CN101628118A - 流感复合多表位dna疫苗及其应用 - Google Patents
流感复合多表位dna疫苗及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101628118A CN101628118A CN200910091227A CN200910091227A CN101628118A CN 101628118 A CN101628118 A CN 101628118A CN 200910091227 A CN200910091227 A CN 200910091227A CN 200910091227 A CN200910091227 A CN 200910091227A CN 101628118 A CN101628118 A CN 101628118A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ctl
- influenza
- epitope
- epi
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及流感复合多表位基因及利用其构建的DNA疫苗。本发明采用生物信息学方法，结合网络服务器和相关软件，对流感主要保护性抗原相关的HA和NA功能表位进行了预测，共获得了来源于多种亚型的流感CTL表位17条，来源于多个亚型的流感Th和B细胞表位12条。在两个表位盒的设计中均添加了内质网膜引导信号(ER)以促进表位多肽更高效的合成与折叠。设计中，本发明还在表位盒掺入了多个通用辅助性T细胞表位(HTL)。利用流感多表位基因构建的DNA疫苗同时预防多种亚型流感病毒，可对多种动物免疫保护。
Description
技术领域
本发明涉及流感疫苗，特别是涉及以流感病毒基因抗原表位为基础的DNA疫苗。
背景技术
流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流感病毒(Influenza virus，IV)引起的急性呼吸道传染病。流感病毒在呼吸道上皮细胞内复制并引起表面炎症，表现为急性上呼吸道炎和全身中毒症状。20世纪30年代人类就开始了对流感病毒的认知及疫苗的开发，然而时至今日流感病毒依然是威胁人类和动物健康的重要病原。数年来，流感病毒的流行造成了巨大的人力资源和物力资源的损失。依据其内部蛋白抗原性的不同，流感病毒可分为A、B、C三个型。A型在广谱的温血动物中存在(禽类和哺乳动物)中存在，而B和C型主要是人类的病原，C型也可在猪上分离到。依据其表面抗原血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)不同，又可分为若干不同的亚型。其中，A型流感病毒是对人和禽危害最为严重的流感类型。其某些亚型变异迅速，致病力强，曾造成过多次世界性大流行，在造成巨大经济损失的同时，还会造成人和禽的大量死亡。
数年来，人流感的流行一直以A型H3、H1亚型，以及B型流感为主。据世卫组织(WHO)发布的公告，全球每年流感病例为6亿～12亿例，死亡50万～100万人，其中重症流感病例300万～500万例，重症流感的病死率为8％～10％。在美国每年因流感造成的经济损失就达30～50亿美元。20世纪中流感造成了四次全球性大流行，包括1918～1919年的西班牙流感(H1N1)，1957年的亚洲流感(H2N2)，1968年的中国香港流感(H3N2)和1977年的俄国流感(H1N1)，给人类带来了灾难性的损失。仅1919年西班牙大流感就夺去了2100万条生命，超过第一次世界大战死亡人数，而全球感染人数达到6亿，而其它几次大流行造成的人类死亡数量也数以百万计。
禽流感(Avian influenza，AI)病原为A型流感病毒，血清型以H5、H7、H9亚型为主。目前，禽流感广泛分布于世界范围内的许多家禽和野禽中，自迁徙水禽分离到的病毒较多，而对鸡和火鸡的危害则最为严重。其中，高致病力禽流感(HPAI)对禽类危害最为严重，其主要血清型为H5和H7亚型。HPAI常以突然死亡和高死亡率为主要特征，常常导致感染鸡群的全群覆没，已经给养禽业带来巨大的经济损失，被国际兽疫局列为A类烈性传染病，同时被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。一直以来，人们普遍认为高致病性禽流感的发生比较罕见，因为在1959-1998年的40年间，世界范围内一共只报道了17次HPAI。但自1999年开始，HPAI的爆发变的非常频繁，1997-2004的七年中就发生了8次HPAI，而且涉及的范围更加广泛，尤其是2004年禽流感的爆发最为严重。距不完全统计，亚洲各国死亡或淘汰的禽只总数近1亿只，超过历史数次HPAI感染/淘汰禽数的总量。在其数次流行的过程中，更发生了数起HPAI感染人类并造成死亡的病例，引起了民众的极大恐慌。禽流感尤其是HPAI展示向人流感进化的趋势，这令环境中流感的流行情况变得更为复杂，并可能再次引发流感大流行。
由于尚缺乏可有效治疗流感的药物，疫苗的使用依然是阻止流感感染和传播的有效手段。当前，人流感和禽流感的预防主要依赖于灭活疫苗以及减毒活疫苗，长期的使用经历证明它们是安全有效的，并发挥了巨大的作用。但是，灭活疫苗和弱毒疫苗，都存在着一些自身无法避免的缺陷。灭活疫苗存在着激发的细胞免疫水平低下，仅能对抗原相配病毒株产生免疫保护，佐剂添加引起的应激反应，生产成本偏高，感染免疫监测等不足。而减毒活疫苗则有突变为高致病性流感的可能。且这两种疫苗均无法有效应对现在流感病毒变异迅速、多亚型流感并存流行、种属界限日益模糊的趋势。开发高效、安全的流感疫苗一直是各国研究的焦点。
随着生物技术领域的飞速发展，以疫苗等生物制品为中心的生物技术研究已成为全球进步最快的领域之一。基因工程技术的不断应用，新型佐剂的涌现，更是加速了疫苗研发的脚步。不断研究更为安全有效的禽流感疫苗，克服传统疫苗的诸多缺陷，更好的防控禽流感，成为科研人员关注的焦点。目前流感疫苗主要分为以下几种。
灭活全病毒疫苗
传统的禽流感的预防主要采用灭活全病毒疫苗。其一般是用甲醛灭活鸡胚尿囊液增殖的禽流感病毒，并辅以佐剂，实验证明其具有良好的免疫保护作用。灭活全病毒疫苗制备工艺简单，免疫效果确实，免疫持续期长，安全性好，不会出现毒力返强和变异现象。目前，禽流感灭活疫苗主要针对亚型包括：H5N1亚型、H7N1亚型和H9N2亚型3种，我国主要以H5N1和H9N2亚型为主。在我国，应用于疫苗生产的毒株包括H9亚型的SS株、F株、LG1株、Re-2株、SD696株，H5亚型的N28、Re-1株。2006年，H5、H9亚型二价灭活苗研制成功，并开始在生产实践中进行应用。最近，禽流感(H9)四联灭活疫苗取得中华人民共和国新兽药注册证书，并获得农业部批准上市。该疫苗主要针对禽流感(H9)、鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征等4种禽类传染病。
亚单位疫苗
亚单位疫苗是指采用理化学或基因工程手段制备的病原体的亚单位成分。它只含有病原体的一部分，不会引起病原体所致的动物发病，因此在安全性和纯度方面大大提高。但由于其生产工艺复杂，导致了使用其成本昂贵。而且一些亚单位疫苗虽然有一定的免疫保护力，但受限于难以维持或恢复天然免疫原的三维结构，因此其总体免疫效果不佳，可能需要辅以佐剂配伍使用。采用基因工程手段，可以将保护性抗原基因连接到载体质粒，然后导入表达系统中进行扩增和表达，通过这样的方法可以获得大量的保护性抗原蛋白。以这种方式生产的蛋白，不仅产量高，而且成本低，具有良好的开发和发展前景。
重组活载体疫苗
基因工程重组活疫苗是用基因工程技术将保护性抗原基因(目的基因)转移到载体中使其表达的活疫苗。因此，在接种携带这种保护性抗原基因的重组疫苗后，除获得对载体的免疫外，还可通过外源基因的表达获得对插入基因相关疾病的保护力。而且可以用较大的载体同时插入多种病毒的抗原基因构建多价疫苗，从而大大减少疫苗接种的次数和劳动量。
重组痘病毒载体疫苗
痘病毒具有许多优点，目前是应用最广泛的载体病毒。但是痘苗病毒有着广泛的宿主范围，使其易在自然界中传播，而且个别人接种痘苗病毒后产生副反应，因此出于生态学和安全学的考虑，目前的研究倾向于使用构建的痘苗病毒宿主限制性突变株和其他限制性痘病毒成员为载体。这样的载体主要包括：鸡痘病毒载体、金丝雀痘病毒载体和鸽痘病毒载体等。采用对禽类致病性较弱的禽痘病毒或痘苗病毒为载体，构建成表达HA的重组病毒，用其作为疫苗，能在禽体内复制，并不断表达HA蛋白、诱导免疫保护力。
重组新城疫载体疫苗
重组新城疫病毒rL-H5株，是采用新城疫病毒LaSota株为载体，表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组病毒。疫苗可以同时预防禽流感和新城疫这两种OIE规定的A类烈性禽类传染病，它的使用大大降低了疫苗制造和使用成本，为提高我国禽流感免疫质量、加大免疫密度提供技术保证。其可同时诱导粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应，对新生雏鸡无不良反应。但是该疫苗受新城疫母源抗体影响较大，临床应用中应把握好免疫时机。此外该疫苗在鹅群中使用时，免疫保护试验结果并不理想。
DNA疫苗
DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA(有时也可是RNA)，一般认为核酸疫苗被导入宿主细胞后，被周围的组织细胞、抗原递呈细胞(APCs)或其他炎性细胞摄取，并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，经加工后形成的多肽抗原可与宿主细胞主要组织相容性复合物MHC I和MHC II分子结合，并被递呈给宿主的免疫识别系统，从而引起特异性体液和细胞免疫应答，从而起到免疫保护作用。
抗独特型抗体疫苗
抗独特型抗体疫苗是根据Jeme的免疫网络学说研制的。一些抗独特型抗体能够和抗体的补位结合并且在空间结构上模拟抗原表位，这类抗体可以替代抗原作为诊断抗原检测机体抗体的水平，还可以作为疫苗免疫动物，使动物产生免疫应答，抵抗相应病原体的侵袭。
发明内容
本发明的目的是提供以流感抗原表位为基础的DNA疫苗及其应用。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供的流感复合多表位DNA疫苗，所述DNA疫苗编码蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亚型流感病毒HA蛋白为载体骨架分子，并以ER信号肽作为引导序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亚型流感病毒HA基因和NP、NA、NS1、M基因中高度保守的免疫优势表位，其中包括来源于上述亚型的流感CTL表位17个，来源于上述亚型的流感Th和B细胞表位12个；共29个表位的流感复合多表位DNA疫苗。
