CN103134931A - 一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素a的双抗体夹心法 - Google Patents

Abstract

一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。本发明应用购于北京军事医学院的重组金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）免疫8周龄的BALB/c小鼠，经过正常的免疫、细胞融合、筛选后得到10株SEA单克隆抗体，10株抗体分别标记辣根过氧化物酶（HRP）并进行两两配对。最后选定以JN2011-01、JN2011-02分别为包被抗体和酶标抗体，以SEA为标准品建立了SEA的夹心ELISA分析方法，LOD为0.23ng/mL，线性范围为0.5-8ng/mL。本发明采用理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体，建立的双抗体夹心法灵敏度高，成本低，与金黄色葡萄球菌肠毒素B、C、D、E无交叉反应，为食品中SEA的检测提供了快速高效的分析手段。

Description

一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的双抗体夹心法

技术领域

本发明涉及一种定量检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。 

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，虽然近年来不断有新型的金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE）被发现，但肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%，而其中77.8%是由肠毒素SEA引起的。 

在食品加工过程中，经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌，然而一旦菌体产生外分泌的肠毒素，那么存在于食物中的肠毒素非常稳定，100℃ 30min不被破坏，摄入人体后可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。2011年我国公布速冻面米制品新国标GB19295—2011，金黄色葡萄球菌由原来的不得检出变为限量检出，因此为了杜绝食品中金黄色葡萄球菌活菌数合格而肠毒素超标的情况，肠毒素的快速检测对于保障食品安全具有更加重要的意义。 

近年来，Elisa凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点越来越多地用于肠毒素的检测，虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但Elisa比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此Elisa也具有相当广泛的应用价值。 

发明内容

(一)要解决的技术问题 

  本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于食品中SEA的批量、快速检测。

(二)技术方案 

为实现上述目的，本发明建立了一种食品中SEA的双抗体夹心检测方法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用重组SEA经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。 

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。 

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到0.23ng/mL，R²为0.998。 

本发明方法的检测分析原理是： 

酶标板上包被了包被抗体JN2011-01，合适的浓度下可以最大限度捕获SEA；洗板3次，洗去未结合的包被抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体JN2011-02-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min。如果样品中SEA浓度≥0.5ng/mL，那么祥品中SEA被包被抗体JN2011-01捕获并与酶标抗体JN2011-02-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；如果样品中SEA浓度＜0.5ng/mL那么样品中SEA不被包被抗体JN2011-01捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

（1）SEA单克隆抗体的制备 

    以重组表达的SEA（北京军事医学科学院，金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验，胥全彬；刘传暄；马清钧.生物工程学报[J]，2003，19(4):402-406）为免疫原，免疫 7周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周进行首免，15μg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，15μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，8μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的老鼠；第八周进行冲刺免疫，8μg/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合。筛选采用间接Elisa进行，共筛选到10个细胞株。

（2）单克隆抗体的配对筛选 

将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度50μg/mL标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释500倍使用，在此条件下，实验成功得到了24对P/N值>10的配对。

（3）夹心法的建立 

选择检测限最稳定的配对，即以JN2011-01为包被抗体，以JN2011-02作为酶标抗体建立夹心法，具体参数如下：

抗体包被浓度：6μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液CBS，

封闭液：含0.2%明胶的0.01M，pH9.6CBS，200μL /孔，37℃封闭2h。

标品稀释液：0.01M、pH7.2 PBS， 

洗涤液：含0.05%吐温-20的PBS

检测抗体浓度：4μg/mL，

抗体稀释液：含有0.1%（W/V）明胶和0.05%吐温-20的PBS

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水

显色液B：60 mg四甲基联苯胺（TMB）溶于100 mL乙二醇。

显色液：显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用 

反应时间：封闭37℃、2h；标准品，37℃、1h；检测抗体37℃、1h；显色12min；

终止液：2 mol/L的硫酸

优化后SEA夹心法，LOD：0.23ng/mL，检测限0.5ng/mL，这比目前报道的方法具有更高的灵敏度。

 (三)有益效果 

本发明提供的金黄色葡萄球菌肠毒素SEA双抗体夹心检测方法采用了理化性质高度均一、特异性好、可以大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，稳定性好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合食品行业大规模、高通量、快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。

在本发明的具体参数下金黄色葡萄球菌肠毒素SEA双抗体夹心法的LOD达到了0.23ng/mL，检测限达到0.5ng/mL，这比目前已有的胶体金试纸条检测专利具有更高的灵敏度。 

生物材料样品保藏 

1、小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株，培养物株号为JN2011-01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC8.90001，保藏曰期为2011年5月31日。 

2、小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株，培养物株号为JN2011-02，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC8.90002，保藏曰期为2011年5月31日。 

