溶液在冰浴中冷却，并在约0℃时缓慢添加三氟乙酸(35.6ml)。将混合物加热至室温并搅拌过夜。混合物用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，水相用二氯甲烷反萃取。合并的有机溶液用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩，得到目标化合物，为黄色油(27.15g，定量收率)。产物无需进一步纯化用在下一步中。
实施例16.4
合成
Figure BDA0003701042630002632
O5-(2-己基癸基)O1-[2-[1-(2-硫烷基乙基)-4-哌啶基]乙基]戊二酸酯
将来自实施例16.3的粗产物(1.37g)溶解在10ml干燥甲苯中。于室温加入N,N-二异丙基乙胺(0.533ml)，得到澄清的溶液。将混合物转移到压力瓶中，并添加0.7ml环硫乙烷。将小瓶密封，并在65℃的油浴中加热过夜。冷却至室温后，浓缩复杂反应混合物，并在后续步骤中使用获得的混合物。
实施例16.5
合成
Figure BDA0003701042630002641
O1-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[5-(2-己基去氧)-5-氧代-戊酰基]氧乙基]-1-哌啶基]乙基二硫烷基]乙基]-4-哌啶基]乙基]O5-(2-己基癸基)戊二酸酯
将来自实施例16.4的粗产物混合物溶解在15ml乙腈中。于室温逐滴加入碘在乙腈：水9:1的溶液中，同时搅拌直到保留棕色。反应混合物浓缩并吸收在乙酸乙酯中。溶液随后用碳酸氢钠溶液和硫代硫酸钠溶液洗涤。有机相在无水硫酸钠上干燥，过滤并在真空中浓缩。目标化合物通过二氧化硅快速色谱法分离，用梯度氯仿→氯仿：甲醇80:20洗脱。合并各馏分并蒸发溶剂，以提供纯目标化合物，为黄色油(562mg，两步收率22％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：4.11ppm(4H),3.98ppm(4H),3.15-2.5ppm(12H),2.37(8H),2.17-1.84ppm(8H),1.81-1.5ppm(10H),1.49-1.08ppm(54H),0.88(12H)
实施例17：合成HEXA-C5DE-PipC3SS
Figure BDA0003701042630002651
实施例17.1
合成
Figure BDA0003701042630002652
[3-溴丙基硫烷基(二苯基)甲基]苯
向三苯基甲硫醇(12g)和1,3-二溴丙烷(22ml)在225ml干燥四氢呋喃中的溶液中添加碳酸钾(6.6g)。反应混合物在50℃搅拌两天，在60℃在氮气下再搅拌4天。滤除不溶盐，滤液在真空中浓缩。150ml二氯甲烷中的残渣溶液用500ml水洗涤冲洗，并在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。残渣通过二氧化硅快速色谱法纯化，用石油醚：二氯甲烷4:1洗脱。合并相关馏分，并在真空中蒸发溶剂，得到纯目标化合物，为固体(4.2g，收率24.3％)。
实施例17.2
合成
Figure BDA0003701042630002653
O5-(2-己基癸基)O1-[2-[1-(3-三苯甲基硫烷基丙基)-4-哌啶基]乙基]戊二酸酯
将来自实施例16.3的产物(4g)和来自实施例17.1的产物(3.4g)于室温与85ml乙腈混合以得到悬浮液。添加二甲基甲酰胺(2ml)，混合物在55℃搅拌16小时，在65℃再搅拌24小时。添加碳酸钾(600mg)，混合物再搅拌3小时。反应混合物过滤、浓缩并通过快速色谱法(二氧化硅，二氯甲烷：甲醇90:10作为洗脱液)纯化，以提供基本纯的目标化合物(3.55g，收率52.9％)，其中含有一些残留的二甲基甲酰胺。
实施例17.3
合成
Figure BDA0003701042630002661
O5-(2-己基癸基)O1-[2-[1-(3-硫烷基丙基)-4-哌啶基]乙基]戊二酸酯
将来自实施例17.2的产物(1g)溶解于5ml干燥二氯甲烷中，并将溶液在冰浴中冷却至0℃。随后添加三氟乙酸(1.965ml)和三乙基硅烷(0.206ml)，以得到略呈棕色的溶液。反应混合物在0℃搅拌30分钟，用50ml二氯甲烷稀释，并用100ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相分离，在无水硫酸钠上干燥并浓缩。残渣在二氧化硅上通过快速色谱法纯化，用梯度二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇95:5洗脱，得到目标化合物(0.47g，收率68％)。
实施例17.4
合成
Figure BDA0003701042630002662
O1-[2-[1-[3-[3-[4-[2-[5-(2-己基去氧)-5-氧代-戊酰基]氧乙基]-1-哌啶基]丙基二硫烷基]丙基]-4-哌啶基]乙基]O5-(2-己基癸基)戊二酸酯
将来自实施例17.3的产物(0.47g)溶解于10ml乙腈中。于室温逐滴加入碘在乙腈：水9:1的溶液中，直到保留棕色。反应混合物于室温搅拌58小时，浓缩并通过快速色谱法(二氧化硅，二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇95:5)纯化，得到目标化合物，为氢碘酸盐(240mg，收率45.8％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：10.01ppm(2H),4.15ppm(4H),3.99ppm(4H),3.83ppm(4H),3.28ppm(4H),2.94-2.80ppm(8H),2.53-2.44ppm(4H),2.43-2,36ppm(8H),2.21-2.09ppm(4H),2.04-1.91ppm(8H),1.84-1.67ppm(6H),1.36-1.2ppm(50H),0.90ppm(12H)
实施例18：合成HEXACA-C5DE-PipSS
Figure BDA0003701042630002671
实施例18.1
合成
Figure BDA0003701042630002672
2-己基癸酰氯
将2-己基癸酸(25g)在250ml干燥二氯甲烷+0.1ml二甲基甲酰胺中的溶液在冰浴中冷却至0℃，并在此温度下逐滴添加草酰氯(12.54ml)。将混合物加热至室温并搅拌3小时。在真空中去除溶剂，得到黄色油(26.5g)，其无需进一步纯化用于下一步。
实施例18.2
合成
Figure BDA0003701042630002681
5-羟基戊基2-己基癸酸酯
1.5-戊二醇(51.07g)和三乙胺在250ml干燥四氢呋喃中的溶液在冰浴中于0℃搅拌。在此温度下，在80分钟内缓慢添加来自实施例18.1的产物(26.5g)在250ml干燥四氢呋喃中的溶液。将反应混合物加热至室温并搅拌过夜。溶剂在真空中蒸发，将所得棕色油溶解在300ml二氯甲烷中，并用500ml水洗涤两次。有机相在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。粗产物通过二氧化硅快速色谱法纯化，用二氯甲烷：甲醇95:5洗脱。合并相关馏分，蒸发溶剂，得到目标化合物，为微棕色油(27.36g，收率81.9％)。
实施例18.3
合成
Figure BDA0003701042630002682
5-(2-己基癸酰基氧基)戊酸
琼斯试剂溶液如下新鲜制备：将浓硫酸(158.36g)逐滴添加到258ml水中的氧化铬(VI)(86.06g)冷却溶液(5℃)中，以获得深橙色溶液。将该溶液在70分钟内缓慢添加到0℃时258ml丙酮中来自实施例18.2的化合物(19.75g)的溶液中。混合物搅拌一小时，通过小心添加120ml异丙醇(放热)使反应淬灭，形成粘性沉淀物。将溶液倒出并在400ml二氯甲烷和300ml水之间分配。分离二氯甲烷溶液。粘性沉淀物用500ml二氯甲烷和500ml水搅拌。分离有机相，与先前获得的二氯甲烷溶液合并，在无水硫酸钠上干燥并浓缩。残渣通过二氧化硅快速色谱法(洗脱液二氯甲烷：甲醇96:4)纯化，在溶剂蒸发后得到目标化合物，为淡黄色油(16.38g，收率79.7％)。
实施例18.4
合成
Figure BDA0003701042630002691
4-[2-[5-(2-己基癸酰氧基)戊酰氧基]乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯
来自实施例18.3的化合物(10g)在200ml干燥二氯甲烷中的溶液用20mg干燥二甲基甲酰胺和草酰氯(3.6ml)处理。混合物在20℃搅拌1小时，在真空中浓缩并在100ml干燥二氯甲烷中重新溶解。于室温将该溶液逐滴添加到4-(2-羟乙基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(7.08g)和三乙胺(5.67g)在100ml二氯甲烷中的溶液中。反应混合物搅拌过夜，然后在真空中浓缩。残留物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯：石油醚1:5洗脱。合并相关馏分并蒸发溶剂，得到纯目标化合物(13.05g，收率81.9％)，为微黄色油。
实施例18.5
合成
Figure BDA0003701042630002692
[5-氧代-5-[2-(4-哌啶基)乙氧基]戊基]2-己基癸酸酯
于室温将来自实施例18.4的产物(5g)溶解在120ml二氯甲烷中。添加三氟乙酸(10.04g)，混合物搅拌过夜。所有挥发物在真空中去除，残渣(6.28g，定量收率)无需进一步纯化用于后续步骤。
实施例18.6
合成
Figure BDA0003701042630002693
[5-氧代-5-[2-[1-(2-硫烷基乙基)-4-哌啶基]乙氧基]戊基]2-己基癸酸酯
将来自实施例18.5的粗产物(3g)溶解在35ml干燥甲苯中。于室温添加N,N-二异丙基乙胺(5.6ml)，得到澄清的溶液。将混合物转移到压力瓶中，并加入1.91ml环硫乙烷。将小瓶密封，并在65℃的油浴中加热过夜。冷却至室温后，浓缩反应混合物并在下一步骤中使用获得的混合物。
实施例18.7
合成
Figure BDA0003701042630002701
[5-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[5-(2-己基癸酰氧基)戊酰氧基]乙基]-1-哌啶基]乙基二硫烷基]乙基]-4-哌啶基]乙氧基]-5-氧代-戊基]2-己基癸酸酯
将来自实施例18.6的粗产物混合物溶解在30ml乙腈中。于室温逐滴加入碘(814mg)在20ml乙腈中的溶液，直到保留棕色。反应混合物于室温搅拌90分钟，然后在真空中浓缩。残渣溶解在50ml氯仿中，溶液随后用50ml饱和碳酸氢钠溶液和硫代硫酸钠溶液洗涤。分离有机相，在无水硫酸钠上干燥，过滤并在真空中浓缩。目标化合物通过硅胶快速色谱法分离(洗脱液二氯甲烷：甲醇20:1+1％氨水)。合并含有纯产物的馏分，并蒸发溶剂，以提供目标化合物，为黄色油(680mg，两步收率10％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：4.15-4.02ppm(8H),2.92ppm(4H),2.83ppm(4H),2.66ppm(4H),2.36-2.26ppm(6H),2.0ppm(4H),1.74-1.62(12H),1.61-1.52ppm(8H),1.46-1.17ppm(50H),0.86ppm(12H)
实施例19：合成HEXA-C5DE-Pip-Thioether
实施例19.1
合成
Figure BDA0003701042630002702
O5-(2-己基癸基)O1-[2-[1-(2-羟乙基)-4-哌啶基]乙基]戊二酸酯将来自实施例16.3的产物(4g)、2-溴乙醇(2.14g)和碳酸钾(2.37g)的混合物在65.8ml二甲基甲酰胺中的混合物在50℃搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，用500ml水稀释，用250ml二氯甲烷萃取3次。合并的有机提取物在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。获得的粗目标化合物(3.3g)无需进一步纯化用于后续步骤。
实施例9.2
合成
Figure BDA0003701042630002711
O1-[2-[1-(2-氯乙基)-4-哌啶基]乙基]O5-(2-己基癸基)戊二酸酯
于室温向来自实施例19.1的粗产物(3.3g)在60ml甲苯中的溶液中逐滴添加亚硫酰氯(1.58g)。反应混合物搅拌90分钟，然后浓缩。产物通过二氧化硅快速色谱法预纯化，用梯度二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇90:10洗脱。合并含有目标化合物(如盐酸盐)的馏分并蒸发溶剂。最终的纯化通过第二次二氧化硅快速色谱法使用乙酸乙酯→乙酸乙酯：甲醇98:2(作为洗脱液)完成。溶剂在真空中去除，残渣吸收在100ml二氯甲烷中。该溶液用100ml饱和碳酸氢钠溶液和盐水进行强力洗涤。分离有机相，在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩，以提供目标化合物，为游离碱(1.95g，收率57％)。
实施例19.3
合成
Figure BDA0003701042630002712
O5-(2-己基癸基)O1-[2-[1-(2-硫烷基乙基)-4-哌啶基]乙基]戊二酸酯
将来自实施例16.3的粗产物(12.5g)溶解在75ml干燥甲苯中。于室温添加N,N-二异丙基乙胺(14ml)，得到澄清的溶液。加入环硫乙烷(7.96ml)，并在55℃时在氩气气氛下搅拌混合物8小时并于室温过夜。混合物被浓缩并通过二氧化硅快速色谱法纯化，用梯度二氯甲烷→二氯甲烷：甲醇95:5洗脱。合并主要含有目标化合物的馏分并蒸发溶剂。产物(1.95g，收率12.4％)含有一些相应的二硫化物(由空气氧化产生)。
实施例19.4
合成
Figure BDA0003701042630002721
O1-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[5-(2-己基去氧)-5-氧代-戊酰基]氧乙基]-1-哌啶基]乙基硫烷基]乙基]-4-哌啶基]乙基]O5-(2-己基癸基)戊二酸酯
来自实施例19.3的产物(1g)溶解在10ml二甲基甲酰胺+两滴水中。溶液在交替使用真空/氩气吹扫的三个循环中脱气。加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐(0.543g)，并于室温搅拌混合物3天。反应混合物用250ml脱气二氯甲烷稀释，并用脱气碳酸氢钠溶液和脱气盐水(各200ml)洗涤。分离有机层，在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。
残渣吸收在10ml脱气二甲基甲酰胺中，并加入来自实施例19.2的产物(1.005g)在5ml脱气二甲基甲酰胺和三乙胺(0.72ml)中的溶液。反应混合物于室温在氩气下搅拌18小时。大多数二甲基甲酰胺在55℃的减压下蒸除。残渣通过多次运行的快速色谱法纯化，以得到混合馏分。使用的二氧化硅用洗脱液(二氯甲烷：甲醇：氨水97：2.85：0.15)进行预处理。合并纯馏分并在真空中去除溶剂，得到澄清的目标化合物(120mg，收率5.9％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)：4.11ppm(4H),3.98ppm(4H),3.07-2.84ppm(4H),2.75-2.51ppm(8H),2.37(8H),2.10-1.88ppm(8H),1.69-1.54ppm(10H),1.44-1.15ppm(54H),0.88(12H)
实施例20：合成HEXA和HEAD脂质
本实施例提供了获得本发明脂质化合物的方法和信息，以及生成和分析本发明组合物的方法。
实施例20.1：HEXA脂质–合成HEXA脂质
根据ChiroBlock GmbH(德国Bitterfeld Wolfen)的通用协议合成HEXA脂质。合成了表Ex-22和图24所示的两种HEXA脂质，参见实施例23和24。
表Ex-22：合成的HEXA脂质的综述
Figure BDA0003701042630002731
***参见表Ex-1的评论。
通过核磁共振波谱(H-NMR，500.13MHz)和质谱(电喷雾电离ESI或大气压化学电离APCI，通过直接注射)证实HEXA脂质的纯度和结构特性。
C24的NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,C6D6)δ4.28-4.14(8H),2.83(4H),2.70-2.61(4H),2.48(4H),2.31(8H),2.03(4H),1.88(4H),1.76-1.61(6H),1.57-1.20(58H),1.03(12H)
C25的NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,C6D6)δ4.21-4.08(8H),2.84(4H),2.62(4H),2.41(4H),2.31(8H),2.04(4H),1.84(8H),1.71(2H),1.59-1.21(62H),1.03(12H)
实施例20.1.1：使用NanoAssemblrTM微流控系统制备LNP
如实施例2.1.1所述，使用表Ex-2中标题为“组合物2”的通用配方制备LNP，如下表Ex-23所示的LNP19至LNP24。LNP25至LNP27也如实施例2.1.1所述制备。因此，根据标准协议，使用NanoAssemblrTM微流控系统(Precision NanoSystems Inc.，Vancouver，BC)将阳离子脂质配制成LNP。
来自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL)的(07:0)PC(DHPC-1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的结构如下：
Figure BDA0003701042630002741
实施例20.1.2：脂质纳米颗粒组合物/HEXA脂质的生物物理特性
表Ex-23中所示的LNP按照实施例2.1.2中讨论的路线进行配制和表征。表征表明，表Ex-23中的LNP表现出与实施例2.1.2中的LNP相似的特性，即获得的表征结果基本在实施例2.1.2中的LNP的范围内。
表Ex-23：HEXA脂质的制剂-此处提及表Ex-22和表1中公开的阳离子脂质
Figure BDA0003701042630002742
***术语“PCL”表示“聚合物结合的脂质”类别的脂质。
实施例20.2：HEAD脂质-合成HEAD脂质
HEAD脂质根据ChiroBlock GmbH(德国，比特菲尔德-沃尔芬)的一般协议合成。在此工作例中，合成了两种HEAD脂质(如表Ex-24和图25所示)，见实施例25和26。
表Ex-24：合成的HEAD脂质的综述
Figure BDA0003701042630002743
Figure BDA0003701042630002751
通过核磁共振波谱(H-NMR，500.13MHz)和质谱(电喷雾电离ESI或大气压化学电离APCI，通过直接注射)证实HEAD脂质的纯度和结构特性。
