CN102697795A - 一种抗肿瘤联合用药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表阿霉素与槲皮素制备抗肿瘤的联合用药物中的用途。本发明还公开了一种联合用药物。本发明选择表阿霉素为抗癌药物，槲皮素作为表阿霉素的MDR逆转剂，PLGA为纳米粒共聚物材料，制备同时包载表阿霉素和槲皮素的复方纳米粒，达到一定的包封率和载药量，以纳米粒各种指标评价其性质，以体外细胞试验评价其逆转多药耐药效果。采用乳化溶剂蒸发法制备EPI-QC复方纳米粒，通过比较系统的研究发现EPI-QC复方纳米粒可以一定程度逆转肿瘤细胞的耐药性，并且降低其对正常细胞的毒性。

Description

一种抗肿瘤联合用药物

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤联合用药物。属药物领域。

背景技术

恶性肿瘤已成为人类死亡的一个重要原因。近年来，化学治疗同手术治疗、放射治疗一样，已经成为恶性肿瘤不可或缺的重要治疗手段。尽管人们在化疗方面做出很多努力，研究新的化疗药物，改进化疗方案，但是治疗效果仍不理想。一方面，大部分抗肿瘤药物缺乏对肿瘤细胞的选择性，在杀伤细胞的同时，对正常细胞也有毒副作用，从而导致严重的全身不良反应，所以很多患者无法坚持，甚至放弃化疗，临床上难以期望通过增加药物剂量来获得理想的效果；另一方面，肿瘤细胞对于化疗药物的耐药性，更多可能是继发性耐药引起的多药耐药（MDR），这些因素严重影响了化疗疗效。

多药耐药（MDR）是指在化疗过程中，肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物耐药的同时，对其他结构不同作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药的现象，它是导致肿瘤治疗失败的重要原因。MDR以原发性和继发性两种形式出现，前者是细胞固有的对药物不敏感，首次使用药物就产生耐药性，后者是初始对药物敏感，但经过几个疗程后，对药物产生耐药性。随着对MDR机制了解的深入，国内外学者开始寻找逆转肿瘤多药耐药的策略，很重要的一方面就是针对细胞膜P-糖蛋白(P-gp)或其它ABC家族成员等的小分子逆转剂。目前已发现数百种MDR逆转剂，这些逆转剂主要包括：钙通道阻滞剂，如维拉帕米，蛋白激酶抑制剂，钙调素拮抗剂，生物碱等。尽管大量的体外细胞试验已经证实许多逆转剂可以成功逆转P-gp介导的MDR，但是临床应用上，发现很多都不能达到理想的治疗效果，因为它们是通过与抗肿瘤药物竞争的方式来抑制P-gp对抗肿瘤药物的外排，但是，它们对P-gp的亲合力又较弱，因此，为了使肿瘤细胞内的药物浓度达到足够高就不得不保证要有高的逆转剂的血浆浓度，结果导致在体内产生了严重的毒副作用。

肿瘤细胞MDR机制十分复杂，牵涉到与MDR相关的基因较多，仅从单个基因表达的研究入手还不能反映MDR的全貌。一般的化学制剂只有单一的逆转作用靶点，而中药是一个复杂化学分子复合体，往往同时兼备数种逆转机制，因此从中药中筛选有效的MDR逆转剂已经成为研究的热点。

目前，将化疗药物和小分子逆转剂同时包载于同一个纳米粒中，可以保证将其靶向到靶点位置的同时，达到更高的逆转倍数和治疗效果，降低药物剂量，从而减小对正常细胞的毒副作用。纳米粒，一种超微型药物载体，比细胞还小，可被组织和细胞吸收，改善药代动力学性质，能实现缓释、控释和靶向释药的目的，从而显著地提高疗效，降低毒副反应。纳米粒作为药物传递系统之一，与脂质体同样具有良好的靶向、缓释控释的作用，载药纳米粒的形成，可以是药物溶解、包裹于纳米粒内部，也可以是吸附粘着于纳米粒表面，具有尺寸效应、表面效应、易吸收等生物优势，能够提高药物的生物利用度，避免其降解或泄漏，提高其稳定性。

表阿霉素（Epirubicin，EPI）的同分异构体阿霉素，目前为治疗肝癌单药中效率最高的药物，也是最早开发的具有抗肿瘤活性的蒽环类药物，抗瘤谱广﹑疗效好，但是，阿霉素具有严重的全身不良反应，如心脏损害﹑骨髓抑制等，从而严重地限制其在临床上的应用。表阿霉素为桔红色粉末状结晶，溶于水，微溶于乙醇，不溶于氯仿、丙酮等溶剂，在溶液中pH为7时，呈桔红色，pH超过9时呈蓝紫色。Delozier等研究认为表阿霉素的抗肿瘤活性与阿霉素相当或略好，目前的临床结果也得出了此结果，而且在动物体内表阿霉素的毒性更低，尤其心脏毒性更是如此。表阿霉素主要作用机理是它能够直接嵌入DNA碱基对之间，干扰转录过程，阻止mRNA的形成，从而能抑制DNA和RNA的合成，所以对细胞周期各阶段均有作用，最主要是作用于细胞核。另外，表阿霉素对拓扑异构酶II亦有抑制作用。目前，表阿霉素临床主要用于急性白血病和恶性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等多种实体瘤。

槲皮素（quercetin，QC）是一种天然的黄酮类化合物，化学名为3，3’，4’，5，7-五羟基黄酮，具有抗癌防癌、抗自由基、抗贫血、抗炎和抗过敏等多种生物活性及药理作用。特别是近年来研究发现槲皮素有促进凋亡及增加某些化疗药物抗肿瘤敏感性作用，能显著抑制人卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞和前列腺癌细胞等生长。

目前，尚没有文献报道将表阿霉素和槲皮素联合使用的相关报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了表阿霉素与槲皮素制备抗肿瘤的联合用药物中的用途。本发明的另一技术方案是提供了一种抗肿瘤联合用药物及其制备方法。

本发明提供了表阿霉素与槲皮素制备抗肿瘤的联合用药物中的用途。

其中，所述的药物是治疗肿瘤多药耐药的药物。

进一步优选地，所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：0.1-10:1-100。

更进一步优选地，所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：1︰10。

本发明还提供了一种抗肿瘤联合用药物，它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或依次给药的表阿霉素与槲皮素，及药学上可接受的载体制备成的制剂。

