CN102600466A

CN102600466A - 抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102600466A
Application number: CN2012100787060A
Authority: CN
Inventors: 许君; 马倩; 张玉娟; 高振兴; 郑文明
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN102600466B

Abstract

本发明公开了一种抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制备方法，采用生物信息学方法，结合网络服务器和相关软件对流感保护抗原相关的NP、M1和HA功能表位进行了预测，获得来自H1N1、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亚型CTL表位和B细胞表位共8条表位，在每两个表位之间加入柔性片段GPGPG连接，命名为HMN；将表位多肽相应的核苷酸序列连到质粒载体上，原核系统表达，纯化的表达蛋白配以佐剂制成疫苗，免疫小鼠。该重组多肽，通过western blot试验，证明目的基因有效表达且具有抗原性；通过小鼠免疫试验，试验组T淋巴细胞亚群指数高于对照组，表明该多肽可诱导BALC/c小鼠产生针对所选表位的特殊性体液免疫和细胞免疫反应，证明其具有较强免疫原性。

Description

抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉一种抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法。

背景技术

流行性感冒(Influenza)是由流行性感冒病毒(简称流感病毒，Influenza Virus，IV)引起的至今尚未得到有效控制的呼吸道急性传染病。甲型流感病毒曾引起了全世界数次大范围的流行，每次大流行不仅造成了巨大的人力资源和物力资源的损失，还严重危害人类和畜禽健康。

禽流感(Avain Influenza AI)和猪流感(Swine Influenza S1)分别是由甲型流感病毒引起的禽类传染病和畜类传染病。Smith等人于1933年首次将从人体中所分离到的流感病毒称之为A型流感病毒。20世纪人类流感曾发生过3次瘟疫性的全球大流行，死亡人数达2000多万。禽流感病毒自意大利首次发现至今，由于候鸟的迁徙和国际间禽类贸易的日益频繁，使得该病呈全球性分布，给养禽业造成巨大的经济损失。猪在流感病毒的种间传播方面占有很特别的地位，被认为是人、禽和/或猪流感病毒通过基因重排产生新的亚型流感病毒的“混合器”。近年来，人畜共患病毒性疾病频繁发生，不仅出现了SARS等一些新型病毒，而且一些传统型的人畜共患病毒性疾病呈现流行趋势，并且随着病毒的不断进化，出现了一些新的烈性重组病毒。2009年在全球肆虐的甲型H1N1流感，再次敲响了人畜共患危害人类健康的警钟。目前，我国流感病毒流行广泛并且不断出现变异，毒株间重组的几率非常高。然而并无效果良好的疫苗，且现有疫苗中，不论是灭活苗、弱毒苗，还是亚单位疫苗，都需要培养大量的致病毒株。不仅给疫苗研制带来不便，同时还存在安全性、免疫原性、产量及保存等诸多方面存在不足，因此迫切需要研制新型的、高效的抗流感疫苗，应用新型疫苗来预防流感的爆发。

多表位疫苗(Multi-epitope Vaccine)也称鸡尾酒式疫苗，是同时携带多个与目标抗原相关的及辅助性表位的疫苗。抗原表位预测大多为计算机软件分析法，即根据已有的表位数据资料，通过计算机软件对氨基酸(或碱基)序列进行分析，迅速地预测出候选抗原表位。流感病毒的主要抗原相关蛋白有HA和NA、NP、基质蛋白M1/M2，其中HA、NA和M2是猪流感病毒的三种表面抗原分子，针对三种抗原的抗体都有抑制病毒感染的作用，但由于HA和NA抗原变异性很高，不同变异株间不交叉保护，研制此类抗原疫苗的速度往往跟不上病毒变异。M1和M2是病毒的两个基质蛋白，M1蛋白是病毒的主要结构蛋白，占流感蛋白总量的30％～40％，特异性强，是流感病毒分型的主要依据之一，IEDB的分析结构显示M1蛋白中存在至少三个极为保守的抗原决定簇。M2蛋白的氨基酸序列也高度保守，该蛋白在机体内能刺激产生抵抗不同性别流感抗原，但由于M2分子量很小，免疫原性较差，难以诱导高水平的免疫反应。NP蛋白是构成猪流感病毒的主要核蛋白，各亚型毒株之间氨基酸序列保守，是细胞毒性淋巴细胞识别的内部主要抗原。NP和M1在序列和抗原性上保持相对稳定，二者位于病毒内部，因此不是诱导中和抗体有效的靶目标。然而一旦病毒感染宿主细胞，这些蛋白可能是激活CTL并克服感染的靶目标。2006年Kaiser等提出了通用流感疫苗的设想，主要基于流感保守的NP和M蛋白。在DNA疫苗及活载体重组疫苗上，大量研究已证实通过添加NP或M组分，有助于对其他亚型的流感产生交叉免疫保护。Ernst等、De Filette分别构建了A型流感病毒M蛋白M2e表位，免疫组小鼠能抵抗H1、H3、H6、H9亚型流感病毒的感染。Kodihalli等用火鸡H5N2病毒的HA和NP蛋白制备的亚单位复合疫苗免疫火鸡。在免疫后21d，火鸡产生高的H1抗体滴度，并对同源或异源(H6N1)AIV的攻击产生抵抗力。Jeon等串联表达了HA、NP蛋白B细胞的表位、辅助性T细胞的表位和细胞毒性T细胞表位，将此翻译肽段免疫小鼠后产生了体液免疫和辅助性T细胞反应，小鼠可抵抗致死性病毒的攻击，并迅速得以康复。