THIOETHER的NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,C6D6)δ4.16(4H),2.85-2.67(12H),2.64-2.52(8H),2.44(4H),2.35(6H),2.23(12H),1.84(4H),1.64(16H),1.55-1.17(50H),1.04(24H)
C3SS的NMR数据如下：
1H NMR(400MHz,C6D6)δ4.17(4H),2.85-2.71(12H),2.63-2.52(4H),2.45(4H),2.34(10H),2.23(12H),1.92(4H),1.79(4H),1.73-1.15(68H),1.01(24H)
实施例20.2.1:使用NanoAssemblrTM微流控系统/HEAD脂质制备LNP
如实施例2.1.1所述，使用表Ex-7中标题为“组合物B”的通用配方制备LNP28至LNP32。如实施例2.1.1所述，使用表Ex-7中标题为“组合物A”的通用配方制备LNP-C。因此，根据标准协议，使用NanoAssemblrTM微流控系统(Precision NanoSystems Inc.，Vancouver，BC)将阳离子脂质配制成LNP。
实施例20.2.2：脂质纳米颗粒组合物/HEXA脂质的生物物理特性
表Ex-25中所示的LNP按照实施例2.2.2中讨论的路线进行配制和表征。表征表明，表Ex-25中的LNP表现出与实施例2.2.2中的LNP相似的特性，即获得的表征结果基本在实施例2.2.2中的LNP的范围内。
表Ex-25：HEAD脂质和对照(LNP-C)的制剂总结
Figure BDA0003701042630002752
Figure BDA0003701042630002761
***术语“CL”表示最先进的阳离子脂质
***术语“PL”表示包含mPEG 2000的最先进的聚合物结合的脂质实施例21：使用肌肉施用实施例20的LNP用于RABV-G疫苗接种
为分析根据实施例20的LNPs的免疫原性，根据上述程序生产RABV-G(狂犬病病毒糖蛋白)mRNA，产生RABV-G mRNA，其包含mCap，muag-3'-UTR；3’-末端的64x腺苷(聚A尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C尾)；和5个额外的核苷酸(SEQ ID NO：32)：
7周龄雌性Balb/C小鼠(表Ex-26和Ex-27每组n＝8；表Ex-28每组n＝6)在第0天和第21天使用包含上述RABV-G mRNA的根据表Ex-26、表Ex-27和表Ex-28的制剂进行肌肉内注射。
表Ex-26：组合物和制剂细节；其他提及的描述在实施例20.1.1、实施例20.2.2、表Ex-23和表Ex-25下，其中描述了组合物的mol％比
Figure BDA0003701042630002762
表Ex-27：组合物和制剂细节；其他提及的描述在实施例20.1.1、和表Ex-23下，其中描述了组合物的mol％比
Figure BDA0003701042630002763
Figure BDA0003701042630002771
表Ex-28：组合物和制剂细节；其他提及的描述在实施例20.2.2、和表Ex-25下，其中描述了组合物的mol％比
Figure BDA0003701042630002772
为确定血清中针对狂犬病病毒的抗体水平，对表Ex-26、Ex-27和Ex-28中的各组进行了经典的病毒中和试验(荧光抗体病毒中和(FAVN)试验)。
首次施用mRNA后28天，处死小鼠，采集血液和器官样品(脾脏)用于进一步分析。在这方面，在这步中获得的脾细胞样品中的狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)特异性细胞应答被测定为RABV-G特异性T细胞活化。根据以下标准方案通过细胞内细胞因子染色，然后通过流式细胞术分析进行分析：在抗CD107a(美国圣地亚哥Biolegend)和抗CD28(美国圣何塞BDBiosciences)的存在下，用RABV-G肽鸡尾酒刺激脾细胞。未刺激的脾细胞以同样的方式处理，但不补充肽混合物。另外，对照是用PMA/离子霉素(无抗CD28；来自Sigma Aldrich的PMA和离子霉素；Merck KGaA，Darmstadt，Germany)刺激的脾细胞(阳性对照)和未经荧光团结合抗体染色的脾细胞(阴性对照)。刺激程序后，用表面和细胞内荧光团结合的抗体染色脾细胞，并用流式细胞术分析。
在增强前的第21天也采集了血清样品，其中第21天的血清样品通过FAVN分析进行病毒中和抗体(VNA)分析。此外，首次施用该制剂18小时后采集血清样品，以用于由LNP配制的RABV-G编码mRNA免疫的小鼠血清中的细胞因子水平的早期分析。
对于所述免疫原性分析，VNT如前所述进行测量，即血清中的抗狂犬病病毒中和滴度(VNT)由德国
Figure BDA0003701042630002781
Hygiene-Labor GmbH根据WHO协议使用FAVN分析和StandardChallenge Virus CVS-11进行分析。
对用LNP-配制的抗原编码mRNA免疫18小时后的小鼠的血清样品进行CBA分析，该抗原包含MIG、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IL-12p70、IL-6、TNF、IL-1β、IFN-γ列中的细胞因子/趋化因子。此外，血清中的IFN-α水平根据标准协议通过ELISA测定。
此外，对于表Ex-26中的各组，第28天采集的脾脏样品用RABV-G肽库再刺激，并测定T细胞应答(CD4和CD8)，即CD4 T细胞免疫应答(IFNу/TNFα产生CD4 T细胞)和CD8 T细胞免疫应答(IFNу/TNFα产生CD8 T细胞和CD107+IFNу产生CD8 T细胞)；使用细胞内细胞因子染色(ICS)测定抗原特异性T细胞的诱导。如前所述进行分析。
结果显示在图26(关于表Ex-27中的组)、图27A、27B和27C(关于表Ex-26中的组)以及图28中(关于表Ex-28中的组)。
结果：
图26、图27A和图28显示在初次疫苗接种后第21天分别用5μg RABV-G-mRNA和1μgRABV-G-mRNA(如表Ex-27(图26)、表Ex-26(图27A)和表Ex-28(图28)中所述在LVP中配制)进行单次肌肉内注射的免疫在所有动物中诱导出非常强的VNT，远高于0.5IU/ml的保护滴度。
图7B和27C显示表Ex-26的LNP-RABV-G mRNA疫苗在疫苗接种后诱导特异性细胞应答，即在用RABV-G肽库再刺激的脾细胞中(也显示了未刺激脾细胞的对照)。在注射缓冲液的对照动物中未观察到这种作用。所有制剂均观察到RABV-G特异性CD4+T细胞(图27B)和RABV-G特异性CD8+T(图27C)。
实施例22：包含本发明脂质的不同LNP用于体内疟疾疫苗接种CSP mRNA包含HSD17B4的5’-UTR、PSMB3的3’-UTR、3’-末端的64x腺苷(聚A-尾)；5个核苷酸，3’-末端的30x胞嘧啶(聚C-尾)、组蛋白茎环和5个额外的核苷酸。根据制造商的说明，使用ScriptCapTMm7G Capping System(CellScript，Madison，WI，USA)对mRNA进行进一步酶促封端，并使用商用多聚腺苷酸化试剂盒进行酶促多聚腺苷酸化，得到SEQ ID NO：38。
如表Ex-29至Ex-31所示，在脂质纳米颗粒中配制所得mRNA构建物，其中提到了以下脂质结构(均为市售)(关于(07:0)PC(DHPC)的结构，见实施例20.1.1)：
C8-PEG 2000(N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}，AvantiPolar Lipids；Alabaster，AL)：
Figure BDA0003701042630002791
C10-PEG 2000(NOF Corporation，Tokyo，Japan)：
Figure BDA0003701042630002792
表Ex-29：HEXA脂质的制剂-此处提及表1中公开的阳离子脂质
Figure BDA0003701042630002793
Figure BDA0003701042630002801
表Ex-30：HEXA脂质的制剂-此处提及表1中公开的阳离子脂质
Figure BDA0003701042630002802
表Ex-31：HEXA脂质的制剂-此处提及表Ex-25中公开的阳离子脂质
Figure BDA0003701042630002803
***PCL表示“聚合物结合的脂质”。
根据表Ex-29和Ex-30以及Ex-25中一部分的LNP制剂在第0天和第21天肌肉内(即胫骨肌)被施用，RNA、制剂和对照组的剂量如表Ex-32至Ex-34所示。阴性对照组仅接受缓冲液。在第21天和第35天采集血清样品用于ELISA。
表Ex-32：根据表Ex-29的LNP疫苗接种方案
组 小鼠个数 RNA治疗 制剂 mRNA 剂量 途径 体积
1 6 编码CSP的mRNA LNP33 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
2 6 编码CSP的mRNA LNP34 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
3 6 编码CSP的mRNA LNP35 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
4 6 编码CSP的mRNA LNP36 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
5 6 编码CSP的mRNA LNP37 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
6 6 编码CSP的mRNA LNP38 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
7 6 编码CSP的mRNA GN02 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
8 6 不适用：仅有缓冲液 不适用 不适用 肌肉内注射 1×25μl
表Ex-33：根据表Ex-30的LNP疫苗接种方案
组 小鼠个数 RNA治疗 制剂 mRNA 剂量 途径 体积
1 6 编码CSP的mRNA LNP39 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
2 6 编码CSP的mRNA LNP40 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
3 6 编码CSP的mRNA LNP41 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
4 6 编码CSP的mRNA LNP42 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
5 6 编码CSP的mRNA LNP43 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
6 6 编码CSP的mRNA GN02 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
7 6 不适用：仅有缓冲液 不适用 不适用 肌肉内注射 1×25μl
表Ex-34：根据表Ex-25的一部分LNP疫苗接种方案
组 小鼠个数 RNA治疗 制剂 mRNA 剂量 途径 体积
1 6 编码CSP的mRNA LNP28 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
2 6 编码CSP的mRNA LNP32 CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
3 6 编码CSP的mRNA LNP-C CSP 1μg 肌肉内注射 1×25μl
4 6 不适用：仅有缓冲液 不适用 不适用 肌肉内注射 1×25μl
表Ex-35：根据表Ex-29的一部分LNP疫苗接种方案
Figure BDA0003701042630002811
Figure BDA0003701042630002821
通过ELISA测定特异性体液免疫应答：
使用疟疾[NANP]7肽进行包被，进行ELISA。使用各自的血清稀释液对经包被的的板进行孵育，并使用生物素化的同型特异性抗小鼠抗体，然后使用链霉亲和素HRP(辣根过氧化物酶)并以AmplexTM Red试剂作为底物检测特定抗体与各自的疟疾[NANP]7的结合。在初次包被后的35天，通过ELISA测定针对疟疾[NANP]7的抗体(总IgG或如各图所示的IgG)的终点滴度。结果如图31、34和35所示。
细胞内细胞因子染色：
根据本领域已知的标准方案，在第35天分离疫苗接种小鼠的脾细胞。简单地说，分离的脾脏通过细胞过滤器研磨，在PBS/1％FBS中洗涤，然后进行红细胞溶解。在用PBS/1％FBS进行广泛洗涤步骤后，将脾细胞接种到96孔板中(2x106个细胞/孔)。在37℃，在2.5μg/ml抗CD28抗体(BD Biosciences)和蛋白质转运抑制剂的存在下，用CSP肽混合物(1μg/ml)刺激细胞6小时。刺激后，洗涤细胞并根据制造商的说明，使用Cytofix/CytopermTM试剂(BDBiosciences)对细胞内细胞因子进行染色。以下抗体用于染色：Thy1.2-FITC(1:100)、CD8-PE-Cy7(1:200)、TNF-PE(1:100)、IFNγ-APC(1:100)(eBioscience)、CD4-BD Horizon V450(1:200)(BD Biosciences)并与1:100稀释的Fcγ-block孵育。Aqua染料用于区分活/死细胞(Invitrogen)。使用BD FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)获取细胞。使用FlowJo软件(Tree Star，Inc.)分析流式细胞术数据。结果如图29、30、32和33所示。
结果：
如图31、34和35所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导强烈的体液免疫应答(除LNP33制剂外，见图31)。值得注意的是，与最先进的LNP制剂(LNP-C)相比，含有C26脂质的LNP(LNP28和LNP32)的IgG1浓度更高，见图35。
如图29、30、32和33所示，LNP配制的CSP mRNA疫苗在小鼠中诱导细胞免疫应答(CD4+[图29和32]和CD8+[图30和33]T细胞应答)。
由于CD8+T细胞是针对疟原虫引起的细胞内感染的主要保护性免疫机制，因此有效的疟疾疫苗应能诱导强烈的CD8+T细胞应答。因此，这些发现突出了本发明GN01制剂的一个有利特点。
实施例23：合成HEXA-C5DE-反向-PipSS
对于合成HEXA-C5DE-反向-PipSS，硫代乙酸钾与甲苯磺酸酯11的烷基化以定量产率提供硫代乙酸酯衍生物12。在MeOH中用NaOH水溶液形成二硫醚衍生物13，纯化后获得80％的13。使用HCl进行Boc-脱保护以定量产率提供14。与2-溴乙醇直接烷基化生成化合物16失败。因此，采用醛19进行了14的还原烷基化反应，得到了37％至45％的TBDMS保护的二醇16’。随后用TBAF脱保护，提供清洁转化，生成16。由于该产物不能与残留的TBA盐完全分离，因此其直接用于与羧酸21的最终偶联。这种羧酸通过用戊二酸酐处理醇20制备，提供34％至40％的21％。成功测试了21和16的最终偶联，提供HEXA-C5DE-反向-PiPSS，不过其以很低的收率(23％)分离且纯度不足。放大试验最初只得到了9％的HEXA-C5DE-反向-PiPSS。但根据大规模的提取步骤，材料从MeCN层中分离出来，MeCN层中含有中间物，其中只有一个酸部分与16偶联。使用相同的条件和该材料的纯化以及不纯批次，成功地将该材料重新用于最终产品的偶联，得到了43％的HEXA-C5DE-反向-PiPSS，具有所需的纯度。
反应方案：
Figure BDA0003701042630002841
对于合成HEXA-C5DE-反向-PipSS(见以下方案1)，二羧酸衍生物3和4-哌啶乙醇偶联得到86％的双酰胺4。在通过快速色谱法纯化后，随后用LiAlH4还原得到24％的5。最后与市售维生素E衍生物6偶联，得到52％的HEXA—5DE-反向-PipSS，其通过在庚烷和MeCN之间萃取，然后进行快速色谱法纯化。
实施例24：合成HEXA-C5DE-Pip-C3硫醚
生成HEXA-C5DE-Pip-C3硫醚的途径始于二醇22的甲磺酸化，其提供99％的双甲磺酸衍生物23。随后的取代得到68％的双胺24。经萃取和快速色谱法后，最终与羧酸21酯化得到23％的HEXA-C5DE-Pip-C3硫醚。
反应方案：
Figure BDA0003701042630002851
实施例25：合成硫醚
对于合成硫醚，二羧酸衍生物3和4-哌啶乙醇偶联得到86％的双酰胺4。在通过快速色谱法纯化后，随后用LiAlH4还原得到24％的5。最后与市售维生素E衍生物6偶联得到52％的硫醚，其通过庚烷和MeCN之间的萃取，然后进行快速色谱法纯化。
反应方案：
Figure BDA0003701042630002861
实施例26：合成C3SS
生成C3S的途径始于7的二聚，这提供了定量收率的8。经快速色谱法纯化后，甲磺酸化提供了70％的9。与4-哌啶乙醇偶联得到33％的10。萃取和快速纯化后，随后与6偶联，得到51％的C3SS。
反应方案：
Figure BDA0003701042630002871
实施例P1：兔肌肉内注射产生高抗体水平的HEXA JET注射
将GN01 LNP和基于上述HEXA和HEAD脂质的LNPs中配制的不同mRNA编码抗体通过肌肉内注射的方式注射给兔子。对于注射，采用常规针头注射或无针注射；无针注射通过使用喷射注射(PharmaJet肌肉内注射装置)进行。
每组由10只动物组成。在10个时间点给兔子放血：第0天(注射前)、第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第14天、第21天、第28天。为评估血清中的IgG浓度，使用人Fc特异性ELISA作为生成的抗体的读数(IgG ELISA)。
实施例P2：小鼠皮内和肌肉内注射后聚合物结合的脂质成分的体内效应
为分析PEG成分的体内效应，在体内环境中类似地使用来自实施例7的LNP。使用上述的hEpo mRNA代替PpLuc作为载荷。为进行体内分析，向6至8周龄的Balb/C小鼠(每组5只)注射0.5mg/kg LNP配制的hEpo。EDTA血浆采样在注射后6小时和24小时进行；一组通过皮内途径施用hEpo，另一组通过肌内途径施用hEpo。
结果：
体内分析证实了实施例7所示的体外实验的结果，即显示了具有较短烷基链(C8)的聚合物结合的轭脂质的显著效果，即注射后6小时和24小时更高的hEpo表达。
实施例P3：
以下疫苗采用体内接种试验中使用的标准mRNA配制，并在小鼠中进行疫苗接种测试。
表P-1：根据表Ex-2、表Ex-8和表Ex-25的LNP疫苗接种方案
Figure BDA0003701042630002881
**见表Ex-2
***见表Ex-8：“组合物B”，GN-CISE-001:Chol:DPhyPE:DMG-PEG 2000
****见表Ex-25。
序列表
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gccgccacca tgg 13