其中，所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：0.1-10:1-100。

进一步优选地，所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：1︰10。

本发明药物是由表阿霉素、槲皮素为活性成分，制备成纳米粒，再加入冻干辅料支架剂，冷冻干燥，制备成冻干粉针；所述的纳米粒是含有下述重量配比的原料及辅料制备而成：

表阿霉素0.1-10份、槲皮素1-90份、PLGA 10-90份、稳定剂2-20份；其中，所述的稳定剂为F-68、PVA205、PVA403。

进一步优选地，所述的纳米粒是含有下述重量配比的原料及辅料制备而成：

表阿霉素0.2份、槲皮素2份、PLGA 100份、PVA2055份。

其中，所述的纳米粒的粒径小于220nm。平均电位为-0.33±0.38mV。

进一步优选地，所述的纳米粒的平均粒径为141.1±2.89nm。

其中，所述的纳米粒的制备方法为：

a、称取原料及辅料：

b、将表阿霉素溶解于95%乙醇溶液中，槲皮素溶解于丙酮溶液中；

c、将PLGA与b步骤的乙醇溶液、丙酮溶液混合，加入二氯甲烷；混合后与含0.5-5%w/vPVA205的水相混合，其中，有机相和水相的体积比为：1︰2-5，探头超声3-10min，制备成初乳；

d、将c步骤的初乳经减压旋转蒸干溶剂，得本发明纳米粒。

其中，b步骤中表阿霉素溶解于95%乙醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/ml；槲皮素溶解于丙酮溶液的浓度为5-15mg/ml；c步骤中二氯甲烷︰丙酮︰乙醇的体积比为：1︰0.4︰0.1；c步骤所述的探头超声条件为：200W功率探头超声3min；c步骤所述的水相中含2%w/w PVA205；有机相和水相的体积比为：1︰2；d步骤所述的减压旋转条件为：25℃、50r/min条件下，旋转蒸发仪减压旋转40min。

其中，所述的冻干辅料支架剂为甘露醇、注射用乳糖、注射用葡萄糖、右旋糖酐、氯化钠、甘氨酸钠、磷酸二氢钠、氨基乙酸中的一种。

进一步优选地，所述的冻干辅料支架剂为甘露醇。

本发明还提供了一种制备所述的抗肿瘤联合用药物的方法，它包括如下步骤：

①称取原料及辅料：

②将表阿霉素溶解于浓度为95%乙醇溶液中，槲皮素溶解于丙酮溶液中；

③将PLGA与b步骤的乙醇溶液、丙酮溶液混合，加入二氯甲烷；混合后与含PVA205的水相混合，探头超声，制备成初乳；

④将步骤③中的初乳经减压旋转蒸干溶剂，得本发明纳米粒；

⑤将步骤④中的纳米粒，加入蒸馏水溶解，再加入溶剂重量2%-10%的冻干辅料支架剂，-50℃冷冻干燥，得冻干粉针。

本发明选择表阿霉素为抗癌药物，槲皮素作为表阿霉素的MDR逆转剂，PLGA为纳米粒共聚物材料，制备同时包载表阿霉素和槲皮素的复方纳米粒，达到一定的包封率和载药量，以纳米粒各种指标评价其性质，以体外细胞试验评价其逆转多药耐药效果。采用乳化溶剂蒸发法制备EPI-QC复方纳米粒，通过比较系统的研究发现EPI-QC复方纳米粒可以一定程度逆转肿瘤细胞的耐药性，并且降低其对正常细胞的毒性，为临床提供了一种新的用药选择。

附图说明

图1本发明药物制备工艺图

图2不同稳定剂的筛选结果

图3PVA205不同浓度筛选结果

图4PLGA用量筛选结果

图5有机相和水相体积比的筛选

图6EPI-QC复方纳米粒的Zeta电位

图7K562cells(×400)

图8K562/A02cells(×400)

图9L02cells(×400)

具体实施方式

实施例1本发明药物冻干制剂的制备

处方：表阿霉素0.2g、槲皮素2g、PLGA100g、PVA2055g、甘露醇50g；共制1000支；

具体步骤为：

a、用乙醇配制成浓度为的1mg/ml的EPI溶液，丙酮配制浓度为10mg/ml的QC溶液，备用；

b、称取PLGA，加入二氯甲烷和丙酮溶液溶解PLGA，再加入乙醇溶液组成有机相，二氯甲烷︰丙酮︰乙醇的体积比为：1︰0.4︰0.1，混匀，与2%PVA的水相混合，200W功率探头超声3min后置圆底烧瓶中，25℃、50r/min条件下，于旋转蒸发仪上减压除去有机溶剂，40min后即得纳米粒（EPI-QC复方纳米粒）；加入蒸馏水，完全溶解，再加入溶剂重量2%-10%的甘露醇，冷冻干燥，经预冻（-50℃，7小时）、升华干燥、解析干燥，得冻干粉针。

具体制备工艺见制备工艺见图1。

实施例2纳米粒同时包载盐酸表阿霉素和槲皮素制备工艺的研究

纳米粒包裹材料方面，本发明选择了在国外已经批准的具有良好生物相容性和降解性的聚乳酸共聚物（PLGA），此材料在体内能完全降解为乳酸和乙酸，再经过三羧酸循环转化为水和二氧化碳排出体外，无刺激、无毒。

本发明选择的模型药物表阿霉素和槲皮素在理化性质上差别较大，前者是水溶性药物，后者为水不溶、脂难溶药物，在制备工艺上有很大的困难。

1仪器与试药

1.1仪器

1.2试剂

PLGA    山东省医疗器械研究所

PVA     可乐丽国际贸易(上海)有限公司

F₆₈     BASF

甲醇和乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯

2实验方法

2.1破膜溶剂的选择

文献报道中，能够溶解PLGA的溶剂有DMSO、乙腈、丙酮和二氯甲烷，本实验中对以上有机溶剂进行了筛选，以获得合适的破膜剂。

2.2包封率和载药量

纳米粒混悬液中含量测定包括：混悬液中药物总含量的测定和包裹在纳米粒内部或吸附在纳米粒表面的药物。选择合适的方法分离未包封游离药物和纳米粒，按下面公式计算药物包封率和载药量（公式2-1,2-2）。

