CN111208296A - 一种检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条、其制备方法及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，所述桶装胶体金微孔试纸条包括胶体金微孔和检测试纸条；所述胶体金微孔包被有辣椒素单克隆抗体；所述检测试纸条上依次设置有样品垫、包被辣椒素完全抗原的T线、包被羊抗鼠二抗的C线和吸水垫。本发明所述桶装胶体金微孔试纸条的特异性强、灵敏度高、性能稳定、操作简便、检测结果肉眼可判，其可用于地沟油的快速鉴定，为食品安全市场监管人员提供了便利，为人民群众的健康提供了有力保障。

Description

一种检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条、其制备 方法及其检测方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测食用油中辣椒素的桶装胶 体金微孔试纸条、其制备方法及其检测方法。
背景技术
目前，国外对地沟油的检测方法报道较少，其关注点主要集中在预防阶 段；而我国国内虽有多达上百种的检测技术，但至今尚未形成统一的国家标 准。常规检测方法主要包括水含量测定方法、酸价测定方法等，这些方法虽 然简简单易行，但检测灵敏度、特异性及准确性均存在不足；其他的检测方 法则包括各类色谱法、色谱-质谱串联测定法等，这些方法虽然检测结果准确， 但成本昂贵，不适用于现场大规模筛查。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种以地沟油中的特殊稳定外源性标志物 ——辣椒素为研究重点，结合免疫学胶体金快速检测技术，开发了一种检测 食用油外源标志物辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，该桶装胶体金微孔试纸 条的特异性强、灵敏度高、性能稳定、操作简便、检测结果肉眼可判，其可 用于地沟油的快速鉴定，为食品安全市场监管人员提供了便利，为人民群众 的健康提供了有力保障。胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体反应的一种免疫学分析检测技术。该技术使用方便快速，成本低廉，应用范围广，对人体无毒害，可通过肉眼直接判读检测结果。
用于实现上述目的的技术方案如下：
本发明提供一种检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，所述桶 装胶体金微孔试纸条包括胶体金微孔和检测试纸条；
所述胶体金微孔包被有辣椒素单克隆抗体；
所述检测试纸条上依次设置有样品垫、包被辣椒素完全抗原的T线、包 被羊抗鼠二抗的C线和吸水垫。
在一个实施方案中，本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微 孔试纸条中，所述辣椒素完全抗原的制备方法包括以下步骤：
(1)将香兰素胺盐酸盐0.8-1mmol、四氢呋喃5-7ml和三乙胺10-15 mmol混合，在室温下搅拌30-40min；
(2)将步骤(1)得到的混合物与丁二酸酐1-2mmol混合，在室温下 搅拌4-6h；
优选地，将步骤(1)得到的混合物与丁二酸酐1-2mmol混合，在室温 下搅拌4-6h至TLC监测原料点消失；
(3)将步骤(2)得到的混合物与水10-12mL、乙酸乙酯8-10mL混合， 在室温下搅拌3-5min；
(4)将步骤(3)得到的混合物与饱和碳酸氢钠5-7mL混合，搅拌均 匀，分液，后将水相的pH调至2-3；
(5)将步骤(4)得到的混合物用乙酸乙酯8-10mL萃取2～3次，合并 得到的乙酸乙酯相，干燥，后用3-4mL甲醇进行重结晶，得到如式I所示的 辣椒素半抗原；其中所述辣椒素半抗原的分子式为C12H15NO5，相对分子量 为253.2；
Figure BDA0002371128160000031
(6)将步骤(5)得到的辣椒素半抗原0.1-0.15mmol与DMF 200-300μL、 三正丁胺0.1-0.2mmol、氯甲酸异丁酯0.1-0.2mmol混合，震荡1-2h；
(7)将步骤(6)得到的混合物与牛血清白蛋白混合，在室温下搅拌4-6 h，后置于浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液中透析，收集透析液，得到如式II 所示的辣椒素完全抗原；
优选地，每12h更换一次所述磷酸盐缓冲液；
优选地，所述牛血清白蛋白的浓度为5-6mg/ml；
优选地，所述辣椒素半抗原与所述牛血清白蛋白的偶联比为60～70:1；
优选地，所述透析温度为4～8℃；
优选地，所述透析时间为2～3天；
Figure BDA0002371128160000032
在一个实施方案中，本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微 孔试纸条中，所述胶体金微孔的制备方法包括：
(1)将加热至沸腾的质量分数为0.02％的氯金酸水溶液与质量体积比为 10％的柠檬酸三钠溶液混合，继续煮沸，冷却后得到胶体金溶液；优选地， 所述氯金酸与所述柠檬酸三钠的质量比为1:1.2；
