CN103087185A - 改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物及制备方法，改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物，是在阳离子载体-基因复合物上结合有改性蛋白。本发明所制备的改性蛋白等电点约在5.5-6.5，具有内涵体环境下电荷反转能力。其能在pH大于7的情况下带负电荷，能与阳离子载体-基因二元复合物结合，屏蔽其正电荷从而降低毒性；在pH小于5的情况下带正电荷，改性蛋白从阳离子载体-基因二元复合物上脱落，与阳离子基因载体共同发挥“质子海绵效应”，使阳离子复合物基因载体从内涵体内逃离。改性蛋白和改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的制备方法简单。改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的基因转染效率高，生物毒性低。

Description

改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物及制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及一种改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物及制备方法。

背景技术

基因治疗是一种将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治病目的的治疗方法。裸露的外源基因带负电，难以渗入同样带负电的细胞膜且容易被机体或细胞降解，因而难以表达。所以基因治疗的关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，使目的基因能够在靶细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达。

基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两类。1.病毒载体转染效率高，但也有能诱导宿主免疫反应、潜在的致瘤性、装载容量有限、代价高等缺点，限制了它们的应用。2.非病毒载体是目前公认可替代病毒载体的基因载体系统，它可避免诸如免疫原性、毒性等病毒载体的缺陷。具有低毒、低免疫反应，外源基因随机整合率低且携带基因大小类型不受限制等优点。虽然非病毒载体安全性好，但存在转染、整合效率低等缺点。

因此，如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因药物载体，如何提高非病毒性基因载体的靶向特异性和体内外转染效率，已经是迫在眉睫的关键问题。

阳离子脂质体和阳离子聚合物载体属于非病毒性基因载体。它们是利用结构上带正电的氨基静电复合基因，再通过静电作用结合细胞膜或通过携带的靶向配体与细胞膜上的带负电荷的受体结合，通过内吞、逃离内体和胞质转运的方式表达目的基因。

但是，阳离子载体与基因组装形成的复合物带有过量正电荷，易与血清中带负电的蛋白非特异性结合。当静脉注射后，复合物因聚集而被清除。另外，阳离子载体易与血液成分作用，会导致补体激活、血细胞凝结、血小板减少、白细胞减少等不良现象。因此，屏蔽掉阳离子载体-基因二元复合物表面过量的正电荷，是一种合理有效的解决途径。目前主要有两种方法：一种是将二元复合物表面PEG化，增强复合物的水溶性，在复合物周围形成一层水分子膜，使得复合物与血液中带负电的物质减少接触；另一种方法是将带正电的二元复合物与带负电的大分子通过静电作用进行组装，形成三元复合物，从而中和掉过量的正电荷。目前，将蛋白作为第三元物质来屏蔽过量正电荷的方法得到越来越广泛的研究。蛋白的来源非常丰富，而且具有良好生物相容性和生物可降解性。蛋白分子表面存在的氨基和羧基官能团易于共价改性，从而有效地与靶向配体偶合，增强载体的靶向性。因此采用蛋白-阳离子载体-基因三元复合物可高效安全地将基因递送到靶向部位，从而实现基因治疗，具有良好的研究前景。

另一方面，基因载体的转染效率很大程度上决定于其逃离细胞内涵体的能力，阳离子载体如PEI、PDMAEMA等具有大量未质子化的叔胺和仲胺基团，能在内涵体的酸性环境下进一步质子化，使内涵体内正电荷数目上升。与此同时，为平衡电荷，细胞质内负离子进入内涵体，使内涵体内渗透压上升，从而涨破内涵体，释放基因载体与基因。这就是聚阳离子基因载体的“质子海绵效应”。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种改性蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种改性蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种转染效率高及生物相容性好的改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物。

本发明的第四个目的是提供一种改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的制备方法。

一种改性蛋白，是用式（I）或（II）表示：

其中：P为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或胶原蛋白。

上述改性蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）取400mg蛋白溶于40-80mL双蒸水中溶解；

（2）将80-100mL乙胺或80-100mL浓度为2-4mg/mL的巯基乙胺水溶液滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.7-4.8；

（3）取80-100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于8-12mL双蒸水中溶解，加入步骤（2）获得的溶液中，在20-30℃水浴中反应1-4h；

（4）将步骤（3）获得的溶液用截止分子量3500～10000的透析袋在纯水中透析2～14天；

（5）将步骤（4）获得的透析产物冷冻干燥后得到改性蛋白。

所述蛋白优选牛血清白蛋白、人血清白蛋白或胶原蛋白。

改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物，其特征是在阳离子载体-基因复合物上结合有改性蛋白。

所述阳离子载体优选脂质体2000、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、聚赖氨酸、壳聚糖或聚甲基丙烯酸N,N二甲氨基乙酯。