公式2-1

公式2-2

分离游离药物与含药纳米粒的方法中，常见的有三种：透析法，凝胶过滤法和离心法，实验中筛选了透析和离心两种方法。

2.2.1透析法

2.2.1.1透析袋的预处理

①EDTA溶液的配制：称取EDTA 93.05mg，加蒸馏水180mL溶解，用0.5mol/L NaOH溶液调节pH=8.0，加蒸馏水定容至250mL备用；

②EDTA-NaHCO₃混合溶液的配制：分别称取EDTA 93.05mg，NaHCO35g，加蒸馏水180mL溶解，用0.5mol/L NaOH溶液调节pH=8.0，加蒸馏水定容至250mL备用；

③将透析袋剪成适当长度小段，用EDTA-NaHCO₃混合溶液煮沸10min，放冷，用蒸馏水彻底洗净，然后用EDTA溶液煮沸10min，放冷，用蒸馏水彻底洗净，最后用20%-50%乙醇溶液浸泡，4℃保存。

2.2.1.2包封率的测定

取制备好的EPI-QC复方纳米粒1mL置于处理过的透析袋中，排出气泡，将透析袋两端扎紧，置盛有25mL介质的锥形瓶中，室温下，60r/min水浴振荡透析，考察透析平衡的时间，HPLC测定介质中的药物浓度，同时取1mLEPI-QC复方纳米粒，DMSO破乳后，甲醇定容至10mL，同法测定两种药物总量，按公式2-1计算包封率。

2.2.2离心法

取制备好的EPI-QC复方纳米粒1mL，筛选离心时间和转速，弃上清液，加入DMSO超声溶解底部沉淀，甲醇定容至10mL，HPLC测定含量，同法测定药物总量，按公式2-1计算包封率。

2.3制备方法的筛选

纳米粒常见的制备方法有乳化溶剂蒸发法、纳米沉淀法、盐析法和复乳法等，其中前两者的使用较多，因此本发明对乳化溶剂蒸发法、纳米沉淀法这两种方法进行考察。

2.3.1乳化溶剂蒸发法

用乙醇配制一定浓度的EPI溶液，丙酮配制一定浓度的QC溶液（其中，EPI0.2g,，浓度为1mg/ml、QC2mg，浓度为10mg/ml），备用，称取PLGA 60mg，加入1mL二氯甲烷和0.4mL丙酮溶液溶解PLGA，再加入0.1mL乙醇溶液组成有机相，混匀，与2%PVA的水相混合，200W功率探头超声3min后置圆底烧瓶中，25℃、50r/min条件下，于旋转蒸发仪上减压除去有机溶剂，40min后即得EPI-QC复方纳米粒。

2.3.2纳米沉淀法

用乙醇配制一定浓度的EPI溶液，丙酮配制一定浓度的QC溶液（其中，EPI0.2g,，浓度为1mg/ml、QC2mg，浓度为10mg/ml），备用，称取PLGA 60mg，加入1mL丙酮溶解PLGA，再加入0.1mL乙醇溶液组成有机相，在一定强度磁力搅拌条件下缓缓注入到2%PVA的水相中，继续搅拌一定时间转入圆底烧瓶中，25℃、50r/min条件下，于旋转蒸发仪上减压除去残余有机溶剂后即得EPI-QC复方纳米粒。

2.4单因素实验考察

2.4.1稳定剂种类的筛选

乳化溶剂蒸发法第一步要制得稳定的乳剂，需在外水相中加入一定量的表面活性剂。选用不同的表面活性剂，按照前述的制备方法，通过考察外观和稳定性，测定粒径和包封率等指标来筛选适宜者。实验中考察的稳定剂为比较常用的F-68，PVA205和PVA403。

2.4.2稳定剂浓度的筛选

固定其它条件不变，考察稳定剂浓度分别为0.5%、1%、2%和5%。

2.4.3PLGA用量的筛选

固定其它条件不变，考察PLGA用量分别为40mg、60mg、80mg和100mg。

2.4.4有机相和水相体积比的筛选

有机相和水相的比例需要在一定的范围内，才能保证在制备纳米粒的第一步得到稳定的乳剂，考察有机相和水相的体积比为1:2、1:3、1:4和1:5。

2.4.5超声时间的筛选

乳化溶剂蒸发法中初乳的形成对于最终纳米粒的质量影响至关重要，超声时间过短，达不到细胞粉碎的目的，难以形成小粒径的粒子；超声时间过长，可能会破坏乳剂，也不利于乳剂的形成。考察超声时间分别为3min,5min,10min对形成乳剂的影响，以能静置30min不分层为评价指标。

3实验结果

3.1破膜溶剂的选择

实验筛选了DMSO、乙腈、丙酮和二氯甲烷四种破膜剂，结果表明，每200μL纳米粒加入500μLDMSO超声后能够得到完全澄清透明的溶液，乙腈和丙酮在此浓度下不能完全破乳，而二氯甲烷不能够溶解槲皮素，所以选择DMSO为破膜溶剂。

3.2包封率和载药量测定方法

3.2.1透析法

模型药物EPI和QC均有颜色，透析过程中，可以观察到部分药物吸附在捆绑透析袋的细线上，透析完的透析袋上也有少量的吸附，HPLC测定该法对两种药物的回收率分别为60.00%和55.79%，不符合要求，故此法不适合用于EPI-QC复方纳米粒包封率的测定。

3.2.2离心法

离心条件：4℃,45000r/min，离心30min，弃上清液，加入DMSO超声溶解底部沉淀，甲醇定容至10mL，HPLC测定含量。

3.3制备方法的筛选

3.3.1乳化溶剂蒸发法

此法制得的EPI-QC复方纳米粒外观为粉红色混悬液，室温放置一周能保持稳定。

3.3.2纳米沉淀法

此法制得的EPI-QC复方纳米粒外观为粉红色混悬液，室温放置几个小时后就有沉淀产生，制备过程中考察了水相稳定剂的种类和浓度，并没对沉淀产生的问题有所改善，也考察了注射器在液面下注入还是液面上注入的问题，发现液面下注入得到的纳米粒外观较好，但是由于液面下注入操作不便，方法重新性差。

乳化溶剂蒸发法制备的纳米粒在外观、稳定性和重复性三个方面都优于纳米沉淀法，本发明选择乳化溶剂蒸发法制备EPI-QC复方纳米粒。

3.4单因素实验考察

3.4.1稳定剂种类的筛选

实验结果见表1，图2。F-68作稳定剂制备出的纳米粒很不稳定，过夜就有沉淀产生，所以并没有进一步测定其粒径和包封率。PVA205和PVA403作稳定剂都能得到外观、稳定性、粒径和PDI都较好的纳米粒。但是PVA205作稳定剂制备的纳米粒包封率更高，本发明选择PVA205作稳定剂。

