CN112089704B - 一种仿生纳米载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仿生纳米载体及其制备方法和应用，属于药物制剂技术领域。所述仿生纳米载体以包载化疗药物的阳离子纳米粒作为内核，在阳离子纳米粒表面包覆有免疫细胞膜和肿瘤细胞膜组成的杂化细胞膜作为外壳。本发明的仿生纳米载体具有靶向性高，摄取能力强，能够增强抗肿瘤疗效，为个体化和精准治疗提供了新的思路，具有较高的临床实践意义。

Description

一种仿生纳米载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种免疫细胞和肿瘤细胞包被的载药阳离子仿生纳米载体及其在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用。
背景技术
目前，已有许多纳米粒作为肿瘤药物递送系统被研究开发，其中一些已被批准用于临床使用，而大部分仍处于临床试验的不同阶段。这是因为纳米粒的肿瘤靶向效率低，尤其是化疗药物带来全身性毒副反应，加重了患者的身体、心理负担。纳米粒在靶向药物递送中的效率很大程度上取决于血液循环时间，积累和穿透肿瘤组织的潜力以及最终的细胞内化效率，单核吞噬系统（由血液单核细胞、树突状细胞和组织驻留巨噬/单核细胞组成）是纳米粒被静脉注射进入体内的第一个障碍，单核巨噬系统将外来纳米药物内在化，导致在肿瘤部位的积累不足，折损了抗肿瘤药物的递送效率，降低癌症治疗的疗效。
近些年的研究表明，仿生纳米载体不仅可以通过将纳米粒进行伪装避开免疫系统的识别[Green J.J,et al.Nature,2016.540(7633):386-394]，还可以高效靶向肿瘤并渗透到肿瘤组织内部，显著抑制癌症的转移，为抗肿瘤转移提供了一种新策略。在众多仿生材料中，细胞膜是一种可赋予纳米粒独特生物学性质的材料，通过将细胞膜融合于纳米粒表面，可使纳米粒具备原细胞复杂而独特的表面理化性质[Kroll A.V,BioconjugChem.2017.28(1):23-32；Tan S,Theranostics,2015. 5(8):863-81]。根据给药目的及用途，细胞膜仿生纳米粒中的细胞膜可采用红细胞膜[Gao M,Adv Mater.2017.29(35)；Rao L,Acs Nano,2017.11(4):3496-3505]、白细胞膜[Cho N.H,etal.NatNanotechnol.2011.6(10):675-82]、肿瘤细胞膜[Chen Z,et al.ACS Nano.2016.10(11):10049-10057]、血小板膜[Dehaini D,et al.Adv Mater,2017.29(16)]等；而纳米粒内核可采用PLGA[Hu C.M,et al.Proc Natl Acad Sci U S A,2011.108(27):10980-5]、明胶[LiL.L,et al.ACS Nano,2014. 8(5):4975-83]等。通过这一策略，细胞膜的结构与功能，尤其是细胞膜表面的特异性功能蛋白得以保留；而合成的纳米粒作为核心，不但可以起到支撑作用，还可以荷载药物或进行结构修饰。这些细胞膜仿生纳米粒在纳米医学和药学领域表现出极大的发展潜力，拥有着广阔的应用空间。
CN107929262A公开了一种乙二胺阳离子化白蛋白抗肿瘤纳米粒，该纳米粒包括乙二胺阳离子化白蛋白和至少一种抗肿瘤活性物质，所述乙二胺阳离子化白蛋白作为所述抗肿瘤活性物质的载体。该纳米粒注射入体内后，阳离子化白蛋白会与肾小球基底膜上阴离子部位结合而引发自身免疫性疾病，导致抗阳离子白蛋白免疫球蛋白lgG1的产生和沉积，最终引发人膜性肾病。同时，该纳米粒的血液循环时间短，几乎没有缓释作用。