本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
前述的DNA疫苗，其中所述的Th和B细胞表位为下表所列表位18-29(请参阅序列表SEQ ID No.22至SEQ ID No.33所示)；所述CTL表位为流感HA基因组中17个高度保守的CTL免疫优势表位，如下表1-17所示(请参阅序列表SEQ ID No.5至SEQ ID No.21所示)：
| 序号 | 表位序列 | 来源 | 表位性质 |
| 1 | CLLKGIAPL | H1 HA42-50 | CTL |
| 2 | ELREQLSSV | H1 HA100-108 | CTL |
| 3 | SVVSSHYSR | H1 HA199-207 | CTL |
| 4 | TLTERGVEV | H7 HA18-26 | CTL |
| 5 | KLYGSGSKL | H7 HA184-192 | CTL |
| 6 | TVERTNIPR | H7 HA32-40 | CTL |
| 7 | TLTENNVPV | H9 HA18-26 | CTL |
| 8 | YIVERPSAV | H9 HA78-86 | CTL |
| 9 | NVSYSGTSK | H9 HA123-131 | CTL |
| 10 | YIWGVHHPV | H3 HA178-189 | CTL |
| 11 | KLATGMRNV | H3 HA315-323 | CTL |
| 12 | NVTMPNNEK | H3 HA165-173 | CTL |
| 13 | TIMEKNVTV | H5 HA18-26 | CTL |
| 14 | TIGECPKYV | H5 HA298-306 | CTL |
| 15 | TLNQRLVPK | H5 HA204-212 | CTL |
| 16 | QLAILITTVT | N2 NA25-34 | CTL |
| 17 | ITGFAPFSK | N2 NA94-102 | CTL |
| 18 | RALYHTENAYVSVVSSHY | H1 HA188～205 | ThB |
| 19 | NHTVTGVSASCSHNG | H1 HA125～139 | ThB |
| 20 | TESWSYIVETPNPEN | H1 HA73～87 | ThB |
| 21 | PSFFRNVVWLIKKNS | H5 HA141～155 | ThB |
| 22 | TLNQRLVPKIATRSKVNG | H5 HA206～223 | ThB |
| 23 | CPKYVKSNRLVLATG | H5 HA302～316 | ThB |
| 24 | DPALIIWGIHHSGSTA | H7 HA165～181 | ThB |
| 25 | QTKLYGSGSKLITVG | H7 HA182～196 | ThB |
| 26 | SMGIQSDVQVDANCE | H7 HA255～269 | ThB |
| 27 | NVSYSGTSKACSDSFYRS | H9 HA123～140 | ThB |
| 28 | GGKWSYIVERPSAVNGMC | H9 HA73～90 | ThB |
| 29 | HNGMLCATNLGHPLILNT | H9 HA37～54 | ThB |
表位之间采用柔性小分子linker连接。
前述的DNA疫苗，其中所述柔性小分子linker为KAA、KAAA、AAA、NAAA或AAY。
前述的DNA疫苗具有抗原性。
前述的DNA疫苗具有免疫原性。
前述的DNA疫苗在预防流感中的应用。
前述的DNA疫苗的应用，其中所述疫苗同时预防多种亚型流感病毒，所述疫苗为注射剂。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提供的一种H3/H1主导型流感复合多表位DNA疫苗，其采用PCR方式从前述的DNA疫苗中扩增H3和H1亚型流感病毒HA基因并添加相应的表位基因，获得重组体质粒。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提供的一种H3/H5主导型流感复合多表位DNA疫苗，其采用PCR方式从前述的DNA疫苗中扩增H3和H5亚型流感病毒HA基因并添加相应的表位基因，获得重组体质粒。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。依据本发明提供的一种H5/H7主导型流感复合多表位DNA疫苗，其采用PCR方式从前述的DNA疫苗中扩增H5和H7亚型流感病毒HA基因并添加相应的表位基因，获得重组体质粒。
前述的DNA疫苗编码蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亚型流感病毒HA蛋白为载体骨架分子，以内质网膜引导信号肽(ER)作为引导序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亚型流感病毒HA基因和NP、M、NA、NS1基因中高度保守的免疫优势表位，其中包括来源于多种亚型的流感CTL表位17条，来源于多个亚型的流感Th和B细胞表位12条，共29个表位的流感复合多表位DNA疫苗。同时，对基因启始密码子ATG的前后碱基序列作了设计和调整，使其符合Kozak规则；考虑到宿主细胞表达外源蛋白时对密码子的偏爱性，还对密码子进行了相应的调整，以期获得最佳的免疫效果。
本发明的流感复合多表位DNA疫苗，其中所述DNA疫苗CTL表位的选择采用SYFPEITHI、Bimas、Multipre对参考毒株序列进行分析，对其HLA*0201及HLA*1101的CTL表位进行预测，筛选得分较高，排名靠前的CTL表位，综合评价各软件预测结果分析得到所需表位。
Th表位预测采用网络服务器SYFPEITHI和Multipre。主要对HLA-DRB 1*04、HLA-DRB 1*07、HLA-DRB 1*08、HLA-DRB1*11、HLA-DRB1*13、HLA-DRB1*15限制性Th细胞表位进行预测，并综合参考其他HLA-DR亲和力评分。B细胞表位预测采用网络服务器Bcepred对线性B细胞表位进行预测。筛选时依据亲水性好(hydrophilicity)，可及性高(accessibility)，可塑性好(flexibility)，抗原性强(antigenicity)，分子极性强(polarity)，表面暴露(exposedsurface)和转角(turns)可能性大的为候选B细胞表位。所有预测优先筛选位于HA主要抗原区HA1上的表位。随后，汇总各项表位预测结果，以Th表位预测为基础，使预测表位区尽量覆盖与B细胞表位预测交集区，以获得兼有Th与B细胞表位功能的预测表位。通过PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下载流感HA及NA蛋白分子构象，应用InsightII软件进行分子建模，分析候选表位空间构象。排除位于α-螺旋和β-片层不易形成表位的序列，将位于转角、无规则卷曲处且表面暴露好的序列确定为候选细胞表位。将候选表位序列与已发表的HA蛋白序列比较，分析其特异性(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。最后，综合各项结果确定细胞表位。
CTL表位盒设计，在预测和搜集CTL表位的基础上，添加合适的Linker连接各CTL表位，并通过蛋白酶体裂解预测软件PAProC优化CTL表位盒的构成和Linker的选择。Th及B细胞表位盒设计，在预测和搜集Th与B细胞表位的基础上，添加柔性及可裂解Linker连接各表位。而后，在此基础上在表位盒中均加入内质网信号引导序列和通用Th表位，以辅助表位更好突破MHC限制性而发挥功能。根据设计的表位盒，复原其核苷酸序列，并参照真核优势密码子规则进行优化。
在搜集已发表的表位基础上，结合预测所得表位，对CTL表位盒和ThB表位盒进行分子设计，并采用理论结合软件模拟的方式进行表位盒组成的优化。最终，设计获得了理论上具有良好功能的CTL表位盒和ThB表位盒，随后进行人工合成。
前述的DNA疫苗，通过细胞转染试验，证明目的基因有效表达且具有抗原性。
前述的DNA疫苗，通过小鼠免疫试验，表明该疫苗可诱导BALB/c小鼠产生针对所选表位的特异性体液免疫和细胞免疫反应，证明其具有免疫原性。
前述的DNA疫苗，通过转染人外周血来源DC细胞并与自体人T淋巴细胞共培养，可诱导产生针对所选表位的特异性体液免疫和细胞免疫反应，表明该疫苗在人体中应用的可行性。
前述的技术方案具有如下优点：在两个表位盒的设计中均添加了内质网膜引导信号(ER)以促进表位多肽更高效的合成与折叠。设计中，本发明还在表位盒掺入了多个通用辅助性T细胞表位(HTL)。通用辅助性T细胞表位，具有与大多数人的HLA-DR分子、小鼠MHCII类分子高亲和力结合的能力，可以有效地激活CD4+T淋巴细胞，使其分泌IL-2、IL-12等细胞因子，这些细胞因子以旁路分泌方式作用于流感抗原特异性T细胞，从而可大大提高疫苗的免疫效力。已证实其掺入可以有效改善表位递呈过程中受MHC限制性的影响，并已广泛应用于表位疫苗的设计与构建中。我们以此来辅助组建的表位盒更好克服种属和个体MHC限制性的问题而发挥功能。
在搜集已发表的流感表位的基础上，采用生物信息学方法，对多亚型(H1、H3、H5、H7、H9)流感的HA和NA的T和B细胞表位进行预测和筛选。随后，通过体外实验，分析了预测的Th和B细胞表位的抗原性。在此基础上，进行了复合多表位DNA疫苗的设计与构建，该DNA疫苗重组体转染BHK21细胞，RT-PCR及间接免疫荧光检测表明，目的蛋白成功表达，表达产物可以分别被标准各亚型HA阳性血清及M，NS，NA阳性血清所识别。该疫苗免疫BALB/c小鼠、鸡、猪的免疫实验后进行免疫学指标的检测，结果显示这该疫苗可刺激小鼠、鸡、猪、产生特异性体液免疫和细胞免疫反应。最后，我们通过小鼠、鸡、猪的免疫实验，对复合多表位DNA疫苗的免疫原性进行了研究。本发明可同时预防多种亚型流感病毒，可对多种动物免疫保护，该疫苗可以与任何药物(抗病毒药物、治疗性抗体等)进行联合应用。
附图说明
图1为本发明较佳实施例核酸疫苗质粒pVAX1-H3-EHA-H1-M2构建流程示意图；
图2为本发明较佳实施例核酸疫苗质粒pVAX1-H5-EHB-H3-M2构建流程示意图；
图3为本发明较佳实施例核酸疫苗质粒pVAX1-H5-EHC-H7-M2构建流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明综合利用分子生物学、分子病毒学、分子免疫学、细胞生物学、生物信息学等不同学科知识、技术结合生物信息学模拟、分子设计、表位选择以及基因重组技术，综合考虑流感的特性、基因组结构和特点以及与感染和免疫紧密相关的问题，在分子水平上构建了三个主导型的针对不同亚型、不同流行株均有预防作用的新型流感复合多表位基因工程预防疫苗pVAX1-AHI、pVAX1-BHI、pVAX1-CHI、pVAX1-ACI、pVAX1-BCI、pVAX1-CCI。该疫苗通过接种机体，能够诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫反应，达到预防病毒感染目的，既可以作为预防性疫苗用于鸡群和猪群的免疫接种，同时对人群的流感预防也有积极作用。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版相关章节进行。
