CN102153621B - 新型甲型h1n1流感na蛋白b细胞表位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用生物信息学结合实验鉴定的方法研究新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位。该B细胞表位有8段氨基酸序列，其序列如下：SKDN、LNDKHSNGTIKDRSPYR、SPYNSRFE、SWRNNILRTQES、DNWHGSNRP、DNPRPNDKTGS、DPNGWTGTDNNFSI、RGRPKE。本发明的B细胞表位肽具有中和病毒等作用，可用于研发新的表位肽疫苗和药物，开发新型甲型H1N1流感诊断试剂，还可用作治疗靶点。

Description

新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位及其应用

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞的抗原表位及其应用。

背景技术

自2009年新型甲型H1N1流感在墨西哥和美国流行以来，该型流感已蔓延全球；根据广东地区流感监测结果显示，截至2010年1月底，前6个月的分离毒株中，新型甲型H1N1流感毒株占90％以上，是最明显的优势毒株。

根据Garten RJ报告，新型甲型H1N1流感NA基因来自欧亚猪流感基因[GartenRJ，Davis CT，Russell CA，et al.Antigenic and Genetic Characteristicsof Swine-Origin 2009 A(H1N1)Influenza Viruses Circulating in Humans.Science.2009；325(5937)：197-201.感染人类的猪流感H1N1的抗原性及遗传特征；科学；2009.]；Maurer-Stroh S等[Maurer-Stroh S，Ma J，Lee RTC，etal.Mapping the sequence mutations of the 2009 H1N1 influenza A virusneuraminidase relative to drug and antibody binding sites.BiologyDirect.2009，4(18)：1-9.2009年H1N1中与药物和抗体结合位点有关的神经氨酸酶的突变序列图谱研究；生物直接；2009.]分析了该型流感NA与药物和抗体结合位点，采用Califonia-04-2009(新型H1N1)、Hong Kong-516-1997(H5N1)、Iowa-1945(猪H1N1)等某些序列位点的氨基酸序列差异，发现位点变异没有改变药物作用，但改变了抗原表位。吴迪等[吴迪，徐天磊，孙静，等.甲型H1N1流感病毒HA蛋白结构模建与构象表位分析.科学通报.2009；54(12)：1642-1644.]根据甲型H1N1流感病毒HA蛋白的一级结构序列，采用蛋白质分析软件，分析其可能的构象表位；王国戗等[王国戗，牛菊霞，贾安奎.甲型H1N1流感病毒血凝素的B细胞抗原表位预测.中国病原生物学杂志.2009；4(12)：890-893.]预测了甲型H1N1流感病毒血凝素的B细胞抗原表位。

但已公开发表的研究具有以下缺陷：(1)Maurer-Stroh S等没有对新型甲型H1N1流感NA蛋白表位进行全面研究，仅对IETCNQS氨基酸序列(序号第46-52位，作者认为可能是表位；其它亚型毒株具有不同氨基酸序列序号)等进行理论剖析，没有实验数据支持；(2)吴迪等对血凝素(注：不是NA)三维构象进行分析，不涉及表位序列，也无实验数据支持；(3)王国戗等仅采用分子生物学软件对血凝素(注：不是NA)B细胞抗原表位进行预测，发现可能的45个表位肽；后者研究较为粗浅，是理论预测的初级阶段。

B细胞表位是指抗原中可被B细胞抗原受体(BCR)或抗体特异性识别并相互结合的线性片段或空间构象型结构。B细胞表位预测有助于免疫原性多肽和新型疫苗分子的设计，并有利于诊断试剂的开发以及临床治疗。如果单纯使用实验去寻找所需要的B细胞表位，在目前的生物实验技术水平下是不可能达到的。而采用免疫信息学方法对抗原表位进行预测成为表位定位必不可少的工具，并发挥巨大作用。