因此，研制一种既能注射到体内后具有长循环，在肿瘤部位最大化积累，同时又能具有深层渗透和内化作用的抗肿瘤制剂成为肿瘤靶向纳米制剂领域的难题和热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫细胞和肿瘤细胞包被的载药仿生纳米载体，该仿生纳米载体通过同源靶向和归巢效应实现增强的肿瘤靶向能力，递送抗肿瘤药物，提高癌症治疗效果。
本发明的目的之一是提供了一种仿生纳米载体，以包载化疗药物的阳离子纳米粒作为内核，将免疫细胞膜和肿瘤细胞膜组成的杂化细胞膜作为外壳包覆于阳离子纳米粒表面。通过外壳实现长循环和免疫监视最大程度的在肿瘤部位积累，达到更加精准的靶向定位，而后通过内核阳离子纳米粒实现深层渗透和内化作用以增强化疗药物的抗肿瘤的效果。
本发明中，阳离子纳米粒由阳离子化合物修饰的生物相容性高分子材料制成；杂化细胞膜由免疫细胞膜和肿瘤细胞膜按一定质量比混合组成。杂化细胞膜中免疫细胞膜和肿瘤细胞膜通过不同的比例为实现个性化的纳米药物的定制提供了极大的灵活性，通过不同的比例可以实现纳米载体在体内血液长循环和主动靶向的平衡，以期望达到最佳的肿瘤部位累积效率。
适用于本发明的仿生纳米载体的化疗药物，包括但不限于卡非佐米、硼替佐米、紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素中的一种或组合物等。其中，卡非佐米、硼替佐米、紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素均为FDA批准的小分子化疗药物，能作用于多种与转移、耐药相关的通路，诱导肿瘤细胞凋亡，具有一定抑制肿瘤转移活性，将这些化疗药物包载于上述纳米载体中，能够延长其在血液中半衰期，提高化疗药物靶向性，诱导肿瘤细胞凋亡。
在本发明的一个具体实施例中，化疗药物采用紫杉醇。
适用于本发明的阳离子纳米粒的阳离子化合物，包括但不限于乙二胺、壳聚糖、壳寡糖、赖氨酸、精氨酸、寡聚赖氨酸、寡聚精氨酸中的一种或几种的组合。
在本发明的一个具体实施例中，阳离子化合物优选为乙二胺。
适用于本发明的阳离子纳米粒的生物相容性高分子材料，包括但不限于乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）、聚乳酸（PLA）、白蛋白、聚谷氨酸中的一种或组合物等。生物相容性高分子材料具有良好的亲水性，可以实现疏水性药物的包载，同时其表面具有丰富的功能基团，易于修饰，以达到特定的改造目的。
在本发明的一个具体实施例中，生物相容性高分子材料优选为白蛋白。
适用于本发明的仿生纳米载体的免疫细胞膜，包括但不限于巨噬/单核细胞膜、T细胞膜、NK细胞膜、中性粒细胞膜中的一种或组合物等。免疫细胞膜包被可以靶向炎症部位，实现癌症药物的递送，并且减少抗体调理作用和血清蛋白的吸附，躲避免疫监视。
在本发明的一个具体实施例中，免疫细胞膜优选巨噬/单核细胞膜。
适用于本发明的仿生纳米载体的肿瘤细胞膜，包括但不限于乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、骨髓瘤或脑胶质瘤细胞等。癌细胞很容易在体外对其进行培养并获得膜材料。癌细胞还具有独特的特性，例如自我靶向能力，可用于癌症药物的递送和成像目的，以及抗原展示，可用于免疫调节。
在本发明的一个具体实施例中，肿瘤细胞膜优选鼠源乳腺癌4T1细胞膜。
本发明中，所述仿生纳米载体的杂化细胞膜应来源于与癌症受试者具有相同生物种属的免疫细胞和癌症受试者相同生物种属的肿瘤细胞膜。不同生物种属的免疫细胞膜包被会引起免疫原性，促进免疫系统对于仿生纳米载体的清除；不同生物种属的肿瘤细胞膜包被会稀释肿瘤抗原库，引入无效外来蛋白，甚至引发产生免疫原性。
在本发明中，所述仿生纳米载体的杂化膜与阳离子生物相容性高分子材料的质量比为1:10-1:1。
在本发明的一个具体实施例中，仿生纳米载体的杂化膜与阳离子生物相容性高分子材料的质量比为1:1-1:3，仿生纳米载体的电位与杂化膜电位一致，可实现完全包被，出于经济考虑，仿生纳米载体的杂化膜与阳离子生物相容性高分子材料的质量比优选为1:3。
