CN102295697A - 一步法构建阳离子化载体蛋白与玉米赤霉烯酮的偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明根据胺甲基化反应反应原理，利用玉米赤霉烯酮结构中羰基碳的α-活泼氢，以甲醛为偶联剂，与阳离子蛋白中的胺乙基发生缩合反应，一步法构建玉米赤霉烯酮-阳离子载体蛋白偶联物。该法较之目前采用先将玉米赤酶烯酮衍生化为羧基活化物后，再与载体蛋白缩合偶联的两步法，具有步骤少、操作简单、利用率高的优点。

Description

一步法构建阳离子化载体蛋白与玉米赤霉烯酮的偶联物
技术领域
本发明涉及阳离子载体蛋白的制备及玉米赤霉烯酮-阳离子蛋白偶联物的一步法构建。将构建的偶联物作为免疫原免疫动物，可提高机体的免疫应答水平，制备高质量的抗玉米赤霉烯酮抗体。
背景技术
玉米赤霉烯酮(Zearalenone)，又称F-2毒素，玉米烯酮。其首先从有赤霉病的玉米中分离得到，玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属(Fusarium)的菌株，如禾谷镰刀菌(F.graminearum)和三线镰刀菌(F.tricinctum)。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，其中玉米的阳性检出率为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20％，含毒量为0.364～11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜，家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症。妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产，死胎和畸胎。食用含赤霉病麦面粉制作的各种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心，发冷，头痛，神智抑郁和共济失调等。
由于ZEN污染食品的途径很多，因此要完全杜绝ZEN的污染是不可能的，完善监督措施和采用科学检测方法可以在最大程度上减少ZEN对人类健康的危害。目前，ZEN的检测方法主要有基于理化和免疫的分析方法，前者包括薄层层析法、高效液相色谱、质谱和毛细管电泳等，薄层层析法作为我国目前检测ZEN国标方法，虽然操作简便，成本低廉，但由于是半定量方法，灵敏度低，已经难以满足低检测限的需要；而其他仪器分析方法虽然灵敏度高、重现性好，但同时存在着耗时、检测仪器昂贵、操作复杂等缺点，不能满足现场快速检测的需求；而酶联免疫吸附反应、免疫微柱以及免疫芯片等免疫学检测方法由于节省时间、成本低、操作简便，适合批量检测和现场检测，正逐步受到我国各质检相关部门的重视。
ZEN作为半抗原，需将其与载体蛋白偶联后，才能具备刺激动物产生抗体的免疫原性。但由于完全抗原制备过程复杂，ZEN利用率低，因此常常需要使用较大量的ZEN才能制备得到相应的抗体；然而，“9.11”事件后，ZEN作为一种剧毒的生物试剂被美国等发达国家严格控制。市场上该毒素标准品不仅价格高而且难以买到，这给研究ZEN的免疫学检测方法带来很大困难，也在一定程度上阻碍了免疫学方法的应用和推广。
早期研究认为ZEN本身性质不活泼，不具备与载体蛋白连接的活性基团，需将其衍生后，再与载体蛋白偶联，即先将ZEN转化为ZEN-羧基活化物(ZEN-Oxime，ZEN-O)，然后，在碳化二亚胺(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide，EDC)等偶联剂的催化下，与载体蛋白发生缩合反应，形成稳定的ZEN-O-载体蛋白偶联物。其中，第一步ZEN的转化率为70％～80％，ZEN-O的纯化得率为80％～90％，而第二步，仅有30％～40％的ZEN-O偶联到载体蛋白上。因此，ZEN的总利用率在20％左右，利用率较低。
综合上述原因，研究提高ZEN利用率的偶联物制备方法是非常必要的。
本发明利用了阳离子载体蛋白胺甲基化原理构建了ZEN-阳离子载体蛋白的偶联物。在ZEN的结构中，由于其羰基的α-活泼氢在弱酸条件下，以烯醇式存在，可通过甲醛的偶联作用，与载体蛋白的胺乙基发生胺甲基化偶联。由于阳离子载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙基取代，因而整个蛋白带正电，作为完全抗原免疫动物时，较之普通蛋白的偶联物，阳离子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体内的免疫应答，同时，也提高了机体对共价偶联在阳离子载体蛋白半抗原(ZEN)的识别和应答水平，即可刺激抗原提呈细胞对半抗原决定簇的提呈、促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖。
本发明中ZEN的总利用率在50％左右。实验证明，通过该法制备的偶联物具有较好的免疫原性，能够刺激机体产生高质量的ZEN抗体。因此，本发明相对于传统合成方法，有操作步骤少、毒素利用率高、抗体效价高等优点。
本专利发明者针对两步法存在的诸多问题，发明了用阳离子载体蛋白一步构建玉米赤霉烯酮-载体蛋白偶联物的方法。相关研究国内外尚未见报道。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种一步构建ZEN-载体蛋白偶联物的方法。
(二)技术方案
