CN102232927A - 长春新碱-peg-plga嵌段共聚物纳米粒及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒，将长春新碱包载于PEG-PLGA嵌段共聚物中，还提供了采用乳化-溶剂蒸发法等方法制备上述纳米粒的方法，以及该纳米粒在制备抗癌药物中的用途。本发明提供的纳米粒可以有效增加药物的溶解度；避免突释及不完全释放现象，使药物达到缓释的作用；降低RES对其的识别与吞噬，实现药物在网状内皮系统以外的组织、器官的靶向释放；降低毒副作用，增加生物相容性，延长药物在血液循环中的时间；增加患者的顺应性。

Description

长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒、制备方法和应用。

背景技术

白血病是目前最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命健康。目前治疗方法虽有化学治疗、放射治疗、骨髓移植和支持疗法等多种，但抗肿瘤药物治疗仍为最有效疗法。目前应用最广泛的有五大类：抗代谢药、抗肿瘤抗生素类、烷化剂类、植物成分类及其他类，相应的药物有甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春地辛和L-门冬酰胺酶等[1]。其中大多数由于特异性较差、常规治疗剂量即可对正常组织器官产生显著的毒副作用、患者不能耐受且价格昂贵，临床使用受到了一定的限制。

长春新碱于20世纪60年代开始应用于临床，用于肿瘤治疗已有30多年，具有使细胞分裂(有丝分裂)在中期停止的作用。可用于治疗急性淋巴细胞性白血病，疗效较好，对其他急性白血病、何杰金氏病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和乳腺癌也有疗效[2]。其游离形式极不稳定，故采用其硫酸盐的形式。临床应用的硫酸长春新碱为注射剂，存在着药物半衰期短、代谢快、神经系统和胃肠道毒性强等缺点。因此开发具有长循环、缓释作用和靶向性的新载药系统势在必行。

近年来，各种可控的载药系统被研发，它们可以增加药物的溶解度、降低毒副作用，比如聚合物纳米微球[3]、脂质体[4]、胶束[5]、乳剂[6]、环糊精[7]和前体药物[8]等。其中，脂质体[9]和聚合物纳米微球[10]吸引了众多目光，它们是两种临床认可的产品。脂质体将药物粉末或溶液包埋在纳米级的微粒中，具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。盐酸多柔比星脂质体是1995年第一个FDA认证的治疗AIDS和Kaposi’s sarcoma的脂质体药物[11-13]。但是它有如下缺点：包囊疏水药物效率低、药物突释、制备程序复杂且降解物有毒性。

目前，粒径为100纳米尺度的可生物降解的聚合物纳米粒已成为学术和产业研究的热点，它已经越来越显示其显著疗效[14-16]。嵌段共聚物纳米粒是由具有亲水性片段和疏水性片段的两亲性嵌段共聚物在水溶液中自发形成的一种自组装结构，具有粒径小(一般小于100mn)、粒度分布窄、载药范围广、结构稳定、体内滞留时间长、可降解、载药量高和独特的体内分布等特点[17-19]。最常用的就是脂肪族聚脂类poly(d，l-lactic-co-glycolicacid)(PLGA)[20-21]。它在体内降解成乳酸和羟基乙酸，最终代谢成水和二氧化碳，无毒性、无免疫原性，已被美国FDA批准应用于临床研究[22]。不过其释药速度难尽人意。比如说，紫杉醇从PLGA微球中释放速度慢，3个月才只有50％药物的释放量。这是因为药物和PLGA都是疏水性的[23]。为了控制药物释放，可以使聚合物混合或使用不同的添加剂[24-25]。例如，结构中包括至少两种不同族群的二聚体和三聚体，既有疏水性又有亲水性，这种结构在控制药物释放中已赢得越来越多的关注。其中PLGA-PEG显示了很好的特性[26]。聚乙二醇(PEG)的加入，会抑制血清蛋白的吸附，降低细胞识别的程度[27]，改进载药系统的生物相容性[28]，同时有效减少免疫源性和毒性。综合来说，制备足够小的PEG-PLGA载体，能够在毛细血管中自由循环，保护药物不被降解；具有较长的血液半衰期来持续释放药物；降低治疗癌症药物的毒副作用；有更好的药物代谢分布；同时能避免反复注射以增加患者的顺应性。

长春新碱(VCR)为广谱抗肿瘤药，于20世纪60年代开始应用于临床，是目前治疗恶性肿瘤最重要的药物之一。VCR通过作用于肿瘤细胞微管蛋白而干扰肿瘤细胞代谢，临床上主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、何杰金及非何杰金淋巴瘤，也用于乳腺癌、骨髓瘤、支气管肺癌、软组织肉瘤及神经母细胞瘤等，但由于具有较大的与剂量累积高度相关的神经系统毒性和局部组织刺激性，因而限制了其在临床上的应用[29]。

