CN104977276A - 一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，具体通过分别制备抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体和抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体，然后通过偶联的方法将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定在检测芯片上，将不同浓度的牛乳β-乳球蛋白流经检测芯片，加入抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号，从而达到快速高效检测牛乳β-乳球蛋白主要过敏原蛋白的目的。本发明方法具有灵敏度高、准确度高、检测快捷等特点，可成为牛乳过敏原检测的重要技术手段。

Description

一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法。

背景技术

FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品中，牛乳及其制品就是其中之一。在欧美的食品标签法中也规定了牛                                                                                             乳是必须标示的食物过敏原成分。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，βLG)是牛乳中的主要过敏原，牛乳过敏原βLG的检测方法目前主要是针对牛乳中特异性过敏原蛋白质或编码过敏原的DNA片段。以DNA片段为检测目标的检测的手段，依赖聚合酶链式反应（PCR）来扩增特定的DNA片段，检测食品中过敏原基因的DNA残留，这种技术是把编码过敏原蛋白的DNA作为食物过敏物质的检测目标而不是检测过敏原蛋白本身。这类方法目前应用比较广泛是定性PCR和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）。Real-time PCR可以利用特异性探针提高检测的特异性。目前，PCR技术已用于不同食品过敏原的检测。但食物过敏反应主要是由于食物中过敏原蛋白所引起，并不是蛋白对应的基因本身，PCR出现阳性结果也不能说明食物中含有对应的过敏原蛋白。因此，以检测过敏原基因为基础的方法并不是理想的检测方法，在实际检测中应用较少。

检测食物中特异性过敏原蛋白质的方法主要是基于蛋白与特异抗体的免疫反应性。制备高效价的特异性抗体是过敏原蛋白检测的关键。在牛乳过敏原的免疫检测中就是利用抗原和抗体的特异结合的原理。目前，最主要的免疫检测方法就是ELISA法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。有两种半定量的ELISA方法：分别是双抗体夹心法（Double antibody sandwich method ELISA，S-ELISA）和竞争法（Competitive ELISA，C-ELISA），其中双抗体夹心法灵敏高也最为常用。ELISA的蛋白检测方法主要是检测食品中的牛乳总蛋白或牛乳主要过敏原（βLG，CNs，BSA），S-ELISA的检出限（LOD）一般是约为2.5ppm，C-ELISA的LOD一般约为1ppm。纯化的抗βLG多克隆抗体已经用于双抗体夹心法检测婴幼儿奶粉和人乳中低剂量的βLG，其检出限可达到0.002ng·mL^-1。目前，基于抗βLG单克隆抗体的双抗体夹心法也用于检测天然或变性的βLG，可检测热处理后变性的牛乳及其制品。抗酪蛋白多克隆抗体和单克隆抗体也已用于牛乳中酪蛋白的检测，主要用于评价水解婴幼儿奶粉蛋白的免疫反应性。ELISA的检测所用时间大约4h，对人员的操作要求也较高。

除了ELISA方法外，电泳法（SDS-PAGE）、质谱法（LC/MS/MS），免疫印迹法(Western Blotting)也用于水解牛乳中牛乳过敏原的检测。但与传统的ELISA方法相比，这些方法的灵敏度不高，对低剂量的过敏原检测不出或成本太高。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，旨在解决现有检测方法存在的耗时耗力，灵敏度不高及对低剂量的过敏原检测不出或成本太高的问题。

本发明的技术方案如下：

一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，包括步骤：

A、以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体；

B、以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体；

C、通过偶联的方法将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的牛乳β-乳球蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤A具体包括：以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，将牛乳β-乳球蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将牛乳β-乳球蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后夹动物眼球取血，离心取血清，制得抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤A之后还包括：对抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体进行效价测定、纯化及特异性测定。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B具体包括：以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，将牛乳β-乳球蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将牛乳β-乳球蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后取免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过PEG法进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选与克隆，制得抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B还包括对抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行纯化处理，所述纯化处理具体包括：用牛乳β-乳球蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应，取阳性杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成1×106/mL，接种动物腹腔每只0.5mL，待8～10d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，纯化腹水，得到一株抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B还包括采用免疫印迹法对抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行鉴定，并采用不同的抗IgG类型单抗对抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行抗体类型测定。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤B还包括对抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体进行特异性测定。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D具体包括步骤：