本发明中，所述阳离子纳米粒内核的平均粒径为80~200nm，包被杂化细胞膜后最终粒径在100~200nm，相比于微米尺度的细胞，比表面积较大，能更高效地发挥膜结构的作用，并且当尺寸较大（超过250nm）存在易被免疫系统识别清除、血液循环时间短的问题，不利于在机体内实现长循环和在肿瘤部位渗透。
本发明的另一个目的是提供了一种仿生纳米载体的制备方法。
由于本发明的仿生纳米载体是将杂化细胞膜作为外壳包覆在载药阳离子纳米粒表面，所以需要考虑载药阳离子纳米粒的稳定性及其粒径大小，才能实现良好的包覆效果。而载药阳离子纳米粒的稳定性及其粒径大小取决于所采用的制备方法。
目前文献报道的阳离子纳米粒制备方法很多，如专利CN107929262A所采用的方法是将亲水性材料溶于水相，疏水性药物溶于油相，然后将油相缓慢加入水相之中，高速剪切，高压均质，再溶剂蒸发。但是在实际实验过程中，发明人发现此方法具有一定的局限性：高压均质后的体系稳定性提高，但是之后再去除有机溶剂的话，可能会使体系的稳定性折损，同时在旋蒸过程中可以发现乳光加深甚至乳光消失，粒径增大，出现溶液聚集等现象。因此溶剂的去除时间点非常关键，尽量在稳定体系之前去除为佳。
专利CN103169664A使用的是乳化-挥发-离心-冻干/再分散的方法，将亲水性材料溶于水相，疏水性药物溶于油相，然后将油相缓慢加入水相之中，高速剪切，形成初乳，搅拌挥发有机溶剂，然后离心，弃去上清液。但在实际实验过程中，由于阳离子纳米粒的表面带有电荷的特异性，离心后的再分散性效果不佳，同时根据沉降公式可知，离心过程会造成产率的下降。
专利CN111249254A中使用的方法为溶剂化后加入交联剂戊二醛固化，然后离心去除溶剂，但该方法引入了交联剂戊二醛，带来了戊二醛的去除等相继的复杂步骤以及潜在的溶剂毒性。
发明人在本发明中创造性的使用了乳化-挥发法-冷冻干燥的方法。具体是先将油相缓慢加入水相形成初乳，继续搅拌挥发大部分有机溶剂，待体系稳定之后再旋蒸去除剩余有机溶剂，高速剪切形成粒径均一的纳米粒，再冷冻干燥即可。此方法较目前主流的制备方法相比，纳米粒子粒径可以降至120nm以下，且避免了交联剂、助悬剂等有毒溶剂的引入，同时纳米粒子的稳定性有更好的提高。
在本发明的一个具体实施例中，所述仿生纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将乙二胺溶液在不断搅拌下缓慢滴加入到牛血清白蛋白溶液中，然后缓慢分批多次加入催化剂1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC•HCL)适量，室温下反应两小时，加入适量的醋酸缓冲液(4mol/L，pH=4.75)终止反应，然后透析48小时，每24小时更换一次，制得阳离子高分子材料。
（2）将阳离子高分子材料溶于水相中，将化疗药物溶于油相之中，将油相以一定速度加入水相之中，辅以搅拌形成初乳。然后继续搅拌挥发去除大部分有机溶剂，待体系稳定之后，再旋蒸去除剩余有机溶剂，高速剪切形成粒径均一的纳米粒，再冷冻干燥即可。
（3）将生长状态良好的肿瘤细胞和免疫细胞消化，PBS清洗三次，将细胞中的培养基、血清、胰酶等成分清洗干净，收集细胞。用低渗液与蛋白酶抑制剂处理细胞，4℃放置2小时，待细胞充分裂解，将细胞裂解溶液置于超声细胞破碎仪中破碎。裂解后的细胞溶液3200g离心5min，收集上清液，将沉淀用适量预冷至4℃的低渗液和蛋白酶抑制剂混悬，重复细胞裂解操作，取溶液3200g离心5min，合并上清液。将上清液于20000g离心20min，弃沉淀，再次收集上清液。将上清液于100000g离心60min富集细胞膜。
（4）将步骤（3）所得的免疫细胞膜和肿瘤细胞膜按照一定质量比进行混合，然后共挤出通过400nm碳酸酯膜。