发明内容

本发明的流感多表位疫苗，其中所描述CTL表位的选择采用SYFPEITHI、CTLpred、Multipre对参考毒株序列进行分析，对其HLA*0201及HLA*1101的CTL表位进行预测，筛选得分较高，排名靠前的CTL表位，综合评价各软件预测结果分析得到所需表位。

B表位预测使用网络服务器BepiPred 1.0sever、Bcepred对线性B细胞表位进行预测。筛选时依据亲水性好(hydrophilicity)，可及性高(accessibility)，可塑性好(flexibility)，抗原性强(antigenicity)，分子极性强(polarity)，表面暴露(exposed surface)和转角可能性大(Turns)的为候选B细胞表位。所有预测表位筛选于HA主要抗原区和NP、M1的保守区域。汇总各项表位预测结果，以CTL表位预测为基础，使预测表位尽量覆盖B细胞表位预测区，以获得兼有CTL与B细胞表位功能的预测表位。应用SWISS MODELSIB Service和3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server进行分子建模，分析候选表位构象，最终确定细胞表位。根据设计的表位，复原其核酸序列，按照原核优势密码子规则进行了优化，随后进行人工合成。

抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制备方法，采用生物信息学方法，结合网络服务器和相关软件对流感保护抗原相关的NP、M1和HA功能表位进行了预测，获得来自H1N1、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亚型CTL表位和B细胞表位共8条表位，在每两个表位之间加入柔性片段GPGPG连接，命名为HMN；将表位多肽相应的核苷酸序列连到质粒载体上，原核系统表达，纯化的表达蛋白配以佐剂制成疫苗，免疫小鼠，所述8条表位分别为SEQ ID No：1至SEQ ID No：8；HMN的编码核苷酸序列为：SEQ ID No：9。

该多肽通过western blot试验，证明目的基因有效表达且具有抗原性；通过小鼠免疫试验，试验组T淋巴细胞亚群指数高于对照组，表明该疫苗可诱导BALC/c小鼠产生针对所选表位的特殊性体液免疫和细胞免疫反应，证明其具有免疫原性。

附图说明

图1：重组表达质粒pET28a-HMN PCR鉴定；M1：DNA分子质量标准；1、2：重组质粒pET28a-HMN PCR产物；

图2：重组表达质粒pET28a-HMN酶切鉴定；M1、M2：DNA分子质量标准；1：空质粒pET28a的BamH I+HindIII双酶切产物；2：重组质粒pET28a-HMN的BamH I+HindIII双酶切产物；

图3：重组蛋白原核表达，M：蛋白质分子量标准(低)；1：BL21经IPTG诱导后的细菌裂解产物；2：pET28a-BL21经IPTG诱导后的细菌裂解产物；3-6：pET28a-HMN在28℃分别由0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L IPTG诱导后的细菌裂解产物；7-10：pET28a-HMN在37℃分别由0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/LIPTG诱导后的细菌裂解产物；

图4：免疫小鼠T淋巴细胞亚类检测。A：PBS组；B：市售疫苗组；C：25μg组；D：50μg组。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

流感病毒表位筛选

搜集已发表的流感表位，从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上分别下载H1、H3、H5、H9亚型流感HA基因、NP基因和M1基因的氨基酸和核苷酸序列。

生物信息学MHC类分子预测采用：网络服务器SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm )、CTLpred(http://www.imtech.res.in/raghava/ctlpred/index.html )、Multipre(http://www.i2r.a-star.Edu.sg)；生物信息学B细胞表位预测采用：网络服务器BepiPred 1.0 sever (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)、Bcepred(http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_submission.html)、SWISS MODELSIB Service(http://swissmodel.expasy.org/)和3D-JIGSAW Protein Comparative ModellingServer(http://bmm.cancerresearchuk.org/～3djigsaw/)。