PVA（聚乙烯醇）外观为白色粉末，是一种用途相当广泛的水溶性高分子聚合物，具有合成方便、安全低毒、产品质量易于控制、价格便宜、使用方便等特点，是极有潜力的优良药用辅料。PVA系列均可以在95℃以下的热水中溶解，但由于聚合度、醇解度高低的不同，醇解方式等不同在溶解时间、温度上有一定的差异，溶解PVA205和PVA403时，可边搅拌边将本品缓缓加入水中，室温溶胀2h，而后升温到95℃左右加速溶解，并保温1.5h小时，直到溶液不再含有微小颗粒，备用。

表1不同稳定剂的筛选结果

3.4.2稳定剂浓度的筛选

表2PVA205不同浓度筛选结果

实验结果见表2,图3,PVA205需要达到一定浓度，纳米粒才可以稳定放置，浓度太小很快就有沉淀产生，采用2%或更大浓度时，很容易得到外观、稳定性、粒径和PDI都较好的纳米粒，但是当用量过大时，超声时形成的乳剂比较粘，在探头上粘附比较多，损失比较大，另外，旋转蒸发除去有机溶剂这一步很难控制真空度，非常容易起泡，制备工艺的重现性很差，而且EPI和QC的包封率很低，都没有到20%，本发明选择稳定剂PVA205的浓度为2%w/w。

3.4.3PLGA用量的筛选

表3PLGA用量筛选结果

实验结果见表3,图4,PLGA的用量对纳米粒外观影响并不大，都可以得到性状较好的纳米粒，随着PLGA用量的增加，两种药物的包封率都呈增加的趋势，其中EPI的趋势大于QC，可能是因为处方中EPI的投药量小于QC，投入更多的材料，药物更容易包裹于材料中或者吸附在材料表面。除40mg外，粒径和PDI呈上升趋势，但都小于220nm,考虑到包封率的影响，EPI用量为0.2mg、QC2mg的情况下，本发明选择PLGA的用量为100mg。

3.4.4有机相和水相体积比的筛选

表4有机相和水相体积比的筛选

实验结果如表4,图5,有机相与水的体积比在1:2-1:5都能够得到性状比较稳定的纳米粒，EPI的包封率相差不大，QC的包封率随着水相体积的增加而减小，考虑到水相体积太大，单位体积中药物含量太少，本发明选择有机相和水相的体积比为1:2。

3.4.5超声时间的筛选

探头超声时间为3min,5min和10min时，都可以得到30min内不分层的乳剂，考虑到超声时间过长可能会破坏原本已经形成的乳剂，本发明选择3min为超声时间。

4结论与讨论

4.1破膜溶剂的选择

本实验室HPLC是紫外检测器，关于纳米粒药物含量的测定，不能够直接用制剂进样，因为纳米粒带有乳光，直接进样测定会影响结果的准确性，需要选择一种破膜剂，既可以破坏溶解包载材料，还能够溶解药物，本实验中选择满足以上条件的DMSO作为破膜剂。

4.2EPI-QC复方纳米粒制备工艺研究

从可重复性、操作的简便性和制剂稳定性三个方面考虑，本发明选择乳化溶剂蒸发法作为制备纳米粒的方法，采用高速冷冻离心法测定其包封率和载药量，综合考察外观、稳定性、粒径、PDI以及包封率，结合细胞部分预实验确定其最适处方。

4.3处方和工艺确定

确定最佳处方为：PLGA 100mg，EPI和QC质量比为1:10，二氯甲烷：丙酮：乙醇=1:0.4:0.1，稳定剂为2%PVA205，有机相与水相体积比为1:2。

文献报道，乳化溶剂蒸发法中，单纯用一种有机溶剂无法得到最佳的工艺，因此实验中除了二氯甲烷外，往往加入一些与水互溶的有机溶剂。丙酮和乙醇具有极好的水溶性，能与水以任意比例互溶，与二氯甲烷混合使用制备W/O型乳液可以降低CH₂Cl₂/水的界面张力，增强乳液的稳定性，得到外观性状更好的纳米粒。本发明中，选择丙酮与乙醇的混合溶剂，也有助于两种模型药物溶解在有机相中。

在最初预实验的时候，也考察过二氯甲烷和丙酮的比例，发现两者比例为4:1的时候，过夜有沉淀产生，可能是丙酮量太少，影响了纳米粒的成型过程。

按上述处方制备三批EPI-QC复方纳米粒，外观均为粉红色悬浊液，稳定性好，测定其包封率和载药量如表5。

表5本发明复方纳米粒包封率和载药量

从表5可知，EPI-QC复方纳米粒中EPI的包封率和载药量分别为64.48±2.50%，RSD为3.88%，0.129±0.005%，RSD为3.67%；QC的包封率和载药量分别为44.83±2.15%，RSD为4.79%，0.897±0.043%，RSD为4.79%。此处方工艺重现性良好。

实施例3本发明EPI-QC复方纳米粒质量研究及其冻干工艺研究

对最终处方的EPI-QC复方纳米粒的形态、粒径分布和Zeta电位进行了考察，并且研究其冻干工艺。

1仪器和试药

1.1仪器

Malvern Zetasizer Nano ZS90激光粒度测定仪英国Malvern公司

pHS–4C型酸度计      成都方舟科技开发公司

ModulyoD冷冻干燥机   美国热电公司

1.2试剂

盐酸表阿霉素         济南伟都化工有限公司

槲皮素               成都超人植化有限公司惠赠

EPI-QC复方纳米粒     按实施例1的方法制备

乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2实验方法

2.1纳米粒外观性状

对EPI-QC复方纳米粒进行拍照，观察其外观性状。

2.2透射电镜下观察形态

取EPI-QC复方纳米粒适当稀释后，用2%的磷钨酸负染，自然风干后，用透射电子显微镜观察并拍照。

2.3粒径分布

粒径是评价纳米粒质量的重要指标，它影响其在人体内的循环和代谢，被动靶向中，粒径对于纳米粒在体内分布起到决定性作用，后续细胞实验中，要求过滤灭菌，因此我们需要严格控制粒径在220nm以下，并且分布比较均匀。取EPI-QC复方纳米粒稀释适当倍数后，激光粒度分析仪测定粒径分布。