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
烯醇或者含α-活泼氢的羰基化合物，在偶联剂甲醛的作用下，能与伯胺或仲胺进行偶联。根据该原理，ZEN上羰基的α-活泼氢就能够在甲醛的偶联作用下与含有胺乙基的阳离子蛋白反应，得到ZEN-阳离子蛋白的偶联物。阳离子化蛋白相对于简单蛋白而言，具有较多的胺乙基，因而整个蛋白带正电，作为完全抗原免疫动物时，较之普通蛋白的偶联物，阳离子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提呈细胞识别和刺激机体内的免疫应答.
具体步骤：
1.阳离子蛋白的制备
载体蛋白包括：牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)、血孔匙蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)、多聚赖氨酸(Ploy-l-lysine，PLL)和辣根过氧化物酶(HRP)。
制备步骤：
(1)将乙二胺(ethylenediamine，EDA)加入到冰浴中的2-乙烷磺酸基(2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid，MES)缓冲液中，并用HC1调节pH至弱酸性；
(2)将载体蛋白溶于MES后，与上述EDA溶液混匀；
(3)滴加偶联剂EDC于(2)所述溶液中，室温反应后，用醋酸终止反应；
(4)将上述反应物用去离子水充分透析；
(5)将其冻干后，冻干备用。
所用EDA体积在20μL～100μL之间，所用的载体蛋白质量在5mg～100mg之间，EDA与MES的体积比在1∶25～1∶5之间，MES缓冲液的pH调节到4～6。
制备得到阳离子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin，cBSA)、阳离子卵清白蛋白(Calionized ovalbumin，cOVA)、阳离子血孔匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin，cKLH)、阳离子多聚赖氨酸(Cationized ploy-l-lysine，cPLL)或阳离子辣根过氧化物酶(Cationized horseradishperoxidase，cHRP)。
2.ZEN-阳离子载体蛋白偶联物的制备
ZEN-阳离子载体蛋白偶联物包括ZEN-cBSA、ZEN-cOVA、ZEN-cKLH、ZEN-cPLL和ZEN-HRP。
制备步骤：
(1)将阳离子载体蛋白和ZEN分别用MES缓冲液和二甲基甲酰胺溶解后，将ZEN溶液逐滴加入到载体蛋白液中混匀；
(2)在上述反应液中加入偶联剂甲醛，反应后即得到ZEN-阳离子载体蛋白偶联物；
(3)用去离子水充分透析后，冻干备用。其中，阳离子载体蛋白与ZEN的质量比例在1∶1～5∶1之间，二甲基甲酰胺和甲醛的体积比在1∶1～5∶1之间。
(三)有益效果
本发明以ZEN为半抗原，利用阳离子蛋白一步法合成ZEN-载体蛋白偶联物，该法具有步骤简单、ZEN利用率高等优点，避免了目前所用两步法步骤多、利用率低等缺点。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明专利进一步说明。
图1ZEN的结构
图2载体蛋白的阳离子化
图3ZEN与阳离子载体蛋白的偶联机理
①ZEN在弱酸性缓冲液中的烯醇化；
②阳离子载体蛋白中亚胺离子的形成；
③阳离子载体蛋白中的亚胺离子在甲醛作用下，与烯醇化ZEN偶联
具体实施方式
实施例1ZEN-cBSA偶联物的制备
1.1cBSA的制备：
将50～100μLEDA加入到500μL冰浴MES缓冲液中，并用HCI将pH调节到5.5左右，再将5～100mg BSA溶解于50μL的MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48～72h，冻干备用。
1.2ZEN-cBSA偶联物的制备：
将5～100mg的cBSA与2mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解后，再将上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例2ZEN-cOVA偶联物的的制备
2.1cOVA的制备：
将50～100μL EDA加入到500μL冰浴MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右，再将5～100mg OVA溶解于100μL的上述缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48～72h，冻干备用。
2.2ZEN-cOVA偶联物的制备：
将5～100mg的cOVA与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解后，再将上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例3ZEN-cKLH偶联物的制备
3.1cKLH的制备：
将50～100μL EDA加入到冰浴的500μLMES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右，再将5～100mg KLH溶解于800μL上的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48～72h，冻干备用。
3.2ZEN-cKLH偶联物的制备：
