CN111518178A - 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a标签肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于金黄色葡萄球菌肠毒素A检测的技术领域，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用。本发明提供的金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，并设计合成了相对应的内标肽，所述内标肽是将所述标签肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的亮氨酸，本发明采用高效液相色谱‑质谱联用技术进行分析测定，从而测得食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量。该方法具有良好的线性、灵敏度、回收率，可以直接定性和定量测定食品中的金黄色葡萄球菌肠毒素A。

Description

一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用
技术领域
本发明涉及金黄色葡萄球菌肠毒素A检测技术领域，尤其涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)是与食物中毒相关的最常见的毒素之一。受到SEA污染的牛奶及其副产品会引起广泛的肠胃炎暴发，尽管在一些食物中毒病例中检测到的金黄色葡萄球菌病原体很少或没有，但这些样品中往往会存在SEA。SEA是由金黄色葡萄球菌产生的一种外毒素，在高温条件下具有稳定性。由于个体对SEA的敏感性不同，SEA对人类的毒性剂量仍然未知。但为了公众的健康，在食品安全方面监测乳与乳制品中的SEA残留物是很必要的。
由于食品基质复杂程度的不同，SEA的检测方法要求具有较高的灵敏度和特异性。随着金黄色葡萄球菌肠毒素特异性抗体的使用，诸如酶联免疫吸附试验(ELISA)和反向被动乳胶凝集试验(RPLA)等免疫测定方法已被广泛采用。但是，ELISA是定性的，而RPLA只是半定量的。再者，由于复杂食物基质成分的交叉反应或干扰，基于抗原-抗体反应的免疫分析方法容易导致假阴性或假阳性结果。因此，为了获得良好的实验室间重复性，需要一种经过验证的定量方法。在与SEA有关的食物中毒中，其它细菌毒素也可能成为被怀疑的致病因素，因为它们也可能会引起急性呕吐或严重疾病。由于这些细菌毒素对极端pH条件，甚至对巴氏杀菌具有抵抗力，因此有必要建立有效的方法，以便对SEA进行精确的识别和准确的量化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用，本发明的标签肽能够用于确证和检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的污染水平。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽，所述标签肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽的内标肽，所述内标肽是将所述标签肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的亮氨酸。
本发明还提供了所述金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽在检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A中的应用。
本发明还提供了所述金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，包括如下步骤：
(1)样品预处理：取样品依次进行除杂、沉淀、洗涤和溶解，得到预处理样品；
(2)制备待测样品：在预处理样品中加入所述内标肽依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(3)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，计算得到所述标签肽与所述内标肽的峰面积比；
(4)绘制标准曲线：将步骤(2)中的待测样品替换成所述标签肽的系列标准溶液，按照步骤(3)的方法检测和计算，得到以所述标签肽与所述内标肽峰面积比为纵坐标，以所述标签肽的浓度为横坐标的标准曲线，所述系列标准溶液是在所述标签肽的标准溶液中加入所述内标肽后，再用甲酸水溶液稀释制得；
(5)计算样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量：将步骤(3)中所述标签肽与所述内标肽的峰面积比代入步骤(4)得到的所述标准曲线中，得到金黄色葡萄球菌肠毒素A的浓度，计算得到样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量。
优选的，所述除杂是采用乙酸调节样品的pH至3.5～4.0，固液分离，取上清液1，用氢氧化钠溶液调节所述上清液1的pH至7.0～8.0，固液分离，取上清液2，备用。
