CN105548553B - 快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用 - Google Patents

快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用，其特征在于：包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体；所述抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。本发明提供的辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，可以同时检测辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素的总量；检测灵敏度高，最低检测限为10ng/mL。

Description

快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法 及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用。
背景技术
辣椒素类化合物是使辣椒具有辛辣刺激的主要化学物质，其成分主要包括辣椒素、二氢辣椒素、高二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素等化合物。其中辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类物质总量的90％，并提供了约90％的辣热感刺激。除了赋予食品辛辣味被用作调味品以外，辣椒素类物质还具有消炎镇痛、抗病菌、抗肿瘤作用，能促进脂肪燃烧、降低血脂，抑制胃酸分泌、对胃黏膜损伤有保护作用等药用价值。在食品加工领域，辣椒素类物质因其辛辣特性及特有的营养价值，被广泛应用于日常饮食当中。然而，辣椒素类物质也被证明是一种生物毒素，过多食用辣椒素类物质会引起动物身体不适，甚至产生休克现象。因此，检测食品中辣椒素类物质的成分含量对于指导辣味食品的安全生产及标准化管理具有重要意义。
现有的对辣椒素类物质的检测方法主要是精密仪器分析法，包括高效液相色谱法、气相色谱与质谱联用法、液相色谱与质谱及串联质谱联用的方法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求所检测的样品的纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境和检测人员要求高，难以实现快速检测，检测成本高，不适用于现场快速检测。免疫分析方法由于其特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点在近年来获得了快速发展。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析技术由于其检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，近年来在真菌毒素、农药残留等微量残留物的定性、在线、快速检测上得到了广泛应用。然而，目前国内外还未有将该方法应用于辣椒素类物质的检测中。由于我国的饮食习惯，辣椒食品丰富，但其产品说明中的辣味程度标示模糊，因此迫切需要能快速、准确、现场检测辣椒素类物质的技术，以实现对辣味食品中辣椒素类物质的统一的、规范化的生产。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用。该免疫层析试纸条可用于食品中辣椒素类物质的快速检测，具有操作简单、成本低廉、灵敏度高的特点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条(见图1)，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体；所述抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。
按上述方案，所述的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm，检测垫长23～30mm，宽3～4mm；金标垫长6～12mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。
按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。
按上述方案，所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8～15mm，所述检测线与质控线的间距为5～10mm。
按上述方案，所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：Pr载体蛋白。
按上述方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH，优选为卵清白蛋白OVA。
按上述方案，所述检测垫检测线上每厘米所需要的辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.125～0.6μg；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg。
按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的用量为400～980ng。
如上所述快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.2～1.2mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿8～15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.125～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.15～1.2mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的用量为400～980ng，然后真空冷冻干燥2～6小时，置干燥器中室温保存；所述抗辣椒素类物质通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条。
按上述方案，辣椒素类物质包被抗原的包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述的兔抗鼠多克隆抗体的包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
按上述方案，所述步骤(3)和步骤(4)中的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1～2g，蔗糖2～5g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
按上述方案，所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL 0.1mg/mL的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清白蛋白(OVA)水溶液至OVA终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
按上述方案，所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。
如上所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的应用，方法如下：
称取已磨细待测样品，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在60～90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加入10％甲醇-PBS溶液复溶，得到待测样品溶液，再取80-200μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，10-20分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照；
检测结果：
(1)阴性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色与对照试纸条上检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质含量低于10ng/mL；
(2)阳性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色比对照试纸条上检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质含量等于或高于10ng/mL并低于100ng/mL；当检测试纸条上质控线显色，并且检测线不显色时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质含量等于或高于100ng/mL；
(3)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线是否显色，该试纸条判为无效；
最后经换算即得待测样品中辣椒素类物质的含量。