2.4多分散系数（PDI）

PDI是评价粒径分布的一个重要指标。PDI数值越小，则粒子的粒径越趋向均一，数值越大，则粒径分布范围越宽，一般要求微粒系统的PDI＜0.3。

2.5Zeta电位

取EPI-QC复方纳米粒，测定其Zeta电位。

2.6含量测定

2.6.1色谱条件

2.6.2线性范围考察

精密称取盐酸表阿霉素10.00mg，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，得到100.0μg/mL的储备液，放置于4℃冰箱中保存。分别精密量取储备液2.0、1.0、0.2、0.1、0.05mL置10mL容量瓶中定容。分别进样测定，记录峰面积，用峰面积（A）对浓度（C）作线性回归，得到标准曲线回归方程，并绘制标准曲线。

精密称取槲皮素10.00mg，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，得到100.0μg/mL的储备液，放置于4℃冰箱中避光保存。分别精密量取储备液10.0、2.0、1.0、0.5、0.2mL置10mL容量瓶中定容。分别进样测定，记录峰面积，用峰面积（A）对浓度（C）作线性回归,得到标准曲线回归方程，并绘制标准曲线。

2.6.3专属性考察

取空白纳米粒和载药纳米粒各1mL，适当稀释后，进样10μL，记录色谱图。

2.6.4回收率考察

取空白纳米粒1mL，加入EPI和QC的标准液，分别制成高、中、低浓度的溶液，进样10μL，记录峰面积，计算回收率。

2.6.5包封率测定

按照下面公式计算包封率。

2.7冻干粉针处方（EPI0.2mg,QC2mg,PLGA100mg,甘露醇50mg，纳米粒按实施例1的方法制备）

2.7.1支架剂的选择

纳米粒呈混悬液，长期贮存可能会出现药物渗漏、相分离等物理和化学变化，对长期贮存不利，所以往往采用冷冻干燥的方法保存，保持它的物理化学稳定性，防止药物渗漏，增加其在贮存过程中的稳定性。

表6标准计分

冷冻干燥过程中，为了保护纳米粒不被破坏，往往加入一些低分子糖类作为冻干保护剂，有利于制剂的分散和稳定。本发明中，考察了不加支架剂，加入乳糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖和甘露醇作为支架剂，以冻干粉针的外观、色泽、再分散性以及分散之后的粒径和PDI为指标，平行实验三份，进行打分，确定支架剂的种类和比例。

以冻干之后纳米粒的外观、色泽和再分散性作为评价指标，评分标准如表6，同一得分以辅料用量少者为佳。

2.7.2冻干粉针质量评价

观察冻干后的EPI-QC复方纳米粒的外观、颜色和再分散性，重新分散后，比较冻干前后的包封率有无明显变化。

3实验结果

3.1纳米粒外观性状

EPI-QC复方纳米粒呈粉红色，有明显乳光。

3.2透射电镜下观察形态

透射电镜可以看出，EPI-QC复方纳米粒呈比较规则的球形，粒径较小，无明显团聚。

3.3粒径分布

测定三批EPI-QC复方纳米粒，平均粒径为141.1±2.89nm，PDI为0.05±0.02，粒径分布比较均匀。

3.4Zeta电位，见图6

Zeta电位如图6,测定三批EPI-QC复方纳米粒，平均电位为-0.33±0.38mV。

3.5含量测定

3.5.1色谱条件

EPI的色谱条件

色谱柱为：Aichrom Reliasil C18柱(150mm×4.6mm,5μm)；

流动相为：乙腈－水=32：68，用85%磷酸调节pH=2.4；

检测波长为：254nm；

流速为：1.0mL/min；

柱温为：40℃；

进样量为：10μL。

QC的色谱条件

色谱柱为：Aichrom Reliasil C18柱(150mm×4.6mm,5μm)；

流动相为：甲醇－0.04%磷酸=55：45；

检测波长为：372nm；

流速为：1.0mL/min；

柱温为：40℃；

进样量为：10μL。

数据处理后回归方程为A=24495C-2732.7，r=0.9999（n=5），表明盐酸表阿霉素在0.5-20μg/mL范围内线性关系良好，标准曲线数据见表7标准曲线，符合测定要求。

表7不同的表阿霉素盐酸浓度的峰面积

表8不同槲皮素浓度的峰面积

数据处理后回归方程为A=35088C-57004，r=0.9998(n=5)，表明槲皮素在2-100μg/mL范围内线性关系良好，标准曲线数据见表8，标准曲线符合测定要求。

3.5.3专属性

空白辅料对EPI-QC复方纳米粒中两种药物含量测定无干扰。

3.5.4回收率

表9不同浓度EPI-回收率（n=3）

表10不同浓度QC回收率（n=3）

EPI和QC的回收率见表10，结果表明，回收率都在95%-105%以上，符合测定要求。

3.5.5包封率

实验三批纳米粒，EPI和QC平均包封率分别为60.28，43.19。

3.6冻干粉针处方

3.6.1支架剂的选择

结果见表11

表11EPI-QC复方纳米粒支架剂的选择

测定复溶之后纳米粒的平均粒径和PDI，见表12。

表12复溶之后纳米粒的平均粒径和PDI

综合外观、色泽、再分散性、平均粒径和PDI得出结论：从外观上看，不加支架剂的冻干粉针外观很差，加入支架剂之后对外观有不同程度的改善，但是种类不同影响效果差别较大，其中以甘露醇最好，而且其用量没有太大影响；从复溶情况看，只有甘露醇能够在30秒内完全溶解，其它都有不同程度的小结块存在；从粒径和PDI看，冻干之后粒径都比冻干之前稍微有些偏大，但是PDI仍然较好，而且加不加支架剂并没有太大影响。结果表明，选用5%或者10%甘露醇作为支架剂都比较理想，本着节约成本方面的考虑，本发明选择5%甘露醇作为冻干支架剂。