优选的，所述沉淀是按照体积比1:(0.8～1.2)在上清液2中加入三氯乙酸溶液进行沉淀，静置，固液分离，取沉淀，备用；所述三氯乙酸溶液的质量浓度为15～25％。
优选的，所述洗涤的试剂为冰乙醇，所述溶解的试剂为Tris-HCl缓冲液。
优选的，所述变性处理的试剂包括Rapigest SF溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液，所述Rapigest SF溶液的质量浓度为0.5～1.5％，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为50～150mM，所述碘代乙酰胺溶液的浓度为100～300mM，所述预处理样品与Rapigest SF溶液、二硫苏糖醇溶液、碘代乙酰胺溶液的体积比为(100～300)：20:20:20；所述酶解处理的酶为重组人胰蛋白酶，所述重组人胰蛋白酶的浓度为50～150μg/mL，所述预处理样品与重组人胰蛋白酶的体积比为(100～300)：20；所述终止处理的试剂为甲酸，所述预处理样品与甲酸的体积比为(100～300)：10。
优选的，所述高效液相色谱的检测条件为：Acquity UPLC BEH Peptide 300 C18柱2.1×100mm，1.7μm；柱温：35～45℃；进样体积：5μL；流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈；梯度洗脱：0min-1min，5％流动相B；1min-3min，5％流动相B线性变化至25％流动相B；3min-3.5min，线性变化至40％流动相B；3.5min-4.5min，线性变化至100％流动相B；4.5min-5.8min，保持100％流动相B；5.8min-6.0min，线性降至5％流动相B；6.0min-8.0min，保持5％流动相B；流速为0.3mL/min；所述质谱的条件为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测；毛细管电压3.5kV；离子源温度：125～175℃；脱溶剂温度：325～375℃；脱溶剂气流速：800L/h；锥孔气流速：50L/h；进样量：5μL。
本发明还提供了一种检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的试剂盒，所述试剂盒包括金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其内标肽，所述标签肽的氨基酸序列如SEQID No.1所示，所述内标肽是将所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的亮氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过筛选SEA标签肽，设计合成了SEA标签肽的稳定同位素标记的内标肽，并利用高效液相色谱-质谱联用的分析技术，实现了SEA的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
(2)本发明选择SEA酶解产物中的标签肽作为检测对象，适用于变性蛋白的检测，可以满足样品中的变性与非变性蛋白的同时检测，保证了方法的准确性。
(3)本发明选择以SEA的标签肽作为直接检测目标物，避免了现有检测技术对难获取的SEA标准品的依赖，同时也避免了分析人员接触高浓度SEA的风险，保证了方法的可行性和安全性。
具体实施方式
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽，该标签肽的序列如SEQ IDNo.1所示。标签肽的选择是定向蛋白质组学检测技术中的关键步骤，它直接关系到定量方法的特异性和准确性。本发明综合考虑验证了候选多肽的特异性、酶解稳定性、质谱响应信号强度和回收率等因素后，最终选择SELQGAALGNLK(SEQ ID No.1)作为SEA的标签肽。并以此标签肽的氨基酸序列为模板，引入稳定同位素标记的Fmoc-Leu-OH-13C6,15N氨基酸，利用化学合成法获得该标签肽的内标肽SE(L-13C6,15N)QGAA(L-13C6,15N)GNLK作为内标。本发明采用高效液相色谱-质谱联用技术进行分析测定，从而测得食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量。
本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽，所述标签肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
在本发明中，所述标签肽是从SEA的酶解产物中筛选获得，具有良好的特异性和稳定性。
本发明还提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽的内标肽，所述内标肽是将所述标签肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的亮氨酸。
本发明还提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽在检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A中的应用。