(2)向步骤(1)得到的胶体金溶液中添加0.1mol/L的K2CO3溶液至 pH为6.0～6.5；
(3)将步骤(2)得到的溶液与辣椒素单克隆抗体的稀释液混合，反应 20～30min；后添加质量分数为1～2％的牛血清白蛋白溶液进行封闭，离心， 弃去上清液，取沉淀物；
其中，所述步骤(2)得到的溶液与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的 体积比为25:2；
所述牛血清白蛋白与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为5:4；
所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的制备方法为：将辣椒素单克隆抗体与 水混合至浓度为8-10μg/mL；所述辣椒素单克隆抗体为中国农业科学院油料 作物研究所制备的、编号为YQQD8细胞株产生的抗辣椒素单克隆抗体，该 YQQD8细胞株冻存于中国农业科学院油料作物研究所；
优选地，所述辣椒素单克隆抗体的浓度为6.0mg/mL；
(4)将步骤(3)得到的沉淀物与浓度为0.2mol/L的硼酸盐缓冲液混 合，得到混合物，将该混合物添加至微孔中，冻干，得到胶体金微孔；
优选地，所述步骤(3)得到的沉淀物与所述硼酸盐缓冲液的体积比为 1:8～10；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的pH为8.5～9；
优选地，将所述胶体金微孔于温度为2～8℃下保存，优选地，将所述胶 体金微孔于温度为4℃下保存；
优选地，所述步骤(4)中的冻干程序依次为：在温度为-50℃下保持4-6 h；在温度为-25℃下保持4-6h；在温度为-15℃下保持4-6h；在温度为5℃下 保持4-6h；在温度为25℃下保持6-8h。
在一个实施方案中，本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微 孔试纸条中，所述样品垫的制备方法为：将玻璃纤维垫浸泡于0.04-0.06mol/L 的磷酸缓冲液中，后晾干；其中所述磷酸缓冲液含有体积分数为0.3～0.5％的 曲拉通X-100。
在一个实施方案中，本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微 孔试纸条中，所述检测试纸条为硝酸纤维素膜；优选地，所述吸水垫为吸水 性材料。
在一个实施方案中，本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微 孔试纸条中，所述包被辣椒素完全抗原的T线的划线方法为：将所述辣椒素 完全抗原与水混合至浓度为5～6mg/ml的辣椒素完全抗原溶液；将得到的辣 椒素完全抗原溶液与磷酸盐缓冲液混合，得到T线包被溶液；将得到的T线 包被溶液在所述检测试纸条上划膜，后置于温度为50～60℃下烘烤12～18h；
其中，所述T线包被溶液的浓度为1-1.5mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.03mol/L，优选0.02mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液中含有质量分数为0.5～1％的海藻糖。
在一个实施方案中，本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微 孔试纸条中，所述包被羊抗鼠二抗的C线的划线方法为：将所述羊抗鼠二抗 与磷酸盐缓冲液混合，得到C线包被溶液；将得到的C线包被溶液在所述检 测试纸条上划膜，后置于温度为50～60℃下烘烤12～18h；
其中，所述羊抗鼠二抗的浓度为12.5～14.5mg/ml；优选13.7mg/ml；
所述C线包被溶液的浓度为1-1.5mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.03mol/L，优选0.02mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液中含有质量分数为0.5～1％的海藻糖。
在所述检测试纸条上依次设置样品垫、包被辣椒素完全抗原的T线、包 被羊抗鼠二抗的C线和吸水垫；具体而言，将固定好T、C线的检测试纸条 依次贴上样品垫和吸水垫，然后切成固定宽度为4.0mm的试纸条，将该试 纸条与所述胶体金微孔组装于所述试纸桶内，密封干燥保存。
本发明还提供一种使用本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金 微孔试纸条的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将食用油样本与水基试剂混合，离心后取水相溶液；将得到的水相 溶液与磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液混合，得到待测样本处理液；
其中，所述水基试剂为含有5-10％NaCl的0.1-0.2mol/L NaOH溶液；