该免疫层析试纸条在辣椒素类物质检测中的工作原理：当待测样品溶液加入到试纸条下端的样品垫上时，待测样品溶液通过毛细作用沿试纸条向吸水垫方向移动，当其移动至金标垫时，纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体被溶解。当样品中含有辣椒素类物质时，辣椒素类物质将和金标垫上的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体结合并一同向上泳动，其到达固定着辣椒素类物质包被抗原的检测线时，抗原将和辣椒素类物质竞争结合纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体上有限的抗原结合位点，样品中辣椒素类物质含量越高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体将越少，在检测线上形成的显色带颜色越浅。当检测线上的抗原所结合的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体少于一定的数量时，检测线处将不会有红色线条出现。无论样品中是否含有辣椒素类物质，未被检测线上的抗原截获的纳米金标记的抗辣椒素类物质的抗体或纳米金标记的抗辣椒素类物质的抗体与辣椒素类物质的结合物将继续移动到质控线并与质控线上的兔抗鼠多克隆抗体结合并被富集显色。据此，分别将检测试纸条上包被辣椒素类物质包被抗原的检测线与对照试纸条上相应检测线颜色进行显色对照，即可获得样品中辣椒素类物质含量情况。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，可以同时检测辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素的总量；检测灵敏度高。本发明提供的免疫层析试纸条对检测溶液中辣椒素类物质的最低检测限为10ng/mL。
(2)操作简单：用该辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条进行检测时只需将样品溶液逐滴加到试纸条的样品垫上即可，一步式操作，简单方便。
(3)检测过程中不需要辣椒素类物质标准溶液作为对照。本发明提供的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条检测样品时，只需要用空白样品作为阴性对照，不需要使用辣椒素类物质标准溶液作为阳性对照。且该方法的检测结果肉眼即可判读。
附图说明
图1为本发明提供的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的结构示意图。1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线。
图2为本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原紫外光谱图。
图3本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原紫外光谱图。
具体实施方式
实施例1抗辣椒素类物质单克隆抗体的获得
抗辣椒素类物质单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生的单克隆抗体，具体制备方法：
将杂交瘤细胞株YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心30min，吸取上清，将所得腹水上清与3倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h以上；4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，冰浴条件下缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量单克隆抗体，将抗体冻干粉置-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。
用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株YQQD8分泌的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的亚型为IgG1。
用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达2.56×106，即鼠腹水抗体稀释2.56×106倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对辣椒素类物质的50％抑制浓度IC50为5.8ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50％抑制浓度IC50依次为8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9％-170％。
杂交瘤细胞株YQQD8的获得：
a辣椒素类物质通用人工免疫抗原的制备
辣椒素类物质通用人工半抗原的制备：
称取香兰素胺盐酸盐0.28g溶于6ml四氢呋喃，搅拌滴加0.15g三乙胺，室温搅拌30min。准确称取丁二酸酐0.15g(0.0015mol)加入上述反应液中，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL乙酸乙酯室温搅拌2min，过滤后所得沉淀即为半抗原为4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄胺基]-4-羰基羧酸(4-[(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-4-oxobutanoic acid)，分子式为C12H15NO5。
经核磁鉴定结果为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.17(s,1H),8.87(s,1H),8.31(d,J＝6.0Hz,1H),4.21(d,J＝5.8Hz,2H),3.80(s,3H),2.52(t,J＝6.9Hz,2H),2.42(t,J＝6.7Hz,2H)。与其结果的理论值一致，表明该半抗原化合物成功合成。
辣椒素类物质通用人工完全抗原-免疫抗原的制备
称取上述辣椒素类物质通用人工半抗原20.3mg(约0.08mmol)和11.6mg(约0.1mmol)NHS于反应瓶中，加入400ulDMF溶解于反应瓶中，室温搅拌30min，称取20.6mg(约0.1mmol)DCC溶于100ulDMF中，将DCC/DMF溶液逐滴滴加至上述反应瓶，室温搅拌4h，4℃静置过夜。8000rpm/5min，取上清活泼酯液。
将上清活泼酯液，逐滴滴加到6ml 7mg/ml的BSA溶液中反应，反应缓冲液为0.2MpH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室温进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01MpH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-免疫抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图2，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。
辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原的制备
称上述辣椒素类物质通用人工半抗原4.55mg溶于200μL无水DMF中,然后按顺序加入4.27μL三正丁胺、2.34μL氯甲酸异丁酯,室温下搅拌反应1h，得活化的辣椒素类物质半抗原溶液。
将活化的辣椒素类物质半抗原溶液逐滴滴加到10ml 4.5mg/ml的OVA溶液中反应，反应缓冲液为0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室温进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01M pH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-包被抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图3，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。
b杂交瘤细胞株YQQD8的制备
1.动物免疫
购买7周龄BALB/c小鼠5只，免疫上述辣椒素类物质人工抗原-免疫抗原。第一次免疫将免疫抗原与等体积快免佐剂QuickAntibody-Mouse5W(购自北京博奥龙生物技术有限公司)迅速混匀后，于小鼠后腿小腿肌肉注射免疫小鼠。第21天、42天分别按同样方式加强免疫。3次免疫所用免疫抗原的剂量相同，均为每鼠12.5μg。每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第3次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，加强免疫时，采用小鼠腹腔注射峰方式，免疫抗原的用量为之前的2倍，不需要用佐剂混合。
2.细胞融合