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<223> Kozak序列
<400> 2
gccgccacca ugg 13
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 组蛋白茎环
<400> 3
caaaggctct tttcagagcc acca 24
<210> 4
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 组蛋白茎环
<400> 4
caaaggcucu uuucagagcc acca 24
<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBA1 3'-UTR
<400> 5
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc 110
<210> 6
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBA1 3'-UTR
<400> 6
gcuggagccu cgguggccau gcuucuugcc ccuugggccu ccccccagcc ccuccucccc 60
uuccugcacc cguacccccg uggucuuuga auaaagucug agugggcggc 110
<210> 7
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBA2 3'-UTR
<400> 7
gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc 60
tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaagtctga gtgggcag 108
<210> 8
<211> 108
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBA2 3'-UTR
<400> 8
gcuggagccu cgguagccgu uccuccugcc cgcugggccu cccaacgggc ccuccucccc 60
uccuugcacc ggcccuuccu ggucuuugaa uaaagucuga gugggcag 108
<210> 9
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBB 3'-UTR
<400> 9
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120
tattttcatt gc 132
<210> 10
<211> 132
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HBB 3'-UTR
<400> 10
gcucgcuuuc uugcugucca auuucuauua aagguuccuu uguucccuaa guccaacuac 60
uaaacugggg gauauuauga agggccuuga gcaucuggau ucugccuaau aaaaaacauu 120
uauuuucauu gc 132
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muag 3'-UTR
<400> 11
gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg 44
<210> 12
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> muag 3'-UTR
<400> 12
gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accg 44
<210> 13
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白3'-UTR
<400> 13
catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60
aagcttattc atctgttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120
ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180
gaatct 186
<210> 14
<211> 186
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白3'-UTR
<400> 14
caucacauuu aaaagcaucu cagccuacca ugagaauaag agaaagaaaa ugaagaucaa 60
aagcuuauuc aucuguuuuu cuuuuucguu gguguaaagc caacacccug ucuaaaaaac 120
auaaauuucu uuaaucauuu ugccucuuuu cucugugcuu caauuaauaa aaaauggaaa 180
gaaucu 186
<210> 15
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白7 3'-UTR
<400> 15
catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60
tagcttattc atctcttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120
ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180
gaacct 186
<210> 16
<211> 186
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白7 3'-UTR
<400> 16
caucacauuu aaaagcaucu cagccuacca ugagaauaag agaaagaaaa ugaagaucaa 60
uagcuuauuc aucucuuuuu cuuuuucguu gguguaaagc caacacccug ucuaaaaaac 120
auaaauuucu uuaaucauuu ugccucuuuu cucugugcuu caauuaauaa aaaauggaaa 180
gaaccu 186
<210> 17
<211> 187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALB7 3'-UTR
<400> 17
gcatcacatt taaaagcatc tcagcctacc atgagaataa gagaaagaaa atgaagatca 60
atagcttatt catctctttt tctttttcgt tggtgtaaag ccaacaccct gtctaaaaaa 120
cataaatttc tttaatcatt ttgcctcttt tctctgtgct tcaattaata aaaaatggaa 180
agaacct 187
<210> 18
<211> 187
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALB7 3'-UTR
<400> 18
gcaucacauu uaaaagcauc ucagccuacc augagaauaa gagaaagaaa augaagauca 60
auagcuuauu caucucuuuu ucuuuuucgu ugguguaaag ccaacacccu gucuaaaaaa 120
cauaaauuuc uuuaaucauu uugccucuuu ucucugugcu ucaauuaaua aaaaauggaa 180
agaaccu 187
<210> 19
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMB3 3'-UTR
<400> 19
ccctgttccc agagcccact tttttttctt tttttgaaat aaaatagcct gtctttc 57
<210> 20
<211> 57
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PSMB3 3'-UTR
<400> 20
cccuguuccc agagcccacu uuuuuuucuu uuuuugaaau aaaauagccu gucuuuc 57
<210> 21
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSD17B4 5'-UTR
<400> 21
gtcccgcagt cggcgtccag cggctctgct tgttcgtgtg tgtgtcgttg caggccttat 60
tc 62
<210> 22
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSD17B4 5'-UTR
<400> 22
gucccgcagu cggcguccag cggcucugcu uguucgugug ugugucguug caggccuuau 60
uc 62
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL32 (32L4) 5'-UTR
<400> 23
ggcgctgcct acggaggtgg cagccatctc cttctcggca tc 42
<210> 24
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RPL32 (32L4) 5'-UTR
<400> 24
ggcgcugccu acggaggugg cagccaucuc cuucucggca uc 42
<210> 25
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP5A1 5'-UTR
<400> 25
gcggctcggc cattttgtcc cagtcagtcc ggaggctgcg gctgcagaag taccgcctgc 60
ggagtaactg caaag 75
<210> 26
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATP5A1 5'-UTR
<400> 26
gcggcucggc cauuuugucc cagucagucc ggaggcugcg gcugcagaag uaccgccugc 60
ggaguaacug caaag 75
<210> 27
<211> 2035
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PpLuc mRNA
<400> 27
ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu gaggauggag 60
gacgccaaga acaucaagaa gggcccggcg cccuucuacc cgcuggagga cgggaccgcc 120
ggcgagcagc uccacaaggc caugaagcgg uacgcccugg ugccgggcac gaucgccuuc 180
accgacgccc acaucgaggu cgacaucacc uacgcggagu acuucgagau gagcgugcgc 240
cuggccgagg ccaugaagcg guacggccug aacaccaacc accggaucgu ggugugcucg 300
gagaacagcc ugcaguucuu caugccggug cugggcgccc ucuucaucgg cguggccguc 360
gccccggcga acgacaucua caacgagcgg gagcugcuga acagcauggg gaucagccag 420
ccgaccgugg uguucgugag caagaagggc cugcagaaga uccugaacgu gcagaagaag 480
cugcccauca uccagaagau caucaucaug gacagcaaga ccgacuacca gggcuuccag 540
ucgauguaca cguucgugac cagccaccuc ccgccgggcu ucaacgagua cgacuucguc 600
ccggagagcu ucgaccggga caagaccauc gcccugauca ugaacagcag cggcagcacc 660
ggccugccga aggggguggc ccugccgcac cggaccgccu gcgugcgcuu cucgcacgcc 720
cgggacccca ucuucggcaa ccagaucauc ccggacaccg ccauccugag cguggugccg 780
uuccaccacg gcuucggcau guucacgacc cugggcuacc ucaucugcgg cuuccgggug 840
guccugaugu accgguucga ggaggagcug uuccugcgga gccugcagga cuacaagauc 900
cagagcgcgc ugcucgugcc gacccuguuc agcuucuucg ccaagagcac ccugaucgac 960
aaguacgacc ugucgaaccu gcacgagauc gccagcgggg gcgccccgcu gagcaaggag 1020
gugggcgagg ccguggccaa gcgguuccac cucccgggca uccgccaggg cuacggccug 1080
accgagacca cgagcgcgau ccugaucacc cccgaggggg acgacaagcc gggcgccgug 1140
ggcaaggugg ucccguucuu cgaggccaag gugguggacc uggacaccgg caagacccug 1200
ggcgugaacc agcggggcga gcugugcgug cgggggccga ugaucaugag cggcuacgug 1260
aacaacccgg aggccaccaa cgcccucauc gacaaggacg gcuggcugca cagcggcgac 1320
aucgccuacu gggacgagga cgagcacuuc uucaucgucg accggcugaa gucgcugauc 1380
aaguacaagg gcuaccaggu ggcgccggcc gagcuggaga gcauccugcu ccagcacccc 1440
aacaucuucg acgccggcgu ggccgggcug ccggacgacg acgccggcga gcugccggcc 1500
gcgguggugg ugcuggagca cggcaagacc augacggaga aggagaucgu cgacuacgug 1560
gccagccagg ugaccaccgc caagaagcug cggggcggcg ugguguucgu ggacgagguc 1620
ccgaagggcc ugaccgggaa gcucgacgcc cggaagaucc gcgagauccu gaucaaggcc 1680
aagaagggcg gcaagaucgc cguguaagac uagugcauca cauuuaaaag caucucagcc 1740
uaccaugaga auaagagaaa gaaaaugaag aucaauagcu uauucaucuc uuuuucuuuu 1800
ucguuggugu aaagccaaca cccugucuaa aaaacauaaa uuucuuuaau cauuuugccu 1860
cuuuucucug ugcuucaauu aauaaaaaau ggaaagaacc uagaucuaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa augcaucccc 1980
cccccccccc cccccccccc cccccccaaa ggcucuuuuc agagccacca gaauu 2035
<210> 28
<211> 858
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HsEPO mRNA
<400> 28
gggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug ggcgugcacg agugccccgc cuggcugugg cuccugcuga 120
gccuccuguc ccugccgcuc gggcugcccg uccugggcgc ccccccgcgg cucaucugcg 180
acagccgcgu gcuggagcgg uaccugcucg aggcgaagga ggccgagaac aucaccaccg 240
ggugcgccga gcacugcucc cugaacgaga acaucacggu gccggacacc aaggucaacu 300
ucuacgccug gaagcgcaug gaggugggcc agcaggccgu ggaggucugg caggggcugg 360
cgcuccugag cgaggccgug cugcggggcc aggcccuccu ggugaacucc agccagcccu 420
gggagccccu gcagcuccac gucgacaagg ccguguccgg ccugcgcagc cugaccaccc 480
uccugcgggc gcugggggcc cagaaggagg ccaucucccc cccggacgcc gccagcgcgg 540
ccccgcuccg cacgaucacc gccgacaccu uccggaagcu guuccgcgug uacuccaacu 600
uccugcgggg caagcucaag cuguacaccg gggaggccug ccgcacgggc gaccggugag 660
gacuaguccc uguucccaga gcccacuuuu uuuucuuuuu uugaaauaaa auagccuguc 720
uuucagaucu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780
aaaaaaaaaa aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu 840
uucagagcca ccagaauu 858
<210> 29
<211> 1975
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MmDCT mRNA
<400> 29
agggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accaugggcc 60