应用生物信息学的方法，对多种亚型(H1、H3、H5、H9)流感HA、NP和M1相关的CTL和B细胞表位进行了预测分析，综合各项表位筛选获得CTL/B相关表位共8条，将表位片段(请参阅表1SEQ ID No：1至SEQ ID No：8所示)拼接起来(由于多表位基因片段独立且较小，在每两个氨基酸序列之间添加柔性片段：GPGPG，以促进表达蛋白进行正确折叠，减少由于空间构象相互影响而可能产生的对抗原性的影响)，命名为HMN。

表1

序号	表位序列	来源	表位性质
				SEQ ID No：1	IPNIGSRPW	H3HA_230-238	CTL
SEQ ID No：2	RESRNPGNAEI	NP_243-253	CTL/B
				SEQ ID No：3	RLVPKIATRSKVNG	H5HA_223-236	B
SEQ ID No：4	YVKSNRLVLATG	H5HA_320-331	CTL
				SEQ ID No：5	LNGNGDPNNMD	M1_84-94	CTL/B
SEQ ID No：6	KHSNGTVKDRSP	NA_143-154	B
				SEQ ID No：7	KVRDQEGRM	H 1HA_236-244	CTL
SEQ ID No：8	RLIQNSLTIERMVLS	NP_55-69	Th

2.多表位串联多肽的合成：将所设计的序列HMN的编码核苷酸序列交由上海生工生物工程有限公司进行合成。编码核苷酸序列为：

ATTCCGAACATTGGCTCCCGTCCGTGGGGTCCAGGTCCGGGTCGTGAATCTCGTAATCCAGGTAATGCAGAAATTGGCCCAGGTCCAGGTCGTCTGGTACCAAAAATCGCGACGCGTTCTAAGGTTAACGGTGGTCCAGGCCCTGGCTACGTTAAATCTAATCGCCTGGTACTGGCAACCGGTGGTCCGGGTCCTGGTCTGAATGGTAACGGTGATCCGAATAATATGGATGGCCCTGGTCCGGGCAAACACTCCAACGGCACTGTCAAGGACCGTTCCCCTGGCCCGGGTCCGGGCAAGGTTCGTGACCAGGAAGGCCGTATGGGTCCTGGCCCAGGCCGTCTGATTCAGAATTCTCTGACCATCGAACGTATGGTGCTGTCC；

3.引物合成：应用primer5、olige6引物设计软件，根据筛选的多表位序列设计引物，引物由博尚公司合成：

HMN-F：CCGGATCC ATTCCGAACATTGGCTCC

HMN-R：CCAAGCTT GGACAGCACCATACGTTCG

4.大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

用接种环取冻存的菌种DH5á在LB固体培养基上划线，倒置于37温箱过夜培养。挑生长良好的单个菌落接种于5mL LB液体培养基中37-振荡培养过夜。按1％的体积将培养物接种至适量200ml无抗性LB液体扩大培养基中，37℃，250r/min恒温振荡培养至OD600＝0.4～0.5，将培养物转入预冷的离心管中，4℃5000r/min离心10min，弃上清，加入10ml CaCl₂溶液，重悬沉淀，冰浴30min。4℃，5000r/min离心5min，弃上清。加入约1ml CaCl₂溶液，重悬菌体，冰置几分钟。加入1ml 50％已灭菌甘油混匀后用冷却的无菌吸头将感受态细胞分装于无菌的1.5mL Ep管中，每管200ul，标明菌株、体积和日期，置-80℃冰箱保存备用。

5.限制性内切酶酶切反应

双酶切反应：选择反应活性等于或接近100％的同一缓冲系统进行双酶切反应，若温度或缓冲系统不同，则按先低温后高温，先低盐后高盐的顺序进行，或第一酶切完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀回收DNA，再进行第二酶切反应。反应液进行琼脂糖凝胶电泳检查。完全酶切后，回收片段备用。

6.PCR反应：用天根公司Taq的扩增HMN基因，按照说明加入10X Taq buffer2.5ul、dNTP Mixture(2.5mM)2ul、上游引物1ul、下游引物1ul、HMN基因1ul、天根EXTaq 0.5ul，灭菌水17ul。PCR循环参数设定为：94℃预变性5min，94℃30s，64℃30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸10min。扩增在biometra PCR仪上进行，扩增得一条片段，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)(TIANGEN公司)，按照操作说明将目的片段回收，纯化，用BamH I及HindIII双酶切后，与相同酶切的pET28a(+)载体连接。连接产物命名为pET28a-HMN。

7.转化

将连接产物pET28a-HMN加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。放入42℃水浴中，热激90s，冰浴冷却2min；加入到890uL LB液体培养基中，37℃条件下150r/min恒温振荡培养40～60min。室温12000r/min离心1min弃上清，重悬菌体，涂布在含有卡那霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养14～16h，出现转化菌落。

8.质粒的提取(碱裂解法)

