CN113171449B - 一种甲型流感病毒通用dna疫苗及其构建方法 - Google Patents
一种甲型流感病毒通用dna疫苗及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法，属于基因工程技术领域。所述DNA疫苗包括基因构建体、载体和递送系统，所述基因构建体插入所述载体构建表达质粒，所述递送系统包被所述表达质粒构成甲型流感病毒通用DNA疫苗，其中，所述基因构建体是由四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联组合而成，所述递送系统为细胞穿透肽。该疫苗将甲型流感病毒M2蛋白胞外区、通用疫苗和DNA疫苗的优势结合，可以有效预防和控制不同亚型甲型流感病毒，具有重要的科学意义和社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，涉及一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法。
背景技术
流感是由流感病毒感染引起的一种严重的急性呼吸道传染病。每年在全球造成人和动物的大量死亡，给全球的公共卫生健康以及经济发展带来了严重的威胁。流感病毒根据病毒核衣壳蛋白(NP)和基质蛋白M的特征，可将其分为甲、乙、丙三种亚型，其中甲型流感病毒(Influenza A virus)是目前流行最广和影响最深远的流感病毒。甲型流感病毒其基因特性使其经常发生不可预测的变异，因此，对于甲型流感病毒的研究与防制不容忽视。
预防和控制甲型流感的最有效方法是接种疫苗，目前可获得的大多数甲型流感疫苗是亚型特异性的，甲型流感病毒又极易发生变异出现新变异株，并且不能保护患者免受其他病毒亚型的影响，这大大限制了疫苗的适用性和有效性。开发新型通用甲型流感疫苗可以提供较为广泛的保护。其中，DNA疫苗是根据实验需求利用分子生物学技术进行设计，与减毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等传统疫苗相比具有较强的可控性。通过设计安全、高效的递送载体有助于DNA疫苗顺利靶向免疫细胞，提高其免疫效力。因此，基于现有技术中甲型流感病毒疫苗存在的问题，设计一种新型的通用性甲型流感疫苗非常必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法，该疫苗将甲型流感病毒M2蛋白胞外区、通用疫苗和DNA疫苗的优势结合，可以有效预防和控制甲型流感病毒。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种甲型流感病毒通用DNA疫苗，包括基因构建体、载体和递送系统，所述基因构建体插入所述载体构建表达质粒，所述递送系统包被所述表达质粒构成甲型流感病毒通用DNA疫苗，其中，所述基因构建体是由四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联组合而成，所述递送系统为细胞穿透肽。
优选的是，所述基因构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选的是，所述甲型流感病毒的四种不同亚型为H1亚型、H3亚型、H5亚型和H9亚型。
优选的是，所述表达质粒：所述细胞穿透肽按照质量比为(1：10)-(1：20)混合，实现包被。
优选的是，所述细胞穿透肽包括RVG9dR和Protamine至少一种。
优选的是，所述细胞穿透肽是由RVG9dR和Protamine按质量比(1-3)：(1:3)混合而成。
优选的是，所述疫苗为预防甲型流感病毒通用DNA疫苗。
本发明还提供一种所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗的构建方法，包括以下步骤：
将四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联，形成基因构建体；
将所述基因构建体转入真核表达载体构建表达质粒；
用细胞穿透肽包被所述表达质粒，构建甲型流感病毒通用DNA疫苗。
优选的是，所述基因构建体还包括组织纤溶酶原激活物tPA的分泌序列，所述分泌序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过将H1、H3、H5、H9亚型流感病毒的M2e序列串联(4M2e)基因片段克隆到真核表达载体，构建出真核表达质粒，然后通过筛选，以最佳细胞穿透肽包被适量的DNA进行小鼠免疫实验，发现对甲型流感病毒H1N1和H9N2均具有高保护效力。本发明将甲型流感病毒胞外区、通用疫苗和DNA疫苗的优势结合，设计基于甲型流感病毒M2胞外区的通用DNA疫苗，该疫苗可以有效的预防和控制甲型流感病毒，具有重要的科学意义和社会价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为目的基因4M2e的设计结构图；
图2为目的片段4M2e的凝胶电泳图；
图3为三种细胞穿透肽的凝胶阻滞实验凝胶电泳图；A为实施例2实验一组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2-6分别为按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pVax1-4M2e与RVG(9dR)混合，1为对照；B为实施例2实验二组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2-6分别为按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pVax1-4M2e与Protamine混合，1为对照；C为实施例2实验三组的凝胶阻滞实验凝胶电泳图，2-8分别为按照1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例将pVax1-4M2e与细胞穿透肽复合物RVG(9dR)+Protamine混合液混合，1为对照；
图4为pVax1-EGFP：细胞穿透肽RVG9dR的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应A-E；F为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；
图5为细胞穿透肽RVG9dR不同实验组随机拍摄的荧光图荧光强度分析图；横坐标1-5分别代表pVax1-EGFP：细胞穿透肽RVG9dR的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；
