CN104977412A - 一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素sem的双抗夹心法 - Google Patents

一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素sem的双抗夹心法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法。本发明包括（1）用包被抗体包被酶标板，洗板，用于洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体为SEM单克隆抗体；（2）加入封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，洗板，用于洗去酶标板上多余封闭液；（3）在酶标板上加入样品，孵育后洗板；（4）以SEM兔抗血清为一抗加入酶标板，反应后洗板，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，反应后洗板；（5）加入显色液使酶标板显色，然后加入硫酸终止反应，用酶标仪检测OD450；（6）将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得样品中SEM的含量。本发明具有定性、定量检测SEM，检测准确度高等优点。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法
技术领域
 本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的方法，属于免疫学技术领域，具体涉及的是一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，简称SEs)，是一种由金黄色葡萄球菌分泌的细胞外毒素，其会导致中毒休克、食物中毒及一系列过敏性及免疫学疾病。目前已发现的肠毒素有23种血清型，其中SEA-SEE称为传统肠毒素，SEG-SEX为新型肠毒素。SEM属于新型肠毒素类型，其理论分子量为24.842KD。据文献报道，sem基因以基因簇（egc）的形式存在。由于肠毒素基因簇受同一操纵子调控。据调查显示，目前在多药耐药性菌株中约77.8%含有基因簇（egc）。基于sem基因流行的广泛性，新型肠毒素SEM也潜在威胁人类的健康。因此，食品及原料中SEM的检出，对于控制由金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM引起的食源性疾病具有重要意义。
目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法主要有免疫学法、分子生物学法和生物传感器法。基于PCR技术的分子生物学方法从基因水平进行诊断，可以检测大量样品，具有高灵敏度和特异性，可检测各类金黄色葡萄球菌的肠毒素基因。但PCR法只能判断葡萄球菌携带肠毒素的基因型，胞外肠毒素蛋白的表达往往受时间、水分活度（AW 0.85~0.99）、酸碱度（pH 4.0~7.0）和温度（8℃~30℃）等因素的影响，用PCR方法很难准确测定食品或临床样本中肠毒素蛋白的含量。
生物传感器技术因其具有自动化、检样量少、分析速度快、生物功能膜可多次使用等优点受到国内学者的亲睐。目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素用的较多的生物感应器主要为免疫感应器。最新研发的电化学免疫传感器检测B型肠毒素，其最低检出限可达0.017ng/mL。该技术目前也仅限于检测传统的肠毒素，并且由于该方法检测成本高，检测稳定性较差，该方法的发展受到限制。
免疫学检测法依靠抗原抗体的结合，只发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，因此，免疫学检测法具有高度的特异性。酶联免疫吸附（ELISA）法因其具有操作简单、低成本、灵敏度高，特异性强、重复性强、稳定性高等优点，成为国内外研究热点。
对于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测，现有的利用双抗体夹心法检测传统A型肠毒素的技术较为成熟，其灵敏度高达0.0282ng/mL。但利用双抗体夹心法检测新型肠毒素的报道不多，对于一系列新型肠毒素（SEG-SEX）如SEM等的双抗夹心检测方法的研究将具有相当广泛的应用价值。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种即可定性分析、也可定量检测，且灵敏度高、准确度高的检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法，包括以下步骤：
（1）用包被抗体包被酶标板，洗板，用于洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体为SEM单克隆抗体；
（2）加入封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，洗板，用于洗去酶标板上多余封闭液；
（3）在酶标板上加入样品，孵育后洗板；
（4）以SEM兔抗血清为一抗加入酶标板，反应后洗板，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，反应后洗板；
（5）加入显色液使酶标板显色，然后加入硫酸终止反应，用酶标仪检测OD450，
（6）将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得样品中SEM的含量；
当样品中SEM浓度≥0.5 ng/mL，样品中SEM被配对抗体捕获与酶标二抗结合，并催化底物在450 nm产生吸收值时，被判定为阳性；
当样品中SEM浓度＜0.5ng/mL，样品中SEM不被配对抗体捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号时，被判定为阴性。
本发明记载的方法对不同浓度的标准SEM进行OD450值检测后，得到的线性范围良好，可以直接做成标准曲线，通过对样品的OD450值检测后，用该值在标准曲线上找出对应的浓度，即可实现对样品的定量检测。
兔抗血清中存在非特异性蛋白，因而其很难达到较高的特异性，若单独选作包被抗体，易造成假阳性，不利于SEM抗原蛋白检测，导致检测准确率较低。本发明将仅针对一种抗原决定簇的SEM单克隆抗体作为包被抗体，将SEM兔抗血清作为一抗加入反应体系中，不仅克服了直接使用兔抗血清所带来特异性问题，还提高了方法的灵敏度和准确性。