（5）将步骤（2）所得的载药阳离子纳米粒与步骤（4）中所得的杂化细胞膜按一定比例混合，分别循环共挤出400nm、200nm的碳酸酯膜一定次数，纯化，即得。
为优化上述制备方案，采取的具体措施还包括：
上述步骤（1）中，催化剂的用量为10~100mg，催化剂的用量对于阳离子材料的表面修饰程度具有正相关，发明人研究发现，用量对于阳离子材料的电位的几乎无影响，但是对于之后的纳米粒的粒径以及包封率具有一定比例的影响，兼顾粒径的合适寸尺和较高的包封率，优选为30mg。
上述步骤（2）中阳离子高分子材料与化疗药物按照质量比3：1~15：1，通过控制材料与药物的比例，可以实现对粒径和包封率的控制，综合粒径和包封率，优选为10：1。
上述步骤（2）中油相加入至水相的速度为0.1~10.0mL/min，优选为0.5mLl/min。
上述步骤（2）中的有机溶剂为丙酮、乙醇，优选为乙醇。
上述步骤（2）中探头超声具体是指功率为150W，总时间为15min，模式为超2s，停5s，该超声条件下不会引起温度的上升，可以避免某些多肽类生物材料由于温度升高而变性。
上述步骤（3）中低渗裂解液和蛋白酶抑制剂的具体配比为：5mL细胞裂解液与50µL蛋白酶抑制剂处理8000万细胞。
上述步骤（3）中的探头超声具体是指功率为65W，总时间为1min，模式为超2s，停5s。
上述步骤（4）中肿瘤细胞膜和免疫细胞膜的质量比为1:1。
上述步骤（5）中的循环挤出次数为10~50，优选为20。
本发明还保护了上述仿生纳米载体在制备抗肿瘤靶向治疗药物中的应用。
本发明创新性提出通过采用仿生技术包被阳离子纳米粒，与包被的电中性纳米粒的仿生载体相比，赋予内部颗粒具有更深层次的渗透和内化作用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种免疫细胞和肿瘤细胞包被的载药阳离子仿生纳米载体及其应用，该仿生纳米载体通过同源靶向、归巢效应、逃避免疫监视和延长的血液循环时间，使仿生纳米载体最大程度地聚集在肿瘤部位，获得增强的靶向能力，该纳米载体在完成肿瘤归巢和网状内皮系统逃避的任务后，其内部的阳离子纳米粒具有更深层次的渗透和内化作用：肿瘤溶酶体环境中的pH为5.5，低于正常组织的pH，为了保持电中性和离子强度的内部平衡，阳离子纳米粒可诱导过量的电解质和水进入溶酶体中，从而促使溶酶体膜破裂同时内部阳离子纳米粒逃逸，逃脱的内部纳米粒由于其尺寸优势和改变的表面电位具有极高的深层渗透和内化能力，提高化疗药物的摄取能力，提高抗肿瘤疗效。
附图说明
图1为未包膜的载药纳米粒（NPs）、4T1细胞膜包被的载药纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜包被的载药纳米粒（RAW-m-NPs）和肿瘤靶向的仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）的粒径分布图。
图2为未包膜的载药纳米粒（NPs）、4T1细胞膜（4T1-m）、4T1细胞膜包被的载药纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜（RAW-m）、RAW细胞膜包被的载药纳米粒（RAW-m-NPs）和仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）的Zeta电位图。
图3为肿瘤靶向的仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）透射电镜图。
图4为紫杉醇注射液、未包膜纳米粒（NPs）、仿生纳米粒（Comb-m-NPs）在PH7.4条件下测得的体外药物释放曲线。
图5为4T1细胞膜（4T1-m）、4T1细胞膜包被的纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜（RAW-m）、RAW细胞膜包被的纳米粒（RAW-m-NPs）以及仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）WesternBlot的检测结果。