所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的浓度为0.05～0.15mol/L；
(2)将所述待测样本处理液置于所述胶体金微孔中，静置；后将所述检 测试纸条上的所述样品垫部分浸入所述胶体金微孔中，静置，观察T线和C 线；通过比色法来判别结果，若T线显色较C线浅，则判为阳性，表示食用 油中含有辣椒素；若T线显色同C线或较C线深，则判为阴性，表示食用油 中不含有辣椒素；若C线不显色，无论T线是否显色，表示所述检测方法的 操作不正确或所述桶装胶体金微孔试纸条已变质失效。
在一个实施方案中，本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微 孔试纸条的检测方法包括以下步骤：
(1)将食用油样本与水基试剂混合，离心，取水相溶液；后将所述水相 溶液与磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液混合，得到待测样本处理液；
其中，所述食用油样本与所述水基试剂的体积比为1:0.5；
所述水基试剂为含有5-10％NaCl的0.1-0.2mol/L NaOH溶液；
所述水相溶液与所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的体积比为2:1；
所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的pH为5.0-5.5；
所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的浓度为0.1mol/L；
(2)将所述待测样本处理液置于所述胶体金微孔中，静置3～5min，后 将所述检测试纸条上的所述样品垫部分浸入所述胶体金微孔中，静置5～10 min后取出；通过比色法来判别结果，若T线显色较C线浅，则判为阳性，表 示食用油中含有辣椒素；若T线显色同C线或较C线深，则判为阴性，表示 食用油中不含有辣椒素；若C线不显色，无论T线是否显色，表示所述检测 方法的操作不正确或所述桶装胶体金微孔试纸条已变质失效。
本发明还提供一种本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔 试纸条以及使用本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条 的检测方法在检测食用油中辣椒素中的应用。
本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条的检测方法 中，利用辣椒素在不同溶液中的溶解差异性，采用水基试剂(即含有5-10％NaCl 的0.1-0.2mol/LNaOH溶液)来提取食用油中的辣椒素，避免使用对环境有毒 副作用的有机试剂，并减少食用油样本前处理中的复杂操作步骤，简单实用。
本发明所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，其特异性 强、灵敏度高、性能稳定、操作简便，可在10-15min实现对地沟油的快速鉴 定。与此同时，该该桶装胶体金微孔试纸条的使用不受场地限制，检测结果肉 眼可判，非常适用于现场大规模抽检，为食品安全市场监管人员提供了便利， 为人民群众的健康提供了有力保障。
本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条的制备是建 立免疫学分析方法基础之上的，首先需制备所述辣椒素完全抗原和对辣椒素完 全抗原具有特异性强、亲和力高的辣椒素单克隆抗体。由于辣椒素分子量较小， 不具备刺激机体产生针对辣椒素抗原决定簇的特异性抗体，作为小分子的抗原 必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性。在完成辣椒素完全抗原的合成制备 后，通过完全抗原免疫小鼠，筛选获得持续分泌高特异性和亲和力的单克隆抗 体的细胞株，可保证抗辣椒素单抗原料的持续稳定供给。
本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条主要由金标 抗体胶体金微孔和包被辣椒素完全抗原的T线、包被羊抗鼠二抗的C线划线 的检测试纸条试纸条组成，其在反应条件、稀释液成分等方面均需摸索适宜本 发明的工艺条件。
本发明所述待测样本处理液的制备是食用油样本检测的重要前提。本发 明检测准确性的保证不仅需要稳定的检测方法，也需要食用油样本中的待测物 被充分提取。食用油样本前处理的难易程度也关乎所述检测效率的高低。本发 明采用水基试剂(含有5-10％NaCl的0.1-0.2mol/L NaOH溶液)提取法，利 用辣椒素在不同溶液中的溶解差异性，通过在食用油样本中加入水基试剂，无 需有机试剂即可实现目标物辣椒素的萃取分离，操作简便、无毒，易于推广。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条中的 试纸条结构。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例 仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中 所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明采用的主要试剂：检测试纸条购自赛多利斯科学仪器(北京)有 限公司；辣椒素单克隆抗体为中国农业科学院油料作物研究所制备的、编号 为YQQD8细胞株产生的抗辣椒素单克隆抗体，该YQQD8细胞株冻存于中国 农业科学院油料作物研究所；羊抗鼠二抗购自Jackson ImmunoResearch。