所述基因优选绿色荧光蛋白编码的质粒或干扰核糖核酸。

所述改性蛋白是用式（I）或（II）表示：

其中：P为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或胶原蛋白。

上述改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的制备方法，包括如下步骤：

（1）将阳离子载体与基因复合得到阳离子载体-基因复合物；

（2）在pH=7.4条件下，将式（I）或（II）表示的改性蛋白与阳离子载体-基因复合物复合，得到粒径均一的改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物纳米粒。

改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物简称三元复合物。

本发明的优点

（1）本发明的改性蛋白的制备方法，其反应条件温和，不破坏蛋白结构，能保持蛋白活性；

（2）本发明所制备的改性蛋白等电点约在5.5-6.5，具有内涵体环境下电荷反转能力。其能在pH大于7的情况下带负电荷，能与阳离子载体-基因二元复合物结合，屏蔽其正电荷从而降低毒性；在pH小于5的情况下带正电荷，改性蛋白从阳离子载体-基因二元复合物上脱落，与阳离子基因载体共同发挥“质子海绵效应”，使阳离子复合物基因载体从内涵体内逃离。

（3）改性蛋白和改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的制备方法简单。

（4）改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的基因转染效率高，生物毒性低。

附图说明

图1为改性牛血清白蛋白（mBSA）和牛血清白蛋白（BSA）的圆二色谱对比图。

图2为mBSA和BSA的zeta电位对比图。

图3中，A为mBSA粒径分布图，B为pH=7.4下的三元复合物粒径分布图，C为pH=5.0下的三元复合物的粒径分布图。

图4为不同mBSA浓度下的三元复合物zeta电位图。

图5为不同mBSA浓度的三元复合物琼脂糖凝胶电泳照片。

图6为不同浓度下mBSA的细胞毒性。

图7为不同mBSA含量的三元复合物细胞毒性。

图8为不同mBSA含量的三元复合物转染效率。

图9为本发明的三元复合物的结构示意图，其中（III）为乙胺改性蛋白与阳离子载体-基因形成的三元复合物；（IV）为巯基乙胺改性蛋白与阳离子载体-基因形成的三元复合物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例只是为了使本领域的技术人员更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1

改性蛋白的合成与表征

1．改性牛血清白蛋白合成

（1）取400mg牛血清白蛋白溶于50mL双蒸水中溶解；

（2）将90mL乙胺滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.75；

（3）取90mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）溶于10mL双蒸水中溶解，加入步骤（2）获得的溶液中，在25℃水浴中反应2h；

（4）将步骤（3）获得的溶液用截止分子量8000～10000的透析袋在纯水中透析2天；

（5）将步骤（4）获得的透析产物冷冻干燥后得到改性牛血清白蛋白（mBSA）。

2．改性牛血清白蛋白和牛血清白蛋白（BSA）圆二色谱测试，见图1。

3．改性牛血清白蛋白和牛血清白蛋白等电点测试：

称取80mg改性牛血清白蛋白（mBSA），溶于8mL双蒸水中，配制成浓度为10mg/mL的mBSA母液。取1mL的mBSA母液溶于9mL事先配好的5个不同pH缓冲液中，从而得到5个不同pH值，浓度为1mg/mL的mBSA溶液。

用马尔文激光粒度仪测定mBSA在各个pH条件下的Zeta电位如图2，用同样的方法测定BSA（牛血清白蛋白）的等电点，从图中可得，mBSA的等电点在5.8左右，BSA的等电点在4.8左右。

实施例2

改性人血清白蛋白合成

（1）取400mg人血清白蛋白溶于40mL双蒸水中溶解；

（2）将80mL乙胺滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.7；

（3）取80mg的EDC·HCl溶于8mL双蒸水中溶解，加入步骤（2）获得的溶液中，在20℃水浴中反应4h；

（4）将步骤（3）获得的溶液用截止分子量3500的透析袋在纯水中透析14天；

（5）将步骤（4）获得的透析产物冷冻干燥后得到改性人血清白蛋白。

实施例3

改性胶原蛋白合成

（1）取400mg胶原蛋白溶于80mL双蒸水中溶解；

（2）将100mL乙胺滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.8；

（3）取100mg的EDC·HCl溶于12mL双蒸水中溶解，加入步骤（2）获得的溶液中，在30℃水浴中反应1h；

（4）将步骤（3）获得的溶液用截止分子量8000～10000的透析袋在纯水中透析5天；

（5）将步骤（4）获得的透析产物冷冻干燥后得到改性胶原蛋白。

实施例4

改性牛血清白蛋白合成

（1）同实施例1；

（2）将90mL浓度为3mg/mL的巯基乙胺水溶液滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.75；