图6为4T1细胞膜（4T1-m）、4T1细胞膜包被的纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜（RAW-m）、RAW细胞膜包被的纳米粒（RAW-m-NPs）以及仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）SDS-PAGE的检测结果。
图7为利用激光共聚焦显微镜进行了亚细胞定位的三重标记实验结果。溶酶体被LysoTracker Red 选择性地标记为红色荧光，用 DAPI 染色的细胞核呈蓝色，包裹香豆素C6 的仿生纳米载体为绿色荧光 。
图8为通过流式细胞仪检测 4T1 细胞膜包被的纳米粒（ 4T1-m-NPs ）、 RAW 细胞膜包被的纳米粒（ RAW-m-NPs ）、 4T1 细胞膜和 RAW 细胞膜共包被的仿生纳米粒（ Comb-m-NPs ）以及未包膜的纳米粒（ NPs ）与 4T1 细胞共孵育后香豆素的摄取量结果 。
图9为荷4T1肿瘤的Balb/C小鼠尾静脉注射4T1细胞膜包被的纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜包被的纳米粒（RAW-m-NPs）、4T1细胞膜和RAW细胞膜共包被的仿生纳米粒（Comb-m-NPs）以及未包膜的纳米粒（NPs）以及游离Dir染料之后的实时图像，分别于给药0.5小时、2小时、5小时、8小时、24小时对小鼠进行活体成像拍照。
图10为荷4T1肿瘤的Balb/C小鼠尾静脉注射4T1细胞膜包被的纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜包被的纳米粒（RAW-m-NPs）、4T1细胞膜和RAW细胞膜共包被的仿生纳米粒（Comb-m-NPs）以及未包膜的纳米粒（NPs）以及游离Dir染料之后24小时各脏器中Dir的荧光成像图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
仿生纳米载体（Comb-m-NPs）的制备：
（1）将40mL乙二胺溶液（1.4mol/L，pH=4.75）在不断搅拌下缓慢滴加入到5mL牛血清白蛋白溶液（10%，m/v），然后缓慢分批多次加入催化剂1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCL) 30mg，室温下反应两小时，加入400μL的醋酸缓冲液(4mol/L，pH=4.75)终止反应，然后透析48小时，每24小时更换一次，得到阳离子高分子材料。
（2）取阳离子高分子材料100mg溶于10mL生理盐水中，取紫杉醇10mg溶于1mL乙醇之中，将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min加入水相之中，辅以搅拌形成初乳。然后继续搅拌一段时间挥发除去大部分乙醇，待体系稳定之后，再旋蒸除去剩余乙醇，使用探头超声（功率为150W，总时间为15min，模式为超2s，停5s）高速剪切形成粒径均一的纳米粒，再冷冻干燥即可。得到载药纳米粒（NPs）。
（3）将生长状态良好的4T1细胞和RAW细胞消化，PBS清洗三次，将细胞中的培养基、血清、胰酶等成分清洗干净，收集细胞。用低渗液与蛋白酶抑制剂处理细胞，4℃放置2小时，待细胞充分裂解，将细胞裂解溶液置于超声细胞破碎仪中破碎。裂解后的细胞溶液3200g离心5min，收集上清液，将沉淀用适量预冷至4℃的低渗液和蛋白酶抑制剂混悬，重复细胞裂解操作，取溶液3200g离心5min，合并上清液。将上清液于20000g离心20min，弃沉淀，再次收集上清液。将上清液于100000g离心60min富集细胞膜。