于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1500)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以约5-10︰1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50％PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，用72mLRPMI-1640完全培养液将小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞重悬，将重悬细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640完全培养液含有20％(体积百分数)胎牛血清，10％(体积百分数)Clone 培养基和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体RPMI-1640完全培养基是指，在RPMI-1640完全培养液中加入1％(质量百分数)的甲基纤维素。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司；Clone 培养基购于北京博奥龙免疫技术有限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。
3.细胞株的筛选及克隆
待96孔板上的细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗辣椒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用辣椒素作为竞争原，与固定在ELISA板上的抗原竞争性的结合上清中的抗体，其中与辣椒素结合的抗体将会在之后的步骤被洗掉，与包被抗原结合的抗体则被固定在ELISA板上，加入HRP标记的羊抗鼠抗体及显色液后则会显色。竞争原辣椒素浓度越高，显色越浅，450nm处的吸光度值越低。选择未加竞争原时吸光值较高和灵敏度均较高的孔(此处吸光值较高指，竞争原为0的孔所测得吸光值，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度IC50值较小)。采用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养，克隆后待细胞集落长至肉眼可见大小时，分别将每个细胞集落挑至液体培养基中，采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆1次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株YQQD8。该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。
c抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系YQQD8抗体可变区序列测定
(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系YQQD8的总RNA；
(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScriptTM-2Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；
(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、55℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5，-GAV GTG AWG STG GTG GAG TC-3，(20mer)和5，-GAG GAG ACG GTG ACT GAGGT-3，(20mer)其中S、R和W为简并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为5，-RTT KTG ATG ACC CAR AC-3，(17mer)和5，-ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG-3，(20mer)。
得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长313bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由104个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长299bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由99个氨基酸组成，序列如SEQID NO:4所示。
实施例2：快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，步骤如下：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长16mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原即上述的辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原配制成浓度为0.5mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.3μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.5mg/mL的包被液，于距检测线5mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.3μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽4mm。
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长13mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的用量为800ng，然后真空冷冻干燥6小时，置干燥器中室温保存；
所述抗辣椒素类物质通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.4mL 0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL 0.1mg/mL的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清白蛋白(OVA)水溶液至OVA终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；
所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条。见图1。
上述快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条在食用油检测中的应用：
称取大豆油、玉米油和辣椒油样品各5g，分别加入50ml体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加入5ml 10％甲醇-PBS溶液复溶，得到待测样品溶液，再取180μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇-PBS溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，10分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照，读取结果：
检测结果：大豆油和玉米油样品检测试纸条的质控线显示出红色条带，检测线均与空白对照试纸条的检测限颜色相近，则判为阴性结果，由此判定：大豆油和玉米油中辣椒素类物质含量低于10ng/mL。辣椒油样品检测试纸条的质控线显示出红色条带，而检测线不显色，则判为阳性结果，表明辣椒油中辣椒素类物质的含量超过100ng/mL。其与高效液相色谱检测结果也是相符的。
高效液相色谱法检测：称取大豆油、玉米油和辣椒油样品各5g，分别加入50ml体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加5ml甲醇复溶，上机检测，结果显示大豆油和玉米油中未检出辣椒素类物质，辣椒油样品中辣椒素类物质含量为199ng/mL。
实施例3：快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，步骤如下：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长18mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原即上述的辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原配制成浓度为0.25mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿9mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.15μg，然后于37℃条件下干燥20分钟；