图6为pVax1-EGFP：细胞穿透肽Protamine的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应A-E；F为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；
图7为细胞穿透肽Protamine不同实验组随机拍摄的荧光图荧光强度分析；横坐标1-5分别代表pVax1-EGFP：细胞穿透肽Protamine的重量比分别为1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；
图8为pVax1-EGFP：细胞穿透肽复合物RVG9dR+protamine的重量比分别为1：1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:20(对应A-F；G为阴性对照)进行转染后随机拍摄的荧光图；
图9为细胞穿透肽复合物RVG9dR+protamine不同实验组随机拍摄的荧光图进行荧光强度分析；横坐标1-6分别代表pVax1-EGFP：细胞穿透肽Protamine的质量比分别为1:1、1:2、1:4、1:8、1:10、1:20；纵坐标为荧光强度；
图10为H1N1攻毒组的小鼠21d内小鼠的体重变化情况以及存活率；A为体重变化，B为存活率；
图11为H9N2攻毒组的小鼠21d内小鼠的体重变化情况以及存活率；A为体重变化，B为存活率。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1构建质粒pVAX1-4M2e
根据4种亚型甲型流感病毒的M2e的核苷酸序列通过一种组合策略设计通用DNA疫苗的目的基因4M2e序列。
首先，将H9亚型、H1亚型、H3亚型和H5亚型的基因串联组合形成一个基因构建体，并进行密码子优化后，将所设计的基因构建体与组织纤溶酶原激活物(tPA)的分泌序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)结合，进一步改善目的蛋白的分泌(如图1)。
利用PCR技术进行目的片段4M2e的扩增，扩增引物为：
上游引物序列：AATCGAATTCATGGATGCAATGAAGAGAGG
下游引物序列：AATCCTCGAGTCAATCAGAGGAGTAGTGTCACTAC
目的基因4M2ePCR扩增体系如表1所示：
表1
目的基因4M2e的PCR反应程序如表2所示：
表2
扩增产物用2％琼脂凝胶进行电泳，结果如图2所示，在378bp出现亮条带，与预期片段长度相同。其中，新合成的目的片段4M2e的DNA序列(SEQ ID NO：1)为：
atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccaggaatcttcaagtcttctaaccgaggtcgaaacgcttaccagaaccggatgggggtgcaactgcagcggttcaagtgattccctgctgacagaggtggaaacccctacaaggtccgagtgggaatgccgctgttctgactctagtgatgcagccgctagcctgctgactgaggtggaaaccccaattcgaaacgagtggggctgccggtgtaatgactcaagcgatgcagccgcttctctgctgaccgaagtggaaactcccaccagaaacgagtgggaatgcaggtgtagtgactcctctgattga
回收PCR产物，并将PCR胶回收的4M2e目的片段和真核表达质粒pVAX1使用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行酶切；利用T4 DNA Ligase连接以上两个酶切片段，构建质粒pVAX1-4M2e。
实施例2凝胶阻滞实验
实验分为如下三组：
实验一组：从-20℃中将储存浓度为1mg/mL的细胞穿透肽RVG(9dR)(上海生工生物工程股份有限公司)取出提前放入冰盒上自然融化，然后从大量提取的pVax1-4M2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与RVG(9dR)配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min，使其充分结合。
实验二组：从-20℃中将储存浓度为1mg/mL的细胞穿透肽Protamine(上海生工生物工程股份有限公司)取出提前放入冰盒上自然融化，然后从大量提取的pVax1-4M2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与Protamine配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min,使其充分结合。
实验三组：从-20℃中将储存浓度为1mg/mL的细胞穿透肽RVG(9dR)和Protamine取出提前放入冰盒上自然融化，使细胞穿透肽RVG(9dR)和Protamine按质量比1：1先结合形成多肽混合物，然后从大量提取的pVax1-4M2e真核表达质粒中取出1μg，按照1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8的比例与多肽复合物配置好混合液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温下静置20min，使其充分结合。
将上述三组实验组进行1％的琼脂糖电泳，120V，200mA，30min，利用紫外凝胶成像系统观察。结果如图3所示：DNA与RVG9dR最适合结合比例为1:2，DNA与Protamine的最适合结合比例为1:2，DNA与RVG9dR+protamine的最适合结合比例是1:1。
实施例3细胞转染实验
细胞培养：293T细胞培养在含有10％胎牛血清的(Fetal Bovine Serum，FBS)和1％双抗(Penicillin-Streptomycin Solution，PS)的DMEM培养液于37℃培养箱培养。(培养基和血清均购自Biological Industries公司)。
转染：将293T细胞铺在6孔细胞培养板中，每孔1×106个细胞，待其长成均匀的单层细胞，次日进行后续转染实验。
以质粒DNA(pVAX1-EGFP)为模型进行细胞转染实验，从细胞荧光及荧光强度来判断3种细胞穿透肽在细胞水平上对质粒DNA递送效果。具体步骤如下：