低渗裂解液和蛋白酶抑制剂的具体配比为：5mL细胞裂解液与50µL蛋白酶抑制剂处理8000万细胞。
（4）将步骤（3）所得的4T1细胞膜和RAW细胞膜按照1：1进行混合，然后共挤出通过400nm碳酸酯膜。
（5）将步骤（2）所得的载药阳离子纳米粒与步骤（4）中所得的杂化细胞膜按照质量比为3：1混合，分别循环共挤出400nm、200nm的碳酸酯膜5次，纯化，即得。
对比例1
4T1细胞膜包被的载药纳米粒（（4T1-m-NPs））的制备
（1）将40mL乙二胺溶液（1.4mol/L，pH=4.75）在不断搅拌下缓慢滴加入到5mL牛血清白蛋白溶液（10%，m/v），然后缓慢分批多次加入催化剂1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCL) 30mg，室温下反应两小时，加入400μL的醋酸缓冲液(4mol/L，pH=4.75)终止反应，然后透析48小时，每24小时更换一次。
（2）取阳离子高分子材料100mg溶于10mL生理盐水中，取紫杉醇10mg溶于1mL乙醇之中，将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min加入水相之中，辅以搅拌形成初乳。然后继续搅拌一段时间挥发除去大部分乙醇，待体系稳定之后，再旋蒸除去剩余乙醇，使用探头超声（功率为150W，总时间为15min，模式为超2s，停5s）高速剪切形成粒径均一的纳米粒，再冷冻干燥即可。
（3）将生长状态良好的4T1细胞消化，PBS清洗三次，将细胞中的培养基、血清、胰酶等成分清洗干净，收集细胞。用低渗液与蛋白酶抑制剂处理细胞，4℃放置2小时，待细胞充分裂解，将细胞裂解溶液置于超声细胞破碎仪中破碎。裂解后的细胞溶液3200g离心5min，收集上清液，将沉淀用适量预冷至4℃的低渗液和蛋白酶抑制剂混悬，重复细胞裂解操作，取溶液3200g离心5min，合并上清液。将上清液于20000g离心20min，弃沉淀，再次收集上清液。将上清液于100000g离心60min富集细胞膜。
（4）将步骤（3）所得的4T1细胞膜挤出通过400nm碳酸酯膜。
（5）将步骤（2）所得的载药阳离子纳米粒与步骤（4）中所得的肿瘤细胞膜按照质量比为3：1混合，分别循环共挤出400nm、200nm的碳酸酯膜5次，纯化，即得。
对比例2
RAW细胞膜包被的载药纳米粒（RAW-m-NPs）的制备
（1）将40mL乙二胺溶液（1.4mol/L，pH=4.75）在不断搅拌下缓慢滴加入到5mL牛血清白蛋白溶液（10%，m/v），然后缓慢分批多次加入催化剂1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCL) 30mg，室温下反应两小时，加入400μL的醋酸缓冲液(4mol/L，pH=4.75)终止反应，然后透析48小时，每24小时更换一次。
（2）取阳离子高分子材料100mg溶于10mL生理盐水中，取紫杉醇10mg溶于1mL乙醇之中，将紫杉醇乙醇溶液以0.5mL/min加入水相之中，辅以搅拌形成初乳。然后继续搅拌一段时间挥发除去大部分乙醇，待体系稳定之后，再旋蒸除去剩余乙醇，使用探头超声（功率为150W，总时间为15min，模式为超2s，停5s）高速剪切形成粒径均一的纳米粒，再冷冻干燥即可。
（3）将生长状态良好的RAW细胞消化，PBS清洗三次，将细胞中的培养基、血清、胰酶等成分清洗干净，收集细胞。用低渗液与蛋白酶抑制剂处理细胞，4℃放置2小时，待细胞充分裂解，将细胞裂解溶液置于超声细胞破碎仪中破碎。裂解后的细胞溶液3200g离心5min，收集上清液，将沉淀用适量预冷至4℃的低渗液和蛋白酶抑制剂混悬，重复细胞裂解操作，取溶液3200g离心5min，合并上清液。将上清液于20000g离心20min，弃沉淀，再次收集上清液。将上清液于100000g离心60min富集细胞膜。