将5～100mg的cKLH与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解后，再将上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例4ZEN-cPLL偶联物的制备
4.1cPLL的制备：
将50～100μLEDA加入到冰浴的500μL上MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右，再将5～100mgPLL溶解于1000μL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48～72h，冻干备用。
4.2ZEN-cPLL偶联物的制备；
将5～100mg的cPLL与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解后，再将上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
实施例5ZEN-cHRP偶联物的制备
4.1cHRP的制备：
将50～100μLEDA加入到冰浴的500μL上MES缓冲液中，并用HC1将pH调节到5.5左右，再将5～100mg HRP溶解于1000μL的上述MES缓冲液，然后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的EDC，室温搅拌1～12h后，用醋酸终止反应，最后用去离子水充分透析48～72h，冻干备用。
4.2ZEN-cHRP偶联物的制备；
将5～100mg的cPLL与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解后，再将上述ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中混匀，然后迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
上述所用MES缓冲液浓度均为0.1mol/L，HCl均为1mol/L，醋酸均为4mol/L。
ZEN-阳离子蛋白偶联物的鉴定；
采用紫外分光光度计对阳离子载体蛋白、ZEN标品及偶联物进行扫描，根据其特征吸收峰来确定偶联是否成功。
结果显示，ZEN-阳离子载体蛋白偶联物在270nm和315nm有两个主要的吸收峰，前一个吸收峰是载体蛋白(280nm)和ZEN(274nm)的叠加峰，而后者是ZEN的另一特征吸收峰(315nm)。根据偶联比公式，结合紫外图谱上吸收峰波长及吸光度，可以计算出ZEN与阳离子蛋白的偶联比。
Figure BSA00000163674500061
其中：MZEN：偶联物中ZEN的摩尔质量；
M载体蛋白：偶联物中载体蛋白的摩尔质量；
A偶联物·278nm：偶联物在278nm处的吸光度；
A偶联物·366nm：偶联物在366nm处的吸光度；
εZEN·278nm：ZEN在278nm处的摩尔吸光系数；
εZEN·366nm：ZEN在366nm处的摩尔吸光系数；
ε载体蛋白·278nm：载体蛋白在278nm处的摩尔吸光系数
经过计算，ZEN与阳离子蛋白的偶联比在8.8左右，证明了成功制备ZEN-阳离子蛋白偶联物。
主要参考文献
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Claims (6)

1.阳离子蛋白，其特征在于结构式：
其中，载体蛋白的羧基几乎全部被胺乙基取代，整个蛋白带正电，因而作为完全抗原免疫动物时，阳离子载体蛋白更易与机体内带弱负电的细胞膜表面结合，进而被抗原提成细胞识别和刺激机体内的免疫应答。
2.ZEN-阳离子蛋白偶联物，其特征在于它的分子结构式为：
Figure FSA00000163674400012
其中，载体蛋白可以是阳离子牛血清白蛋白(Cationized bovine serum albumin，cBSA)、阳离子卵清白蛋白(Cationized ovalbumin，cOVA)、阳离子血孔匙蛋白(Cationized keyhole limpet hemocyanin，cKLH)、阳离子多聚赖氨酸(Cationized poly-L-lysine，cPLL)或阳离子辣根过氧化物酶(Cationized horseradish peroxidase，cHRP)，分别与ZEN结合得到ZEN-cBSA、ZEN-cOVA、ZEN-cKLH、ZEN-cPLL和ZEN-cHRP。
3.制备权利要求1所述一种阳离子载体蛋白的方法，其特征在于包括步骤：
(1)制备cBSA，步骤如下：
将20～100μL乙二胺(ethylenediamine，EDA)加入到冰浴的500μL 0.1mol/L 2-乙烷磺胺(2-(N-morpholino)ethane sμLfonic acid，MES)缓冲液中，并用1mol/L HC1将pH调节到4～6，然后，将5～100mg BSA溶解在50μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的碳化亚二胺(1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide，EDC)，室温搅拌1～12h，用4mol/L醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，将其冻藏备用。
(2)制备cOVA，步骤如下：