参与高能量连接的氨基酸残基构成抗原-抗体的关键性结合残基(CBR)，CBR上氨基酸的替换将极大地影响其亲和性。若CBR位于较短的连续性多肽序列内，则其形成线性表位；若CBR位于多肽序列间隔较远的位置，通过蛋白折叠聚集在抗原表面，则其形成构象性表位。抗体一般通过深而狭窄的袋状抗原结合槽与多糖、核酸、多肽、半抗原等形成的B细胞表位相结合，在结合槽中的氨基端和羧基端通过范德华力聚合在一起。研究认为蛋白的亲水部位与蛋白的抗原性有关，计算局部平均亲水性峰值发现蛋白中平均亲水性峰值区域大多位于线性B细胞表位内或与之相连。运用数学方法对球蛋白的研究发现极性氨基酸残基大多位于球状蛋白表面，而非极性氨基酸大多位于蛋白内部，并计算了蛋白中位于球状蛋白表面的突出指数，发现理论计算的蛋白突出部位与实验确定的B细胞表位间具有较高的一致性。对蛋白的可及性即抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性参数和蛋白的电荷分布参数等研究发现，这些参数值均可用作为预测某些蛋白抗原决定簇的重要参数。

人们希望获得相对准确、尽可能短的肽链作为有效抗原。目前以蛋白质的理化性质和氨基酸结构上的特点为理论基础，不断改进新的预测方法和加入新的计算方法，如综合预算法、叠加预算法等，一些新的分析软件也相应开发使用。目前，国外B细胞表位预测方法多数是从抗原蛋白的氨基酸一级结构出发，以线性表位预测为主，其基本思想是综合抗原蛋白理化性质、结构特点、统计显著性度量等指标进行表位预测。但是基于上述参数的表位预测，预测准确度一般低于60％，难以令人满意。

发明内容

本发明的目的是提供新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞的抗原表位，并筛选出其表位肽，同时制备作用于表位肽的抗体，这些表位肽或抗体可应用于H1N1的疫苗、药物的研制以及检测等方面。

为实现上述目的，采用如下的技术方案：

本发明的新型甲型H1N1流感NA蛋白的毒株编号为GD-801-2009，其NA基因在GenBank的序列号为：GenBank GU471691。本发明的新型甲型H1N1流感NA蛋白共469个氨基酸，序列如下：

MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISHSIQLGNQNQIETCN

QSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIY

SKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIK

DRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDGINWLTIGISGPDN

GAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQ

ASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSN

RPWVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFS

FKYGNGVWIGRTKSISSRNGFEMIWDPNGWTGTDNNFSIKQDIVGINEWS

GYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNS

DTVGWSWPDGAELPFTIDK

其中，下划线部分的序列为其B细胞表位，具体来说，其B细胞表位的氨基酸序列及其位置如下所示：

位置       肽段序列

101-104    SKDN

140-156    LNDKHSNGTIKDRSPYR

168-175    SPYNSRFE

218-229    SWRNNILRTQES

294-302    DNWHGSNRP

324-334    DNPRPNDKTGS

376-389    DPNGWTGTDNNFSI

428-433    RGRPKE

其中，为了使上述肽段能较好的和偶联蛋白结合，进而可以增强表位肽的免疫原性以产生高效价相应抗体，在化学合成这些表位肽时，我们在有的肽段序列的前端或末端增加了半胱氨酸(C)。因而，实际应用中，我们使用的肽段序列如下所示：

位置       肽段序列

101-104    SKDNC

140-156    CLNDKHSNGTIKDRSPYR

168-175    SPYNSRFE

218-229    SWRNNILRTQES

294-302    DNWHGSNRP

324-334    DNPRPNDKTGSC

376-389    DPNGWTGTDNNFSI

428-433    CRGRPKE

其中，下划线标注的C为化学合成中加入的氨基酸。

上述八段表位序列是通过生物信息学方法分析获得的，利用生物分析软件进行目的基因的核苷酸和氨基酸一般特性和氨基酸变异研究，对氨基酸变异进行评估；然后进行蛋白特性和结构的分析，设置预测、筛选和评估程序，筛选B细胞表位，最后建立3D模型，对于目的蛋白(目的基因)氨基酸变异位点进行变异前后的氨基酸特性改变的比较，分析特定氨基酸位点变异对目的基因蛋白表位的可能影响，得到上述八段表位序列及其具体位置。进而通过实验确证表位肽的特异性、表位肽抗体的敏感性、中和病毒等作用。