实施例1：制备本发明所述辣椒素完全抗原
本发明所述辣椒素完全抗原的制备方法包括以下步骤：
(1)将香兰素胺盐酸盐0.8mmol、四氢呋喃5ml和三乙胺10mmol混 合，在室温下搅拌30min；
(2)将步骤(1)得到的混合物与丁二酸酐1mmol混合，在室温下搅 拌4h，至TLC监测原料点消失；
(3)将步骤(2)得到的混合物与水10mL、乙酸乙酯8mL混合，在 室温下搅拌3min；
(4)将步骤(3)得到的混合物与饱和碳酸氢钠5mL混合，搅拌均匀， 分液，后将水相的pH调至2；
(5)将步骤(4)得到的混合物用乙酸乙酯8mL萃取两次，合并两次 得到的乙酸乙酯相，干燥，后用3mL甲醇进行重结晶，得到如式I所示的 辣椒素半抗原；所述辣椒素半抗原的分子式为C12H15NO5，相对分子量为 253.2；
(6)将步骤(5)得到的辣椒素半抗原0.1mmol与DMF 200μL、三正 丁胺0.1mmol和氯甲酸异丁酯0.1mmol混合，震荡1h；
(7)将步骤(6)得到的混合物与牛血清白蛋白混合，在室温下搅拌4h， 后置于0.01M的磷酸盐缓冲液中在温度为4℃下透析2天，收集透析液，得 到如式II所示的辣椒素完全抗原；其中每12h更换一次所述磷酸盐缓冲液； 所述牛血清白蛋白的浓度为5mg/ml；所述辣椒素半抗原与所述牛血清白蛋 白的偶联比为60:1。
实施例2：制备本发明所述辣椒素完全抗原
本发明所述辣椒素完全抗原的制备方法包括以下步骤：
(1)将香兰素胺盐酸盐1mmol、四氢呋喃7ml和三乙胺15mmol混合， 在室温下搅拌40min；
(2)将步骤(1)得到的混合物与丁二酸酐2mmol混合，在室温下搅 拌6h，至TLC监测原料点消失；
(3)将步骤(2)得到的混合物与水12mL、乙酸乙酯10mL混合，在 室温下搅拌5min；
(4)将步骤(3)得到的混合物与饱和碳酸氢钠7mL混合，搅拌均匀， 分液，后将水相的pH调至3；
(5)将步骤(4)得到的混合物用乙酸乙酯10mL萃取两次，合并两次 得到的乙酸乙酯相，干燥，后用4mL甲醇进行重结晶，得到如式I所示的 辣椒素半抗原；所述辣椒素半抗原的分子式为C12H15NO5，相对分子量为 253.2；
(6)将步骤(5)得到的辣椒素半抗原0.15mmol与DMF 300μL、三 正丁胺0.2mmol和氯甲酸异丁酯0.2mmol混合，震荡2h；
(7)将步骤(6)得到的混合物与牛血清白蛋白混合，在室温下搅拌6h， 后置于0.01M的磷酸盐缓冲液中在温度为8℃下透析3天，收集透析液，得 到如式II所示的辣椒素完全抗原；其中每12h更换一次所述磷酸盐缓冲液； 所述牛血清白蛋白的浓度为5-6mg/ml；所述辣椒素半抗原与所述牛血清白 蛋白的偶联比为70:1。
实施例3：制备本发明所述胶体金微孔
本发明所述胶体金微孔的制备方法包括以下步骤：
(1)向加热至沸腾的质量分数为0.02％的氯金酸水溶液(其中氯金酸为 0.2g)中添加质量体积比为10％的柠檬酸三钠溶液(其中柠檬酸三钠为0.24 g)，继续煮沸，冷却后得到胶体金溶液，其中；
(2)向步骤(1)得到的胶体金溶液中添加0.1mol/L的K2CO3溶液至 pH为6.0；
(3)将所述浓度为6.0mg/mL的辣椒素单克隆抗体与水混合至浓度为8 μg/mL，得到所述辣椒素单克隆抗体的稀释液；然后将步骤(2)得到的溶液 与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液混合，反应20min；然后添加质量分数为 1％的牛血清白蛋白进行封闭，离心，弃去上清液，取沉淀物；其中所述步骤 (2)得到的溶液与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为25:2；所述 牛血清白蛋白与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为5:4；
(4)将步骤(3)得到的沉淀物与浓度为0.2mol/L、pH为8.5的硼酸 盐缓冲液以体积比为1:8进行混合，得到混合物，将该混合物添加至微孔中， 冻干，得到胶体金微孔，将该胶体金微孔于温度为2℃下保存；
上述冻干程序依次为：在温度为-50℃下保持4h，在温度为-25℃下保持 4h，在温度为-15℃下保持4h，在温度为5℃下保持4h，在温度为25℃下保 持6h。
实施例4：制备本发明所述胶体金微孔
本发明所述胶体金微孔的制备方法包括以下步骤：
(1)向加热至沸腾的质量分数为0.02％的氯金酸水溶液(其中氯金酸为 0.8g)中添加质量体积比为10％的柠檬酸三钠溶液(其中柠檬酸三钠为0.96 g)，继续煮沸，冷却后得到胶体金溶液；