将20～100μL EDA加入到冰浴的500μL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HC1将pH调节到4～6，然后，将5～100mg OVA溶解在100μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的碳化亚二胺EDC，室温搅拌1～12h，用4mol/L醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，将其冻藏备用。
(3)制备cKLH，步骤如下：
将20～100μL EDA加入到冰浴的500μL0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HC1将pH调节到4～6，然后，将5～100mg KLH溶解在800μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的碳化亚二胺EDC，室温搅拌1～12h，用4mol/L醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，将其冻藏备用。
(4)制备cPLL，步骤如下：
将20～100μLEDA加入到冰浴的500μL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HC1将pH调节到4～6，然后，将5～100mg PLL溶解在1000μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的碳化亚二胺EDC，室温搅拌1～12h，用4mol/L醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，将其冻藏备用。
(4)制备cHRP，步骤如下：
将20～100μL EDA加入到冰浴的500μL 0.1mol/L MES缓冲液中，并用1mol/L HC1将pH调节到4～6，然后，将5～100mg HRP溶解在1000μL的上述MES缓冲液后，与上述EDA溶液混匀，再在上述混合液中添加2～50mg的碳化亚二胺EDC，室温搅拌1～12h，用4mol/L醋酸终止反应，用去离子水充分透析48～72h后，将其冻藏备用。
所用EDA体积在20μL～100μL之间，所用的载体蛋白质量在5～100mg之间，EDA与MES的体积比在1∶25～1∶5之间，MES缓冲液的pH调节到4～6。
4.如权利要求2所述一种ZEN-阳离子载体蛋白偶联物的制备方法，其特征在于ZEN上羰基的α-活泼氢能够在甲醛的偶联作用下与阳离子蛋白的胺乙基反应，得到ZEN-阳离子载体蛋白的偶联物，能够制备包括免疫抗原、包被抗原和酶标记物在内的ZEN-阳离子蛋白偶联物，得到ZEN完全抗原。
5.如权利要求2所述一种ZEN-阳离子载体蛋白偶联物的制备方法，其特征是偶联剂甲醛。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括步骤：
(1)ZEN-cBSA的制备，步骤如下：将5～100mg cBSA与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解，再将ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，充分反应后即得到ZEN-cBSA，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
(2)ZEN-cOVA的制备，步骤如下：将5～100mg的cOVA与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解，再将ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，充分反应后即得到ZEN-cOVA，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
(3)ZEN-cKLH的制备，步骤如下：将5～100mg cKLH与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解，再将ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，充分反应后即得到ZEN-cKLH，用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
(4)ZEN-cPLL的制备，步骤如下：将5～100mg cPLL与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解，再将ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，充分反应后即得到ZEN-cPLL，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
(5)ZEN-cHRP的制备，步骤如下：将5～100mg cHRP与1～50mg ZEN分别用500～10000μL去离子水和50～1000μL二甲基甲酰胺溶解，再将ZEN溶液逐滴加入到上述蛋白质溶液中，混匀后，迅速加入50～1000μL甲醛，37℃下轻摇24h，充分反应后即得到ZEN-cHRP，接着用去离子水充分透析48h后，冻干备用。
其中，阳离子载体蛋白与ZEN的质量比例在1∶1～5∶1之间，二甲基甲酰胺和甲醛的体积比在1∶1～5∶1之间。
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