实验表明，本发明的新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位肽具有明显的NA蛋白的某些特异性功能，具有免疫原性，与其相作用的抗体具有中和病毒作用；这就意味着表位肽在感染宿主细胞中发挥着非常重要的作用。这就为用于制备新型疫苗和药物提供了科学依据；其免疫产生的抗体具有开发免疫诊断试剂的作用，尤其是表位肽氨基酸数目较长的肽段。

上述表位肽可以作为检测抗原用于开发新型甲型H1N1流感相关诊断试剂盒(检测特异性抗体)；上述表位肽抗体能特异地与相应的新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位中的分别结合，也可以作为开发新型甲型H1N1流感相关诊断试剂盒(检测特异性抗原)。

上述表位肽可以作为靶蛋白，用于新型甲型H1N1流感的治疗；其相应抗体可进一步做拮抗新型H1N1病毒的药物。

上述疫苗可包含新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位中的一种或多种抗原表位肽。

本发明的新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位为新型甲型H1N1流感的诊治预防奠定了基础，为用于制备新型疫苗和药物提供了科学的依据。

附图说明

图1是本发明利用生物信息学分析预测目的基因线性B细胞表位的三维立体结构图，红色的部分即是已鉴定的表位肽位置。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是其中所用到的生物信息学分析软件、分析方法和相关数据库都为本领域中专用，本领域技术人员可以通过查阅文献或数据库网站而获得。

实施例1：新型甲型H1N1流感病毒NA蛋白B细胞表位的分析

新型甲型H1N1流感病毒NA蛋白B细胞表位的分析按如下方法进行：

(1)基因序列检测与变异分析

采用Primer Premier 5.0设计并合成甲型流感病毒(H1N1毒株)的目的基因(神经氨酸酶，NA)的RT-PCR引物；检测目的基因核苷酸序列，根据流行病学(时间、地点分布)资料，选择目的毒株；下载国内、外目的基因核苷酸序列；采用Lasergene 7.1软件和Mega 4.0软件，进行目的基因的核苷酸和氨基酸一般特性和氨基酸变异研究，对氨基酸变异进行评估。与此比较毒株目的基因核苷酸序列来自数据库GenBank和LANL。

(2)蛋白特性和结构分析

根据流感病毒目的蛋白核苷酸序列，采用SWISS-MODEL软件分析其螺旋区和片层区(AS和SS)并采用Chimera软件分析其螺旋区和片层区(AC和SC)；使用Protean软件，采用Karplus-Schulz方法分析蛋白质的表面柔性(FK)，采用Kyte-Doolittle的氨基酸亲水性指标(HPK)分析其亲水性，采用Emini方法分析蛋白质的表面可及性(SPE)，采用Jameson-Wolf方法分析其抗原指数(AIJ)。

(3)预测、筛选和评估程序

①聚类与相关分析：用SPSS 13.0统计软件分析目的基因编码蛋白的相关数据。SWISS-MODEL软件分析的目的蛋白的螺旋区和片层区(AS和SS)中，将结果“h”设为1，将无“h”设为0，将结果“s”设为1，将无“s”设为0；Chimera软件分析的螺旋区和片层区(AC和SC)中，将结果“h”设为1，将无“h”设为0，将结果“s”设为1，将无“s”设为0。Karplus-Schulz方法中，将结果“F”设为1，将无“F”设为0。Kyte-Doolittle方法预测其亲水性、Emini方案预测蛋白质的表面可及性、Jameson-Wolf方案预测抗原性指数按具体数值处理，计算各数值统计学分布和四分位数。目的基因蛋白相关数据经SPSS 13.0统计学软件聚类、相关分析，对于各变量进行归类，并进行两两相关性分析。

②筛选B细胞表位：以4个以上连续氨基酸残基为一组的方案，初步预测筛选和预测目的蛋白抗原的B细胞表位。根据目的蛋白的螺旋结构、片层结构、柔性区，蛋白表面亲水性、可及性、抗原指数(AI)的特性，建立一种筛选方法，进行目的蛋白的B细胞表位预测和筛选。