(2)向步骤(1)得到的胶体金溶液中添加0.1mol/L的K2CO3溶液至 pH为6.5；
(3)将所述浓度为6.0mg/mL的辣椒素单克隆抗体与水混合至浓度为 10μg/mL，得到所述辣椒素单克隆抗体的稀释液；然后将步骤(2)得到的 溶液与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液混合，反应30min；然后添加质量分 数为2％的牛血清白蛋白进行封闭，离心，弃去上清液，取沉淀物；其中所 述步骤(2)得到的溶液与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为25:2； 所述牛血清白蛋白与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为5:4；
(4)将步骤(3)得到的沉淀物与浓度为0.2mol/L、pH为9的硼酸盐 缓冲液以体积比为1:10进行混合，得到混合物，将该混合物添加至微孔中， 冻干，得到胶体金微孔，将该胶体金微孔于温度为8℃下保存；
上述冻干程序依次为：在温度为-50℃下保持6h，在温度为-25℃下保持 6h，在温度为-15℃下保持6h，在温度为5℃下保持6h，在温度为25℃下保 持8h。
实施例5：制备本发明所述胶体金微孔
本发明所述胶体金微孔的制备方法包括以下步骤：
(1)向加热至沸腾的质量分数为0.02％的氯金酸水溶液(其中氯金酸为 0.9g)中添加质量体积比为10％的柠檬酸三钠溶液(其中柠檬酸三钠为1.08 g)继续煮沸，冷却后得到胶体金溶液；
(2)向步骤(1)得到的胶体金溶液中添加0.1mol/L的K2CO3溶液至 pH为6.2；
(3)将所述浓度为6.0mg/mL的辣椒素单克隆抗体与水混合至浓度为9 μg/mL，得到所述辣椒素单克隆抗体的稀释液；然后将步骤(2)得到的溶液 与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液混合，反应25min；然后添加质量分数为 2％的牛血清白蛋白进行封闭，离心，弃去上清液，取沉淀物；其中，所述步 骤(2)得到的溶液与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为25:2；所 述牛血清白蛋白与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为5:4；
(4)将步骤(3)得到的沉淀物与浓度为0.2mol/L、pH为9的硼酸盐 缓冲液以体积比为1:10进行混合，得到混合物，将该混合物添加至微孔中， 冻干，得到胶体金微孔，将该胶体金微孔于温度为4℃下保存；
上述冻干程序依次为：在温度为-50℃下保持6h，在温度为-25℃下保持 6h，在温度为-15℃下保持6h，在温度为5℃下保持6h，在温度为25℃下保 持8h。
实施例6：制备本发明所述样品垫
将玻璃纤维垫浸泡于0.04～0.006mol/L的含有体积分数为0.3％的曲拉通X-100磷酸缓冲液中保持3～5min，后晾干，得到本发明所述样品垫。
实施例7：本发明所述包被辣椒素完全抗原的T线的划线
将所述辣椒素完全抗原与水混合至浓度为5mg/ml的辣椒素完全抗原溶 液，将该辣椒素完全抗原溶液与浓度为0.01mol/L的含有质量分数为0.5％ 的海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1mg/ml的T线包被溶液；将该 T线包被溶液在所述硝酸纤维素膜上划膜，后置于温度为50℃下烘烤12h。
实施例8：本发明所述包被辣椒素完全抗原的T线的划线
将所述辣椒素完全抗原与水混合至浓度为6mg/ml的辣椒素完全抗原溶 液，将该辣椒素完全抗原溶液与浓度为0.03mol/L的含有质量分数为1％的 海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1.5mg/ml的T线包被溶液；将该 T线包被溶液在所述硝酸纤维素膜上划膜，后置于温度为60℃下烘烤18h。
实施例9：本发明所述包被辣椒素完全抗原的T线的划线
将所述辣椒素完全抗原与水混合至浓度为5.5mg/ml的辣椒素完全抗原 溶液，将该辣椒素完全抗原溶液与浓度为0.02mol/L的含有质量分数为1％ 的海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1.5mg/ml的T线包被溶液；将 该T线包被溶液在所述硝酸纤维素膜上划膜，后置于温度为55℃下烘烤16h。
实施例10：本发明所述包被羊抗鼠二抗的C线的划线
将所述浓度为12.5mg/ml的羊抗鼠二抗与浓度为0.01mol/L的含有0.5％ 的海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1mg/ml的C线包被溶液；将该 C线包被溶液在所述硝酸纤维素膜上划膜，后置于温度为50℃下烘烤12h。
实施例11：本发明所述包被羊抗鼠二抗的C线的划线
将所述浓度为14.5mg/ml的羊抗鼠二抗与浓度为0.03mol/L的含有1％ 的海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1.5mg/ml的C线包被溶液；将 该C线包被溶液在所述硝酸纤维素膜上划膜，后置于温度为60℃下烘烤18 h。