（3）-（5）同实施例1，得到改性牛血清白蛋白。

实施例5

改性人血清白蛋白合成

（1）同实施例2；

（2）将80mL浓度为4mg/mL的巯基乙胺水溶液滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.7；

（3）-（5）同实施例1，得到改性人血清白蛋白。

实施例6

改性胶原蛋白合成

（1）同实施例3；

（2）将100mL浓度为2mg/mL的巯基乙胺水溶液滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.8；

（3）-（5）同实施例1，得到改性胶原蛋白。

经实验，用其它的蛋白如肌红蛋白，鱼精蛋白等也可以使用上述实施例的方法制备出相应的改性蛋白。

实施例7

三元复合物制备和表征方法

（1）制备三元复合物

阳离子聚合物聚乙烯吡咯烷酮接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PVP-g-PDMAEMA）溶于PBS，调节pH至7.4，用0.22μm的Millipore膜过滤除菌后在4℃保存，备用；将绿色荧光蛋白编码的质粒（EGFP质粒）用PBS（pH=7.4）配制浓度为0.2mg/ml的溶液；按照选定的N/P=10将阳离子聚合物溶液缓慢滴加至50μL的EGFP质粒溶液中，混匀，室温静置30分钟，得阳离子载体-基因复合物（二元复合物）溶液。

其中N代表阳离子聚合物中氨基基团摩尔数，P代表EGFP质粒中磷酸基团摩尔数。

将实施例1中所制得的改性牛血清白蛋白溶于PBS（pH=7.4）中，浓度为2mg/ml，取50μL滴入上述二元复合物溶液中，混匀，室温静置30分钟制得三元复合物溶液。

（2）琼脂糖凝胶电泳实验

取10μL步骤（1）制备的三元复合物溶液与2μL上样缓冲液(6×，大连宝生生物)充分混合后加入到0.8%琼脂糖(含0.5μg/mL溴化乙锭)凝胶中。电泳缓冲液为1×TAE,电压为120V，电泳时间为40min，然后在紫外下观察DNA电泳图谱并照相。结果如图5所示，这说明本发明制备的三元复合物能负载DNA，完全阻滞DNA泳出。

（3）复合物粒径和Zeta电位分析

将步骤（1）制备的三元复合物溶液，采用英国Malvern公司的Nano-ZS ZEN3600型激光粒度仪来测定复合物的粒径、粒径分布以及Zeta电位。测量温度为25°C，角度为173°，入射光波长633nm。结果如图3，图4所示，结果表明在pH7.4条件下，mBSA与阳离子载体-基因复合物形成稳定的三元复合物，在pH5.0条件下，mBSA脱落。

实施例8

用与实施例7相同的方法，将阳离子载体脂质体2000与绿色荧光蛋白编码的质粒复合得到阳离子载体-基因复合物溶液；

将实施例2中所制得的改性人血清白蛋白溶于PBS（pH=7.4）中，浓度为2mg/ml，取50μL滴入上述二元复合物溶液中，混匀，室温静置30分钟制得三元复合物溶液。

实施例9

用与实施例7相同的方法，将阳离子载体聚乙烯亚胺与绿色荧光蛋白编码的质粒复合得到阳离子载体-基因复合物溶液；

将实施例3中所制得的改性胶原蛋白溶于PBS（pH=7.4）中，浓度为2mg/ml，取50μL滴入上述二元复合物溶液中，混匀，室温静置30分钟制得三元复合物溶液。

实施例10

用与实施例7相同的方法，将阳离子载体壳聚糖与干扰核糖核酸复合得到阳离子载体-基因复合物溶液；

将实施例4中所制得的改性牛血清白蛋白溶于PBS（pH=7.4）中，浓度为2mg/ml，取50μL滴入上述二元复合物溶液中，混匀，室温静置30分钟制得三元复合物溶液。

三元复合物的结构示意图见图9，图中（IV）为巯基乙胺改性蛋白与阳离子载体-基因形成的三元复合物。

实施例11

用与实施例7相同的方法，（1）将阳离子载体聚赖氨酸与干扰核糖核酸复合得到阳离子载体-基因复合物溶液；

将实施例5中所制得的改性人血清白蛋白溶于PBS（pH=7.4）中，浓度为2mg/ml，取50μL滴入上述二元复合物溶液中，混匀，室温静置30分钟制得三元复合物溶液。

实施例12

实施例1制备的改性蛋白和实施例7制备的三元复合物的体外细胞毒性实验

(1)在96孔板中接种1×10⁴个HepG2细胞/孔，每孔培养基体积为100μL，5%CO2，37℃孵育过夜；

(2)测定孔分别加入50μL浓度分别为：0.125，0.25，0.5，1，2，4mg/mL的实施例1的mBSA溶液（PBS为溶剂），5%CO2，37℃孵育24h；