目前常采用的Dot-ELISA检测法以硝酸纤维膜（NC）为固相载体，据文献报道，硝酸纤维膜对蛋白的固定易受到非特异性蛋白、氢键作用干扰物、疏水作用干扰物的影响，从而使膜上蛋白物理吸附能力变弱，易造成假阴性。而本发明采用聚苯乙烯酶标板作为固相载体，其物理吸附能力较强，性质稳定，因而能克服因蛋白吸附问题而造成的假阴性。
进一步，本发明优化了抗体包被浓度、一抗稀释度、酶标二抗稀释度、包被液、封闭时间、标准品孵育时间、酶标抗体孵育时间、3.3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）显色时间等。通过该条件的设置可使最低检测限为0.5 ng/mL，R2达到0.9985。
本发明中各步骤的具体工作条件和过程如下：
所述步骤（1）的具体过程如下：用1.8~2.7μg/mL的SEM单克隆抗体包被酶标板并在4℃过夜，该SEM单克隆抗体的加入量优选为100 μL/孔；
所述步骤（2）的具体过程如下：以5%~20%脱脂奶粉为封闭液，在37℃下封闭1h~2h，该封闭液的加入量优选为200 μL/孔；
所述步骤（3）中孵育的温度为37℃，孵育的时间为60~90min；
所述步骤（4）中一抗加入后在37℃下反应1h；所述酶标二抗加入后在37℃下反应30~45min。该一抗和酶标二抗的加入量均优选为100 μL/孔；
所述步骤（5）中显色液加入后在37℃避光显色7~10 min；所述硫酸浓度为2 mol/L。该显色液和硫酸的加入量均优选为100 μL/孔；
其中，所述步骤（1）中的包被抗体、步骤（2）中的封闭液、以及步骤（4）中的一抗和酶标二抗均采用pH=7.4的1×PBS进行稀释，一抗的稀释比例为1:2000~1:4000，酶标二抗的稀释比例为1:6000~1:8000；
所述步骤（1）～步骤（4）中洗板的操作过程如下：倒去酶标板孔内液体，在吸水纸上拍干，用含0.05%Tween-20的PBST加满孔，静置3 min，反复洗涤3～5次。
所述显色液由10 mL显色液A、125 μL显色液B、15μL 3% 的H2O2配置而成；其中显色液A由3.5 g的Na2HPO4·12H2O、1.1 g的柠檬酸混合后加水至200ml，并调节pH值至5.0后制得；显色液B由6 mg的3.3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）加入1mL二甲基亚砜（DMSO）混合制得。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
1、本发明不仅能有效对新型肠毒素SEM进行定性分析，还能有效对新型肠毒素M进行定量检测，且检测准确度高；
2、本发明中的试剂稳定、易保存，且操作简单、低成本、灵敏度高，特异性强、重复性强、稳定性高；且本发明能同时检测大量样品，适用于金黄色葡萄球菌肠毒素SEM蛋白的检测和流行病学调查，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明方法检测得到的SEM标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及其附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
一、准备阶段
本阶段用于配置好相应浓度的各试剂物品等，本发明中所用试剂物品包括：包被抗体、封闭液、样品、一抗、酶标二抗、显色液、硫酸。其中，酶标板为96孔聚苯乙烯可拆酶标板；该包被抗体为SEM单克隆抗体，SEM单克隆抗体浓度为1.8~2.7μg/mL，封闭液浓度为5%~20%的脱脂奶粉溶液，该SEM单克隆抗体和封闭液均采用pH=7.4的1×PBS配置而成。样品包括检测样品和浓度分别为0.5 ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL 、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL的SEM标准品稀释液。一抗为SEM兔抗血清，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为市售产品，购自武汉三鹰生物技术有限公司。硫酸浓度为2 mol/L。
二、测定阶段
首先，绘制出SEM的标准曲线。本阶段采用一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法，用于检测出不同样品的OD450值，具体操作方法如下：
（1）在酶标板上加入包被抗体，包被抗体加入量为100 μL/孔，4℃过夜后，使包被抗体包被酶标板，洗板后洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体为SEM单克隆抗体；
（2）加入封闭液在37℃下封闭1~2 h，使封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，封闭液加入量为200 μL/孔，洗板后洗去酶标板上多余封闭液；
（3）在酶标板上加入样品，孵育后洗板；本实施例中分别一共采用了10种样品进行检测，该9种样品分别为1种检测样品和8种浓度分别为0.5 ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL 、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL的SEM标准品稀释液。该检测样品为PBS空白对照样品；
（4）以SEM兔抗血清为一抗加入酶标板，一抗的加入量为100 μL/孔，在37℃下反应1 h后洗板；再以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，酶标二抗的加入量为100 μL/孔，在37℃下反应30~45 min后洗板；
（5）加入显色液使酶标板显色，加入量为100 μL/孔，加入后在37℃避光显色7~10 min；然后加入浓度为2 mol/L的硫酸，进行终止反应，硫酸加入量为100 μL/孔；用酶标仪检测OD450；
上述步骤中洗板的具体操作过程为：倒去酶标板孔内液体，在吸水纸上拍干，用含0.05% Tween-20的PBST加满孔，静置3min，反复洗涤3～5次；
根据检测出的10种样品的OD450值，并根据10种样品中的SEM浓度，即可对应绘制出SEM的标准曲线，绘制出的标准曲线如图1所示；
其次，采用上述相同的步骤，只需将样品替换成待检测物品，即可检测出待检测物品的OD450值，并对应标准曲线计算出该待检测物品的SEM含量。