实施例12：本发明所述包被羊抗鼠二抗的C线的划线
将所述浓度为13.7mg/ml的羊抗鼠二抗与浓度为0.02mol/L的含有1％ 的海藻糖的磷酸盐缓冲液混合，得到浓度为1.5mg/ml的C线包被溶液；将 该C线包被溶液在所述硝酸纤维素膜上划膜，后置于温度为60℃下烘烤18 h。
实施例13：利用本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条检测食 用油
将上述固定好T、C线的硝酸纤维素膜依次贴上上述制备的样品垫和吸 水垫，然后切成固定宽度为4.0mm的试纸条，将该试纸条与所述胶体金微 孔组装于所述试纸桶内，密封干燥保存。
利用本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条检测食用 油的步骤：
配置含有5％NaCl的0.1mol/L NaOH溶液，作为水基试剂。
取食用油样本1mL置于10mL离心管中，然后添加上述水基试剂0.5mL， 混合，离心，然后吸取下层的水相溶液；然后将该水相溶液1mL与浓度为0.05 mol/L的pH为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液0.5mL混合，得到待测样本处 理液；
将所述胶体金微孔在室温下平衡，然后将上述待测样本处理液150μL添 加至所述胶体金微孔中吹打均匀，静置3～5min，后将所述试纸条的样品垫 部分浸入所述胶体金微孔中，静置5～10min后取出，观察T线和C线。通 过比色法判别检测结果，若T线显色相比于C线较浅，则判为阳性；若T 线显色与C线相同或者T线显色相比于C线较深，则判为阴性；若C线不 显色，则无论T线是否显色，表示操作不正确或试纸条已变质失效，如图1 所示。
实施例14：利用本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条检测食 用油
将上述固定好T、C线的硝酸纤维素膜依次贴上上述制备的样品垫和吸 水垫，然后切成固定宽度为4.0mm的试纸条，将该试纸条与所述胶体金微 孔组装于所述试纸桶内，密封干燥保存。
利用本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条检测食用 油的步骤：
配置含有10％NaCl的0.2mol/L NaOH溶液，作为水基试剂。
取食用油样本2mL置于10mL离心管中，然后添加上述水基试剂1mL， 混合，离心，然后吸取下层的水相溶液；然后将该水相溶液2mL与浓度为0.1 mol/L的pH为5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液1mL混合，得到待测样本处理 液；
将所述胶体金微孔在室温下平衡，然后将上述待测样本处理液150μL添 加至所述胶体金微孔中吹打均匀，静置3～5min，后将所述试纸条的样品垫 部分浸入所述胶体金微孔中，静置5～10min后取出，观察T线和C线。通 过比色法判别检测结果，若T线显色相比于C线较浅，则判为阳性；若T 线显色与C线相同或者T线显色相比于C线较深，则判为阴性；若C线不 显色，则无论T线是否显色，表示操作不正确或试纸条已变质失效，如图1 所示。
通过以上实施例可以看出，本发明所述检测食用油中辣椒素的桶装胶体 金微孔试纸条及其检测方法，特异性强、灵敏度高、性能稳定、操作简便，可 在10-15min实现对地沟油的快速鉴定。
总之，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技 术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，所述桶装胶体金微孔试纸条包括胶体金微孔和检测试纸条；
所述胶体金微孔包被有辣椒素单克隆抗体；
所述检测试纸条上依次设置有样品垫、包被辣椒素完全抗原的T线、包被羊抗鼠二抗的C线和吸水垫。
2.根据权利要求1所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，其特征在于，所述辣椒素完全抗原的制备方法包括以下步骤：
(1)将香兰素胺盐酸盐0.8-1mmol、四氢呋喃5-7ml和三乙胺10-15mmol混合，在室温下搅拌30-40min；
(2)将步骤(1)得到的混合物与丁二酸酐1-2mmol混合，在室温下搅拌4-6h；
优选地，将步骤(1)得到的混合物与丁二酸酐1-2mmol混合，在室温下搅拌4-6h至TLC监测原料点消失；
(3)将步骤(2)得到的混合物与水10-12mL、乙酸乙酯8-10mL混合，在室温下搅拌3-5min；
(4)将步骤(3)得到的混合物与饱和碳酸氢钠5-7mL混合，搅拌均匀，分液，后将水相的pH调至2-3；
(5)将步骤(4)得到的混合物用乙酸乙酯8-10mL萃取2～3次，合并得到的乙酸乙酯相，干燥，后用3-4mL甲醇进行重结晶，得到如式I所示的辣椒素半抗原；其中所述辣椒素半抗原的分子式为C12H15NO5，相对分子量为253.2；