实施例1流感多表位DNA疫苗的建立
搜集已发表的流感表位，参考本发明之前已有研究的基础上，从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上分别下载获得H1、H3、H5、H7、H9亚型流感HA基因和NA基因的氨基酸序列。
生物信息学MHCI类分子预测采用：网络服务器SYPEITHI(http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com)、Bimas(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind)、Multipre(http://antigen.i2r.a-star.Edu.sg)；生物信息学MHCII类分子预测采用：网络服务器SYFPEITHI和Multipre；生物信息学B细胞表位预测采用：网络服务器Bcepred(http://www.intech.res.in/raghava/bcepred)和生物分子模拟软件InsightII(Accelrys，2005)；蛋白酶体切割预测采用：网络服务器PAProC(http://www.paproc.de)。
应用生物信息学方法，对多亚型(H1、H3、H5、H7、H9)流感HA和NA相关的CTL功能表位进行分析，综合各项结果筛选获得CTL相关表位17条(请参阅序列表SEQ ID No.5至SEQ ID No.21所示)；对多亚型(H1、H3、H5、H7、H9)流感HA的Th和B细胞表位进行了共预测分析，综合各项结果筛选获得ThB相关表位12条(请参阅序列表SEQ ID No.22至SEQ ID No.33所示)。
根据针对物种和目的不同，设计了三种主导型的复合多表位核酸疫苗，包括：H3和H1亚型-对人类主要感染流感亚型预防的同时，通过多表位基因盒的加入对H5、H7、H9亚型实现共预防保护，目标主要集中于人群；H3和H5亚型-对可能造成潜在大流行禽流感H5亚型和人流感H3亚型实现共预防的同时，通过多表位基因盒的加入对H1、H7、H9亚型实现共保护，目标主要集中猪和人群；H5和H7亚型-对禽流感主要两个高致病性亚型进行共预防的同时，辅以多表位基因盒对H1、H3、H9亚型实现共保护，目标主要集中于禽和人群。
由于单独的多表位基因盒，片段较小，形成空间构型相对简单，免疫原性较低。因此，本发明采用复合多表位疫苗的形式以结构基因嵌合多表位基因盒，来提高表位盒的免疫原性。依据表位盒功能的不同将其连接入不同结构基因下游，如介导CTL功能为主的表位盒连接于NP基因下游；介导体液免疫的ThB表位盒和M2表位盒则连接入HA基因骨架内。依据不同主导型的需要，采用PCR方式从人工合成总表位盒中分别扩增含有所需的不同功能表位盒。为了使融合基因能够有效表达，在两基因间添加柔性linker(G4S)3，以促进表达蛋白进行正确的空间构象折叠，减少由于空间构象间相互影响而可能产生的对抗原性的影响，此外还加入了具有自裂解功能口蹄疫2A蛋白linker。在翻译起始的“ATG”处均添加Kozak序列，以促进融合蛋白的更高效的表达。
1、流感CTL表位盒和ThB表位盒的合成
将所设计的表位盒序列交由上海旭冠生物工程有限公司进行合成，CTL-1表位盒(如SEQ ID No.1所示)、M2表位盒(如SEQ ID No.4所示)按原有序列合成，CTL-2BOX(如SEQ ID No.2所示)和ThBBOX(如SEQ ID No.3所示)合成时主要合成表位的核心区域，以满足后期DNA疫苗组建的需要。
2、质粒pVAX1-H3-EHA-H1-M2、pVAX1-H5-EHB-H3-M2、pVAX1-H5-EHC-H7-M2、pVAX1-NP-ETA、pVAX1-NP-ETB、pVAX1-NP-ETC的构建
(1)H5HA、H1HA1、NP基因的获得
①模板制备
将所得的A/chicken/Jilin/9/2004(H5N1)、A/NewCaledonia/20/99(H1N1)的尿囊液，应用TRIZOL LS Reagent按说明书方法提取总RNA，用于病毒基因组反转录和PCR扩增。流程如下：取400μl病毒尿囊液于1.5ml离心管，加800μl 1TRIZOL LS Reagent，混匀，室温孵育10min；加入200μl氯仿，混匀，室温孵育15min；12000g离心15min。吸取上层水相并加入500μl异丙醇，室温孵育10min；4℃12000g离心10min；沉淀用1ml 75％乙醇漂洗，干燥，溶于20μlDEPC处理双蒸水，-70℃冻存备用。
②引物设计
应用Prime引物设计软件，参考Genbank登录的相关序列，设计3对引物，分别由A/chicken/Jilin/9/2004(H5N1)扩增H5HA基因，从A/NewCaledonia/20/99(H1N1)扩增H1HA1和NP基因，引物由TaKaRa公司合成。
③反转录
采用TaKaRa公司的RNALAPCRTM Kit(AMV)对病毒RNA进行反转录。按试剂盒说明依次加入RNase Free dH2O 5.5μl、dNTPMixture 2μl、RNase Inhibiter 0.5μl、AMV Reverse Transcriptase 1μl、特异上游引物1μl、病毒RNA 4μl，混匀后42℃孵育90min，-20℃保存备用。
④PCR反应
用TaKaRa公司Ex TaqTM Kit扩增HA和NP基因，按试剂盒说明加入10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)5μl、dNTP Mixture(2.5mM)4μl、上游引物1μl、下游引物1μl、反转录产物3μl、TaKaRa Ex Taq酶0.25μl、灭菌蒸馏水35.75μl。PCR循环参数设定为：94℃预变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，最后72℃延伸10min。取PCR产物进行凝胶电泳，观察扩增结果。
⑤PCR产物连接与阳性克隆质粒的鉴定
将上述H5N1亚型AIV HA基因，H1N1亚型IV HA和NP基因的PCR产物与pMD18-T simple载体连接，构建pMD18-Tsimple-H5HA、pMD18-T simple-H1HA、pMD18-T simple-NP。按照载体试剂盒说明进行操作。T载体1μl，T4连接酶1μl，回收DNA片段适量并加ddH2O补至10μl，于16℃反应14～16h。转化后挑菌，提取质粒进行酶切鉴定。挑选酶切结果与预计相同者进一步鉴定，所有酶切结果均与预计完全相同者，即为阳性重组质粒。质粒纯化后由大连宝生物公司进行序列测定。
(2)H3HA和H7HA基因的人工合成
以A/African Starling/983/79(H7N1)病毒株的HA基因为模板，人工合成完整HA ORF核苷酸序列，克隆于pMD18-T上，构建DNA重组体pMD18-H7HA。以A/Wisconsin/67/2005(H3N2)病毒株的HA基因为模板，人工合成完整HA ORF核苷酸序列，并以简并碱基突变掉序列内部部分酶切位点，克隆于pMD18-T载体上，构建DNA重组体pMD18-H3HA。
(3)不同主导型多表位基因盒的获得
由于各主导型的DNA疫苗含有相关流感亚型完整HA或HA1组分，因此在表位盒中可以省略相关亚型的HA来源表位。根据不同主导型的需要，对人工合成的CTL BOX-2和ThB BOX进行PCR改造，通过引物在片段两端引入合适的酶切位点和linker或内质网膜引导引号(ER)，通用Th(HTL)表位-TT、PAN-DR、Gag，用于进一步DNA疫苗构建的需要。与pMD18-T simple载体连接，并获得阳性克隆，纯化质粒送至大连宝生物公司进行序列测定。将改造好的CTLBOX-2通过Spe I和Sal I双酶切，与以经过相同双酶切的含各流感通用M1、NA1、NA2、NS1 CTL表位的CTL BOX-1偶联，构建成各主导型所需CTL功能表位盒。
改造好的H3/H1主导型CTL表位盒阳性质粒命名为pMD18S-ETA，其ThB表位盒阳性质粒命名为pMD18S-EHA。H5/H3主导型CTL表位盒阳性质粒命名为pMD18S-ETB，其ThB表位盒阳性质粒命名为pMD18S-EHB。H5/H7主导型CTL表位盒阳性质粒命名为pMD18S-ETC，其ThB表位盒阳性质粒命名为pMD18S-EHC。
(4)HA及NP基因的改造
根据不同主导型的需要，对获得的HA和NP基因进行PCR改造，通过引物在片段两端引入合适的酶切位点及linker部分，用于进一步DNA疫苗构建的需要。与pMD18-T simple载体连接，获得阳性克隆，纯化质粒送至大连宝生物公司进行序列测定。获得的含H5HA基因阳性质粒命名为pMD18S-H5HA，含H7HA1基因阳性质粒命名为pMD18S-H7HA1，含H3HA基因阳性质粒命名为pMD18S-H3HA，含H3HA1基因阳性质粒命名为pMD18S-H3HA1，含H1HA1基因阳性质粒命名为pMD18S-H1HA1，含NP基因阳性质粒命名为pMD18S-NP。
再分别设计引物，PCR分别扩增可直接用于在pVAX1表达的H1HA1、H3HA1、H7HA1基因。与pMD18-T simple载体连接，并获得阳性克隆，纯化质粒送至大连宝生物公司进行序列测定。将含有H1HA1基因的阳性质粒命名为pMD18S-EH1HA1，将含有H3HA1基因的阳性质粒命名为pMD18S-EH3HA1，将含有H7HA1基因的阳性质粒命名为pMD18S-EH7HA1。
(5)流感病毒复合多表位DNA重组体的构建
■H3/H1主导型相关DNA重组体的构建(请参阅图1所示)
①DNA重组体pVAX1-H3的构建
用限制性内切酶NheI和XhoI消化质粒pMD18S-H3HA，获得基因片段H3HA，与以相同内切酶消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-H3HA(pVAX1-H3)重组体质粒。
②DNA重组体pVAX1-EH1的构建
用限制性内切酶NheI和HindIII消化质粒pMD18S-EH1HA1，获得基因片段H1HA1，与以相同内切酶消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-H1HA1(pVAX1-EH1)重组体质粒。
③DNA重组体pVAX1-NP的构建
用限制性内切酶KpnI和SalI消化质粒pMD18S-NP，获得基因片段NP，与以KpnI和XhoI消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-NP重组体质粒。