(1)将6孔板中各个孔内的原细胞培养液弃掉，并用磷酸盐缓冲液PBS液清洗1-2次。
(2)6孔板每孔中需在加入2mL Opti-MEM培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱。
(3)取出1.5mL灭菌后的离心管，按照所需实验计划分成四组，每个1.5mL离心管需要加入100μLOpti-MEM无血清培养基。
(4)实验分组：
第一组：1-5号离心管中分别加入1μg pVax1-EGFP，相对应的6-10号离心管中分别加入RVG(9dR)2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1-5号离心管中的试剂加入到相应的6-10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20-30min。
第二组：1-5号离心管中分别加入1μg pVax1-EGFP，相对应的6-10号离心管中分别加入protamine 2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1-5号离心管中的试剂加入到相应的6-10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20-30min。
第三组：1-5号离心管中分别加入1μg pVax1-EGFP，相对应的6-10号离心管中分别加入(RVG9dR+protamine)1μg、2μg、4μg、8μg、10μg、20μg，室温静置5min后将1-5号离心管中的试剂加入到相应的6-10号离心管中，轻轻地吹打混匀，室温静置20-30min。
(5)取出6孔板，做好标记，每孔加入相应的混合液，预留一个细胞培养孔不做处理将其作为空白对照，于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(6)培养6-8h后，将6孔板中的Opti-MEM无血清培养基替换成DMEM细胞培养基，继续培养24h，利用荧光倒置显微镜观察荧光并利用ImageJ软件进行荧光强度分析。
如图4和图5所示，结果显示随着穿透肽RVG9dR质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒DNA的结合效果越明显，且质粒DNA与细胞穿透肽RVG9dR在质量比1:20处结合效果最好。
如图6和图7所示，结果显示随着穿透肽Protamine质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒DNA的结合效果越明显，且质粒DNA与细胞穿透肽Protamine在质量比1:20处结合效果最好。
如图8和图9所示，结果显示随着细胞穿透肽复合物(RVG9dR+Protamine)质量比逐渐增加，细胞转染后细胞荧光及荧光强度越高，其与质粒DNA的结合效果越明显，且质粒DNA与细胞穿透肽复合物(RVG9dR+Protamine)在质量比1:20处结合效果最好。
综上所述，以质粒DNA(pVAX1-EGFP)为模型进行的三组细胞转染试验，从细胞荧光及荧光强度结果得出：随着细胞穿透肽RVG9dR、Protamine以及(RVG9dR+Protamine)质量比逐渐增加(1:2、1:4、1:8、1:10、1:20)，其与质粒DNA的结合效果越明显，并且细胞穿透肽复合物(RVG9dR+Protamine)的效果最佳，其中质粒DNA与细胞穿透肽(RVG9dR+Protamine)在质量比1:20处结合效果最好。
实施例4DNA疫苗免疫小鼠
根据细胞转染实验结果得出，(RVG9dR+Protamine)多肽包被DNA的效果较好，且质量比1:20的效果最好。按照DNA：RVG9dR+Protamine多肽质量比为1:20进行小鼠免疫实验。实验共8组BALB/c小鼠，8只/每组，按照以下实验分组操作。
第一组(25ug pVax1-4M2e+500ug多肽免疫组，PR8 H1N1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1-4M2e+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
第二组(25ug pVax1-4M2e+500ug多肽免疫组，WM01-p15 H9N2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1-4M2e+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01-p15 H9N2代病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
第三组(50ug pVax1-4M2e+1000ug多肽免疫组，PR8 H1N1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠50ug pVax1-4M2e+1000ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍滴鼻，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
第四组(50ug pVax1-4M2e+1000ug多肽免疫，WM01-p15 H9N2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠50ug pVax1-4M2e+1000ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01-p15 H9N2代病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
第五组(25ug载体pVax1免疫+500ug多肽免疫组、PR8 H1N1攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
第六组(25ug载体pVax1免疫+500ug多肽免疫组、WM01-p15 H9N2攻毒组)：一次免疫肌注小鼠25ug pVax1+500ug(RVG9dR+Protamine)，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01-p15 H9N2代病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