D1、将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定于检测芯片上；

D2、以3~7μL/min的流速注射一浓度的牛乳β-乳球蛋白流经检测芯片280~320s；

D3、以3~7μL/min的流速注射HBS-EP缓冲液平衡检测芯片表面150~200s；

D4、以3~7μL/min的流速注射抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号；

D5、以25~35μL/min的流速注射8~10mM Glycine-HCl 25~35s，3次用于抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的表面；

在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代一定浓度的牛乳β-乳球蛋白作为样本零浓度用来检测LOD。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D1中，所述抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的固定具体包括步骤：

D11、注射HBS-EP缓冲液，以8~12μL/min的流速平衡检测芯片表面4~7min；

D12、注射NHS与EDC的混合液，以8~12μL/min的流速活化检测芯片表面5~10min；

D13、注射抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体，以8~12μL/min的流速偶联检测芯片5~10min；

D14、注射乙醇胺，以8~12μL/min的流速封闭检测芯片表面5~10 min。

所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其中，所述步骤D2中，用HBS-EP缓冲液将牛乳β-乳球蛋白稀释为5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同浓度的牛乳β-乳球蛋白。

有益效果：本发明利用抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体作为固定抗体，捕抓牛乳β-乳球蛋白，再通过抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体进行信号放大，达到快速高效进行检测牛乳主要过敏原蛋白的目的。本发明方法同时结合了双抗体夹心ELISA方法的特异性和SPR快速高效的特征，从而达到高效、准确、便捷的检测效果。

具体实施方式

本发明提供一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其包括步骤：

A、以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体；

B、以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体；

C、通过偶联的方法将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的牛乳β-乳球蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。

  表面等离子共振( SPR) 法基于光学技术原理通过分析分子间相互作用信息，能够实时检测一种或多种分子之间的反应，是一种新型食品过敏原检测方法。此SPR方法无背景干扰，对样品的纯化程度较低，使用简单、快速、无需标记、灵敏度高。

本发明利用SPR方法检测牛乳主要过敏原牛乳β-乳球蛋白。具体分别制备抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体和抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体，然后通过偶联的方法将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定在检测芯片上，将不同浓度的牛乳β-乳球蛋白流经检测芯片，加入抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号，从而达到快速高效检测牛牛乳主要过敏原蛋白的目的。本发明方法具有灵敏度高、准确度高、检测快捷等特点。

下面通过一具体实施例对本发明上述技术方案进行详细说明。

一、抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体制备

1、首次免疫

取100 μg牛乳β-乳球蛋白和等体积的福氏完全佐剂混合乳化后，皮下注射小鼠颈背部。加强免疫共2次，蛋白量同前，混入等量的福氏不完全佐剂。每次免疫间隔约3周，第3次免疫后，第5天，采取夹眼球取血，离心取血清。对于抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的鉴定采用了免疫印迹法（Western-blotting）鉴定，先用提取的牛乳β-乳球蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转到硝酸纤维素膜上，用免疫后小鼠血清为一抗，以免疫前小鼠血清为阴性对照，用标记HRP的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，用DAB显色。

2、抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的效价测定与纯化

采用常规的间接ELISA法进行检测，提取的牛乳β-乳球蛋白按100ng/孔4℃包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37℃封闭2h，以获取的多抗血清为一抗，同时用免疫前小鼠血清做平行阴性对照试验，从1:100开始对倍稀释，37℃反应1h，PBST洗三次后，加入抗鼠IgG-HRP作为二抗，37℃反应1h，洗三次后加底物TMB显色。测定孔OD值与阴性对照孔OD值之比大于2.1为阳性判断标准，抗体的稀释度即为抗体的效价。鉴定与效价测定后，采用夹眼球取血，离心取血清，用于血清抗体纯化。抗体纯化参照HiTrap protein G亲和层析说明书进行。

3. 抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的特异性测定

用间接ELISA检测该抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体能否认别一些坚果类（杏仁、胡桃、核桃、榛子和开心果）、一些豆类品（大豆、蚕豆、豌豆、黑豆、绿豆、红豆）和葵花种子、小麦、乔麦、黑麦、鸡蛋、牛奶、芝麻、虾、鱼等蛋白。每孔按100ng蛋白/孔4℃包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37℃封闭2h，以该抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体为一抗，同时用牛乳β-乳球蛋白为阳性对照，以PBS为阴性对照。