④DNA重组体pVAX1-H3-H1的构建
用限制性内切酶ClaI和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H3和pMD18S-H1HA1，回收H1HA1基因片段定向克隆到pVAX1-H3中，获得重组质粒pVAX1-H3-H1HA1(pVAX1-H3-H1)。
⑤DNA重组体pVAX1-ETA的构建
用限制性内切酶EcoRI和SalI消化质粒pMD18S-ETA，获得基因片段ETA，与以EcoRI和XhoI消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-ETA重组体质粒。
⑥DNA重组体pVAX1-EHA的构建
用限制性内切酶HindIII和XhoI消化质粒pMD18S-EHA，获得基因片段EHA，与以相同内切酶消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-EHA重组体质粒。
⑦复合多表位DNA重组体pVAX1-NP-ETA的构建
用限制性内切酶EcoRI和SalI消化质粒pMD18S-NP和pMD18S-ETA，回收ETA基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，获得重组质粒pMD18S-NP-ETA。再用限制性内切酶KpnI和SalI消化重组质粒pMD18S-NP-ETA，与KpnI和XhoI消化真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-NP-ETA重组体质粒。
⑧复合多表位DNA重组体pVAX1-H3-EHA-H1-M2的构建
用限制性内切酶HindIII和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H3和pMD18S-EHA，回收EHA基因片段，定向克隆到pVAX1-H3中，获得重组质粒pVAX1-H3-EHA。用限制性内切酶SphI和XhoI消化质粒pMD18S-H1HA1和pMD18-M2，回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-H1HA1中，获得重组质粒pMD18S-H1HA1-M2。用限制性内切酶ClaI和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H3-EHA和pMD18S-H1HA1-M2，回收H1HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAX1-H3-EHA中，获得重组质粒pVAX1-H3-EHA-H1HA1-M2(pVAX1-H3-EHA-H1-M2)。
■H5/H3主导型相关DNA重组体的构建(请参阅图2所示)
①DNA重组体pVAX1-H5的构建
用限制性内切酶NheI和XhoI消化质粒pMD18S-H5HA，获得基因片段H5HA，与以相同内切酶消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-H5HA(pVAX1-H5)重组体质粒。
②DNA重组体pVAX1-EH3的构建
用限制性内切酶NheI和HindIII消化质粒pMD18S-EH3HA1，获得基因片段H3HA1，与以相同内切酶消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-H3HA1(pVAX1-EH3)重组体质粒。
③DNA重组体pVAX1-H5-H3的构建
用限制性内切酶ClaI和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H5和pMD18S-H3HA1，回收H1HA1基因片段定向克隆到pVAX1-H5中，获得重组质粒pVAX1-H5-H3HA1(pVAX1-H5-H3)。
④复合多表位DNA重组体pVAX1-NP-ETB的构建
用限制性内切酶EcoRI和SalI消化质粒pMD18S-NP和pMD18S-ETB，回收ETB基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，获得重组质粒pMD18S-NP-ETB。再用限制性内切酶KpnI和SalI消化重组质粒pMD18S-NP-ETB，与KpnI和XhoI消化真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-NP-ETB重组体质粒。
⑤复合多表位DNA重组体pVAX1-H5-EHB-H3-M2的构建
用限制性内切酶HindIII和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H5和pMD18S-EHB，回收EHB基因片段，定向克隆到pVAX1-H5中，获得重组质粒pVAX1-H5-EHB。用限制性内切酶SphI和XhoI消化质粒pMD18S-H3HA1和pMD18-M2，回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-H3HA1中，获得重组质粒pMD18S-H3HA1-M2。用限制性内切酶ClaI和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H5-EHB和pMD18S-H3HA1-M2，回收H3HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAX1-H5-EHB中，获得重组质粒pVAX1-H5-EHB-H3HA1-M2(pVAX1-H5-EHB-H3-M2)。
■H5/H7主导型相关DNA重组体的构建(请参阅图3所示)
①DNA重组体pVAX1-EH7的构建
用限制性内切酶NheI和HindIII消化质粒pMD18S-EH7HA1，获得基因片段H7HA1，与以相同内切酶消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-H7HA1(pVAX1-EH7)重组体质粒。
②DNA重组体pVAX1-H5-H7的构建
用限制性内切酶ClaI和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H5和pMD18S-H7HA1，回收H7HA1基因片段定向克隆到pVAX1-H5中，获得重组质粒pVAX1-H5-H7HA1(pVAX1-H5-H7)。
③DNA重组体pVAX1-ETC的构建
用限制性内切酶EcoRI和SalI消化质粒pMD18S-ETC，获得基因片段ETC，与以EcoRI和XhoI消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-ETC重组体质粒。
④DNA重组体pVAX1-EHC的构建
用限制性内切酶HindIII和XhoI消化质粒pMD18S-EHC，获得基因片段EHC，与以相同内切酶消化的真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-EHC重组体质粒。
⑤复合多表位DNA重组体pVAX1-NP-ETC的构建
用限制性内切酶EcoRI和SalI消化质粒pMD18S-NP和pMD18S-ETC，回收ETC基因片段，定向克隆到pMD18S-NP中，获得重组质粒pMD18SNP-ETC。再用限制性内切酶KpnI和SalI消化重组质粒pMD18SNP-ETC，与KpnI和XhoI消化真核表达载体pVAX1连接，经转化，挑菌和提取质粒鉴定后获得pVAX1-NP-ETC质粒。
⑥复合多表位DNA重组体pVAX1-H5-EHC-H7-M2的构建
用限制性内切酶HindIII和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H5和pMD18S-EHC，回收EHC基因片段，定向克隆到pVAX1-H5中，获得重组质粒pVAX1-H5-EHC。用限制性内切酶SphI和XhoI消化质粒pMD18S-H7HA1和pMD18-M2，回收M2基因片段，定向克隆到pMD18S-H7HA1中，获得重组质粒pMD18S-H7HA1-M2。用限制性内切酶ClaI和XhoI消化上述试验构建的重组质粒pVAX1-H5-EHC和pMD18S-H7HA1-M2，回收H7HA1-M2基因片段，定向克隆到pVAX1-H5-EHC中，获得重组质粒pVAX1-H5-EHC-H7HA1-M2(pVAX1-H5-EHC-H7-M2)。
3、流感病毒复合多表位DNA重组体的鉴定
(1)流感复合多DNA重组体的酶切鉴定
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，取200μl涂于LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取单个菌落接种于2ml含相应抗生素的LB培养液中，小量制备质粒DNA。选择1～2种合适的限制性内切酶单独或组合消化，琼脂糖凝胶电泳分析。挑选酶切结果与预计相同者进一步鉴定，所有酶切结果均与预计完全相同者，为阳性重组质粒。
(2)流感复合多DNA重组体转染细胞
细胞计数：取细胞悬液0.5ml，加入台盼兰溶液0.5ml，充分振荡后，置室温5-10min，用移液器滴入细胞计数板内，按白细胞计数法计数四角大方格内的细胞总数(N)。将四角大方格内的细胞总数按公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数n(n＝N/4×10000K，式中K为稀释倍数)。
细胞培养：根据细胞计数结果，稀释细胞为5×105/ml个装瓶培养。每25ml容量小瓶装4ml，置37℃孵箱内培养。细胞在1-2h贴壁，几小时至十几个小时后开始生长，24-48h长成单层。
脂质体转染：于6×30mm的培养板中接种传代的BHK细胞1×105～3×105个/ml，当细胞长至60～80％单层时，将培养液弃掉，用PBS洗涤细胞两遍，备用。与在室温下作用15-30min的转染试剂LipofectatimeTM2000和重组质粒的混合物共转染。即在500μl MEM中，加入10μl LipofectatimeTM200，轻轻混匀，将重组质粒DNA 10μg加入到另取的500μl MEM中，混匀；然后将后者滴加于前一液体中，吹气混匀，温室作用15-30min。转染后4.5h，更换新鲜配制的含2％FCS的MEM培养液，继续培养72h，收获细胞。此步设pVAX1空白质粒和细胞对照。
(3)流感病毒复合多表位DNA重组体RT-PCR检测