Figure FDA0002371128150000021
(6)将步骤(5)得到的辣椒素半抗原0.1-0.15mmol与DMF 200-300μL、三正丁胺0.1-0.2mmol、氯甲酸异丁酯0.1-0.2mmol混合，震荡1-2h；
(7)将步骤(6)得到的混合物与牛血清白蛋白混合，在室温下搅拌4-6h，后置于浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液中透析，收集透析液，得到如式II所示的辣椒素完全抗原；
优选地，每12h更换一次所述磷酸盐缓冲液；
优选地，所述牛血清白蛋白的浓度为5-6mg/ml；
优选地，所述辣椒素半抗原与所述牛血清白蛋白的偶联比为60～70:1；
优选地，所述透析温度为4～8℃；
优选地，所述透析时间为2～3天；
Figure FDA0002371128150000022
3.根据权利要求1所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，其特征在于，所述胶体金微孔的制备方法包括：
(1)将加热至沸腾的质量分数为0.02％的氯金酸水溶液与质量体积比为10％的柠檬酸三钠溶液混合，继续煮沸，冷却后得到胶体金溶液；优选地，所述氯金酸与所述柠檬酸三钠的质量比为1:1.2；
(2)向步骤(1)得到的胶体金溶液中添加0.1mol/L的K2CO3溶液至pH为6.0～6.5；
(3)将步骤(2)得到的溶液与辣椒素单克隆抗体的稀释液混合，反应20～30min；后添加质量分数为1～2％的牛血清白蛋白溶液进行封闭，离心，弃去上清液，取沉淀物；
其中，所述步骤(2)得到的溶液与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为25:2；
所述牛血清白蛋白与所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的体积比为5:4；
所述辣椒素单克隆抗体的稀释液的制备方法为：将辣椒素单克隆抗体与水混合至浓度为8-10μg/mL；
优选地，所述辣椒素单克隆抗体的浓度为6.0mg/mL；
(4)将步骤(3)得到的沉淀物与浓度为0.2mol/L的硼酸盐缓冲液混合，得到混合物，将该混合物添加至微孔中，冻干，得到胶体金微孔；
优选地，所述步骤(3)得到的沉淀物与所述硼酸盐缓冲液的体积比为1:8～10；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的pH为8.5～9；
优选地，将所述胶体金微孔于温度为2～8℃下保存，优选地，将所述胶体金微孔于温度为4℃下保存；
优选地，所述步骤(4)中的冻干程序依次为：在温度为-50℃下保持4-6h；在温度为-25℃下保持4-6h；在温度为-15℃下保持4-6h；在温度为5℃下保持4-6h；在温度为25℃下保持6-8h。
4.根据权利要求1所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，其特征在于，所述样品垫的制备方法为：将玻璃纤维垫浸泡于0.04-0.06mol/L的磷酸缓冲液中，后晾干；其中所述磷酸缓冲液含有体积分数为0.3～0.5％的曲拉通X-100。
5.根据权利要求1所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，其特征在于，所述检测试纸条为硝酸纤维素膜；优选地，所述吸水垫为吸水性材料。
6.根据权利要求1所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，其特征在于，所述包被辣椒素完全抗原的T线的划线方法为：将所述辣椒素完全抗原与水混合至浓度为5～6mg/ml的辣椒素完全抗原溶液；将得到的辣椒素完全抗原溶液与磷酸盐缓冲液混合，得到T线包被溶液；将得到的T线包被溶液在所述检测试纸条上划膜，后置于温度为50～60℃下烘烤12～18h；
其中，所述T线包被溶液的浓度为1-1.5mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.03mol/L，优选0.02mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液中含有质量分数为0.5～1％的海藻糖。
7.根据权利要求1所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条，其特征在于，所述包被羊抗鼠二抗的C线的划线方法为：将所述羊抗鼠二抗与磷酸盐缓冲液混合，得到C线包被溶液；将得到的C线包被溶液在所述检测试纸条上划膜，后置于温度为50～60℃下烘烤12～18h；
其中，所述羊抗鼠二抗的浓度为12.5～14.5mg/ml；优选13.7mg/ml；
所述C线包被溶液的浓度为1-1.5mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01～0.03mol/L，优选0.02mg/ml；
所述磷酸盐缓冲液中含有质量分数为0.5～1％的海藻糖。