附图说明

图1 金黄色葡萄球菌肠毒素SEA双抗体夹心法的标准曲线。 

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。 

一、仪器： 

TGL－40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂；

KFLOW纯水机，凯佛隆公司；                                                    

ZD–9556水平摇床，太仓科教器材厂；                                         

96孔8×12可拆酶标板，厦门怡佳美实验器材有限公司；

MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司；

可调试移液器，Thermo Labsystems公司；

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂；

二、试剂：

四甲基联苯胺(TMB)，上海晶纯实业有限公司；

其他试剂均为分析纯试剂；

三、步骤

1．单克隆抗体的制备

1)实验动物：选5只、7周龄的BALB/c小鼠进行免疫。

2)抗原配置：将免疫原用生理盐水稀释，配成1mg/mL的溶液。 

3)乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，乳化完全后皮下多点注射小鼠。 

免疫方法：按照特定免疫流程（该免疫过程后老鼠达到了较高的效价，并且没有耐受）免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合。 

4)采血：第三次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。 

5)融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接Elisa筛选阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆。 

6)抗体的纯化和保存：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-20℃保存。 

2、ELISA反应过程： 

抗体效价测定步骤：

1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 μL/孔，于4 ℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 μL PBST溶液，摇床上振荡3 min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。

2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200 μL/孔，于37 ℃温育箱内温育2 h后取出烘干待用。 

3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h后洗涤、拍干。 

4)每孔加入100 μL，1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h后洗涤、拍干。 

5)每孔加入100 μL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37℃反应15 min，取出后每孔加入100 μL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A₄₅₀。 

金黄色葡萄球菌肠毒素A双抗体夹心法测定步骤： 

a、包被：用6μg/mL的JN2011-01包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜。

b、洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL / 孔，然后甩干反应板，所述PBST为含0.05%吐温-20的PBS。 

c、封闭：含0.2%明胶的0.01M，pH9.6 CBS，200μL /孔，37℃封闭2h。 

d、洗涤：同b。 

e、样品：用样品稀释液0.01M，pH7.2 PBS将SEA母液稀释成0.125，0.25，0.5，1，2，4，8ng/mL系列浓度，另设一个PBS空白对照，酶标板1-7列每孔加入100μL系列浓度样品，第8列加入空白对照，于37℃孵育1h； 

f、洗涤：同b。

g、加酶标抗体JN2011-02-HRP，用含有0.1%明胶和0.05%吐温-20的PBS的抗体稀释液稀释至4μg/mL，100μL /孔，37 C孵育1h。 

h、洗涤：同b。 

i、显色：加显色液100μL /孔，显色15min。 

显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用； 

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水

显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇；

j、终止：加2 mol/L硫酸终止液50μL /孔。

k、测定：用酶标仪检测OD_450nm，，绘制SEA双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD₄₅₀nm值对应求得样品中SEA含量。 

3、交叉率的测定 

将金黄色葡萄球菌肠毒素SEB、SEC、SED、SEE母液精确稀释成10μg/mL、100μg/mL、1ng/mL，在建立的SEA双抗体夹心法体系中检测吸光值，并设空白孔，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验，

试验结果如下：

1、标准曲线：本实验所获得的抗原检测的线性范围是为0.5～8ng/mL，R²=0.99具体请见说明书附图1。

2、LOD：LOD是空白的平均吸收值加3倍的标准偏差对应的抗原浓度，SEA双抗体夹心法LOD为0.23ng/mL。 

3、交叉反应率(CR%) 

结果：100ng/mL以下金黄色葡萄球菌肠毒素SEA夹心法与肠毒素SEB、SEC、SED、SEE无交叉反应，特异性良好，在10μg/mL与SEA的交叉反应为0.03%。具体数据见表1。

表1.金黄色葡萄球菌肠毒素A双抗体夹心法交叉反应 

Claims (2)

1.一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的双抗体夹心法，其特征在于：酶标板上包被了包被抗体JN2011-01，合适的浓度下最大限度捕获SEA；洗板3次，洗去未结合的包被抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体JN2011-02-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色12min；

样品中SEA浓度≥0.5ng/mL，样品中SEA被包被抗体JN2011-01捕获并与酶标抗体JN2011-02-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，被判定为阳性；

样品中SEA浓度＜0.5ng/mL，样品中SEA不被包被抗体JN2011-01捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A的双抗体夹心法，其特征在于：测定步骤为：

a、包被：用6μg/mL的JN2011-01包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤：用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL / 孔，然后甩干反应板，所述PBST为含0.05%吐温-20的PBS；

c、封闭：含0.2%明胶的0.01M，pH9.6 CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤：同b；

e、样品：用样品稀释液0.01M，pH7.2 PBS将SEA母液稀释成0.125，0.25，0.5，1，2，4，8ng/mL系列浓度，另设一个PBS空白对照，酶标板1-7列每孔加入100μL系列浓度样品，第8列加入空白对照，于37℃孵育1h；

f、洗涤：同b；

g、加酶标抗体JN2011-02-HRP，用含有0.1%明胶和0.05%吐温-20的PBS的抗体稀释液稀释至4μg/mL，100μL /孔，37 C孵育1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加显色液 100μL /孔，显色15min；

显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用；

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂，100mL水

显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇；

j、终止：加2 mol/L硫酸终止液，50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀nm，绘制SEA双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD₄₅₀nm值对应求得样品中SEA含量。

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