脂质体是由磷脂和胆固醇构成的具有脂质双分子层结构的微型泡囊，不少研究者用它来降低长春新碱的神经毒性。卢懿等[30，31]采用薄膜-超声分散法制备VCR脂质体，平均粒径为63nm，包封率为59％；以VCR注射液为对照，VCR脂质体使VCR在血液中滞留时间延长了12倍，大鼠淋巴中靶向指数增加了2.75倍。脂质体可良好地载带VCR透过皮肤进入体循环，具有较好的淋巴靶向性。脂质体是研究最多的一种纳米制剂，虽已进入临床研究多年，但脂质体的稳定性一直未能很好地解决。在贮存过程中，药物快速从脂质体中泄漏，最终未被批准用于临床治疗[32]。

白血病患者大都存在不同程度的贫血，需要输血进行纠正。红细胞被用作化疗药物载体，并给予一定导向，可在完成输血的同时达到抗肿瘤的目的。吴江等[17，18]采用改良低渗预膨胀技术制备VCR载体红细胞，并将VCR载体红细胞与细胞株K562共培养，VCR载体红细胞可明显抑制K562细胞增殖并促其凋亡，且该作用随剂量增高而加强，与VCR原药作用效果一致。如果进一步开发可用于临床，这不仅可减轻患者的痛苦，还能减轻患者的经济负担[33]。

林宏英等[34]首次利用聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)聚合物胶束作为载体制备了包载VCR的PEG-PE胶束，对其理化性质和体外抗肿瘤活性进行研究。VCR胶束粒度分布窄而均一，平均粒径在(11.1±0.1)nm；能有效包载VCR；体外释放和耐稀释试验结果表明，VCR胶束在HBS和血清(pH7.0)两种释放介质中稳定；制得的VCR纳米胶束具有良好的稳定性、较高的包封率并显著提高VCR的抗肿瘤活性，表明PEG-PE胶束将是一个潜在的VCR高效输送载体。

另外有学者用碘化油、微球、隐形脂质体和微乳作为VCR载体。但这些载药方法在不同方面存在不足，要走向临床还有一段路要走。

目前，在广泛应用于药物释放体系的众多聚合物材料中，生物可降解的嵌段共聚物有许多独特的优点：1、纳米粒、微球等体系表面的破坏会导致药物突释或不完全释放，引入两亲性的嵌段共聚物后，可修饰系统，避免突释及不完全释放现象；2、胶体靶向载体系统存在的主要问题在于被网状内皮吞噬系统(RES)非特异性吸收，引入嵌段共聚物，可降低RES对其识别与吞噬，实现药物在网状内皮系统以外的组织、器官的靶向释放；3、通过改变共聚物性质如嵌段比例、嵌段长度等调控药物释放速率，设计药物释放时间，满足短期和长期治疗等用途的要求；4、嵌段共聚物由疏水性片段与亲水性片段嵌合而成，其亲水性可提高难溶性药物的溶解度，疏水性可提高疏水性药物的包封率及细胞膜脂质双分子层对药物的通透性；5、能在体内降解为无毒性的单体，有很好的生物相容性，可保证机体的安全[35]。已有研究者制备载阿霉素的PEG-PLGA嵌段共聚物，能够有效地被细胞吸收，且对HepG2细胞的细胞毒性高于阿霉素原料药[36]。PEG-PLGA嵌段共聚物的降解时间长，见表1。

表1PEG-PLGA的体外降解时间

共聚物PEG-PLGA	特性黏度(dL/g)	晶体转化温度(℃)	玻璃转化问题(℃)	释放时间(周)
					50/50	0.05-0.15	无定形	45-50	1-2
50/50	0.15-0.25	无定形	45-50	2-4
					50/50	0.25-0.55	无定形	45-50	3-4
50/50	0.55-0.75	无定形	45-50	1-2
					65/35	0.55-0.75	无定形	45-50	3-4
75/25	0.55-0.75	无定形	50-55	4-5
					85/15	0.55-0.75	无定形	50-55	5-6

发明内容

为了降低长春新碱注射剂对患者的神经毒性作用、增加患者的顺应性，本发明提供的技术方案为：一种长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒，将长春新碱包载于PEG-PLGA中制备纳米粒。

本发明提供的长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒，其中长春新碱和PEG-PLGA两者的配比如下：

长春新碱：PEG-PLGA嵌段共聚物＝1∶10～1∶1000其中，PEG-PLGA采用有机溶剂溶解使其浓度为10-100mg/ml。有机溶剂可以是二氯甲烷、丙酮或两者的混合物。

PEG-PLGA的浓度在制剂时时一个很重要的参数，因为若其浓度大于100mg/ml制得的纳米粒的粒径过大，若其浓度小于10mg/ml，则载药量和包封率过低，均无法应用，因此需控制其浓度在合理范围。

通常，长春新碱为硫酸长春新碱。

制备PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒可采用乳化溶剂挥发法、沉淀法、超声法、固体分散-水化法、溶剂蒸发-固体熔融分散法、薄膜分散法、溶剂蒸发法等，以PVA或F68为表面活性剂。

本发明技术方案提供的PEG-PLGA载长春新碱嵌段共聚物，可以减少突释及不完全释放现象，并使药物达到缓释的作用。由于共聚物纳米粒的粒径较小，可降低RES对其的识别与吞噬，实现药物在网状内皮系统以外的组织、器官的靶向释放；降低毒副作用，增加生物相容性，延长药物在血液循环中的时间，增加患者的顺应性。