采用RT-PCR法，分别根据复合多表位重组质粒pVAX1-NP-ETA，pVAX 1-H3-EHA-H 1-M2、pVAX 1-NP-ETB、pVAX 1-H5-EHB-H3-M2、pVAX1-NP-ETC、pVAX1-H5-EHC-H7-M2序列，对重组质粒全序列进行扩增。收集转染72h后表达质粒及空载体细胞，2000r/min离心10min，提取细胞总RNA。按常规方法进行反转录，PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃3min，30个循环；72℃10min。1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
分别转染了pVAX1-NP-ETA、pVAX1-NP-ETB、pVAX1-NP-ETC的BHK细胞，经RT-RCR扩增，可见2400bp左右的条带，与预计大小相符。分别转染了pVAX1-H3-EHA-H1-M2、pVAX1-H5-EHB-H3-M2、pVAX1-H5-EHC-H7-M2的BHK细胞，经RT-RCR扩增，可见4600bp左右的条带，与预计大小相符。上述结果从转录水平证实，所构建的复合多表位重组质粒可以在真核细胞中有效转录。
(4)流感病毒复合多表位DNA重组体间接免疫荧光法(IFA)检测
PBS漂洗一次细胞板上细胞，冷丙酮固定10-15min。PBS洗涤3次，与兔抗不同亚型流感HA1阳性血清(1∶300稀释)反应1.5小时，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG反应1.5h。PBS洗涤3次，在板中滴一滴甘油缓冲液(50％甘油PBS)，置于荧光显微镜下，波长495nm处观察和拍照(加入二抗后操作步骤均应避光进行，一般情况下，尽量在较短时间内完成拍照，以免荧光淬灭)。
复合多表位DNA疫苗转染BHK细胞后，通过不同阳性血清进行间接免疫荧光结果检测结果显示，转染了各重组质粒的BHK细胞均出现特异性绿色的荧光，特异性荧光分布在细胞膜和细胞浆均有分布，正常BHK细胞和空载体对照未出现特异性荧光，呈阴性反应。说明重组质粒各抗原组分可以获得有效表达，抗原性良好。
实施例2 H3/H1主导型复合多表位核酸疫苗小鼠实验免疫研究
1、实验分组、小鼠免疫及采样
将BALB/c雌性小鼠20只随机分2组，每组10只，分别为pVAX1空质粒对照组、pVAX-MEGNp24质粒免疫组。免疫分三次进行，间隔14d。每次向小鼠的双侧胫前肌注射100μg rDNA(溶于100μL无菌生理盐水中)。于二免后2周取血，置4℃过夜，5000rpm离心10min，收集血清，-20℃保存备检测用。第3次免疫后第10d摘眼球取血，颈椎脱臼处死，凝血分离血清供ELISA检测细胞因子；同时无菌取其脾脏制备脾细胞悬液，分别用于特异性CTL活性测定、淋巴细胞转化实验和Th1/Th2类细胞因子检测。
将6-8周龄雌性BALB/c小鼠100只随机分10组，每组10只，包括8个免疫组，以及2个对照组：空质粒和PBS对照组。分别于0d、21d、35d，免疫三次。首次免疫小鼠的双侧胫前肌注射200μg rDNA(溶于100μl无菌ddH2O中)。以后每次免疫100μg rDNA。三免后10天眼动脉采血，置4℃过夜，5000r/min离心10min，收集血清，20℃保存备抗体检测用。取血结束后颈椎脱臼处死，同时无菌取其脾脏制备脾细胞悬液，用于检测细胞免疫指标检测——淋巴细胞转化试验、IFNγ-ELISPOT检测和T淋巴细胞亚类数量分析。
2、免疫小鼠血清ELISA抗体检测
将AIV H5、H7、H9标准抗原及H1、H3亚型灭活病毒，4℃过夜包被ELISA板并编号。甩掉包被物，洗涤5次，每孔加封闭液100μl，37℃孵育1h。洗涤液充分洗涤5次，每孔加入100μl免疫鼠血清(1∶100倍稀释)，轻轻震荡混匀，37℃温育1.5h。甩干孔内液体，用洗涤5遍，扣干。每空加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗体100μl，37℃孵育1h。甩干孔内液体，洗涤5遍，扣干。加入新配制的显色溶液OPD，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。最后，加入终止液50μl，轻轻震荡混匀，终止反应，于492nm测定各孔吸光值。所得数据以ΔX±SD表示，并进行统计学分析(t检验)。
从抗H3亚型流感病毒特异性ELISA抗体检测结果分析，各免疫组ELISA抗体自免疫一周后开始出现，并逐步上升，二免之后稳步提高，三免后迅速提高并达到顶峰，45d时所有免疫组抗体水平均显著高于对照组(p＜0.01)。
3、免疫小鼠细胞免疫应答检测
①脾脏单淋巴细胞悬液制备
脱颈处死小鼠，消毒液浸泡5min，无菌条件下取出脾脏，置于盛有4ml Hank’s液的六孔板中，取出脾脏用双层玻片研磨，1ml大枪柔和吹匀混液。纱网轻柔过滤至含有4ml分离液(TDB)的10ml离心管，2000r/min离心15min。小心吸取中间层(淋巴细胞层)2-4ml至新10ml离心管中。加入5ml 5％血清1640，轻柔反复洗涤二次，2000r/min离心10min。加入1ml 5％1640重悬细胞，计数，调细胞数至1×107个/ml，备用。
②脾脏T淋巴细胞转化试验(WST法)
操作步骤：于96孔板中每孔分别加入用10％1640稀释好的ConA(4ug/ml)或流感病毒(1MOI)共50μl，同时设细胞中不加刺激物孔，而以加入与刺激剂等体积的10％1640作为组内对照，每样本各种刺激均设3个复孔。然后向每孔中加混匀后脾淋巴细胞悬液50μl，使每孔中培养液总体积为100μl，细胞浓度为2×104/100μl，随后置于5％37℃培养72h。每孔加入10μl wst，继续培养4h。用酶标仪测定450nm吸光值，取3个孔平均值，计算刺激指数(SI)。所得数据进行统计学分析(数据的描述采用x±SD，组间比较采用非配对t检验)。
复合多表位联合免疫组SI指数显著高于对照组(p＜0.05)和其它几个免疫组，说明该组小鼠整体细胞免疫水平最高。证实表位盒的添加可以发挥相应功能，引起全面的免疫应答，有效提高机体细胞免疫功能。
③脾T淋巴细胞亚类数量的检测
取制备好的脾脏T淋巴细胞悬液取2×106个淋巴细胞于EP管中，加入1ml的荧光洗液，1500r/min离心10min，洗涤2次。每管加入FITC标记Anti-Mouse CD4单克隆抗体(0.5mg/ml)、PE标记Anti-Mouse CD8a单克隆抗体(0.2mg/ml)、CY5/PE标记Anti-MouseCD3e(0.2mg/ml)的荧光洗液200μl重新悬浮细胞，各抗体浓度均按1μg/106个淋巴细胞。混匀后4℃避光孵育30min。荧光洗液1500r/min离心10min，洗涤2次。最后以用500μl荧光保存液重悬，上样检测。相同方法，同时分别制备各染色抗体单染对照管和空白管。FACS检测1×104个细胞，分别得到CD4+CD3+、CD8+CD3+T淋巴细胞的数量，所得数据进行统计学分析。
复合多表位联合免疫组无论CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量均最高，且复合多表位联合免疫组CD3+CD4+T淋巴细胞数量显著高于对照组(p＜0.01)，说明该组小鼠机体细胞免疫水平最优，可以推断表位盒的加入显著增进了CD3+CD4+T淋巴细胞数量，有助于调节机体整体免疫水平，证实复合多表位的策略是具有显著优势的。
4、IFN-γELISPOT检测
每只鼠设3个刺激孔和3个对照孔，刺激孔每孔用50μl流感病毒液(1MOI)刺激，每孔总体积为200μl，细胞数为1×106/孔，37℃，5％CO2培养72h。去除培养液，加预冷的去离子水200μl/孔，培养板置冰上10min。1×Washing buffer洗板5-7次，每次30s，最后一次，在吸水纸上扣干。加入生物素标记的检测抗体，37℃孵育1h。1×Washing buffer洗板5次，每次30s，最后一次，在吸水纸上扣干。加入稀释好的酶标抗亲和素，37℃孵育1h。1×Washing buffer洗板5次，每次30s，最后一次，在吸水纸上扣干。加入显色剂AEC液，避光显色，室温避光静置20min；去离子水清洗培养板2次，扣干。放于通风处，室温静置10-30min，让膜自然晾干。ELISPOT板斑点计数，并统计分析。
复合多表位联合免疫组ELISPOT斑点数均显著多于对照组(p＜0.01)，复合多表位联合免疫组斑点数最多，说明该组小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力最强。
实施例3 H5/H3主导型复合多表位核酸疫苗猪实验免疫研究
1、实验分组、猪免疫及采样
将50日龄长白猪30只随机分6组，每组5只。分为5个免疫组，1个空质粒对照组，组间以不同耳号进行标记。分别于0d、21d、35d，免疫三次。首次免疫每只猪颈部肌肉注射2mg rDNA-壳聚糖纳米粒悬液。以后每次免疫1mg rDNA。分别于0d、14d、21d、35d、45d腹下静脉采血，5000r/min离心10min，收集血清，用于ELISA抗体的测定。三免后10天腹下静脉无菌收集抗凝血用于外周血淋巴细胞分离，检测细胞免疫指标检测-淋巴细胞转化试验和T淋巴细胞亚类数量分析。收集的正常血液进行血清分离后，用于血清细胞因子含量的测定和HI抗体的测定。
2、免疫猪血清ELISA抗体水平检测
将AIV H5、H7、H9标准抗原及H1、H3亚型灭活病毒，4℃过夜包被ELISA板并编号。甩掉包被物，洗涤5次，每孔加封闭液100μl，37℃孵育1h。洗涤液充分洗涤5次，每孔加入100μl免疫猪血清(1∶100倍稀释)，轻轻震荡混匀，37℃温育1.5h。甩干孔内液体，用洗涤5遍，扣干。每空加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗体100μl，37℃孵育1h。甩干孔内液体，洗涤5遍，扣干。加入新配制的显色溶液OPD，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。最后，加入终止液50μl，轻轻震荡混匀，终止反应，于492nm测定各孔吸光值。所得数据以ΔX±SD表示，并进行统计学分析(t检验)
免疫组ELISA抗体自免疫一周后开始出现，并逐步上升，二免之后稳步提高，三免后迅速提高并达到顶峰，45d时所有免疫组抗体水平均显著高于对照组(p＜0.01)。结果证实，复合多表位联合免疫组(pVAX1-H5-EHB-H3-M2+pVAX1-NP-ETB)诱生了与单独表达H5HA的pVAX1-H5组相当的H5亚型ELISA抗体水平。
3、猪血清细胞因子检测
取出预包被ELISA板，依照顺序对应加入100μl的标准样品于空白微孔中。分别标记不同组别猪血清样品，加100μl于空白微孔中，每样本均设2个复孔。随后，在标准品和样品孔中加入50μl的酶标记溶液。37℃下孵育60min。弃去孔内液体，加入200μl洗涤液洗板5次，每次静置1-2min。弃去孔内液体，每孔加入底物A、B液各50μL，37℃下孵育15min。最后，每孔加入50μl终止液，终止反应。于450nm的酶标仪上读取各孔OD值。根据试剂盒说明分别绘制标准曲线，并计算各样品的细胞因子含量。所得数据以ΔX±SD表示，并进行统计学分析。