（4）将步骤（3）所得的RAW细胞膜挤出通过400nm碳酸酯膜。
（5）将步骤（2）所得的载药阳离子纳米粒与步骤（4）中所得的免疫细胞膜按照质量比为3：1混合，分别循环共挤出400nm、200nm的碳酸酯膜5次，纯化，即得。
将实施例1、对比例1和对比例2制得的载体进行性能考察，包括：粒径分布和Zeta电位、体外药物释放性能、膜成分检测、溶酶体逃逸考察、体内生物分布和肿瘤靶向性检测。具体如下：
1. 仿生纳米载体的粒径分布和Zeta电位
采用马尔文粒度仪分别测定未包膜的载药纳米粒（NPs）、4T1细胞膜包被的载药纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜包被的载药纳米粒（RAW-m-NPs）和仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）的粒径分布以及未包膜的载药纳米粒（NPs）、4T1细胞膜（4T1-m）、4T1细胞膜包被的载药纳米粒（4T1-m-NPs）、RAW细胞膜（RAW-m）、RAW细胞膜包被的载药纳米粒（RAW-m-NPs）和仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）的Zeta电位。未包膜载药纳米粒（NPs）的粒径约为80nm，仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）的尺寸约为100nm，证明包被细胞膜之后会增大其粒径，粒径分布图见图1；未包膜载药纳米粒（NPs）的Zeta电位约为37mV，说明载紫杉醇的阳离子白蛋白纳米粒已经形成，仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）的电位约为-22mV，说明杂化细胞膜已经包被在纳米粒表面，电位图见图2。
由图3可以看出，本发明的仿生载药纳米粒成形性好。
2. 仿生纳米载体的体外药物释放性能
取紫杉醇浓度为0.5mg/mL的紫杉醇注射液、NPs、Comb-m-NPs各0.2mL，置于分子量为3500的透析袋中，两端用棉线扎紧，置于10mLEP管中，加入8mL释放介质磷酸缓冲液（PH为7.4、1M水杨酸钠），设置温度为37℃，转速为100rpm/min，在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h、60h、72h的时间点取出1mL介质，并补充1mL介质于离心管中。使用高效液相色谱仪于227nm下，计算紫杉醇含量，绘制出释放曲线，见图4。结果显示，仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）释放速率要远小于紫杉醇注射液和未包膜的纳米粒（NPs），显著增加纳米粒在体内的循环时间。本发明制得的仿生载药纳米粒相对于其他纳米载药系统具有良好的药物缓释性能。
3. 仿生纳米载体的膜成分检测
设置组别为4T1-m-NPs、RAW-m-NPs、Comb-m-NPs、4T1-m、RAW-m，分别通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（WesternBlot）来检测蛋白成分，结果见图5和图6。仿生纳米粒（Comb-m-NPs）与4T1细胞膜、RAW细胞膜具有相似的蛋白质成分，说明杂化膜已经包被在纳米粒的表面。
4. 仿生纳米载体对于4T1细胞的摄取性能的检测
将鼠源乳腺癌4T1细胞接种于12孔板（105个/孔），与NPs、4T1-m-NPs、RAW-m-NPs、Comb-m-NPs（香豆素浓度为100ng/mL）共孵育2h、4h、8h小时，将细胞用PBS洗涤并收集，用流式细胞仪分析细胞中香豆素荧光强度，结果见图8 。鼠源乳腺癌4T1细胞对于Comb-m-NPs的摄取量远远高于对照组，说明肿瘤靶向的仿生载药纳米粒（Comb-m-NPs）由于杂化细胞膜的包被提高了其对4T1细胞的靶向性。