筛选的具体入选程序如下：

a.排除条件：SWISS-MODEL方法和Chimera方法预测均无螺旋区；SWISS-MODEL方法和Chimera方法预测均无片层区(一般螺旋区和片层区常位于各自不同残基区域)。所以，两种方法预测均无螺旋区或两种方法均无片层区的区域入选；

b.入选参数：入选参数有三项，包括Kyte-Doolittle方法分析氨基酸亲水性、Jameson-Wolf方法预测蛋白序列抗原指数、Emini方法预测氨基酸残基位于蛋白质表面；入选条件：①三项参数中，各单项参数数值≥50％四分位数；或②如果三项参数中，有两项参数数值≥50％四分位数，此外应满足以下条件：该区域不出现螺旋区和片层区。

c.肽段选择：以4个及4个以上连续氨基酸残基为一组的方案，初步预测筛选和预测目的基因蛋白的B细胞表位。

根据以上a、b、c条件，综合预测结果。

③评估预测肽段：参考SPSS抗原指数(SPSS’AI)，评价目的蛋白抗原表位，SPSS抗原指数表见表2。平均AI＝总AI/氨基酸数量。具有较高平均AI的肽段是表位的主要候选者。

(4)建立3D模型

①建模：采用SWISS-MODEL软件和Chimera软件，分别建立目的基因蛋白三维立体结构模型；并用Swiss-PdbViewer软件分析。

②变异前后比较：对于目的蛋白(目的基因)氨基酸变异位点，进行变异前后的氨基酸特性改变的比较，分析特定氨基酸位点变异对目的基因蛋白表位的可能影响。

通过上述分析，从目的蛋白NA氨基酸序列(本研究检测的毒株包括GenBank中，GU471691，GU471692，GU471693，GU471694，GU471695，GU562466，GU562467，GU562468，GU562469；以及从GenBank中下载全球200余株NA氨基酸序列)，比较氨基酸位点变异，得到目的基因线性B细胞表位如表1所示，表1是目的基因线性B细胞表位的氨基酸序列。目的基因线性B细胞表位的三维立体结构图见图1，红色的部分即是鉴定的表位位置。

表1

位置       肽段

101-104    SKDN

140-156    LNDKHSNGTIKDRSPYR

168-175    SPYNSRFE

218-229    SWRNNILRTQES

294-302    DNWHGSNRP

324-334    DNPRPNDKTGS

376-389    DPNGWTGTDNNFSI

428-433    RGRPKE

由于表位肽分子较小且抗原性较弱，表位肽与偶联蛋白结合后可以增加其免疫原性并刺激产生足以检测的免疫抗体；而在某些表位肽段序列的前端或末端增加了半胱氨酸(C)，其目的是便于结合上偶联蛋白。因而，在后续实验中我们使用的表位肽的序列如下所示：

位置       肽段序列

101-104    SKDNC

140-156    CLNDKHSNGTIKDRSPYR

168-175    SPYNSRFE

218-229    SWRNNILRTQES

294-302    DNWHGSNRP

324-334    DNPRPNDKTGSC

376-389    DPNGWTGTDNNFSI

428-433    CRGRPKE

其中，下划线标注的C为化学合成中加入的半胱氨酸。

表2

实施例2：表位肽的特异性鉴定实验

首先人工合成表位肽，然后免疫鉴定和ELISA直接鉴定，具体方法如下：

选择目的蛋白(目的基因)中SPSS`AI(AI：抗原指数)高分值表位肽段，人工合成；每基因合成表位肽(NA有8个表位肽)；每肽段变异序列4-17个。根据预测、筛选和评估结果，合成一系列肽段。

免疫鉴定肽段时，用人工合成肽段，偶联KLH(血蓝蛋白)，加完全弗氏免疫佐剂；免疫动物(新西兰兔)，5次免疫后制备免疫血清；用该免疫血清，分别鉴定人工合成肽段和毒株。同时，用新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009，GenBank中NA序列号为GU471691)免疫动物，技术方法相同。