三免后10d，采集免疫猪外周血，采用细胞因子ELISA试剂盒检测血清中IFN-γ和IL-4含量。各免疫组IFN-γ水平均显著高于对照组(p＜0.01)。其中双亚型联合免疫组IFN-γ水平最高，显著高于H3免疫组、H5免疫组和双亚型免疫组(p＜0.05或0.01)，说明与NP联合免疫，有效刺激了T淋巴细胞IFN-γ分泌。而与复合多表位联合免疫组相比，差异不显著。复合多表位联合免疫组血清IL-4水平显著高于双亚型联合免疫组(p＜0.05)和其它免疫组(p＜0.01)，说明该组猪Th2细胞功能显著增强。
4、细胞介导的免疫应答检测
①外周血淋巴细胞悬液制备
无菌条件下取10ml猪抗凝血，在其中加入10ml无血清1640，混匀。将混合好的猪血缓慢移入已有20ml猪淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min离心15min。小心吸取中间层(淋巴细胞层)5-8ml至灭菌的10ml离心管中，加入5ml含5％血清1640培养液混匀，1500rpm离心10min，洗涤2次。弃上清，加入2ml 5％1640重悬细胞。计数，调细胞数至1×107个/ml，备用。
②外周血T淋巴细胞转化试验(WST法)
于96孔板中每孔分别加入用10％1640稀释好的ConA(2.5ug/ml)或流感病毒(1MOI)共50ul，同时设细胞中不加刺激物孔，而以加入与刺激剂等体积的10％1640作为组内对照，每样本各种刺激均设3个复孔。然后向每孔中加混匀后猪外周血源淋巴细胞悬液50ul，使每孔中培养液总体积为100ul，细胞浓度为2×104/100ul，随后置于5％37℃培养72h。每孔加入10ul wst，继续培养4h。用酶标仪测定450nm吸光值，取3个孔平均值，计算刺激指数(SI)。所得数据进行统计学分析。
复合多表位联合免疫组SI指数最高，说明该组猪整体细胞免疫水平最高。其SI指数显著高于双亚型免疫组、H5免疫组、免疫组H3(p＜0.05)，但与双亚型联合免疫组差异不显著，证明与NP联合免疫策略，可以引起更为全面的免疫应答，有效提高了机体整体细胞免疫水平。
③外周血T淋巴细胞亚类数量的检测
制备好的猪外周血T淋巴细胞悬液取2×106个淋巴细胞于EP管中，加入1ml的荧光洗液，1500r/min离心10min，洗涤2次。每个样品分为两份，一份加入PE Conjugated Mouse Anti-Pig CD8a和FITCConjugated Mouse Anti-Pig CD3e，一份加入PE Conjugated MouseAnti-Pig CD4a和FITC Conjugated Mouse Anti-Pig CD3e。均以荧光洗液200ul重新悬浮细胞，各抗体浓度均按1ug/106个淋巴细胞。混匀后，4℃避光孵育30min。荧光洗液1500r/min离心10min，洗涤2次。最后以用500μl荧光保存液重悬，上样检测。相同方法，同时分别制备各染色抗体单染对照管和空白管。FACS检测1×104个细胞，分别得到CD4+CD3+、CD8+CD3+T淋巴细胞的数量。所得数据进行统计学分析。
复合多表位联合免疫组CD3+CD4+T淋巴细胞数量显著高于双亚型联合免疫组(p＜0.05)，说明该组猪机体细胞免疫水平最优。而其CD3+CD4+与CD3+CD8+比值低于双亚型联合免疫组，可以推断表位盒的加入显著增进了CD3+CD4+T淋巴细胞数量，在提高了机体整体免疫水平的同时，展示了Th2细胞免疫倾向的上调作用。
上述实验表明，本发明设计的流感复合多表位DNA疫苗具有良好的抗原性和免疫原性，能够诱导BALB/c小鼠产生针对所选表位及衣壳蛋白P24的特异性体液免疫和细胞免疫反应。同时，该疫苗转染人外周血来源DC细胞后，与自体人T淋巴细胞共培养后，可刺激细胞产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，表明疫苗在人体中应用的可行性。
本发明所制备的复合多表位疫苗无论在诱导体液免疫和细胞免疫方面都具有显著的优势的，而表位组分的加入在增进表位亚型特异性的细胞免疫反应上显示了优势。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所
<120>流感复合多表位DNA疫苗及其应用
<130>KHP09112908.0
<160>33
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>426
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gccgccacca tgggaatgca ggtgcagatc cagagcctgt ttctgctcct cctgtgggtg 60
cccggctcca gaggagggat tctgggattt gtgttcacac tcgccgcata cattctggga 120
tttgtgttca cactcaccgt gaaagctgct gccaagttcg tcgctgcctg gaccctgaag 180
gctgccgcta aagcagcctg tgtgaatggc tcttgcttca ctgtgaaagc agccgcacaa 240
attgccatct tgataactac tgtgacagct gcatacatta caggatttgc acctttttct 300
aaggctgccg cctctctctg tcctatccgc gggtgggcta taggcgcagc agcctctatc 360
atcccttcag gccccctcaa agccgctgca atcatggata agaacatcat actgaaggca 420
gccgcc 426
<210>2
<211>561
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tacatttggg gagttcacca ccctgttgca gcagccaaat tggcaacagg gatgcggaat 60
gtgaaggcag ccgccaacgt gactatgcca aacaatgaaa aaaaggctgc cgcatgtctg 120
ctgaaaggaa tagccccact gaatgccgcc gctgaactga gggagcaatt gagttcagtg 180
aaagccgccg ctgtgacagc agcatgctcc catgccggaa aagctgccgc cacactgaca 240
gaaaacaatg tccctgtgaa tgctgctgca tacatcgtcg aaagaccatc cgccgttaaa 300
gccgctgcaa atgtgtctta cagtggaaca agcaaagccg cagccacact gactgaaaga 360
ggagtggaag ttaaggccgc tgccaaactg tacgggagtg gaagcaagct gaaagccgca 420
gctacagtgg agcggacaaa cattcctaga gcagcagcta caatcatgga aaagaacgtt 480
actgttgccg catacaccat cggggaatgc cccaaatatg tgaatgctgc tgccacactg 540
aaccagagac tggtgccaaa a 561
<210>3
<211>1356
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
gccaccatgg gaatgcaggt gcagatccag agcctgtttc tgctcctcct gtgggtgccc 60
gggtccagag gaaaaagatg gataatcctg ggattaaata aaatagtaag aatgtatgga 120
cccgggcctg gcaatgtacc agagaaacaa actagaggca tatttggcgc aatcgcgggt 180
ttcatagaag gacccgggcc tggcagcaaa gcctacagca actgttaccc ttatgatgtg 240
ccggattatg cctcccttgg acccgggcct ggctgtccca gatatgttaa gcaaaacact 300
ctgaaattgg caacagggaa ggccggaccc gggcctggca gggccctcta tcatacagaa 360
aatgcttatg tctctgtagt gtcttcacat tatggacccg ggcctggcaa ggaatcatgg 420
tcctacattg tagaaacacc aaatcctgag aatggacccg ggcctggcaa ccacaccgta 480
accggagtat cagcatcatg ctcccataat gggaaggccg gacccgggcc tggctcaggc 540
cccctcaaag ccgagatcgc gcagagactt gaaggacccg ggcctggccc cctcaaagcc 600
gagatcgcgc agagacttga agatgtcaag gccggacccg ggcctggcga atatttaaac 660
aaaatacaaa attctctttc aactgaatgg tccccatgta gtgtaactgg acccgggcct 720
ggcaatgtgt cttacagtgg aacaagcaaa gcatgttcag attcattcta caggagcgga 780
cccgggcctg gcggaggaaa atggtcctac atcgtcgaaa gaccatcggc cgttaatgga 840
atgtgtggac ccgggcctgg ccacaatggg atgctgtgtg caacaaatct gggacatcct 900
ctcattctaa acaccaaggc cggacccggg cctggcgacc cagctctgat aatctgggga 960
atccatcact ctggatcaac cgcagaagga cccgggcctg gctctatggg gattcagagt 1020
gatgtacaag ttgatgccaa ttgtgaagga cccgggcctg gccagaccaa attatacggg 1080
agtggaagca agctaataac agttgggaag gccggacccg ggcctggccc ctcctttttt 1140
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtggacccg ggcctggcac actaaaccag 1200
agattggtac caaaaatagc tactagatcc aaagtaaacg ggggacccgg gcctggctgc 1260