ugguggggug gggccuccug cuggggugcc ucggcugcgg gauccugcug cgggcccgcg 120
cccaguuccc ccgggucugc augacccucg acggcgugcu gaacaaggag ugcugcccgc 180
cccugggccc cgaggcgacc aacaucugcg gguuccucga gggccgcggg cagugcgccg 240
aggugcagac ggacacccgg cccuggagcg gcccguacau ccugcgcaac caggacgacc 300
gggagcagug gccccgcaag uucuucaacc ggaccugcaa gugcaccggg aacuucgccg 360
gcuacaacug cggcgggugc aaguucggcu ggacggggcc cgacugcaac cgcaagaagc 420
ccgccauccu gcggcgcaac auccacuccc ucaccgccca ggagcgggag caguuccugg 480
gcgcgcugga ccucgccaag aagagcaucc acccggacua cgucaucacc acccagcacu 540
ggcugggccu gcucgggccc aacggcacgc agccccagau cgccaacugc uccguguacg 600
acuucuucgu guggcugcac uacuacagcg uccgcgacac ccugcucggg cccggccggc 660
cguacaaggc caucgacuuc ucccaccagg ggcccgcguu cgugaccugg caccgcuacc 720
accugcugug gcucgagcgg gagcugcagc gccugaccgg caacgagagc uucgcccucc 780
ccuacuggaa cuucgccacg ggcaagaacg agugcgacgu gugcaccgac gagcugcugg 840
gggccgcccg gcaggacgac cccacccuga ucucccgcaa cagccgguuc uccaccuggg 900
agaucgucug cgacagccuc gacgacuaca accgccgggu gacgcugugc aacggcaccu 960
acgaggggcu gcuccggcgc aacaaggugg gccggaacaa cgagaagcug ccgacccuga 1020
agaacgucca ggacugccuc ucccugcaga aguucgacag cccccccuuc uuccagaacu 1080
ccaccuucag cuuccgcaac gcgcuggagg gguucgacaa ggccgacggc acgcucgacu 1140
cccaggugau gaaccugcac aaccuggccc acagcuuccu caacggcacc aacgcccugc 1200
cccacuccgc cgcgaacgac ccgguguucg ucgugcugca cagcuucacc gacgccaucu 1260
ucgacgagug gcucaagcgg aacaaccccu ccaccgacgc cuggccccag gagcuggccc 1320
ccaucgggca caaccgcaug uacaacaugg ugccguucuu cccgcccguc acgaacgagg 1380
agcuguuccu gaccgccgag cagcucggcu acaacuacgc gguggaccug agcgaggagg 1440
aggcccccgu guggagcacc acccuguccg ucgugaucgg gauccucggc gccuucgugc 1500
ugcugcucgg gcugcuggcc uuccuccagu accggcgccu gcggaagggc uacgccccgc 1560
ugauggagac gggccucagc uccaagcgcu acaccgagga ggcggccaag uucguggccg 1620
ccuggacccu gaaggcggcc gccugaggac uagugcauca cauuuaaaag caucucagcc 1680
uaccaugaga auaagagaaa gaaaaugaag aucaauagcu uauucaucuc uuuuucuuuu 1740
ucguuggugu aaagccaaca cccugucuaa aaaacauaaa uuucuuuaau cauuuugccu 1800
cuuuucucug ugcuucaauu aauaaaaaau ggaaagaacc uagaucuaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa augcaucccc 1920
cccccccccc cccccccccc cccccccaaa ggcucuuuuc agagccacca gaauu 1975
<210> 30
<211> 1707
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗狂犬病抗体HC mRNA
<400> 30
gggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug gacuggaccu ggcgcuuccu guucgugguc gccgccgcga 120
ccggcgugca gagccaggug cagcucgucc aguccggggc cgaggugaag aagcccggca 180
gcuccgugaa ggucagcugc aaggccuccg ggggcacguu caaccgguac accgugaacu 240
gggugcgcca ggccccgggg cagggccugg aguggauggg cgggaucauc cccaucuucg 300
gcaccgccaa cuacgcgcag cgguuccagg ggcgccugac caucacggcc gacgagagca 360
ccuccaccgc cuacauggag cucagcuccc ugcggagcga cgacaccgcc gucuacuucu 420
gcgcgcgcga gaaccuggac aacuccggca cguacuacua cuucagcggg ugguucgacc 480
ccuggggcca gggcacccuc gugaccgugu ccagcgccuc caccaagggg cccagcgucu 540
ucccgcuggc ccccuccagc aaguccacga gcggcgggac cgccgcccug ggcugccucg 600
ugaaggacua cuuccccgag cccgugaccg ucagcuggaa cuccggcgcg cugaccagcg 660
gggugcacac guucccggcc gugcugcagu ccagcggccu cuacucccug agcuccgucg 720
ugaccgugcc cagcuccagc cuggggaccc agaccuacau cugcaacguc aaccacaagc 780
ccuccaacac gaagguggac aagcgggugg agcccaagag cugcgacaag acccacaccu 840
gcccgcccug ccccgccccg gagcuccugg gcgggccguc cgucuuccug uucccuccca 900
agcccaagga cacccucaug aucagccgca cgccggaggu gaccugcguc gugguggacg 960
ugucccacga ggaccccgag gugaaguuca acugguacgu ggacggcguc gaggugcaca 1020
acgccaagac caagccccgg gaggagcagu acaacagcac cuaccgcgug gucuccgugc 1080
ugacggugcu gcaccaggac uggcucaacg gcaaggagua caagugcaag gucagcaaca 1140
aggcccugcc cgcgccgauc gagaagacca ucuccaaggc caaggggcag ccccgggagc 1200
cccaggugua cacccugccc ccgagccgcg aggagaugac caagaaccag gugagccuca 1260
cgugccuggu caagggcuuc uaccccuccg acaucgccgu ggagugggag agcaacgggc 1320
agcccgagaa caacuacaag accaccccgc ccgugcugga cuccgacggc agcuucuucc 1380
ucuacuccaa gcugaccguc gacaagagcc gguggcagca ggggaacgug uucuccugca 1440
gcgugaugca cgaggcccug cacaaccacu acacgcagaa gucccucagc cugucccccg 1500
gcaagugagg acuagucccu guucccagag cccacuuuuu uuucuuuuuu ugaaauaaaa 1560
uagccugucu uucagaucua aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc ccccccccca 1680
aaggcucuuu ucagagccac cagaauu 1707
<210> 31
<211> 1005
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗狂犬病抗体LC mRNA
<400> 31
gggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug agcgugccca ccauggccug ggcccugcuc cugcuguccc 120
uccugaccca gggcacgggg agcugggcgc aguccgcccu gacccagccg cgcagcgucu 180
ccggcagccc cgggcagucc gugaccauca gcugcaccgg cacguccagc gacaucgggg 240
gcuacaacuu cguguccugg uaccagcagc accccggcaa ggcccccaag cucaugaucu 300
acgacgccac caagcggccg agcggggucc ccgaccgcuu cuccggcagc aaguccggga 360
acaccgccag ccugaccauc uccggccugc aggcggagga cgaggccgac uacuacugcu 420
gcagcuacgc cggggacuac acgcccggcg ugguguucgg cgggggcacc aagcucaccg 480
uccuggggca gccgaaggcc gcgccguccg ugacccuguu cccucccagc agcgaggagc 540
uccaggccaa caaggccacg cuggugugcc ugaucuccga cuucuacccc ggcgccguca 600
ccguggccug gaaggcggac agcuccccgg ugaaggccgg cgucgagacc accacgccca 660
gcaagcaguc caacaacaag uacgccgcca gcuccuaccu cagccugacc cccgagcagu 720
ggaaguccca ccggagcuac uccugccagg ugacccacga ggggagcacc guggagaaga 780
cggucgcccc caccgagugc uccugaggac uagucccugu ucccagagcc cacuuuuuuu 840
ucuuuuuuug aaauaaaaua gccugucuuu cagaucuaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa augcaucccc cccccccccc 960
cccccccccc cccccccaaa ggcucuuuuc agagccacca gaauu 1005
<210> 32
<211> 1792
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RABV-G mRNA
<400> 32
gggagaaagc uuaccauggu gccccaggcc cugcucuucg ucccgcugcu gguguucccc 60
cucugcuucg gcaaguuccc caucuacacc auccccgaca agcuggggcc guggagcccc 120
aucgacaucc accaccuguc cugccccaac aaccucgugg ucgaggacga gggcugcacc 180
aaccugagcg gguucuccua cauggagcug aaggugggcu acaucagcgc caucaagaug 240
aacggguuca cgugcaccgg cguggucacc gaggcggaga ccuacacgaa cuucgugggc 300
uacgugacca ccaccuucaa gcggaagcac uuccgcccca cgccggacgc cugccgggcc 360
gccuacaacu ggaagauggc cggggacccc cgcuacgagg agucccucca caaccccuac 420
cccgacuacc acuggcugcg gaccgucaag accaccaagg agagccuggu gaucaucucc 480
ccgagcgugg cggaccucga ccccuacgac cgcucccugc acagccgggu cuuccccggc 540
gggaacugcu ccggcguggc cgugagcucc acguacugca gcaccaacca cgacuacacc 600
aucuggaugc ccgagaaccc gcgccugggg auguccugcg acaucuucac caacagccgg 660
ggcaagcgcg ccuccaaggg cagcgagacg ugcggguucg ucgacgagcg gggccucuac 720
aagucccuga agggggccug caagcugaag cucugcggcg ugcugggccu gcgccucaug 780
gacgggaccu ggguggcgau gcagaccagc aacgagacca aguggugccc ccccggccag 840
cuggucaacc ugcacgacuu ccggagcgac gagaucgagc accucguggu ggaggagcug 900
gucaagaagc gcgaggagug ccuggacgcc cucgagucca ucaugacgac caagagcgug 960
uccuuccggc gccugagcca ccugcggaag cucgugcccg gguucggcaa ggccuacacc 1020
aucuucaaca agacccugau ggaggccgac gcccacuaca aguccguccg cacguggaac 1080
gagaucaucc cgagcaaggg gugccugcgg gugggcggcc gcugccaccc ccacgucaac 1140
gggguguucu ucaacggcau cauccucggg cccgacggca acgugcugau ccccgagaug 1200
caguccagcc ugcuccagca gcacauggag cugcuggucu ccagcgugau cccgcucaug 1260
cacccccugg cggaccccuc caccguguuc aagaacgggg acgaggccga ggacuucguc 1320
gaggugcacc ugcccgacgu gcacgagcgg aucagcggcg ucgaccucgg ccugccgaac 1380
ugggggaagu acgugcugcu cuccgccggc gcccugaccg cccugaugcu gaucaucuuc 1440
cucaugaccu gcuggcgccg ggugaaccgg agcgagccca cgcagcacaa ccugcgcggg 1500
accggccggg aggucuccgu gaccccgcag agcgggaaga ucaucuccag cugggagucc 1560
uacaagagcg gcggcgagac cgggcuguga ggacuaguua uaagacugac uagcccgaug 1620
ggccucccaa cgggcccucc uccccuccuu gcaccgagau uaauaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaug cauccccccc 1740
cccccccccc cccccccccc ccccaaaggc ucuuuucaga gccaccagaa uu 1792
<210> 33
<211> 1870
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PpLuc mRNA
<400> 33
aggagaaagc uuaccaugga ggacgccaag aacaucaaga agggcccggc gcccuucuac 60
ccgcuggagg acgggaccgc cggcgagcag cuccacaagg ccaugaagcg guacgcccug 120
gugccgggca cgaucgccuu caccgacgcc cacaucgagg ucgacaucac cuacgcggag 180
uacuucgaga ugagcgugcg ccuggccgag gccaugaagc gguacggccu gaacaccaac 240
caccggaucg uggugugcuc ggagaacagc cugcaguucu ucaugccggu gcugggcgcc 300
cucuucaucg gcguggccgu cgccccggcg aacgacaucu acaacgagcg ggagcugcug 360
aacagcaugg ggaucagcca gccgaccgug guguucguga gcaagaaggg ccugcagaag 420
auccugaacg ugcagaagaa gcugcccauc auccagaaga ucaucaucau ggacagcaag 480
accgacuacc agggcuucca gucgauguac acguucguga ccagccaccu cccgccgggc 540
uucaacgagu acgacuucgu cccggagagc uucgaccggg acaagaccau cgcccugauc 600