(3)向每个测定孔中加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续5%CO2，37℃孵育4h；

(4)小心弃去孔内上清培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置低速震荡仪上振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值；

同时设置调零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(HepG2细胞、相同体积的mBSA溶液（PBS为溶剂）、培养液、MTT、二甲基亚砜)，

(5)计算各个样品孔细胞相对活力，将各孔吸光值减去调零孔吸光值，得到修正后吸光值OD490′。计算对照孔修正后吸光值的平均值avg(OD490C′)。

各样品孔细胞相对活力定义为：

结果如图6所示，mBSA近乎无毒。

用上述方法测定实施例7制备的三元复合物的细胞毒性。

结果如图7所示，随着mBSA浓度的提升，三元复合物的毒性降低。

经实验证明，实施例2-6制备的改性蛋白近乎无毒，实施例8-11制备的三元复合物随着改性蛋白浓度的提升，三元复合物的毒性降低。

实施例13体外转染实验

（1）阳离子聚合物聚乙烯吡咯烷酮接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PVP-g-PDMAEMA）溶于PBS，调节pH至7.4，用0.22μm的Millipore膜过滤除菌后在4℃保存，备用；将绿色荧光蛋白编码的质粒（EGFP质粒）用PBS（pH=7.4）配制浓度为0.2mg/ml的溶液；按照选定的N/P=10将阳离子聚合物溶液缓慢滴加至50μL的EGFP质粒溶液中，混匀，室温静置30分钟，得阳离子载体-基因复合物（二元复合物）溶液。

（2）将实施例1中所制得的改性牛血清白蛋白溶于PBS（pH=7.4）中，浓度分别为1mg/ml和2mg/ml，分别取50μL滴入上述二元复合物溶液中，混匀，室温静置30分钟制得两种三元复合物溶液。

用相同的方法，将牛血清白蛋白溶于PBS（pH=7.4）中，浓度分别为1mg/ml取50μL滴入（1）获得的二元复合物溶液中，混匀，室温静置30分钟制得未改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物溶液。

（3）细胞培养

在24孔板中接种2×10⁵个HepG2细胞/孔，培养基体积为0.5mL。培养18h，细胞融合率达到60-80%；将培养基换成无血清无抗生素的DMEM，每孔0.5mL；

（4）细胞转染

将100μL步骤（2）获得的两种三元复合物溶液和一种未改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物溶液，分别加入24孔板中，每样设3个平行孔；37℃及5%CO₂浓度下培养4h后将孔中液体吸出，换为含2%FBS的DMEM维持培养液，0.5mL/孔；37℃的5%CO₂孵箱中继续培养48h，检测绿色荧光蛋白的表达情况。绿色荧光蛋白的表达，通过倒置荧光显微镜(Olympus IX70,Olympus,Tokyo,Japan)原位定性检测阳性细胞。结果如图8。

经实验证明，实施例8-11制备的三元复合物转染效率比未改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的转染效率高。

Claims (8)

1.一种改性蛋白，其特征是用式（I）或（II）表示：

其中：P为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或胶原蛋白。

2.权利要求1改性蛋白的制备方法，其特征包括如下步骤：

（1）取400mg蛋白溶于40-80mL双蒸水中溶解；

（2）将80-100mL乙胺或80-100mL浓度为2-4mg/mL的巯基乙胺水溶液滴加到步骤（1）制备的蛋白溶液中，调节pH至4.7-4.8；

（3）取80-100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于8-12mL双蒸水中溶解，加入步骤（2）获得的溶液中，在20-30℃水浴中反应1-4h；

（4）将步骤（3）获得的溶液用截止分子量3500～10000的透析袋在纯水中透析2～14天；

（5）将步骤（4）获得的透析产物冷冻干燥后得到改性蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种改性蛋白的制备方法，其特征是所述蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或胶原蛋白。

4.改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物，其特征是在阳离子载体-基因复合物上结合有改性蛋白。

5.根据权利要求4所述的改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物，其特征是所述阳离子载体为脂质体2000、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、聚赖氨酸或壳聚糖。

6.根据权利要求4所述的改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物，其特征是所述基因为绿色荧光蛋白编码的质粒或干扰核糖核酸。

7.根据权利要求4所述的改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物，其特征是所述改性蛋白是用式（I）或（II）表示：

其中：P为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或胶原蛋白。

8.权利要求4-7之一的改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物的制备方法，其特征包括如下步骤：

（1）将阳离子载体与基因复合得到阳离子载体-基因复合物；

（2）在pH=7.4条件下，将权利要求1的改性蛋白与阳离子载体-基因复合物复合，得到粒径均一的改性蛋白-阳离子载体-基因三元复合物纳米粒。

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