cccaaatatg tgaaatcaaa cagattagtc cttgcaacag ggggacccgg gcctggcgcc 1320
aagttcgtgg ctgcctggac cctgaaggct gccgct 1356
<210>4
<211>681
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atgagccttc taaccgaggt cgaaacgcct atcagaaacg aatgggggtg cagatgcaac 60
gattcaagtg acggacccgg gcctggcatg agccttctaa ccgaggtcga aacgcctatc 120
agaaacgaat gggggtgcag atgcaacgat tcaagtgacg gacccgggcc tggcatgagc 180
cttctaaccg aggtcgaaac gcctatcaga aacgaatggg ggtgcagatg caacgattca 240
agtgacggac ccgggcctgg catgagcctt ctaaccgagg tcgaaacgcc tatcagaaac 300
gaatgggggt gcagatgcaa cgattcaagt gacggacccg ggcctggcat gagccttcta 360
accgaggtcg aaacgcctat cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacga ttcaagtgac 420
ggacccgggc ctggcatgag ccttctaacc gaggtcgaaa cgcctatcag aaacgaatgg 480
gggtgcagat gcaacgattc aagtgacgga cccgggcctg gcatgagcct tctaaccgag 540
gtcgaaacgc ctatcagaaa cgaatggggg tgcagatgca acgattcaag tgacggaccc 600
gggcctggca tgagccttct aaccgaggtc gaaacgccta tcagaaacga atgggggtgc 660
agatgcaacg attcaagtga c 681
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Cys Leu Leu Lys Gly Ile Ala Pro Leu
1 5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val
1 5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
1 5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val
1 5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Lys Leu
1 5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Thr Val Glu Arg Thr Asn Ile Pro Arg
1 5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>11
Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val
1 5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>12
Tyr Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val
1 5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>13
Asn Val Ser Tyr Ser Gly Thr Ser Lys
1 5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>14
Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Val
1 5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>15
Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val
1 5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>16
Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys
1 5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>17
Thr Ile Met Glu Lys Ash Val Thr Val
1 5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>18
Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val
1 5
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>19
Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys
1 5
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<400>20
Gln Leu Ala Ile Leu Ile Thr Thr Val Thr
1 5 10
<210>21
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>21
Ile Thr Gly Phe Ala Pro Phe Ser Lys
1 5
<210>22
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>22
Arg Ala Leu Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser
1 5 10 15
His Tyr
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>23
Asn His Thr Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly
1 5 10 15
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>24
Thr Glu Ser Trp Ser Tyr Ile Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn
1 5 10 15
<210>25
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>25
Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser
1 5 10 15
<210>26
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>26
Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val
1 5 10 15
Asn Gly
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>27
Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly
1 5 10 15
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>28
Asp Pro Ala Leu Ile Ile Trp Gly Ile His His Ser Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
<210>29
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>29
Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Ser Lys Leu Ile Thr Val Gly
1 5 10 15
<210>30
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<400>30
Ser Met Gly Ile Gln Ser Asp Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu
1 5 10 15
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>31
Asn Val Ser Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr
1 5 10 15
Arg Ser
<210>32
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>32
Gly Gly Lys Trp Ser Tyr Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly
1 5 10 15
Met Cys
<210>33
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<400>33
His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu Gly His Pro Leu Ile Leu
1 5 10 15
Asn Thr
Claims (10)
1、流感复合多表位DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗编码蛋白是以H3/H1、H3/H5或H5/H7亚型流感病毒HA蛋白为载体骨架分子，并以ER信号肽作为引导序列，包含有甲型H1、H3、H5、H7和H9亚型流感病毒HA基因和NP、M、NA和NS1基因中高度保守的免疫优势表位，其中包括来源于上述亚型的流感CTL表位17个，来源于上述亚型的流感Th和B细胞表位12个；共29个表位的流感复合多表位DNA疫苗。