augaacagca gcggcagcac cggccugccg aagggggugg cccugccgca ccggaccgcc 660
ugcgugcgcu ucucgcacgc ccgggacccc aucuucggca accagaucau cccggacacc 720
gccauccuga gcguggugcc guuccaccac ggcuucggca uguucacgac ccugggcuac 780
cucaucugcg gcuuccgggu gguccugaug uaccgguucg aggaggagcu guuccugcgg 840
agccugcagg acuacaagau ccagagcgcg cugcucgugc cgacccuguu cagcuucuuc 900
gccaagagca cccugaucga caaguacgac cugucgaacc ugcacgagau cgccagcggg 960
ggcgccccgc ugagcaagga ggugggcgag gccguggcca agcgguucca ccucccgggc 1020
auccgccagg gcuacggccu gaccgagacc acgagcgcga uccugaucac ccccgagggg 1080
gacgacaagc cgggcgccgu gggcaaggug gucccguucu ucgaggccaa ggugguggac 1140
cuggacaccg gcaagacccu gggcgugaac cagcggggcg agcugugcgu gcgggggccg 1200
augaucauga gcggcuacgu gaacaacccg gaggccacca acgcccucau cgacaaggac 1260
ggcuggcugc acagcggcga caucgccuac ugggacgagg acgagcacuu cuucaucguc 1320
gaccggcuga agucgcugau caaguacaag ggcuaccagg uggcgccggc cgagcuggag 1380
agcauccugc uccagcaccc caacaucuuc gacgccggcg uggccgggcu gccggacgac 1440
gacgccggcg agcugccggc cgcgguggug gugcuggagc acggcaagac caugacggag 1500
aaggagaucg ucgacuacgu ggccagccag gugaccaccg ccaagaagcu gcggggcggc 1560
gugguguucg uggacgaggu cccgaagggc cugaccggga agcucgacgc ccggaagauc 1620
cgcgagaucc ugaucaaggc caagaagggc ggcaagaucg ccgugugagg acuaguuaua 1680
agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740
auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc 1860
caccagaauu 1870
<210> 34
<211> 727
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单表位构建体MmPmel(14-43) mRNA
<400> 34
aggagaaagc uuaccauggc cugccugggc uuccagcgcc acaaggccca gcucaaccug 60
gcgacccgga ccuggcccug cacgcuccug uucuuccugc uguucauccc gguguucugc 120
ggcgggggug gaagcggcgg ggguggaagu cugagcgccc uccuggccgu gggcgcgcug 180
gaggggcccc gcaaccagga cuggcucggc gucccgcggc agcuggugac caagaccgga 240
gguggcgggu cuggaggugg cgggucagcc aaguucgugg ccgcguggac ccugaaggcc 300
gccgccggug gcggaggguc ggguggcgga ggguccuucc ugcucuggau ccuggccgcc 360
gugagcuccg gccuguucuu cuacagcuuc cuccugaccg cggucucccu gagcaagaug 420
cucaagaagc gcuccccccu gaccacgggg guguacguga agaugccgcc caccgagccc 480
gagugcgaga agcaguucca gcccuacuuc aucccgauca acugaggacu aguuauaaga 540
cugacuagcc cgaugggccu cccaacgggc ccuccucccc uccuugcacc gagauuaaua 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc ccccccccca aaggcucuuu ucagagccac 720
cagaauu 727
<210> 35
<211> 727
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单表位构建体MmTrp1(455-473) mRNA
<400> 35
aggagaaagc uuaccauggc cugccugggc uuccagcgcc acaaggccca gcucaaccug 60
gcgacccgga ccuggcccug cacgcuccug uucuuccugc uguucauccc gguguucugc 120
ggcgggggug gaagcggcgg ggguggaagu cccccgguga ccaacaccga gauguucguc 180
acggcccccg acaaccuggg cuacauguac gaggugcagu ggcccgggca ggaguucgga 240
gguggcgggu cuggaggugg cgggucagcc aaguucgugg ccgcguggac ccugaaggcc 300
gccgccggug gcggaggguc ggguggcgga ggguccuucc ugcucuggau ccuggccgcc 360
gugagcuccg gccuguucuu cuacagcuuc cuccugaccg cggucucccu gagcaagaug 420
cucaagaagc gcuccccccu gaccacgggg guguacguga agaugccgcc caccgagccc 480
gagugcgaga agcaguucca gcccuacuuc aucccgauca acugaggacu aguuauaaga 540
cugacuagcc cgaugggccu cccaacgggc ccuccucccc uccuugcacc gagauuaaua 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc ccccccccca aaggcucuuu ucagagccac 720
cagaauu 727
<210> 36
<211> 727
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单表位构建体MmObsl1(1750-1778) mRNA
<400> 36
aggagaaagc uuaccauggc cugccugggc uuccagcgcc acaaggccca gcucaaccug 60
gcgacccgga ccuggcccug cacgcuccug uucuuccugc uguucauccc gguguucugc 120
ggcgggggug gaagcggcgg ggguggaagu augcgcgagg gcguggagcu gugccccggg 180
aacaaguacg agaugcggcg ccacggcacc acccacagcc ucgucaucca cgacguggga 240
gguggcgggu cuggaggugg cgggucagcc aaguucgugg ccgcguggac ccugaaggcc 300
gccgccggug gcggaggguc ggguggcgga ggguccuucc ugcucuggau ccuggccgcc 360
gugagcuccg gccuguucuu cuacagcuuc cuccugaccg cggucucccu gagcaagaug 420
cucaagaagc gcuccccccu gaccacgggg guguacguga agaugccgcc caccgagccc 480
gagugcgaga agcaguucca gcccuacuuc aucccgauca acugaggacu aguuauaaga 540
cugacuagcc cgaugggccu cccaacgggc ccuccucccc uccuugcacc gagauuaaua 600
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc ccccccccca aaggcucuuu ucagagccac 720
cagaauu 727
<210> 37
<211> 1918
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3N2-HA mRNA
<400> 37
gggagaaagc uuaccaugaa gaccaucauc gcccugagcu acauccucug ccugguguuc 60
gcccagaaga uccccggcaa cgacaacucc accgcgacgc ugugccucgg gcaccacgcc 120
gucccgaacg gcaccaucgu gaagaccauc accaacgacc gcaucgaggu gacgaacgcc 180
accgagcugg uccagaacag cuccaucggg gagaucugcg acagccccca ccagauccug 240
gacggcgaga acugcacccu caucgacgcc cugcuggggg acccccagug cgacggcuuc 300
cagaacaaga agugggaccu cuucguggag cgguccaagg ccuacagcaa cugcuacccc 360
uacgacgugc cggacuacgc gucccugcgc agccuggucg ccuccagcgg cacccucgag 420
uucaacaacg aguccuucaa cuggacgggg gugacccaga acggcaccag cuccgccugc 480
auccggcgca gcuccagcuc cuucuucagc cggcugaacu ggcugaccca ccucaacuac 540
aaguaccccg cccugaacgu gacgaugccc aacaacgagc aguucgacaa gcuguacauc 600
uggggcgucc accaccccgg gaccgacaag gaccagaucu ucccguacgc gcaguccagc 660
gggcgcauca ucgugagcac caagcggucc cagcaggccg ugauccccaa caucggcagc 720
cgcccccgga uccgcgacau cccgucccgg aucagcaucu acuggaccau cgucaagccg 780
ggcgacaucc uccugaucaa cuccacgggg aaccugaucg ccccgcgcgg cuacuucaag 840
cuccggagcg ggaaguccag caucaugcgc uccgacgccc ccaucggcaa gugcaagagc 900
gagugcauca cccccaacgg cuccaucccg aacgacaagc ccuuccagaa cgugaaccgg 960
aucaccuacg gggccugccc ccgcuacgug aagcacagca cccugaagcu ggcgacgggc 1020
augcggaacg uccccgagaa gcagacccgc gggaucuucg gcgccaucgc cggguucauc 1080
gagaacggcu gggagggcau gguggacggg ugguacggcu uccggcacca gaacuccgag 1140
gggcgcggcc aggccgccga ccucaagagc acccaggcgg ccaucgacca gaucaacggg 1200
aagcugaacc ggcugaucgg caagaccaac gagaaguucc accagaucga gaaggaguuc 1260
uccgaggugg agggccgcau ccaggaccuc gagaaguacg ucgaggacac gaagaucgac 1320
cuguggagcu acaacgccga gcugcucgug gcccuggaga accagcacac caucgaccug 1380
accgacuccg agaugaacaa gcucuucgag aagaccaaga agcagcugcg cgagaacgcc 1440
gaggacaugg ggaacggcug cuucaagauc uaccacaagu gcgacaacgc gugcaucggg 1500
agcauccgga acggcacgua cgaccacaac guguaccgcg acgaggcccu gaacaaccgg 1560
uuccagauca agggggucga gcucaagucc ggcuacaagg acuggauccu guggaucagc 1620
uucgccauca gcugcuuccu gcucugcgug gcccugcugg gcuucaucau gugggccugc 1680
cagaagggga acauccgcug caacaucugc aucugaggac uaguuauaag acugacuagc 1740
ccgaugggcc ucccaacggg cccuccuccc cuccuugcac cgagauuaau aaaaaaaaaa 1800
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaugcauc 1860
cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca ccagaauu 1918
<210> 38
<211> 1470
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PfCSP mRNA
<400> 38
gggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug augcgcaagc uggccauccu cagcgugucc agcuuccugu 120
ucgucgaggc ccuguuccag gaguaccagu gcuacggcuc cagcuccaac acccgggugc 180
ucaacgagcu gaacuacgac aacgcgggga ccaaccugua caacgagcuc gagaugaacu 240
acuacggcaa gcaggagaac ugguacagcc ugaagaagaa cucccgcagc cugggggaga 300
acgacgacgg caacaacgag gacaacgaga agcuccggaa gcccaagcac aagaagcuga 360
agcagccggc cgacgggaac cccgacccca acgccaaccc caacguggac ccgaacgcca 420
accccaacgu cgaccccaac gccaacccca acguggaccc gaacgcgaac cccaacgcca 480
accccaacgc caaccccaac gccaacccga acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 540
accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 600
acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 660
accccaacgu ggaccccaac gccaacccca acgccaaccc gaacgcgaac cccaacgcca 720
accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgccaaccc caacgcgaac cccaacgcca 780
acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 840
accccaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc gaacgccaac cccaacaaga 900
acaaccaggg caacggccag gggcacaaca ugcccaacga ccccaaccgc aacgucgacg 960
agaacgccaa cgccaacucc gccgugaaga acaacaacaa cgaggagccg agcgacaagc 1020
acaucaagga guaccugaac aagauccaga acucccucag cacggagugg ucccccugca 1080
gcgugaccug cggcaacggg auccaggucc ggaucaagcc cggcuccgcg aacaagccca 1140
aggacgagcu ggacuacgcc aacgacaucg agaagaagau cugcaagaug gagaagugca 1200
gcuccguguu caacgugguc aacagcucca ucgggcugau cauggugcuc agcuuccugu 1260
uccugaacug aggacuaguc ccuguuccca gagcccacuu uuuuuucuuu uuuugaaaua 1320
aaauagccug ucuuucagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc 1440
ccaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 1470
<210> 39
<211> 847
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HsFGF21 mRNA
<400> 39
aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug gacucggacg agaccggguu cgagcacuca ggacuguggg 120
uuucugugcu ggcuggucuu cugcugggag ccugccaggc acaccccauc ccugacucca 180