8.一种使用根据权利要求1至7中任一项所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将食用油样本与水基试剂混合，离心后取水相溶液；将得到的水相溶液与磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液混合，得到待测样本处理液；
其中，所述水基试剂为含有5-10％NaCl的0.1-0.2mol/L NaOH溶液；
所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的浓度为0.05～0.15mol/L；
(2)将所述待测样本处理液置于所述胶体金微孔中，静置；后将所述检测试纸条上的所述样品垫部分浸入所述胶体金微孔中，静置，观察T线和C线。
9.根据权利要求8所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将食用油样本与水基试剂混合，离心，取水相溶液；后将所述水相溶液与磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液混合，得到待测样本处理液；
其中，所述食用油样本与所述水基试剂的体积比为1:0.5；
所述水基试剂为含有5-10％NaCl的0.1-0.2mol/L NaOH溶液；
所述水相溶液与所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的体积比为2:1；
所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的pH为5.0-5.5；
所述磷酸氢二钠-柠檬酸稀释液的浓度为0.1mol/L；
(2)将所述待测样本处理液置于所述胶体金微孔中，静置3～5min，后将所述检测试纸条上的所述样品垫部分浸入所述胶体金微孔中，静置5～10min后取出。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条以及使用根据权利要求1至7中任一项所述的检测食用油中辣椒素的桶装胶体金微孔试纸条的检测方法在检测食用油中辣椒素中的应用。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1083083A (zh) * 1992-08-28 1994-03-02 安徽省分析测试中心 自红辣椒中提取辣椒红色素和辣椒素的新工艺
CN105004844A (zh) * 2014-05-30 2015-10-28 北京勤邦生物技术有限公司 一种庆大霉素残留检测试纸条及其应用
CN105548553A (zh) * 2016-02-04 2016-05-04 中国农业科学院油料作物研究所 快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用
CN105669482A (zh) * 2015-12-29 2016-06-15 深圳市易瑞生物技术有限公司 一种联苯菊酯半抗原及其快速检验装置及其制备方法
CN107118121A (zh) * 2017-05-31 2017-09-01 江苏师范大学 一种辣椒碱前处理的方法
CN107942052A (zh) * 2017-09-29 2018-04-20 杭州南开日新生物技术有限公司 一种检测β‑兴奋剂类药物的胶体金试剂盒及其制备方法
CN110133259A (zh) * 2019-04-28 2019-08-16 华南农业大学 一种他达那非及其类似物的胶体金微孔法检测试剂盒及其制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1083083A (zh) * 1992-08-28 1994-03-02 安徽省分析测试中心 自红辣椒中提取辣椒红色素和辣椒素的新工艺
CN105004844A (zh) * 2014-05-30 2015-10-28 北京勤邦生物技术有限公司 一种庆大霉素残留检测试纸条及其应用
CN105669482A (zh) * 2015-12-29 2016-06-15 深圳市易瑞生物技术有限公司 一种联苯菊酯半抗原及其快速检验装置及其制备方法
CN105548553A (zh) * 2016-02-04 2016-05-04 中国农业科学院油料作物研究所 快速检测辣椒素类物质的胶体金免疫层析试纸条、制备方法及其应用
CN107118121A (zh) * 2017-05-31 2017-09-01 江苏师范大学 一种辣椒碱前处理的方法
CN107942052A (zh) * 2017-09-29 2018-04-20 杭州南开日新生物技术有限公司 一种检测β‑兴奋剂类药物的胶体金试剂盒及其制备方法
CN110133259A (zh) * 2019-04-28 2019-08-16 华南农业大学 一种他达那非及其类似物的胶体金微孔法检测试剂盒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王龙星 等: "非正常食用油鉴别新方法（一）：三种辣椒碱残留量的液相色谱-质谱分析", 《色谱》 *

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