5. 仿生纳米载体的溶酶体逃逸考察
将4T1细胞按密度5×105个细胞接种于激光共聚焦专用皿中培养24h后，将培养基替换为1mL载有香豆素C6的仿生纳米载体溶液，于37℃下分别孵育1h，4h，8h。弃去培养基，并用4℃放置的冷PBS洗涤三次。采用50nM溶酶体红色荧光探针（LysoTrackerRed）对溶酶体进行染色2h。采用4%的多聚甲醛对4T1细胞进行固定15min，采用10mg/mL浓度的DAPI对细胞核进行染色10min。香豆素6，LysoTrackerRed及DAPI的激发波长分别为488nm，577nm和358nm；发射波长分别为530nm，590nm和461nm。采用激光共聚焦显微镜进行观察。结果见图7，细胞与载香豆素 C6 的仿生纳米载体溶液孵育 1 小时后，仅有一小部分带绿色荧光的仿生纳米载体与带红色荧光的溶酶体重叠，孵育 4 小时后，有大量的绿色荧光与红色荧光重叠。当孵育 8 小时后，绿色荧光与红色荧光分开，表明仿生纳米载体成功从溶酶体中逃逸出来，分布于细胞质中。可能是因为带正电荷的内核阳离子纳米粒与溶酶体膜上的负电荷形成离子对，从而通过排除表面结合水来破坏溶酶体膜的稳定性，进而发生溶酶体逃逸作用。
6. 仿生纳米载体的体内生物分布和肿瘤靶向性检测
在Balb/C小鼠乳腺进行原位瘤接种，待肿瘤长至100mm3左右，对小鼠进行尾静脉注射NPs、4T1-m-NPs、RAW-m-NPs、Comb-m-NPs（Dir浓度为200µg/mL）。于给药后第0.5h、2h、4h、8h、24h进行活体成像拍摄；在第24h将鼠处死，分别取出心、肝、脾、肺、肾，于活体成像仪中拍摄。结果见图9和图10，与对照组相比，Comb-m-NPs在小鼠肿瘤区域检测到强烈的荧光信号，验证了其良好的肿瘤靶向性。

Claims (2)

1.一种仿生纳米载体，其特征在于：所述仿生纳米载体以包载化疗药物的阳离子纳米粒作为内核，在阳离子纳米粒表面包覆有免疫细胞膜和肿瘤细胞膜组成的杂化细胞膜作为外壳；
该仿生纳米载体的制备方法包括以下步骤：
（1）将乙二胺溶液在不断搅拌下缓慢滴加入到牛血清白蛋白溶液中，然后缓慢分批多次加入催化剂1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，室温 下 反应两小时，加入pH4.75的醋酸缓冲液终止反应，然后透析48小时，每24小时更换一次，制得阳离子高分子材料；
（2）将阳离子高分子材料溶于水相中，将化疗药物溶于油相之中，将油相加入水相之中，辅以搅拌形成初乳，然后继续搅拌挥发去除大部分有机溶剂，待体系稳定之后，再旋蒸去除剩余有机溶剂，高速剪切形成粒径均一的纳米粒，再冷冻干燥即可，阳离子高分子材料与化疗药物的质量比为3：1～15：1；
（3）将生长状态良好的4T1细胞和RAW细胞消化，PBS清洗三次，将细胞中的培养基、血清、胰酶成分清洗干净，收集细胞，用低渗液与蛋白酶抑制剂处理细胞，4℃放置2小时，待细胞充分裂解，将细胞裂解溶液置于超声细胞破碎仪中破碎，裂解后的细胞溶液3200g离心5min，收集上清液，将沉淀用预冷至4℃的低渗液和蛋白酶抑制剂混悬，重复细胞裂解操作，取溶液3200g离心5min，合并上清液，将上清液于20000g离心20min，弃沉淀，再次收集上清液，将上清液于100000g离心60min富集细胞膜；
（4）将步骤（3）所得的免疫细胞膜和肿瘤细胞膜进行混合，肿瘤细胞膜和免疫细胞膜的质量比为1:1，然后共挤出通过400nm碳酸酯膜；
（5）将步骤（2）所得的载药阳离子纳米粒与步骤（4）中所得的杂化细胞膜按一定比例混合，分别循环共挤出400nm、200nm的碳酸酯膜，纯化，即得。
2.权利要求1所述的仿生纳米载体在制备抗肿瘤靶向治疗药物中的应用。
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