guccucuccu gcaauucggg ggccaagucc ggcagcggua ccucuacaca gaugaugccc 240
agcagacaga agcccaccug gagaucaggg aggaugggac gguggggggc gcugcugacc 300
agagccccga aagucuccug cagcugaaag ccuugaagcc gggaguuauu caaaucuugg 360
gagucaagac auccagguuc cugugccagc ggccagaugg ggcccuguau ggaucgcucc 420
acuuugaccc ugaggccugc agcuuccggg agcggcuucu ugaggacgga uacaauguuu 480
accaguccga agcccacggc cucccgcugc accucccagg gaacaagucc ccacaccggg 540
acccugcacc ccgaggacca gcucgcuucc ugccacuacc aggccugccc cccgcacucc 600
cggagccacc cggaauccug gccccccagc cccccgaugu gggcuccucg gacccucuga 660
gcaugguggg agguucccag ggccgaagcc ccagcuacga guccugagga cuagucccug 720
uucccagagc ccacuuuuuu uucuuuuuuu gaaauaaaau agccugucuu ucagaucuaa 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aagaauu 847
<210> 40
<211> 1470
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PfCSP mRNA
<400> 40
aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug augcgcaagc uggccauccu cagcgugucc agcuuccugu 120
ucgucgaggc ccuguuccag gaguaccagu gcuacggcuc cagcuccaac acccgggugc 180
ucaacgagcu gaacuacgac aacgcgggga ccaaccugua caacgagcuc gagaugaacu 240
acuacggcaa gcaggagaac ugguacagcc ugaagaagaa cucccgcagc cugggggaga 300
acgacgacgg caacaacgag gacaacgaga agcuccggaa gcccaagcac aagaagcuga 360
agcagccggc cgacgggaac cccgacccca acgccaaccc caacguggac ccgaacgcca 420
accccaacgu cgaccccaac gccaacccca acguggaccc gaacgcgaac cccaacgcca 480
accccaacgc caaccccaac gccaacccga acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 540
accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 600
acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 660
accccaacgu ggaccccaac gccaacccca acgccaaccc gaacgcgaac cccaacgcca 720
accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgccaaccc caacgcgaac cccaacgcca 780
acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 840
accccaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc gaacgccaac cccaacaaga 900
acaaccaggg caacggccag gggcacaaca ugcccaacga ccccaaccgc aacgucgacg 960
agaacgccaa cgccaacucc gccgugaaga acaacaacaa cgaggagccg agcgacaagc 1020
acaucaagga guaccugaac aagauccaga acucccucag cacggagugg ucccccugca 1080
gcgugaccug cggcaacggg auccaggucc ggaucaagcc cggcuccgcg aacaagccca 1140
aggacgagcu ggacuacgcc aacgacaucg agaagaagau cugcaagaug gagaagugca 1200
gcuccguguu caacgugguc aacagcucca ucgggcugau cauggugcuc agcuuccugu 1260
uccugaacug aggacuaguc ccuguuccca gagcccacuu uuuuuucuuu uuuugaaaua 1320
aaauagccug ucuuucagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc 1440
ccaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 1470
<210> 41
<211> 128
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-N5-C30-组蛋白SL-N5
<400> 41
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca 120
ccagaauu 128
<210> 42
<211> 129
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 组蛋白SL-A100-N5
<400> 42
caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaagaauu 129
<210> 43
<211> 93
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 组蛋白SL-A64-N5
<400> 43
caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga auu 93
<210> 44
<211> 105
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A100-N5
<400> 44
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaauu 105
<210> 45
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-N5
<400> 45
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaagaauu 69
<210> 46
<211> 124
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 组蛋白SL-A100
<400> 46
caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaa 124
<210> 47
<211> 88
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 组蛋白SL-A64
<400> 47
caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 88
<210> 48
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A100
<400> 48
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100
<210> 49
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64
<400> 49
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaa 64
<210> 50
<211> 93
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 A64-组蛋白SL-N5
<400> 50
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaacaaagg cucuuuucag agccaccaga auu 93
<210> 51
<211> 134
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5-C30-组蛋白SL-N5
<400> 51
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120
gagccaccag aauu 134
<210> 52
<211> 134
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5-C30-组蛋白SL-N5
<400> 52
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120
gagccaccag aauu 134
<210> 53
<211> 135
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A100-N5
<400> 53
auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa gaauu 135
<210> 54
<211> 135
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A100-N5
<400> 54
agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa gaauu 135
<210> 55
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A64-N5
<400> 55
auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99
<210> 56
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A64-N5
<400> 56
agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99
<210> 57
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A100-N5
<400> 57
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagaau u 111
<210> 58
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A100-N5
<400> 58
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagaau u 111
<210> 59
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5
<400> 59
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa gaauu 75
<210> 60
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-N5
<400> 60
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa gaauu 75
<210> 61
<211> 130
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A100
<400> 61
auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa 130
<210> 62
<211> 130
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A100
<400> 62
agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaaaaaaaaa 130
<210> 63
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A64
<400> 63
auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 94
<210> 64
<211> 94
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-组蛋白SL-A64
<400> 64
agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 94
<210> 65
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A100
<400> 65
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106
<210> 66
<211> 106
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A100
<400> 66
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106
<210> 67
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64
<400> 67
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa 70
<210> 68
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64
<400> 68
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa 70
<210> 69
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-组蛋白SL-N5
<400> 69
auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa caaaggcucu uuucagagcc accagaauu 99
<210> 70
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mRNA 3'-端 N6-A64-组蛋白SL-N5
<400> 70
agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa caaaggcucu uuucagagcc accagaauu 99
<210> 71
<211> 1925
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PpLuc mRNA
<400> 71
aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60
ccuuauucaa gcuuaccaug gaggacgcca agaacaucaa gaagggcccg gcgcccuucu 120
acccgcugga ggacgggacc gccggcgagc agcuccacaa ggccaugaag cgguacgccc 180
uggugccggg cacgaucgcc uucaccgacg cccacaucga ggucgacauc accuacgcgg 240
aguacuucga gaugagcgug cgccuggccg aggccaugaa gcgguacggc cugaacacca 300
accaccggau cguggugugc ucggagaaca gccugcaguu cuucaugccg gugcugggcg 360
cccucuucau cggcguggcc gucgccccgg cgaacgacau cuacaacgag cgggagcugc 420
ugaacagcau ggggaucagc cagccgaccg ugguguucgu gagcaagaag ggccugcaga 480
agauccugaa cgugcagaag aagcugccca ucauccagaa gaucaucauc auggacagca 540
agaccgacua ccagggcuuc cagucgaugu acacguucgu gaccagccac cucccgccgg 600
gcuucaacga guacgacuuc gucccggaga gcuucgaccg ggacaagacc aucgcccuga 660
ucaugaacag cagcggcagc accggccugc cgaagggggu ggcccugccg caccggaccg 720
ccugcgugcg cuucucgcac gcccgggacc ccaucuucgg caaccagauc aucccggaca 780
ccgccauccu gagcguggug ccguuccacc acggcuucgg cauguucacg acccugggcu 840
accucaucug cggcuuccgg gugguccuga uguaccgguu cgaggaggag cuguuccugc 900
ggagccugca ggacuacaag auccagagcg cgcugcucgu gccgacccug uucagcuucu 960
ucgccaagag cacccugauc gacaaguacg accugucgaa ccugcacgag aucgccagcg 1020
ggggcgcccc gcugagcaag gaggugggcg aggccguggc caagcgguuc caccucccgg 1080
gcauccgcca gggcuacggc cugaccgaga ccacgagcgc gauccugauc acccccgagg 1140