3.6.2冻干粉针质量评价

3.6.2.1外观

肉眼观察冻干粉针，外观为粉红色、颜色均匀的细腻疏松块状物，无花斑和明显缺陷。

3.6.2.2再分散性

取上述冻干粉针，加入同体积的蒸馏水，轻轻振摇30s后，得到分散均匀的混悬液。

3.6.2.3包封率

表13本发明冻干粉针的包封率测定

包封率见表13.，冻干之后，包封率有所下降，但是变化范围不大4结论与讨论

4.1透射电镜下，EPI-QC复方纳米粒呈比较规则的球形，粒径大多小于150nm，这与激光粒度测定仪测出结果基本一致，PDI值很小，说明粒径比较均匀。

4.2实验中选择PLGA（聚乳酸乙醇酸）作为纳米粒载体材料，它是由乳酸和乙醇酸以不同比例嵌段共聚而成的高分子纳米材料，在国外已经获得批准，具有良好的生物相容性和降解性。PLGA包裹药物制备成纳米粒后，稳定性有可能会因各种因素而下降，从而造成药物的泄露，实验中采取冷冻干燥的办法来提高纳米制剂的稳定性，冷冻干燥是利用冷冻的溶液在低温低压条件下，从冻结状态不经过液态直接升华除去水分完成干燥，使药物保持原有的理化性质和生理活性，且提高药物包封率和减少有效成分的损失。本发明中选用5%甘露醇作为支架剂效果较理想，冻干后的粒径和PDI与冻干前相比无明显变化，包封率有所下降，但是变化范围不大，采用的冻干工艺制得的纳米粒符合要求。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明EPI-QC复方纳米粒逆转肿瘤细胞多药耐药的研究

本发明选择K562/A02为模型细胞，对EPI-QC复方纳米粒的体外细胞实验进行研究。

1仪器与试剂

1.1仪器

1.1.1细胞系

白血病细胞株K562及K562/A02细胞（耐药细胞株）：四川大学华西医院血液科实验室

正常肝细胞L02：四川大学国家重点实验室

1.1.2仪器和耗材

1.2试剂

1.3试剂的配制

1.3.1RPMI 1640完全培养基的配制

胎牛血清保存于-40℃低温冰箱中，使用前一天放置4℃冰箱使其完全溶解，摇匀之后56℃水浴30min灭活补体，按10%的浓度加入到RPMI1640培养基中，并加入100单位/mL的青霉素和链霉素，4℃冰箱保存。

1.3.2DMEM完全培养基的配制

配制方法同上。

1.3.3消化液的配制

分别称取250mg胰蛋白酶、20mgEDTA溶于一定量的PBS中，反复搅拌直至完全溶解，将上述溶液混合后定容到100mL，配制成胰蛋白酶浓度为0.25%，EDTA浓度为0.02%的细胞消化液，过滤灭菌后4℃冰箱保存。

1.3.4MTT的配制

称取100mg MTT溶于20mL PBS中，涡旋使其完全溶解，得到浓度为5mg/mL的MTT试剂，过滤灭菌后4℃冰箱保存。

1.3.5PBS的配制

称取氯化钠4g，氯化钾0.1g，磷酸氢二钠0.78g，磷酸二氢钾0.1g，加蒸馏水至500ml调pH值为7.2，高压灭菌，4℃密封保存。

2实验方法

2.1细胞培养

2.1.1细胞复苏

从液氮容器中取出K562、K562/A02和L02细胞冻存管，迅速放入盛有37℃水浴装置中，反复振摇使其快速融化，用酒精棉球擦拭冻存管表面，吸出细胞悬液，转移到离心管中，1000rpm离心5min弃上清液，补加一定量的完全培养基，吹打重新悬浮细胞，移入培养瓶中，置37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。

2.1.2细胞冻存

选择处于对数生长期的细胞，冻存前一天换液一次，L02用细胞消化液消化后得到细胞悬液，K562和K562/A02吹打几次得到细胞悬液，加入一定量含10%DMSO的完全培养基，分装在事先灭菌的冻存管中，每管1.5mL细胞悬液，-40℃放置两个小时，用纱布裹好，做好标记，然后移入液氮罐表面30min后整个浸没在液氮罐中。

2.1.3K562和K562/A02细胞的培养

K562细胞接种于含10%胎牛血清的1640培养基的细胞培养瓶，培养基中加入青、链霉素浓度为100单位/mL的双抗，置37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，K562为半贴壁细胞，传代之前需要摇晃培养瓶，轻轻吹打细胞团使之分散，每2天换液一次并传代。K562/A02细胞接种于含10%胎牛血清的1640培养基的细胞培养瓶，培养基中加入青、链霉素终浓度为100μg/mL的双抗，另外加入终浓度为0.8μg/mL的盐酸阿霉素以维持其耐药性，实验前两周用无药培养基培养，取对数生长期的细胞用于实验。

2.1.4L02细胞的培养

L02细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶，培养基中加入青、链霉素终浓度为100单位/mL的双抗，置37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，3-4天传代。传代方法为：倒掉旧的培养基，用PBS从细胞对面的瓶壁上润洗两次，弃之，加入消化液大约1mL，使之铺满瓶壁，放入37℃度培养箱中，1min后拿出在显微镜下观察，消化成单个细胞就可以了，注意消化时间不要太长，然后倒掉消化液，加入培养基，吹打即可。

2.2细胞形态观察

细胞培养瓶置于倒置显微镜下，观察三种细胞的形态。

2.3K562/A02细胞耐药倍数的测定

2.3.1细胞计数

观察细胞，对数期生长的K562/A02那个培养瓶，吹打过后进行细胞计数，将少许细胞悬液吸出沿盖玻片边缘自然渗入，使悬液充满盖玻片和计数板之间，不要留有气泡，亦不要外泄；静置，显微镜下观察计数板四角大方格和中央大方格中细胞数，细胞压中线时，一般遵循：记左不记右，记上不记下的原则。

将计数结果代入下式计算：

4大格细胞总数/4×10⁴×稀释倍数=细胞数/mL

2.3.2K562/A02细胞耐药倍数的测定

查阅文献和预实验的基础上，确定K562和K562/A02两种细胞接种到96孔板的细胞数均为1×10⁵个/mL比较合适。取对数生长期的细胞，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基后吹打混匀，进行细胞计数，适当稀释使其细胞浓度为1×10⁵个/mL。取96孔板，每孔加入20μLEPI溶液，K562细胞中EPI浓度按照0.04、0.2、0.4、2、4、20和40μg/mL设置7个浓度，K562/A02细胞中EPI按照0.4、2、4、20、40、80和160μg/mL设置7个浓度，再加入细胞悬液100μl，设置空白凋零孔（只加入培养基）和正常对照孔（只加入细胞悬液），每个浓度设置6个复孔，96孔板中36个四周边孔不用，加入灭菌PBS饱和水分。将其置于37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，48小时后，1000rpm离心5min弃上清液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液，4小时后，1000rpm离心5min弃上清液，最后加入DMSO使甲臜颗粒充分溶解后，10min后在570nm酶标仪测量其吸收值，并根据光吸收值计算不同浓度EPI对细胞的抑制率。