接种单菌到5ml含适量抗生素的LB培养液中，37℃，200r/min恒温振荡培养过夜。室温下，12000r/min离心1min收集菌体。弃去上清。将细菌沉淀重悬于100μl预冷的Solution I溶液，冰置5min。加入200μl新鲜配制的Solution II，颠倒混匀。加入150μl预冷的Solution III，颠倒混匀，冰浴3～5min。4℃，12000r/min离心5min，取上清，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)溶液，振荡混匀，12000r/min离心10min，取上层溶液，加入2倍体积的无水乙醇，冰置15min，12000r/min离心10min，去上清，用1ml预冷的70％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min弃上清，室温或真空干燥。用50～100μl含20μg/ml RNase(无DNase)的TE(pH8.0)重新溶解DNA沉淀，37℃水浴中孵育30min(去除RNA)。由此获得的质粒DNA可于-20℃贮存备用。

9.质粒DNA的定量

以TE(pH8.0)为空白对照，用NaNoDROP 1000分光光度计测定核酸浓度。双链DNA纯品的OD260/OD280值为1.8-2.0，若样品OD260/OD280值低于1.6，则可能有蛋白质或酚污染，需进一步纯化；若样品OD260/OD280值高于2.0，说明可能样品中RNA含量过高，可以选择用RNA酶消化处理样品。

10.琼脂糖凝胶电泳

用1×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液按质量(g)体积(ml)比(m/v)配制所需浓度的琼脂糖凝胶溶液，加热使琼脂糖完全溶解，冷却至60℃左右加入适量的溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)至终浓度约为0.5μg/ml，充分混匀后缓慢倒入根据需要选定的电泳胶模中，厚度在3～5mm之间，插入相应的梳子，待凝胶完全冷却凝固后，小心拨出梳子，将凝胶放入装有缓冲液的电泳槽中。取适量待进行电泳检测的DNA样品滴加在Parafilm膜(或混样板)上，与合适体积的10×DNA上样缓冲液混匀后，用微量加样器小心的将混合后样品加到点样孔中。以5V/cm的电压进行电泳，当溴酚蓝指示剂迁移至凝胶适当位置后，停止电泳。在紫外灯下观察并记录结果，或拍照保存(图1)。

11.重组子的酶切筛选鉴定

将连接产物转化DH5α，37℃培养过夜。取单菌落接种于2mlKan LB培养液中，小量制备质粒DNA。选择2种合适的限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳分析(图2)。酶切结果与预计相同者即为重组质粒。

12.原核系统表达

将获得阳性重组质粒转化BL21(DE3)感受态，挑取单菌落，接种10mL LB液体培养基，加入10μLKana，培养至OD值0.6时，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃诱导4h，诱导后离心弃上清，加入100ulddH₂O重悬沉淀，加入等体积上样缓冲液，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况(图3)。诱导表达蛋白经Western blot检测能与抗His-tag抗体发生免疫学反应。采用亲和层析法，变性条件下纯化表达蛋白，蛋白经过复性后，定量。量取10mlPBS溶液，加入一定体积复性蛋白母液，使溶液蛋白终浓度为0.1μg/ul、0.2μg/ul，加入等体积福氏佐剂，混匀，4℃存放。

13.小鼠免疫试验

将6-8周龄昆明白雌鼠，随机分成3组，每组6只，A组每只小鼠注射100ul PBS溶液，B组每只小鼠注射100ul市面现有疫苗，C组每只小鼠注射HMN蛋白25μg/500ul量接种/次，D组每只小鼠注射HMN蛋白50μg/500ul量接种/次。间隔2周，免疫3次。三免后2周尾部采血，流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群，所得数据进行统计学分析。分析所得数据，外周血T淋巴细胞计数结果表明，与对照组相比，各免疫组小鼠T淋巴细胞亚类CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺数量均有明显增加。C、D组CD3⁺、CD4⁺与A组差异显著，D组CD3⁺、CD4⁺与B组差异不显著，B组CD3⁺、CD4⁺与A组差异不显著。C组CD8⁺数量高于其余组，且各组差异不显著(图4)。证明HMN蛋白具有良好的免疫原性，能使小鼠CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞显著增加，说明小鼠获得了针对多种亚型(H1、H3、H5)流感的体液和细胞免疫反应。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制备方法，其特征在于，采用生物信息学方法，结合网络服务器和相关软件对流感保护抗原相关的NP、M1和HA功能表位进行了预测，获得来自H1N1、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亚型CTL表位和B细胞表位共8条表位，在每两个表位之间加入柔性片段GPGPG连接，命名为HMN；将表位多肽相应的核苷酸序列连到质粒载体上，原核系统表达，纯化的表达蛋白配以佐剂制成疫苗，8条表位分别为SEQ ID No：1至SEQ ID No：8；HMN的编码核苷酸序列为：SEQ ID No：9。

2.根据权利要求1所述的制备方法制备的新型流感病毒多表位串联多肽序列。