gggacgacaa gccgggcgcc gugggcaagg uggucccguu cuucgaggcc aagguggugg 1200
accuggacac cggcaagacc cugggcguga accagcgggg cgagcugugc gugcgggggc 1260
cgaugaucau gagcggcuac gugaacaacc cggaggccac caacgcccuc aucgacaagg 1320
acggcuggcu gcacagcggc gacaucgccu acugggacga ggacgagcac uucuucaucg 1380
ucgaccggcu gaagucgcug aucaaguaca agggcuacca gguggcgccg gccgagcugg 1440
agagcauccu gcuccagcac cccaacaucu ucgacgccgg cguggccggg cugccggacg 1500
acgacgccgg cgagcugccg gccgcggugg uggugcugga gcacggcaag accaugacgg 1560
agaaggagau cgucgacuac guggccagcc aggugaccac cgccaagaag cugcggggcg 1620
gcgugguguu cguggacgag gucccgaagg gccugaccgg gaagcucgac gcccggaaga 1680
uccgcgagau ccugaucaag gccaagaagg gcggcaagau cgccguguga ggacuagucc 1740
cuguucccag agcccacuuu uuuuucuuuu uuugaaauaa aauagccugu cuuucagauc 1800
ucaaaggcuc uuuucagagc caccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920
aaaaa 1925

Claims (58)

1.一种根据式(I)的阳离子脂质：
Ra-A-Rb 式(I)
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中
Ra选自：
Figure FDA0003701042620000011
或
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4；
Rb选自：
Figure FDA0003701042620000012
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4，或-R1-N(CH3)2；
A是-S-、-S-S-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)O-、-NH-C(O)-NH-、-S-C(O)-N(H)-、-C(O)O-或-O-P(O)(OH)-O-；
R1是乙烷二基、丙烷二基、丁烷二基或具有2至8个碳原子的直链或无支链烷烃二基，其中每个可取代的碳原子未被取代或被一个或多个C1-C4烷基、C1-C4亚烯基、C3-C8环亚烷基或C3-C8环亚烯基取代；
R2是具有2至8个碳原子的烷烃二基；
R3是任选地，如果存在是-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-或-R5-NH-C(O)O-；
R4是具有12至36个碳原子的亲脂性取代基，其中所述具有12至36个碳原子的亲脂性取代基是(i)具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基，或(ii)源自生育酚或生育三烯酚；
R5是具有1至6个碳原子的烷烃二基；
X是与氢原子结合的碳原子(CH)或氮原子；
其中所有的选择彼此独立。
2.根据权利要求1所述的阳离子脂质，其中R4是(i)具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基或(ii)选自方案1中所示的生育酚和生育三烯酚的衍生物的组。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的阳离子脂质，其中R4在每次出现时独立地选自由以下组成的组
Figure FDA0003701042620000021
4.根据权利要求1至3中任一项所述的阳离子脂质，前提是如果(i)R3作为-R5-C(O)-O-存在，(ii)R1和R2是直链未被取代的乙烷二基，(iii)R5是直链未被取代的乙烷二基、直链未被取代的丙烷二基或直链未被取代的丁烷二基，(iv)A是-S-S-，和(v)Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure FDA0003701042620000022
且另一个前提是如果(i)R3不存在，(ii)R1和R2是直链未被取代的乙烷二基，(iii)A是-S-S-，和(iv)Ra和Rb为相同，则R4不是
Figure FDA0003701042620000023
且不是
Figure FDA0003701042620000024
5.根据权利要求1至3中任一项所述的阳离子脂质，其中A是-S-。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的阳离子脂质，其中R3存在且选自由-R5-C(O)-O-、-R5-O-C(O)-、-R5-C(O)-NH-、-R5-OC(O)-NH-和-R5-NH-C(O)O-组成的组；且R4是具有12至25个碳原子的直链或支链烷基或烯基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的阳离子脂质，其中Ra和Rb独立地选自
Figure FDA0003701042620000031
X为CH或-R1-N(H)-C(O)-R3-R4。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的阳离子脂质，其中Ra和Rb中的每一个是
Figure FDA0003701042620000032
X为CH；且
R3存在，且R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基，每次出现时独立选择。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的阳离子脂质，其中
R3存在且为-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
R4是
Figure FDA0003701042620000033
并且其中Ra和Rb为相同。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的阳离子脂质，其中
R3存在且为-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
R4是
Figure FDA0003701042620000041
并且其中Ra和Rb为相同。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的阳离子脂质，其中R3是-R5-C(O)-O-。
12.根据权利要求7或权利要求8所述的阳离子脂质，其中R1是乙烷二基。
13.根据前述权利要求中任一项所述的阳离子脂质，所述阳离子脂质还显示以下特征的一个或多个，在每次出现时独立选择：
(i)R1是未被取代的乙烷二基、丙烷二基或丁烷二基；
(ii)R2是具有2至8个碳原子的直链、无支链的烷烃二基；
(iii)R3是-R5-C(O)-O-或-R5-O-C(O)-；
(iv)R5是具有2至6个碳原子的烷烃二基；和/或
(vi)X是CH。
14.根据权利要求1所述的阳离子脂质，所述阳离子脂质选自如表1中所列化合物的一种。
15.一种组合物，所述组合物包含
(i)根据权利要求1至14中任一项所述的阳离子脂质；
(ii)如表1中所列的阳离子脂质C15；
(iii)如表1中所列的阳离子脂质C2；或
(iv)如表1中所列的阳离子脂质C26。
16.根据权利要求15所述的组合物，所述组合物还包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)类固醇，优选胆固醇；
(ii)中性脂质；
其中所述中性脂质优选为1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)，任选地组合中性脂质1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)；或其中所述中性脂质是两性离子化合物，任选地具有选自肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基和油酰基的两个脂肪酸部分的两性离子化合物，组合具有选自戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基和癸酰基的两个脂肪酸部分的两性离子化合物；
和/或
(iii)聚合物结合的脂质；
其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，且L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。
17.一种组合物，所述组合物包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)根据权利要求1至14中任一项所述的阳离子脂质或包含三级或四级氮/氨基基团的阳离子脂质或在生理pH值时带净正电荷的阳离子脂质；
(ii)类固醇，优选胆固醇；
(iii)如权利要求16的分项(ii)中所述的中性脂质；和/或
(iv)聚合物结合的脂质，其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物：
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，且L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质；
更优选地，其中所述脂质部分L包含至少一种脂肪酸(―尾”)，其包含8、10或12个碳原子，优选8或10个碳原子；
乃至更优选地，其中所述聚乙二醇化脂质选自由1,2-二癸酰基-rac-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000(C10-PEG 2000)；和N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}(Cer8-PEG 2000)组成的组。
18.一种组合物，所述组合物包含以下赋形剂中的一种或多种：
(i)如权利要求17的分项(i)中所述的阳离子脂质；
(ii)类固醇，优选胆固醇；
(iii)如权利要求16的分项(ii)中所述的中性脂质，或优选地两种中性脂质的组合，其中该组合包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有优选C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，进而最优选选自由DHPC(1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、05:0PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、04:0PC(1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0PC(DHPC，1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和09:0PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂；和/或
(iv)聚合物结合的脂质，其中所述聚合物结合的脂质是根据式(II)的化合物
P-A-L 式(II)；
其中P是亲水性聚合物部分，A是任选的连接物，且L是脂质部分；
优选地其中聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质；
更优选地其中所述聚乙二醇化脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG 2000)。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物，其中
优选地所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(a-i)30mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-ii)40mol％至70mol％的量的阳离子脂质；20mol％至50mol％的量的类固醇；5mol％至15mol％的量的中性脂质；和0.5mol％至5mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iii)20mol％至60mol％的量的阳离子脂质；25mol％至55mol％的量的类固醇；5mol％至25mol％的量的磷脂；和0.5mol％至15mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-iv)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的类固醇；8mol％至12mol％的量的磷脂；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-v)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的中性脂质；和1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的聚合物结合的脂质；和
(a-vi)45mol％至65mol％的量的阳离子脂质；25mol％至45mol％的量的胆固醇；8mol％至12mol％的量的DPhyPE和任选地1mol％至10mol％的量的DHPC；以及1mol％至3mol％的量的PEG-DMG 2000；或
更优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(b-i)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-ii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iii)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-iv)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的C10-PEG 2000；
(b-v)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE；和1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000；
(b-vi)59mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；11％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-vii)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；11％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-viii)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和1mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-ix)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和1mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的C10-PEG 2000；和
(b-x)59mol％的量的阳离子脂质；28.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和1mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000
(b-xi)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的类固醇；20％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-xii)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；20％的量的中性脂质；和1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-xiii)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和10mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的聚合物结合的脂质；
(b-xiv)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和10mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的C10-PEG 2000；和
(b-xv)49mol％的量的阳离子脂质；29.3mol％的量的胆固醇；10％的量的DPhyPE和10mol％的量的DHPC；以及1.7mol％的量的Cer8-PEG 2000；
每个量均相对于脂质纳米颗粒的所有脂质赋形剂的总摩尔量；
更优选地，所述组合物包含赋形剂，其比率选自由以下组成的组
(c-i)脂质赋形剂组合，选自由表E中公开的E1至E108组成的组，其摩尔百分比选自由表F中公开的F1至F62组成的组。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的组合物，其中优选地所述组合物包含以下比率的赋形剂
(i)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C23(
Figure FDA0003701042620000082
SS-EC)、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(ii)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C2、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(iii)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C15、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(iv)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C26、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(v)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C23(