细胞抑制率（%）=[1-（实验组OD-空白凋零组OD）/(正常对照组OD-空白凋零组OD)]×100%

每种浓度可以得到六个数值，取其平均值作为最终数值。用SPSS17.0软件统计得到K562和K562/A02的IC₅₀值，IC₅₀为抑制细胞生长达到50%时的药物浓度，根据下面公式计算细胞耐药倍数。实验重复三次，取平均值为最终结果。

耐药倍数=耐药细胞IC₅₀/敏感细胞IC₅₀

2.4逆转剂浓度的确定

称取QC0.3778g，溶于5mL DMSO中，涡旋混匀，得到250mmol/L的槲皮素储备液，用培养基适当稀释配制成75μmol/L、40μmol/L、20μmol/L和10μmol/L。取对数生长期的K562/A02细胞，1000r/min离心5分钟后，弃上清液，加入新鲜培养基后吹打混匀，进行细胞计数，适当稀释使其细胞浓度为1×10⁵个。取96孔板，每孔加入20μLQC溶液，按照10、20、40和75μmol/L设置4个浓度，其余操作同上，并根据光吸收值计算不同浓度QC对细胞的抑制率。

2.5测定逆转倍数

取96孔板，每孔加入20μLEPI溶液，EPI按照0.4、2、4、20、40、80和160μg/mL设置7个浓度，每孔再加入40μmol/LQC溶液和100μL K562/A02细胞悬液，其余操作同上，SPSS17.0统计逆转后的IC₅₀，按下面公式计算逆转倍数。

逆转倍数（RI）=不加逆转剂IC₅₀/加逆转剂IC₅₀

2.6游离药物及其纳米粒对L02的毒性研究

取对数生长期的L02细胞，消化后进行细胞计数，在预实验的基础上，确定96孔板中接种数为5×10⁴。取96孔板，每孔加入20μL不同试剂，分别为EPI，QC、EPI和QC混合物、空白纳米粒和EPI-QC复方纳米粒，再加入细胞悬液100μL，设置空白凋零孔（只加入培养基）和正常对照孔（只加入细胞悬液），每个浓度设置6个复孔，在570nm酶标仪测量其吸收值，并根据光吸收值计算对L02细胞的抑制率。

2.7游离药物及其纳米粒对K562/A02的抑制作用研究

取对数生长期的K562/A02细胞，每孔加入20μL不同试剂，分别为EPI，QC、EPI和QC混合物、空白纳米粒和EPI-QC复方纳米粒再加入细胞悬液100μL，设置空白凋零孔（只加入培养基）和正常对照孔（只加入细胞悬液），每个浓度设置6个复孔，在570nm酶标仪测量其吸收值，并根据光吸收值计算对K562/A02细胞的抑制率。

3结果

3.1K562和K562/A02细胞形态学的观察。

倒置显微镜下，K562和K562/A02两种细胞呈现比较规则的圆形，轮廓清晰，清亮。

（图7、8）。

3.2L02细胞形态学的观察。

倒置显微镜下，未贴壁的细胞保持比较规则的圆形，轮廓清楚，几个小时后开始向四周伸展，慢慢铺满瓶壁，呈多角形，大小比较均匀。

（图9）。

倒置显微镜下，未贴壁的细胞保持比较规则的圆形，轮廓清楚，几个小时后开始向四周伸展，慢慢铺满瓶壁，呈多角形，大小比较均匀。

3.3K562/A02细胞耐药倍数的测定结果

3.3.1EPI对K562细胞增殖的影响

不同浓度EPI对处理K562细胞48h后，随着EPI浓度的增加，细胞抑制率也呈上升趋势，SPSS17.0统计IC50值为1.898。

表14EPI对K562细胞增殖的影响(n=3)

3.3.2EPI对K562/A02细胞增殖的影响

不同浓度EPI对处理K562/A02细胞48h后，随着EPI浓度的增加，细胞抑制率也呈上升趋势，SPSS17.0统计IC50值为56.585。

表15EPI对K562/A02细胞增殖的影响(n=3)

3.3.3K562/A02细胞耐药倍数的测定

表16K562/A02细胞耐药倍数的测定

3.4逆转剂浓度的确定

槲皮素浓度为10μmol/L和20μmol/L时，抑制率为负数，表明槲皮素在低浓度时促进了细胞的生长，槲皮素浓度为40μmol/L和75μmol/L时，抑制率分别为3.75%和23.3%，确定对细胞基本无毒的40μmol/L为逆转剂浓度。

3.5测定逆转倍数

表17EPI and EPI-QC对K562/A02的影响(n=3)

表18EPI and EPI-QC对K562/A02细胞毒性的影响

K562/A02的IC₅₀为56.585，与40μmol/LQC联用后，IC₅₀有所下降，为7.237，逆转倍数为7.81倍。结果表明，QC对K562/A02的多药耐药有一定的逆转作用。

3.6游离药物及其纳米粒对L02的毒性研究

表19游离药物及其纳米粒对L02的毒性研究(n=3)

结果见表19，空白纳米粒对正常肝细胞L02的生长没有抑制作用，说明载药纳米粒给药时，其载体材料本身对正常肝细胞并没有毒性。两种药物联用后，对细胞的毒性显著增加，而制备成复方纳米粒后，毒性有所下降，由此可见，制备复方纳米粒以降低其对正常肝细胞的毒性是有必要的。

3.7游离药物及其纳米粒对K562/A02的抑制作用研究

结果见表20，单独使用EPI和QC时对耐药细胞几乎没有抑制作用，EPI和QC联合使用时，有明显抑制作用产生，说明QC确实可以一定程度逆转K562/A02对EPI的耐药作用，联用后，减少抗肿瘤药物剂量可以达到抑制肿瘤细胞的作用。将之制备成复方纳米粒后，抑制作用与游离药物联用相比，并没有显著差异，结合上面实验结果，制备成纳米制剂之后可以降低药物对正常肝细胞的毒性，说明将抗肿瘤药物和逆转剂同时包裹在纳米粒中是有现实意义的。

表20游离药物及其纳米粒对K562/A02的抑制作用(n=3)

4结论与讨论

4.1血清从-40℃取出的时候最好先放到4℃冰箱过夜解冻，不要放到37℃解冻或者56℃直接灭活，这样血清中会出现沉淀，影响其活性，灭活时间不要过长，否则会严重影响血清活性。