ELISA鉴定表位肽的特异性时，用96孔ELISA板，包被抗原，包被抗原采用与新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009，免疫毒株)神经氨酸酶抗原性不同的毒株，即季节性甲型H1N1毒株GD-15-2007和毒株GD-1-2007、季节性甲型H3N2毒株GD-590-2006和毒株GD-473-2008；用表位肽免疫血清，以检测其表位肽的特异性。

ELISA检测结果发现，用新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009，免疫毒株)、季节性甲型H1N1毒株(毒株GD-15-2007和毒株GD-1-2007)、季节性甲型H3N2毒株(毒株GD-590-2006和毒株GD-473-2008)包被ELISA板(96孔板，病毒浓度为血凝1单位)，新型甲型H1N1毒株(毒株GD-801-2009)免疫血清与季节性甲型H1N1毒株和季节性甲型H3N2毒株高度交叉；而8个表位肽抗体与季节性甲型H3N2毒株和季节性甲型H3N2毒株特异性，其实验结果数据见表3：

表3

注：(1)简称：如CE-7是指由7个氨基酸组成的、首尾分别是C和E的表位肽；

(2)抗体：A-CE-7为抗(Anti)CE-7，是CE-7免疫产生的抗体；

(3)比值：为血清稀释度。

由此分析可得，新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009)的表位肽抗体与季节性甲型H1N1毒株(毒株GD-15-2007和毒株GD-1-2007)、季节性甲型H3N2毒株的抗原交叉免疫反应较弱，而与自身免疫毒株及表位肽的免疫反应滴度较高，这意味着我们制备的新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009)的表位肽及其抗体具有很好的特异性。

实施例3：表位肽抗体的敏感性检测

制备毒株免疫抗体：用检测毒株，加完全弗氏免疫佐剂，免疫动物(新西兰兔)，5次免疫后制备免疫血清；用该免疫血清，分别鉴定相应毒株。

采用免疫抗原，包括毒株及人工合成表位肽，检测所制备的抗体。包被抗原中，新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009)病毒浓度为血凝1单位)，96孔ELISA板包被抗原并封闭，制备的抗体稀释度有1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶20000、1∶40000、1∶80000、1∶160000；第二抗体为羊抗兔抗体-HRP，底物为邻苯二胺。

用新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009，免疫毒株)包被ELISA板(96孔板，病毒浓度为血凝1单位)；ELISA检测结果发现，新型甲型H1N1毒株(毒株GD-801-2009)与其对应抗体滴度达到1∶80000以上；新型甲型H1N1毒株(毒株GD-801-2009)与8个多肽抗体的抗体滴度达到1∶10000--1∶40000；而免疫动物的免疫前本底血清抗体＜1∶100。实验结果见表4，表4为新型H1N1毒株与多肽抗体的敏感性检测结果。

用表位肽(浓度50ug/ml)包被96孔ELISA板，则增加多聚赖氨酸和甘氨酸作用，以提高其检测敏感性。实验结果见表5，表5为表位肽抗原与表位肽抗体的敏感性检测实验结果，检测阳性以OD值＞0.2为基准。

表4

注：(1)简称：如CE-7是指由7个氨基酸组成的、首尾分别是C和E的表位肽；

(2)抗体：A-CE-7为抗(Anti)CE-7，是CE-7免疫产生的抗体；

(3)比值：为血清稀释度。

表5

注：(1)简称：如CE-7是指由7个氨基酸组成的、首尾分别是C和E的表位肽；

(2)抗体：A-CE-7为抗(Anti)CE-7，是CE-7免疫产生的抗体；

(3)比值：为血清稀释度。

本结果显示，毒株GD-801-2009免疫血清的滴度大于1∶80000，而多肽免疫血清的滴度也在1∶10000--1∶20000，意味着表位肽的抗原性较强。A-SC-5的抗体滴度略低，可能与其表位肽氨基酸数量较少有关；一般而言，免疫肽较短，则抗原性相对较弱。