三、检测阶段
1、标准曲线检测。
通过图1可知，本试验抗原在0.5~20 ng/mL线性良好，R2=0.9985，最低检测限为0.5ng/mL。即，当样品中SEM浓度≥0.5 ng/mL，样品中SEM被配对抗体捕获与酶标二抗结合，并催化底物在450 nm产生吸收值时，被判定为阳性；当样品中SEM浓度＜0.5 ng/mL，样品中SEM不被配对抗体捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号时，被判定为阴性。
2、精密度检测。
①批内变异将阳性对照组（20 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/mL），阴性对照组分别作5 个复孔于同一板上，同时检测其OD450值；②批间变异连续5次检测上述相同标本的OD450值；精密度实验结果如表1所示。
表1  DAS-ELISA 检测样品变异系数。
通过精密度实验结果可以看出，本发明方法的批内变异＜10%，批间变异＜15%，说明该方法具有较高的精密度。
3、特异性检测。
用上述建立的方法检测3株医院食物中毒患者源金黄色葡萄球菌（H3、H4、H7）和17株食品源金黄色葡萄球菌(F1、F3、F5、F6、F7、F8、F15、F16、F19、F24、F29、F37、F39、F41、F42、F44、F51)，并与PCR法进行对比，测定方法的特异性，检测结果如表2所示。
表2  DAS-ELISA特异性试验结果。
方法 H3 H4 H7 F1 F3 F5 F6 F7 F8 F15 F16 F19 F24 F29 F37 F39 F41 F42 F44 F51
DAS-ELISA + + + - - - - - - + - + - - - - - - - -
PCR + + + - - - - - - + - + - - - - - - - -
注：“+”代表阳性；“-”代表阴性。
通过表2可以看出，利用建立的DAS-ELISA方法检测20株金黄色葡萄球菌上清液，其检测结果与PCR一致，表明该方法具有良好特异性。
4、测定人工污染样品中SEM的回收率。
SEM人工污染食物的制备：用SEM溶液直接加入生理盐水和食用鲜牛奶混匀作为污染水和牛奶。称取牦牛肉、大米饭各1.0 g，加不同浓度的SEM生理盐水，搅拌均匀，然后离心8000 r/min，20 min，取上清液待检。以本文建立的快速ELI SA 法测OD450值, 计算样品回收率：回收率=测量浓度/实际浓度×100%。
阳性判断：P/ N>2为阳性结果；P:样品OD450值； N:阴性对照OD450值。
配制不同浓度SEM污染样品，采用本发明方法法测定污染样品OD450值，并计算SEM浓度，检测结果见表3所示。
表3   DAS-ELISA检测污染样品的回收率。
注：“-”表示未检出。
由表3可以看出：3种污染样品随着SEM浓度增加，回收率增加，变异系数减小，准确度增高。牦牛肉、牛奶和米饭在SEM浓度达到2.5 ng/mL以上时，回收率达均能达到90%以上，能够准确检测。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素M的双抗夹心法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）用包被抗体包被酶标板，洗板，用于洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体为SEM单克隆抗体；
（2）加入封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，洗板，用于洗去酶标板上多余封闭液；
（3）在酶标板上加入样品，孵育后洗板；
（4）以SEM兔抗血清为一抗加入酶标板，反应后洗板，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，反应后洗板；
（5）加入显色液使酶标板显色，然后加入硫酸终止反应，用酶标仪检测OD450；
（6）将检测得到的OD450值带入标准曲线即可求得样品中SEM的含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述步骤（1）的具体过程如下：用1.8~2.7μg/mL的SEM单克隆抗体包被酶标板，在4℃过夜。
3.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述步骤（2）的具体过程如下：以5%~20%脱脂奶粉为封闭液，在37℃下封闭1~2 h。
4.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述步骤（3）中样品孵育的温度为37℃，孵育的时间为60~90 min。
5.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述步骤（1）中的包被抗体、步骤（2）中的封闭液、以及步骤（4）中的一抗和酶标二抗均采用pH=7.4的1×PBS进行稀释，一抗的稀释比例为1:2000~1:4000，酶标二抗的稀释比例为1:6000~1:8000。
6.根据权利要求5所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述步骤（4）中一抗加入后在37℃下反应1 h；所述酶标二抗加入后在37℃下反应30~45 min。
7.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述步骤（1）～步骤（4）中洗板的操作过程如下：倒去酶标板孔内液体，在吸水纸上拍干，用含0.05%Tween-20的PBST加满孔，静置3 min，反复洗涤3～5次。
8.根据权利要求1所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述步骤（5）中显色液加入后在37℃避光显色7~10min；所述硫酸浓度为2 mol/L。
9.根据权利要求8所述的一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素I的双抗夹心法，其特征在于，所述显色液由10 mL显色液A、125 μL显色液B、15 μL 3% H2O2配置而成；其中显色液A由3.5 g的Na2HPO4·12H2O、1.1 g的柠檬酸混合后加水至200 ml，并调节pH值至5.0后制得；显色液B由6 mg的3.3’,5,5’-四甲基联苯胺加入1mL二甲基亚砜混合制得。
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