4.2细胞复苏这一步一定要迅速，因为冻存液多用含DMSO的培养基，常温时对细胞有害，取出液氮罐之后应立即置于37℃水浴中使其溶解，时间最好控制在1-2min内，通常会调整温度到40℃来加快它的溶解。

4.3K562/A02是对K562长期诱导和筛选得到的良好细胞系，为人原性的，不仅对其诱导药物阿霉素有很强的耐药性，对具有其它化学结构和临床药理作用的抗肿瘤药物也有不同程度的交叉耐药性。

K562/02细胞系在有药条件下培养传六十代生长良好，在无药条件下传20代之后，耐药性也可以基本维持。

本发明所选模型药物表阿霉素为阿霉素的光学异构体，在临床应用上，用于治疗白血病效果比较显著，所以本发明选择K562/A02细胞系来研究肿瘤细胞多药耐药。

4.4MTT是一种黄颜色的染料，全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，其检测细胞存活的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积于细胞内或细胞周围，而死细胞无此功能，形成甲臜的量与细胞活化的程度成正比，通过适当溶剂溶解甲臜后，用酶标仪测溶液的光密度就可以判断活细胞数。最早用于溶解甲臜的溶剂为盐酸异丙醇，振荡溶解结晶后有时会发现溶液中有白色的絮状悬浮物出现，可能是由于细胞密度过大，裂解不完全造成的，后来用于溶解甲臜的溶剂多为DMSO和三联液，三联液的成分为10%SDS-5%异丁醇-0.012mol/L HCL(w/v/v)，它的优点是可以避免因为吸出前面加入的培养基和MTT等繁琐步骤带来的误差，同时也为悬浮细胞的测定提供一种思路。

本发明选择的逆转剂槲皮素由于其可与MTT反应，直接把MTT还原而严重干扰测定结果，K562和K562/A02均为悬浮细胞，所以在加入MTT之前必须离心去除前面加入的培养基，又考虑到三联液中SDS要与槲皮素反应，故不选择三联液溶解甲臜，最后实验方案定为离心去除上清液之后加入DMSO溶解甲臜，然后测定光密度。

4.5MDR的产生是多种基因产物共同作用的结果，参与多药耐药发生的因素很多，其中P-gp是最典型的泵。细胞过度表达P-gp会引起广泛的耐药，临床发现，血液系统肿瘤、淋巴瘤以及骨髓瘤在诊断的初期因为P-gp低表达而且对化疗敏感，初次化疗可达到治疗效果，但是在复发后P-gp表达出现上调，产生多药耐药。

本发明将EPI和QC同时包裹于纳米材料中考察其对正常肝细胞L02和白血病耐药细胞K562/A02的抑制作用，结果表明，40μmol/L的QC可以一定程度逆转白血病耐药细胞K562/A02对EPI的耐药性，降低其IC₅₀，制备成EPI-QC复方纳米粒之后的逆转作用与游离药物联用相比没有显著性差异，但是对正常肝细胞L02的毒性降低，说明将抗肿瘤药物和逆转剂制成复方纳米制剂具有重要的现实意义。

Claims (15)

1.表阿霉素与槲皮素制备抗肿瘤的联合用药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：0.1-10:1-100。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：1︰10。

4.一种抗肿瘤联合用药物，其特征在于：它包含不同规格的单位制剂，用于同时、分别或依次给药的表阿霉素与槲皮素，及药学上可接受的载体制备成的制剂。

5.根据权利要求4所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：0.1-10:1-100。

6.根据权利要求5所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的表阿霉素与槲皮素的重量配比为：1︰10。

7.根据权利要求4-6任意一项所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：它是由表阿霉素、槲皮素为活性成分，制备成纳米粒，再加入冻干辅料支架剂，冷冻干燥，制备成冻干粉针；所述的纳米粒是含有下述重量配比的原料及辅料制备而成：

表阿霉素0.1-10份、槲皮素1-90份、PLGA 10-100份、稳定剂2-20份；其中，所述的稳定剂为F-68、PVA205、PVA403。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的纳米粒是含有下述重量配比的原料及辅料制备而成：

表阿霉素0.2份、槲皮素2份、PLGA 100份、PVA2055份。

9.根据权利要求7或8所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的纳米粒的粒径小于220nm；平均电位为-0.33±0.38mV。

10.根据权利要求9所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的纳米粒的平均粒径为141.1±2.89nm。

11.根据权利要求7-10任意一项所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的纳米粒的制备方法为：

a、称取原料及辅料：

b、将表阿霉素溶解于95%乙醇溶液中，槲皮素溶解于丙酮溶液中；

c、将PLGA与b步骤的乙醇溶液、丙酮溶液混合，加入二氯甲烷；混合后与含0.5-5%w/vPVA205的水相混合，其中，有机相和水相的体积比为：1︰2-5，探头超声3-10min，制备成初乳；

d、将c步骤的初乳经减压旋转蒸干溶剂，得本发明纳米粒。

12.根据权利要求11所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：b步骤中表阿霉素溶解于95%乙醇溶液的浓度为0.5-1.5mg/ml；槲皮素溶解于丙酮溶液的浓度为5-15mg/ml；c步骤中二氯甲烷︰丙酮︰乙醇的体积比为：1︰0.4︰0.1；c步骤所述的探头超声条件为：200W功率探头超声3min；c步骤所述的水相中含2%w/w PVA205；有机相和水相的体积比为：1︰2；d步骤所述的减压旋转条件为：25℃、50r/min条件下，旋转蒸发仪减压旋转40min。

13.根据权利要求7所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的冻干辅料支架剂为甘露醇、注射用乳糖、注射用葡萄糖、右旋糖酐、蔗糖、山梨醇、氯化钠、甘氨酸钠、磷酸二氢钠、氨基乙酸中的一种。

14.根据权利要求13所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的冻干辅料支架剂为甘露醇。

15.一种制备权利要求7-14任意一项所述的抗肿瘤联合用药物的方法，它包括如下步骤：

①称取原料及辅料：

②将表阿霉素溶解于浓度为95%乙醇溶液中，槲皮素溶解于丙酮溶液中；

③将PLGA与b步骤的乙醇溶液、丙酮溶液混合，加入二氯甲烷；混合后与含PVA205的水相混合，探头超声，制备成初乳；

④将步骤③中的初乳经减压旋转蒸干溶剂，得本发明纳米粒；

⑤将步骤④中的纳米粒，加入蒸馏水溶解，再加入溶剂重量2%-10%的冻干辅料支架剂，-50℃冷冻干燥，得冻干粉针。

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