2、如权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，所述Th和B细胞表位为下表所列表位18-29；所述CTL表位为流感HA基因组中17个高度保守的CTL免疫优势表位，如下表1-17所示：
表位之间采用柔性小分子linker连接。
3、如权利要求2所述的DNA疫苗，所述柔性小分子linker为KAA、KAAA、AAA、NAAA或AAY。
4、如权利要求1-3任一项所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗具有抗原性。
5、如权利要求1-3任一项所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗具有免疫原性。
6、权利要求1-3任一项所述的DNA疫苗在预防流感中的应用。
7、如权利要求6所述的应用，其特征在于所述疫苗同时预防多种亚型流感病毒，所述疫苗为注射剂。
8、一种H3/H1主导型流感复合多表位DNA疫苗，其特征在于，采用PCR方式从权利要求1-5任一项所述的DNA疫苗中扩增H3和H1亚型流感病毒HA基因并添加相应的表位基因，获得重组体质粒。
9、一种H3/H5主导型流感复合多表位DNA疫苗，其特征在于，采用PCR方式从权利要求1-5任一项所述的DNA疫苗中扩增H3和H5亚型流感病毒HA基因并添加相应的表位基因，获得重组体质粒。
10、一种H5/H7主导型流感复合多表位DNA疫苗，其特征在于，采用PCR方式从权利要求1-5任一项所述的DNA疫苗中扩增H5和H7亚型流感病毒HA基因并添加相应的表位基因，获得重组体质粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910091227A CN101628118A (zh) | 2009-08-12 | 2009-08-12 | 流感复合多表位dna疫苗及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910091227A CN101628118A (zh) | 2009-08-12 | 2009-08-12 | 流感复合多表位dna疫苗及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101628118A true CN101628118A (zh) | 2010-01-20 |
Family
ID=41573506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910091227A Pending CN101628118A (zh) | 2009-08-12 | 2009-08-12 | 流感复合多表位dna疫苗及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101628118A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102153621A (zh) * | 2010-02-12 | 2011-08-17 | 广东省疾病预防控制中心 | 新型甲型h1n1流感na蛋白b细胞表位及其应用 |
| CN102600466A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-25 | 河南农业大学 | 抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法 |
| CN111675753A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-09-18 | 深圳市疾病预防控制中心 | 禽流感病毒抗原表位筛选方法和应用 |
| CN118255849A (zh) * | 2024-02-06 | 2024-06-28 | 中山大学·深圳 | 一种流感病毒通用疫苗及其制备方法与应用 |
-
2009
- 2009-08-12 CN CN200910091227A patent/CN101628118A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102153621A (zh) * | 2010-02-12 | 2011-08-17 | 广东省疾病预防控制中心 | 新型甲型h1n1流感na蛋白b细胞表位及其应用 |
| CN102153621B (zh) * | 2010-02-12 | 2014-07-02 | 广东省疾病预防控制中心 | 新型甲型h1n1流感na蛋白b细胞表位及其应用 |
| CN102600466A (zh) * | 2012-03-23 | 2012-07-25 | 河南农业大学 | 抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法 |
| CN102600466B (zh) * | 2012-03-23 | 2014-06-11 | 河南农业大学 | 抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制备方法 |
| CN111675753A (zh) * | 2020-05-19 | 2020-09-18 | 深圳市疾病预防控制中心 | 禽流感病毒抗原表位筛选方法和应用 |
| CN118255849A (zh) * | 2024-02-06 | 2024-06-28 | 中山大学·深圳 | 一种流感病毒通用疫苗及其制备方法与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | Orf virus DNA vaccines expressing ORFV 011 and ORFV 059 chimeric protein enhances immunogenicity | |
| EP4410843A1 (en) | Recombinant fusion protein derived from hr region of s2 protein of sars-cov-2 and application of recombinant fusion protein | |
| US9504741B2 (en) | Immune methods against influenza viruses and combinatorial vaccines thereof | |
| CN108329379A (zh) | H7亚型流感病毒h7n9的普通型/嵌合型病毒样颗粒及制备方法、应用和疫苗 | |
| Fagiolo et al. | Humoral and cellular immune response to influenza virus vaccination in aged humans | |
| EP3840780A1 (en) | Vectors for eliciting immune responses to non-dominant epitopes in the hemagglutinin (ha) protein | |
| JP2023052092A (ja) | 免疫原性組成物 | |
| CN103193869B (zh) | 一种牛口蹄疫病毒a型合成肽及其制备和应用 | |
| CN109136198A (zh) | 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗 | |
| CN101628118A (zh) | 流感复合多表位dna疫苗及其应用 | |
| AU2013290597B2 (en) | Attenuated swine influenza vaccines and methods of making and use thereof | |
| MX2014001754A (es) | Vacunas contra influenza h5. | |
| CN106794242B (zh) | 针对禽类呼肠孤病毒的广谱疫苗 | |
| Shi et al. | Protective efficacy of an H1N1 cold-adapted live vaccine against the 2009 pandemic H1N1, seasonal H1N1, and H5N1 influenza viruses in mice | |
| Li et al. | Characterisation and haemagglutinin gene epitope mapping of a variant strain of H5N1 subtype avian influenza virus | |
| Naohiro et al. | Protective effect of individual glycoproteins of Newcastle disease virus expressed in insect cells: the fusion protein derived from an avirulent strain had lower protective efficacy | |
| CN115044562B (zh) | 一种嵌合表达分子佐剂的重组狂犬病病毒及其制备方法与应用 | |
| JP2023138970A (ja) | 鳥インフルエンザウイルスｈ５亜型に対する免疫原性組成物 | |
| Boots et al. | MHC class II-restricted T-cell hybridomas recognizing the nucleocapsid protein of avian coronavirus IBV. | |
| Ping et al. | Generation of a broadly reactive influenza H1 antigen using a consensus HA sequence | |
| CN103275937A (zh) | 表达 pcv2密码子优化orf1和orf2串联基因的重组病毒 | |
| CN101838319B (zh) | 一种Asia 1型FMDV复合多表位 | |
| Nouri et al. | Identification of Novel Multi Epitopes Vaccine against the Capsid Protein (ORF2) of Hepatitis E Virus | |
| CN103992408A (zh) | 一种蓝耳病蛋白工程疫苗的制备 | |
| CN109517044B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒基因工程抗原和抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100120 |