第七组(PR8 H1N1免疫组)：将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释500万倍，滴鼻免疫小鼠(50μL/只)一次，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的PR8 H1N1病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
第八组(WM01-p15 H9N2免疫组)：将实验室WM01-p15 H9N2病毒原液稀释100万倍，滴鼻免疫小鼠(50μL/只)一次，14d后使用相同剂量再次免疫，再次免疫14d后将实验室保存的WM01-p15 H9N2病毒原液稀释1000倍进行攻毒，21d内观察小鼠的存活率和体重变化情况。
H1N1攻毒组和H9N2攻毒组21d内小鼠的存活率和体重变化情况，如图10和11所示。从图10A和B可以看出，PR8 H1N1免疫组感染PR8 H1N1后，小鼠体重无明显变化；25μgpVax1-4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组和50μgpVax1-4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组在感染PR8 H1N1后，小鼠临床表现较明显，被毛粗乱、呼吸急促、弯腰驼背、活动迟缓、扎堆聚集以及体重下降等症状；25μg pVax1-4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，有4只小鼠死亡，剩余小鼠攻毒后第7天后体重又开始回升；50μgpVax1-4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，未出现小鼠死亡，6-7d后体重开始逐渐回升；25μg载体pVax1+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组在感染PR8 H1N1后，小鼠临床表现明显，体重急剧下降，5d内小鼠全部死亡。(P值<0.0001，体重百分比下降>25％人为判定其死亡)。
从图11A、B可看出，WM01-p15 H9N2免疫组感染WM01-p15 H9N2后，未发生小鼠死亡，小鼠体重无明显变化；25μg pVax1-4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组和50μgpVax1-4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组在感染WM01-p15H9N2后，小鼠临床表现也较明显，被毛粗乱、呼吸急促、弯腰驼背、活动迟缓、扎堆聚集以及体重下降等症状；25μgpVax1-4M2e+500μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，有1只小鼠死亡，其余小鼠攻毒后第7d起体重开始回升；50μg pVax1-4M2e+1000μg(RVG9dR+Protamine)免疫组，无小鼠死亡，攻毒后第7d后体重逐渐回升；25μg载体pVax1+500μg多肽复合物免疫组在感染WM01-p15 H9N2后，小鼠临床表现明显，体重急剧下降，8d内小鼠全部死亡。(P值<0.0001，体重百分比下降>25％人为判定其死亡)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种甲型流感病毒通用DNA疫苗及其构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccagcc aggaatcttc aagtcttcta accgaggtcg aaacgcttac cagaaccgga 120
tgggggtgca actgcagcgg ttcaagtgat tccctgctga cagaggtgga aacccctaca 180
aggtccgagt gggaatgccg ctgttctgac tctagtgatg cagccgctag cctgctgact 240
gaggtggaaa ccccaattcg aaacgagtgg ggctgccggt gtaatgactc aagcgatgca 300
gccgcttctc tgctgaccga agtggaaact cccaccagaa acgagtggga atgcaggtgt 360
agtgactcct ctgattga 378
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccagcc aggaa 75
Claims (4)
1.一种甲型流感病毒通用DNA疫苗，其特征在于，包括基因构建体、载体和递送系统，所述基因构建体插入所述载体构建表达质粒，所述递送系统包被所述表达质粒构成甲型流感病毒通用DNA疫苗，其中，所述基因构建体是由四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联组合而成，所述递送系统为细胞穿透肽；
所述甲型流感病毒的四种不同亚型为H1亚型、H3亚型、H5亚型和H9亚型；
所述表达质粒：所述细胞穿透肽按照质量比为1：20混合，实现包被；
所述基因构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述细胞穿透肽包括RVG9dR和Protamine至少一种。
2.如权利要求1所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗，其特征在于，所述细胞穿透肽是由RVG9dR和Protamine按质量比(1-3)：(1-3)混合而成。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将四种不同亚型甲型流感病毒的保守序列M2e基因串联，形成基因构建体；
将所述基因构建体转入真核表达载体构建表达质粒；
用细胞穿透肽包被所述表达质粒，构建甲型流感病毒通用DNA疫苗。
4.如权利要求3所述的甲型流感病毒通用DNA疫苗的构建方法，其特征在于，所述基因构建体还包括组织纤溶酶原激活物tPA的分泌序列，所述分泌序列的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
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