所述的包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.25mg/mL的包被液，于距检测线10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.15μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述的硝酸纤维素膜长28mm，宽4mm。
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长8mm宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的用量为720ng，然后真空冷冻干燥6小时，置干燥器中室温保存；
所述抗辣椒素类物质通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。
所述的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1g，蔗糖2g，叠氮化钠0.02g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。
所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2mL0.1mg/mL的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清白蛋白(OVA)水溶液至OVA终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；
所述的0.1mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条。见图1。
上述快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条在食用油检测中的应用：
将由超市购买的微辣薯片粉碎后，称取5g样品，加入50ml体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加入5ml 10％甲醇-PBS溶液复溶，得到待测样品溶液，再取180μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇-PBS溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，10分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照，读取结果：
检测结果：微辣薯片样品检测试纸条的质控线显示出红色条带，而检测线颜色比空白对照试纸条的检测线颜色浅，检测结果判为阳性，由此判定：微辣薯片样品中辣椒素类物质的含量高于10ng/mL，而低于100ng/mL。其与高效液相色谱检测结果也是相符的。
高效液相色谱法检测：将由超市购买的微辣薯片粉碎后，称取5g样品，加入50ml体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加5ml甲醇复溶，上机检测，结果显示微辣薯片样品中辣椒素类物质的含量30.6ng/mL。

Claims (10)

1.快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体；所述抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生。
2.根据权利要求1所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm，检测垫长23～30mm，宽3～4mm；金标垫长6～12mm，宽3～4mm；样品垫长12～15mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm。
3.根据权利要求1所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为8～15mm，所述检测线与质控线的间距为5～10mm。
4.根据权利要求1所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：Pr载体蛋白。
5.根据权利要求4所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。
6.根据权利要求1所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫检测线上每厘米所需要的辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.125～0.6μg；质控线上每厘米所需要的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg。
7.根据权利要求1所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的用量为400～980ng。
8.权利要求1所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备
检测线的包被：将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.2～1.2mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿8～15mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.125～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.15～1.2mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥6～12小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液，每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体的用量为400～980ng，然后真空冷冻干燥2～6小时，置干燥器中室温保存；所述抗辣椒素类物质通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生；
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条。
9.根据权利要求8所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：辣椒素类物质包被抗原的包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述的兔抗鼠多克隆抗体的包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述步骤(3)和步骤(4)中的封闭液每100mL中含有：卵清白蛋白1～2g，蔗糖2～5g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；
所述纳米金标记的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.4mL0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL 0.1mg/mL的抗辣椒素类物质通用单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清白蛋白(OVA)水溶液至OVA终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入40.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。
10.权利要求1所述的快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的应用，其特征在于：方法如下：
称取已磨细待测样品，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液，混匀，在60～90℃下回流1小时，冷却后，将提取液真空旋转干燥，加入10％甲醇-PBS溶液复溶，得到待测样品溶液，再取80-200μL该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，10-20分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照；
检测结果：
(1)阴性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色与对照试纸条上检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质含量低于10ng/mL；
(2)阳性：当检测试纸条上质控线显色，并且检测线颜色比对照试纸条上检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质含量等于或高于10ng/mL并低于100ng/mL；当检测试纸条上质控线显色，并且检测线不显色时，表明待测样品溶液中辣椒素类物质含量等于或高于100ng/mL；
(3)无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线是否显色，该试纸条判为无效；最后经换算即得待测样品中辣椒素类物质的含量。
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