Figure FDA0003701042620000083
SS-EC)、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(vi)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C2、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(vii)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C15、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(viii)59mol％的如表1中公开的阳离子脂质C26、28.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、1mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(ix)49mol％的如表1中公开的阳离子脂质C23(
Figure FDA0003701042620000081
SS-EC)、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(x)49mol％的如表1中公开的阳离子脂质C2、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；
(xi)49mol％的如表1中公开的阳离子脂质C15、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000；或
(xii)49mol％的如表1中公开的阳离子脂质C26、29.3mol％的胆固醇、10mol％的DPhyPE、10mol％的DHPC和1.7mol％的DMG-PEG 2000。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的组合物，所述组合物还包含生物活性组分。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述生物活性组分是选自由人工mRNA、包含至少一个编码序列的化学修饰或未修饰的信使RNA(mRNA)、自复制RNA、环状RNA、病毒RNA和复制子RNA组成的组的核酸化合物；或其任何组合，优选地其中所述生物活性组分是mRNA或mRNA化合物。
23.根据权利要求15至22中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含mRNA
(i)其量可使N/P比率达到10至20的范围；或
(ii)其量可使脂质：mRNA的重量比达到20至60的范围，优选约3至约15、5至约13、约4至约8或约7至约11。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中所述组合物是用于用无菌液体载体重组的无菌固体组合物，并且其中所述组合物还包含一种或多种选自pH改性剂、填充剂、稳定剂、非离子表面活性剂和抗氧化剂的无活性组分，并且其中所述无菌液体载体是水性载体。
25.根据权利要求15至24中任一项所述的组合物，其中所述组合物是无菌液体组合物，并且其中所述脂质纳米颗粒的平均流体动力学直径由动态激光散射确定为约50nm至约300nm、或约60nm至约250nm、或约60nm至约200nm、或约70nm至200nm、或约75nm至约160nm、或约90nm至约140nm、或约100nm至约140nm。
26.根据权利要求15至25中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米颗粒显示的ζ电位范围为-50mV至+50mV。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物是单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。
28.根据权利要求22至26中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含至少一个化学修饰。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述化学修饰选自由碱基修饰、糖修饰、主链修饰和脂质修饰组成的组，优选地其中所述化学修饰是碱基修饰，更优选地其中所述碱基修饰选自由假尿嘧啶(ψ)、N1-甲基假尿嘧啶(N1Mψ)、1-乙基假尿嘧啶、2-硫脲嘧啶(s2U)、4-硫脲嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶及其任何组合组成的组。
30.根据权利要求22至29中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物包含编码肽或蛋白质的编码区，其中所述编码区显示序列修饰。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述序列修饰选自G/C含量修饰、密码子修饰、密码子优化或序列的C-优化；优选地其中与相应野生型mRNA的编码区相比
-编码区的G/C含量增加；
-编码区的C含量增加；
-编码区中的密码子用法与人类密码子用法相适应；和/或密码子适应指数(CAI)在编码区增加或最大化。
32.根据权利要求22至31中任一项所述的组合物，其中所述mRNA化合物还包含
a)5’-CAP结构；
b)至少一个miRNA序列，优选地其中microRNA结合位点用于选自由miR-126、miR-142、miR-144、miR-146、miR-150、miR-155、miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27、miR-26a或其任何组合组成的组的microRNA；
c)至少一个5'-UTR元件；
d)至少一个聚(A)序列；
e)至少一个聚(C)序列；
f)至少一个3’-UTR元件；
或其任何组合。
33.根据权利要求22至32中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含5’-CAP结构，优选地m7G、CAP0、CAP1、CAP2、修饰的CAP0或修饰的CAP1结构。
34.根据权利要求22至33中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含至少一个异源5’-UTR和/或至少一个异源3’-UTR，优选地其中所述至少一个异源5’-UTR包含核酸序列，其源自选自HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B和UBQLN2的基因的5’-UTR，或来自这些基因中任一个的同系物、片段或变体；和/或
优选地其中所述至少一个异源3’-UTR包含核酸序列，其源自选自PSMB3、ALB7、α-珠蛋白、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的3’-UTR，或来自这些基因中任一个的同系物、片段或变体。
35.根据权利要求22至34中任一项所述的组合物，其中至少一个编码RNA包含(i)HSD17B4 5’-UTR和PSMB3 3’-UTR或(ii)RPL325’-UTR和ALB7 3’-UTR。
36.根据权利要求22至35中任一项所述的组合物，所述组合物包含5'至3'方向的以下元件：
a)5’-CAP结构，优选地选自由m7G(5’)、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)组成的组；
b)5'-UTR元件，其包含源自TOP基因的5'-UTR的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：22、24、26的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；
c)至少一个编码序列；
d)3'-UTR元件，其包含源自α-珠蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：6、8、10、12、14、16、18、20的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；和/或3'-UTR元件，其包含源自白蛋白基因的核酸序列，所述核酸序列优选地包含对应于根据SEQ ID NO：18的核酸序列或其同系物、片段或变体的RNA序列；
e)任选地，至少一个聚(A)序列，优选地由10至200、10至100、40至80、或50至70个腺苷核苷酸组成；
f)任选地，至少一个聚(C)序列，优选地由10至200、10至100、20至70、20至60或10至40个胞嘧啶核苷酸组成；和
g)任选地，至少一个组蛋白茎环，优选地包含根据SEQ ID NO：4的RNA序列。
37.根据权利要求21至36中任一项所述的组合物，其中所述生物活性组分是
(a)mRNA，其包含至少一个编码肽或蛋白质的编码序列，或其片段或变体，其中所述肽或蛋白质是抗原，其中所述抗原优选地源自致病性抗原、肿瘤抗原、致敏性抗原或自身免疫性自体抗原，或其片段或变体；或
(b)mRNA，其包含至少一个编码治疗性蛋白质的编码序列，或其片段或变体，其中所述治疗性蛋白质选自由以下组成的组
(i)用于治疗代谢、内分泌或氨基酸紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变蛋白质的治疗性蛋白质；
(ii)用于治疗血液疾病、循环系统疾病、呼吸系统疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白质；
(iii)用于治疗癌症或肿瘤疾病的治疗性蛋白质；
(iv)用于激素替代疗法的治疗性蛋白质；
(v)用于将体细胞重新编程为多能干或全能干细胞的治疗性蛋白质；
(vi)用作佐剂或免疫刺激的治疗性蛋白质；
(vii)作为治疗性抗体的治疗性蛋白质；
(viii)作为基因编辑剂的治疗性蛋白质；和
(ix)用于治疗或防止选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病的治疗性蛋白质。
38.根据权利要求37的分项(a)所述的组合物，其中所述抗原编码选自由细菌、病毒、真菌和原生动物抗原组成的组的致病性抗原。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述致病性抗原源自SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)、nCoV-2019冠状病毒、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、巨细胞病毒(CMV)、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)、埃博拉病毒、黄病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类偏肺病毒(hMPV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人类副流感病毒(HPIV)、流感病毒、肠外致病性大肠杆菌、拉沙哺乳类沙粒病毒(LASV)、MERS冠状病毒、结核分枝杆菌、尼帕病毒、诺如病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、轮状病毒、痘苗病毒、黄热病病毒、寨卡病毒、沙眼衣原体(即引起衣原体病的衣原体细菌)或疟原虫(如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫)。
40.根据权利要求15至39中任一项所述的组合物用于
(i)治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自由肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况；和/或
(ii)用于治疗代谢或内分泌紊乱的酶替代疗法，或用于替代缺失、缺陷或突变的蛋白质。
41.根据权利要求15至39中任一项所述的组合物用于治疗或预防传染病。
42.根据权利要求40或41使用的组合物，所述组合物包含至少一个编码RNA，其中所述至少一个编码RNA包含至少一个编码至少一种用于治疗或防止疾病、紊乱或状况的肽或蛋白质的编码序列，其中所述组合物通过肌肉内注射或皮内注射施用给有需要的受试者。
43.一种试剂盒或套组试剂盒，其包括权利要求21至42的组合物的任一种，任选地包括用于溶解的液体载体，以及任选地包括提供关于各成分的施用和剂量的信息的技术说明书。
44.根据权利要求21至42中任一项所述的组合物或权利要求43所述的试剂盒或套组试剂盒用作药物。
45.根据权利要求44所述的用作药物的组合物，其中所述药物用于防止、预防、治疗和/或改善选自以下疾病的疾病：包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病、肝病、自身免疫性疾病、过敏、包括遗传性疾病、一般遗传性疾病的单基因疾病、具有遗传背景且通常由确定的基因缺陷引起并根据孟德尔定律遗传的疾病；心血管疾病、神经系统疾病、呼吸系统疾病、消化系统疾病、皮肤疾病、肌骨紊乱、结缔组织紊乱、肿瘤、免疫缺陷、内分泌、营养和代谢疾病、眼病、耳病以及与肽或蛋白质缺乏相关的疾病。
46.根据权利要求44或45所述的用作药物的组合物，其中所述药物是疫苗。
47.一种包含权利要求15至42中任一项所述组合物的疫苗或权利要求43所述的试剂盒或套组试剂盒用于防止、预防、治疗和/或改善选自包括病毒、细菌或原生动物传染病的传染病、癌症或肿瘤疾病的疾病。
48.一种治疗或预防传染病；癌症或肿瘤疾病、紊乱或状况；选自肝纤维化、肝硬化和肝癌组成的组的肝病；过敏；或自身免疫性疾病；紊乱或状况的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供如上述权利要求中任一项所述的mRNA、如上述权利要求中任一项所述的组合物、权利要求47所述的疫苗、权利要求43所述的试剂盒或套组试剂盒；和
b)将所述mRNA、所述组合物、所述疫苗或所述试剂盒或套组试剂盒应用或施用给组织或生物体。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述mRNA、权利要求15至42中任一项所述的组合物、权利要求47所述的疫苗或权利要求43所述的试剂盒或套组试剂盒通过静脉注射、肌肉内注射、皮下注射或皮内注射施用给组织或生物体。
50.一种诱导受试者产生免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用如权利要求47所述的疫苗，其量能有效地在受试者中产生抗原特异性免疫应答。
51.一种用于对受试者进行疫苗接种的包含权利要求15至42中任一项所述组合物的药物组合物或权利要求43所述的试剂盒或套组试剂盒，包含有效量的编码病毒抗原的mRNA。
52.包含权利要求15至42中任一项所述的组合物的药物组合物或权利要求43所述的试剂盒或套组试剂盒的用途，用于(i)诱导免疫应答，用于(ii)诱导抗原特异性T细胞应答或优选地用于(iii)诱导CD8+T细胞应答。
53.权利要求52所述的药物组合物用于预防传染病或在制造用于预防传染病的药物中的用途，其中所述药物优选是疫苗。
54.一种用于防止、改善或治疗有需要的受试者的疾病或状况的方法，所述方法包括对所述受试者施用权利要求15至42中任一项所述的组合物或权利要求43所述的试剂盒或套组试剂盒。
55.根据权利要求48至50和54中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致受试者淋巴细胞中由mRNA编码的抗原表达。
56.根据权利要求48至50、54和55中任一项所述的方法，其中组合物的施用导致抗原特异性抗体应答，优选地其中所述抗原特异性抗体应答通过血清中抗原特异性抗体的存在来测量。
57.根据权利要求15至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含具有至少一个长度为C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14，优选长度为C6、C7、C8、C9或C10，更优选长度为C6、C7、C8，最优选长度为C7的烷基链的中性脂质或磷脂，或进一步最优选地其中所述组合物包含两种中性脂质的组合，其中所述组合包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有优选C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，进而最优选选自由DHPC(1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、05:0PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、04:0PC(1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0PC(DHPC，1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和09:0PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂。
58.根据权利要求15至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C14的长度，优选具有C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，或进而最优选地其中所述组合物包含两种中性脂质的组合，其中所述组合包含具有至少两个烷基链的中性脂质或磷脂，由此每个烷基链独立地具有优选C6、C7、C8、C9或C10的长度，更优选具有C6、C7、C8的长度，最优选具有C7的长度，进而最优选选自由DHPC(1,2-二庚酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、05:0PC(1,2-二戊酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、04:0PC(1,2-二丁酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、06:0PC(DHPC，1,2-二己酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、08:0PC(1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和09:0PC(1,2-二壬酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)组成的组的磷脂。
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