二、抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体制备

1、抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的制备与其纯化

先用纯牛乳β-乳球蛋白免疫BAL B/C小鼠，具体要求按照多克隆抗体制备过程中的动物免疫，然后取用牛乳β-乳球蛋白免疫后的BAL B/C小鼠的脾细胞，将与NS-1鼠骨髓瘤细胞按2∶1的比例混合，用PEG法进行细胞融合。加到已有饲养细胞层的96孔板内，置37℃、5%CO₂培养箱中培养。HAT选择培养，筛选出所需要的杂交瘤细胞系，阳性孔经4次亚克隆后，选取最后克隆扩大培养，生产抗体。用间接免疫酶标法筛选阳性克隆及亚类鉴定。用纯牛乳β-乳球蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应。取生长良好的杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成1×106/mL，接种小鼠腹腔每只0.5mL，待8～10d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，-20℃保存备用。腹水中单抗的纯化参照用抗体纯化的Protein G 亲和交换层析柱（GE 公司）说明书。主要得到一株抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体。

2、抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的鉴定、抗体类型和抗体效价的测定

对于抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的鉴定采用了免疫印迹法（Western-blotting）鉴定，先用牛乳β-乳球蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后电转到硝酸纤维素膜上，用纯化后的抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体为一抗，以免疫前小鼠血清为阴性对照，用标记HRP的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，显色。采用不同的抗IgG类型单抗对纯化后的抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行抗体类型测定。采用常规的间接ELISA法进行检测，天然的牛乳β-乳球蛋白按100ng/孔4℃包被过夜，封闭液为3%BSA-PBST，37℃封闭2h，以纯化后的抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体为一抗，同时用免疫前小鼠血清做平行阴性对照试验，从1:100开始对倍稀释，37℃反应1h，PBST洗三次后，加入抗鼠IgG-HRP作为二抗，37℃反应1h，洗三次后加底物TMB显色。测定孔OD值与阴性对照孔OD 值之比大于2.1 为阳性判断标准，抗体的稀释度即为抗体的效价。

3、抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的特异性测定

用间接ELISA检测该抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体能否认别一些坚果类（杏仁、胡桃、核桃、榛子和开心果）、一些豆类品（大豆、蚕豆、豌豆、黑豆、绿豆、红豆）和葵花种子、小麦、乔麦、黑麦、鸡蛋、牛奶、芝麻、虾、鱼等蛋白。每孔按100ng蛋白/孔4℃包被过夜，封闭液为2%BSA-PBST，37℃封闭2h，以该抗体为一抗，同时用牛乳β-乳球蛋白为阳性对照，以PBS为阴性对照。

四、SPR检测

本实验使用SPR方法（GE Healthcare， BIAcore T200）进行检测。

材料

CM5芯片，Cat. No. BR-1005-30 (GE Healthcare)；

NHS：100 mM N-羟基琥珀酰亚胺；

EDC：400 mM 二甲基氨基丙基乙基碳酰胺；

HBS-EP缓冲液；

乙醇胺：1 M乙醇胺，pH 8.5；

牛乳β-乳球蛋白：纯度>90%，1.0 mg/mL，保存在PBS缓冲液中；

抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体：纯度>90%，1.8 mg/mL，保存在PBS缓冲液中；

抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体：纯度>90%，1.0 mg/mL，保存在PBS缓冲液中；

方法

抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的固定

用氨基偶联的方法将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定在CM5芯片上：

表面平衡：HBS-EP缓冲液，以10μL/min的流速平衡芯片表面5min；

表面活化：注射“NHS + EDC”1:1混合液，以10μL/min的流速活化芯片表面7min；

偶联：注射抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体（稀释在10 mM 醋酸钠，pH 4.5缓冲液中），以10μL/min的流速偶联7 min；

表面封闭：注射乙醇胺，以10μL/min的流速封闭表面7 min。

抗体灵敏度检测

用HBS-EP缓冲液将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体稀释为5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL进行检测，所有浓度均重复以下过程：

以5μL/min的流速注射一定浓度的牛乳β-乳球蛋白300 s；

以5μL/min的流速注射HBS-EP缓冲液180 s平衡表面；

以5μL/min的流速注射0.3mg/mL抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号；

以30μL/min的流速注射10mM Glycine-HCl（pH 2.0）30 s，3次用于再生抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的表面。