实施例4：表位肽抗体中和病毒作用

采用单层MDCK细胞株；100TCID₅₀病毒液100ul加待检血清(稀释度1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000)100ul，4℃1h；然后加入单层MDCK培养管(加前用Hank’s液洗涤两次)，37℃1h后倒去液体；加1ml维持液(0.25％Typsin)，34℃5％CO₂；每天观察细胞病变(CPE)。

结果见表6，表6是表位肽抗体的中和效果的实验数据。

表6

注：TCID₅₀的数值为血清稀倍数

由上述结果可见，8个表位肽抗体具有不同程度的抗病毒中和作用，TCID₅₀滴度在5×10^-5×10^-3之间；全毒株(GD-801-2009)免疫抗体的抗病毒TCID₅₀滴度为5×10^-3。本研究的表位肽抗体却具有明显的中和病毒作用(曾重复实验)，其作用机制可能是表位肽抗体与毒粒神经氨酸酶表位结合后，影响毒粒感染(吸附和穿入等)MDCK细胞。查阅类似研究中，以前国内、外研究罕见NA表位肽抗体的报告，流感抗体的中和作用多是指血凝素抗体；该实验结果的具体机制，作者会进一步深入研究。

实施例5：表位肽抗体抗病毒凝集后的释放作用的相关实验

4u病毒100μl，加不同稀释滴度的抗体100μl，4℃1h；再加1.0％鸡红血球100μl，37℃30min，观察血凝抑制现象；以后置22℃环境，每30min观察凝集后的释放现象，约4-6h后，记录凝集后的释放现象。

采用新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009，血凝滴度为4u)和多肽免疫抗体(稀释度1∶10-1∶640)进行血凝抑制试验，加1.0％鸡红血球。如表7所示，表7是多肽抗体的抵抗病毒血凝后的释放作用的实验结果数据，结果发现，抗体A-DP-9、A-SE-8、A-SS-12在1∶80滴度具有抵抗病毒血凝后的释放作用，A-CR-18、A-DC-12、A-DI-14在1∶40滴度具有抵抗病毒血凝后的释放作用，A-SC-5在1∶30滴度具有抵抗该释放作用，A-CE-7仅在1∶10滴度具有抵抗病毒血凝后的释放作用；而各兔的免疫前血清无抵抗释放作用。

表7

h：凝集现象；+：病毒血凝后的无释放作用；-：血凝后释放作用

神经氨酸酶又称唾液酸酶是分布于流感病毒被膜上的一种糖蛋白，它具有抗原性，可以催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞，在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色。

神经氨酸酶负责催化唾液酸与糖蛋白之间糖苷键的水解。流感病毒侵染宿主后其表面的血凝素与宿主上皮细胞表面的血凝素受体结合，进入细胞，其基因利用宿主细胞的资源进行复制和表达，最终重新组装成新的流感病毒颗粒，以出芽的形式突出宿主细胞，但是成熟的流感病毒与宿主细胞之间，仍然依靠血凝素分子末端的唾液酸残基与血凝素受体分子表面的糖基团以2-6或2-3糖苷键链接，这使得流感病毒无法立即脱离宿主细胞。神经氨酸酶负责催化水解这一重要的糖苷键，使成熟的病毒颗粒最终脱离宿主细胞，感染新的上皮细胞，造成流感病毒在患者体内的扩散。

本表位肽抗体由毒株神经氨酸酶表位肽刺激动物(兔)机体免疫产生，可以针对同一株毒株的释放作用；则意味着抗体A-DP-9等可以抑制新型甲型H1N1流感病毒的宿主细胞内释放。据此推论，该抗体作用可以减少甚至终止流感病毒在患者体内的扩散，减轻患者症状。

实施例6：表位肽抗体抗神经氨酸酶活性作用

血凝滴度1u病毒100μl，分别加不同稀释滴度的抗体100μl，4℃1h；取其混合物20μl，加4-MU-NANA(底物)20μl，37℃1h；加20μl终止液NaOH(0.5M)。