附图说明

图1PEG-PLGA载硫酸长春新碱纳米粒的扫描电镜图；

图2PEG-PLGA载长春新碱纳米粒的粒径分布图；

图3VCR嵌段共聚物纳米粒的体外释放曲线。

具体实施方式

本发明长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒，是将长春新碱包载于PEG-PLGA中制备而得。

其中，长春新碱采用其硫酸盐-硫酸长春新碱(VCR)。

长春新碱和PEG-PLGA两者的配比如下：

长春新碱：PEG-PLGA嵌段共聚物＝1∶10～1∶1000。

制备PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒可采用乳化溶剂挥发法、沉淀法、超声法、固体分散-水化法、溶剂蒸发-固体熔融分散法、薄膜分散法、溶剂蒸发法等。

如：

1.乳化溶剂挥发法采用单乳法

将PEG-PLGA嵌段共聚物加到含有模型药物的二氯甲烷和丙酮的混合有机溶剂中构成油相，将此油相加到乳化剂和去离子水所构成的水相中，超声乳化，挥发有机溶剂，即得：其中，二氯甲烷/丙酮体积比为1/3-3，O/W体积比为1/2-1/10。

2.乳化溶剂挥发法采用复乳法

取PEG-PLGA适量，溶于二氯甲烷和丙酮的混合溶液中，超声溶解。加入药物的内水相溶液，探头超声，形成油包水初乳(W/O)，再将初乳加入大量的表面活性剂溶液中，探头超声，形成复乳(W/O/W)，37℃旋转蒸发挥去有机溶剂，即得。其中，所述二氯甲烷/丙酮体积比为1/3-3，内水相/油相体积比为1/5-1/20，外水相/油相体积比为2-8。

3.沉淀法

取PEG-PLGA适量，溶于丙酮溶液中，加入药物，混匀。在搅拌条件下，缓慢滴入一定浓度表面活性剂溶液中，37℃旋转蒸发或室温搅拌挥去有机溶剂，即得。其中，丙酮/水相体积比为1/3-1/10。

聚合物胶束的制备有多种，可以根据聚合物和药物的性质选择合适的制备方法。例如：如果聚合物在水中能够分散，则可以采用熔融自分散法、自乳化溶剂蒸发法；如果不易分散到水中时，则需采用渗析的方法。

在上述方法中，所采用的PEG-PLGA载体材料可以购买商品化的，也可以自行合成，其分子量：5000-50000，PLGA比例为25/75-75/25。

上述制备方法都是已知技术。乳化法较为通用，制作效果好。

用上述方法制备的纳米粒进行粒径、体外释放测量，结果见图1-3。

从图1中可以看出所有粒子均为规整球形，且大小均一，粒径100nm以内，比光散射测定结果略小，这可能是因为电镜制样过程中染色剂的加入使壳层PEG链段收缩与塌陷造成的。

图2是用动态激光光散射测定的PEG-PLGA长春新碱纳米粒的粒径分布，从图中可以看出基本上呈窄峰分布，粒径集中在100-200nm之间。

图3是对比了长春新碱以及本发明提供的PEG-PLGA长春新碱纳米粒在体外释放曲线。从图中可以知道，本发明提供的PEG-PLGA长春新碱纳米粒比长春新碱的缓释时间延长明显，共聚物中VCR在20d释放完全，对照溶液中游离VCR在6d释放完全。

通过上述方法制备而得的长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒可用于制备为冻干制剂等制剂应用。

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Claims (7)

1.一种长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚物纳米粒，其特征在于，将长春新碱包载于PEG-PLGA嵌段共聚物中，其中，按质量比长春新碱∶PEG-PLGA嵌段共聚物＝1∶10～1∶1000。

2.根据权利要求1所述的长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚纳米粒，其特征在于，所述PEG-PLGA中PEG(Mn＝2000)∶PLGA(Mn＝1.5万、3.5万、3.8万，50∶50)。

3.根据权利要求1或2所述的长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚纳米粒，其特征在于PEG-PLGA嵌段共聚物溶液的浓度为10-100mg/ml。

4.权利要求1-2所述的长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚纳米粒的制备方法，其特征在于，将PEG-PLGA嵌段共聚物溶解于二氯甲烷和丙酮的混合有机溶剂中构成油相，加入长春新碱的内水相溶液，探头超声，使其形成W/O的初乳，将此初乳加入到含有一定浓度乳化剂的外水相溶液中，探头超声，形成W/O/W的复乳，挥发有机溶剂，即得；其中，所述二氯甲烷/丙酮体积比为1/3-3，内水相/油相的体积比为1/5-1/20，外水相/油相体积比为2-8。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述乳化剂是PVA，F68。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述PEG-PLGA嵌段共聚物溶液浓度为10-100mg/ml。

7.权利要求1-3所述长春新碱-PEG-PLGA嵌段共聚纳米粒在制备抗癌药物中的用途。

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