在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代一定浓度的牛乳β-乳球蛋白作为样本零浓度（n=5）用来检测LOD（即最低检测限：背景信号下能够检测出的被检物的最低浓度；计算方法为样本零浓度信号平均值SD的三倍）。

通过上述建立起的SPR检测牛乳主要过敏原Ara h1蛋白的方法，抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的LOD为0.34ng/mL；抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体的LOD为5.54ng/mL，相比于其他方法，本发明方法最大的优势在于无需对样品进行标记，检测方便、快捷、灵敏度高、并且可以多次利用，样品需要的量极少，能高通量、高质量地分析数据。

本发明利用抗原抗体专一识别的原理，结合SPR高效、准确、快速的优点对牛乳的主要过敏原牛乳β-乳球蛋白进行检测。与现有技术相比，本发明的核心改进之处在于通过SPR技术，利用高效价的抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体作为固定抗体，捕抓牛乳β-乳球蛋白，再通过抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体进行信号放大，快速高效进行检测牛乳主要过敏原蛋白。这种方法同时结合了双抗体夹心ELISA方法的特异性和SPR快速高效的特征，从而达到高效、准确、便捷的检测效果。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，包括步骤：

A、以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，免疫动物，制备抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体；

B、以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，免疫动物，获得杂交瘤细胞，通过杂交瘤细胞制备抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体；

C、通过偶联的方法将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定于检测芯片上，将不同浓度的牛乳β-乳球蛋白流经所述检测芯片，然后加入抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号，得到检测结果。

2.根据权利要求1所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤A具体包括：以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，将牛乳β-乳球蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将牛乳β-乳球蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后夹动物眼球取血，离心取血清，制得抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤A之后还包括：对抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体进行效价测定、纯化及特异性测定。

4.根据权利要求1所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B具体包括：以牛乳β-乳球蛋白作为抗原，将牛乳β-乳球蛋白和福氏完全佐剂混合乳化后免疫动物，同时将牛乳β-乳球蛋白和福氏不完全佐剂混合乳化后免疫动物，然后取免疫后的动物脾细胞与骨髓瘤细胞混合，通过PEG法进行细胞融合，获得杂交瘤细胞，对杂交瘤细胞进行筛选与克隆，制得抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B还包括对抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行纯化处理，所述纯化处理具体包括：用牛乳β-乳球蛋白为靶抗原，应用ELISA法进行交叉试验排除非特异性反应，取阳性杂交瘤细胞株用生理盐水洗涤3次，配成1×106/mL，接种动物腹腔每只0.5mL，待8～10d后抽取腹水，离心，分离腹水，分装，纯化腹水，得到一株抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B还包括采用免疫印迹法对抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行鉴定，并采用不同的抗IgG类型单抗对抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体进行抗体类型测定。

7.根据权利要求1所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤B还包括对抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体进行特异性测定。

8.根据权利要求1所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D具体包括步骤：

D1、将抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体固定于检测芯片上；

D2、以3~7μL/min的流速注射一浓度的牛乳β-乳球蛋白流经检测芯片280~320s；

D3、以3~7μL/min的流速注射HBS-EP缓冲液平衡检测芯片表面150~200s；

D4、以3~7μL/min的流速注射抗牛乳β-乳球蛋白多克隆抗体用于放大信号；

D5、以25~35μL/min的流速注射8~10mM Glycine-HCl 25~35s，3次用于抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的表面；

在非零浓度注射之前，用HBS-EP缓冲液替代一定浓度的牛乳β-乳球蛋白作为样本零浓度用来检测LOD。

9.根据权利要求8所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D1中，所述抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体的固定具体包括步骤：

D11、注射HBS-EP缓冲液，以8~12μL/min的流速平衡检测芯片表面4~7min；

D12、注射NHS与EDC的混合液，以8~12μL/min的流速活化检测芯片表面5~10min；

D13、注射抗牛乳β-乳球蛋白单克隆抗体，以8~12μL/min的流速偶联检测芯片5~10min；

D14、注射乙醇胺，以8~12μL/min的流速封闭检测芯片表面5~10 min。

10.根据权利要求8所述的检测牛乳过敏原的表面等离子共振法，其特征在于，所述步骤D2中，用HBS-EP缓冲液将牛乳β-乳球蛋白稀释为5、10、20、40、80、100、500、1000、4000、16000、50000、100000ng/mL的不同浓度的牛乳β-乳球蛋白。