新型甲型H1N1毒株(GD-801-2009，血凝1u)与免疫抗体(1∶10-1∶1000)作用，4℃1h后，检测神经氨酸酶活性(神经氨酸酶NA分解底物4-MU-NANA)。结果见表8，表8是表位肽抗体对神经氨酸酶活性作用实验结果数据，由此可得，除抗GD-801-2009具有明显抑制神经氨酸酶活性外，其它表位肽抗体也具有不同程度的抑制神经氨酸酶活性作用。

表8

抗神经氨酸酶活性功能，是抗流感病毒药物的筛选条件之一；神经氨酸酶分解4-MU-NANA成4-MU和NANA是该酶的功能之一，目前国外常用该检测技术筛选耐药毒株。本实验结果显示，全毒株免疫的多克隆抗体具有一定的抑制神经氨酸酶分解4-MU-NANA作用(76％)，其它特异性表位肽抗体抑制神经氨酸酶作用相对较弱(87％-98％)。可能本研究合成的表位肽没有完全覆盖神经氨酸酶分解4-MU-NANA活性位点，或单一表位肽抗体不足以抑制整个神经氨酸酶活性作用。

根据以上氨基酸变异分析结果、表位肽段鉴定结果、ELISA血清学抗原分析结果，进行综合评估。该结果的直接意义是鉴定被检基因B细胞抗原表位；该结果的间接推断意义为根据表位变异程度提供新型甲型H1N1流感预警报告；通过表位肽的功能鉴定，可以为疫苗研制、药物治疗、临床诊断提供依据和决策。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<120>新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位及其应用

<160>8

<210>1

<211>4

<212>PRT

<400>1

Ser Lys Asp Asn

<210>1

<211>17

<212>PRT

<400>2

Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro

1               5               10               15

Tyr Arg

<210>1

<211>8

<212>PRT

<400>3

Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu

1               5

<210>1

<211>12

<212>PRT

<400>4

Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser

1               5                   10

<210>1

<211>9

<212>PRT

<400>5

Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro

1               5

<210>1

<211>11

<212>PRT

<400>6

Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser

1               5               10

<210>1

<211>14

<212>PRT

<400>7

Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp Asn Asn Phe Ser Ile

1               5                   10

<210>1

<211>6

<212>PRT

<400>8

Arg Gly Arg Pro Lys Glu

1             5

<210>1

<211>469

<212>GD-801-2009 H1N1 PRT

<400>9

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Cys Met Thr

1               5                   10                  15

Ile Gly Met Ala Asn Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile

            20                  25                  30

Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Leu Gly Asn Gln Asn Gln Ile Glu Thr

        35                  40                  45

Cys Asn Gln Ser Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln

    50                  55                  60

Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gln Ser Val

65                  70                  75                  80

Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly

                85                  90                  95

Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly

            100                 105                 110

Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu

        115                 120                 125

Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His

    130                 135                 140

Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser

145                 150                 155                 160

Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser

                165                 170                 175

Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr

            180                 185                 190

Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asn Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr

        195                 200                 205

Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu

    210                 215                 220

Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr

225                 230                 235                 240

Val Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Gln Ala Ser Tyr Lys Ile Phe

                245                 250                 255

Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Val Lys Ser Val Glu Met Asn Ala Pro

            260                 265                 270

Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile

        275                 280                 285

Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val

    290                 295                 300

Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly

305                 310                 315                 320

Ile Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly

                325                 330                 335

Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys

            340                 345                 350

Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg

        355                 360                 365

Asn Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp

    370                 375                 380

Asn Asn Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser

385                 390                 395                 400

Gly Tyr Ser Gly Ser Phe ValGln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp

                405                 410                 415

Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys

            420                 425                 430

Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val

        435                 440                 445

Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro

    450                 455                 460

Phe Thr Ile Asp Lys

465

Claims (3)

1.新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位，其特征在于，所述表位为如下所示的氨基酸序列：

DPNGWTGTDNNFSI。

2.权利要求1所述的新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位的应用，其特征在于，用于制备新型甲型H1N1流感疫苗或药物。

3.权利要求1所述的新型甲型H1N1流感NA蛋白B细胞表位在制备新型甲型H1N1流感诊断试剂盒中的应用。