本发明还提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，包括如下步骤：
(1)样品预处理：取样品依次进行除杂、沉淀、洗涤和溶解，得到预处理样品；
(2)制备待测样品：在预处理样品中加入所述内标肽依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(3)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，计算得到所述标签肽与所述内标肽的峰面积比；
(4)绘制标准曲线：将步骤(2)中的待测样品替换成所述标签肽的系列标准溶液，按照步骤(3)的方法检测和计算，得到以所述标签肽与所述内标肽峰面积比为纵坐标，以所述标签肽的浓度为横坐标的标准曲线，所述系列标准溶液是在所述标签肽的标准溶液中加入所述内标肽后，再用甲酸水溶液稀释制得；
(5)计算样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量：将步骤(3)中所述标签肽与所述内标肽的峰面积比代入步骤(4)得到的所述标准曲线中，得到金黄色葡萄球菌肠毒素A的浓度，计算得到样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量。
本发明取样后先对样品进行预处理，取样品依次进行除杂、沉淀、洗涤和溶解，得到预处理样品。
在本发明中，所述除杂优选采用乙酸调节样品的pH至3.5～4.0，固液分离，取上清液1，再优选采用氢氧化钠溶液调节所述上清液1的pH至7.0～8.0，固液分离，取上清液2，备用。本发明进行除杂的目的是为了去除样品中的杂质蛋白。
在本发明中，所述乙酸调节样品的pH优选至3.5～4.0，进一步优选为3.8；所述氢氧化钠溶液调节上清液1的pH优选至7.0～8.0，进一步优选为7.5。
在本发明中，所述除杂过程中两次固液分离均优选为离心，所述离心的温度独立的优选为3～5℃，进一步独立的优选为4℃；所述离心的转速独立的优选为8000～15000转/分钟，进一步独立的优选为10000转/分钟；所述离心的时间独立的优选为10～20分钟，进一步独立的优选为15分钟。
在本发明中，所述沉淀是按照体积比1:(0.8～1.2)，进一步优选为1:1在上清液2中加入三氯乙酸溶液进行沉淀，静置，固液分离，取沉淀，备用。
在本发明中，所述氢氧化钠的浓度优选为3～8M，进行一步优选为5M。
在本发明中，所述沉淀过程中的固液分离优选为离心，所述离心的温度优选为3～5℃，进一步优选为4℃；所述离心的转速优选为8000～15000转/分钟，进一步优选为10000转/分钟；所述离心的时间优选为10～20分钟，进一步优选为15分钟。
在本发明中，所述三氯乙酸的质量浓度优选为15～25％，进一步优选为20％。
在本发明中，所述静置的温度优选为2～8℃，进一步优选为4℃；所述静置的时间优选为20～40分钟，进一步优选为30分钟。
在本发明中，所述静置后固液分离优选为离心，所述离心的温度优选为4～10℃，进一步优选为4℃；所述离心的转速优选为8000～15000转/分钟，进一步优选为10000转/分钟；所述离心的时间优选为5～15分钟，进一步优选为10分钟。
在本发明中，所述洗涤前优选将所述沉淀冷至4℃。
在本发明中，所述洗涤优选采用冰乙醇进行洗涤，本发明对冰乙醇的用量没有特殊要求，能够充分洗涤即可；本发明在洗涤时，将冰乙醇加入到沉淀中，并采用涡旋混匀，然后在4℃下，以10000转/分钟，离心10分钟，弃去上清液，重复此洗涤步骤2次。
在本发明中，所述洗涤后还优选对洗涤后的沉淀进行干燥，所述干燥是在氮气流下吹干，所述干燥的温度优选为25～35℃，进一步优选为30℃。
在本发明中，所述溶解采用Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的pH优选为8～9，进一步优选为8.5；所述Tris-HCl溶液的浓度优选为50～150mM，进一步优选为100mM；所述Tris-HCl溶液的用量优选为2～10mL，进一步优选为5mL。
本发明在制得预处理样品后，在预处理样品中加入所述内标肽，然后依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品。
在本发明中，所述内标肽的浓度优选为15～25nM，进一步优选为20nM；所述预处理样品和所述内标肽的体积比优选为(150～250):100，进一步优选为200:100。
在本发明中，所述变性处理的试剂优选包括Rapigest SF溶液、二硫苏糖醇溶液(DTT)和碘代乙酰胺溶液(IAA)，所述Rapigest SF溶液的质量浓度优选为0.5～1.5％，进一步优选为1％；所述二硫苏糖醇溶液的浓度优选为50～150mM，进一步优选为100mM；所述碘代乙酰胺溶液的浓度优选为100～300mM，进一步优选为200mM；所述预处理样品与RapigestSF溶液、二硫苏糖醇溶液、碘代乙酰胺溶液的体积比优选为(100～300)：20：20：20，进一步优选为200：20：20：20。
在本发明中，所述变性处理的步骤优选为在预处理样品中加入内标肽后，再加入Rapigest SF溶液和二硫苏糖醇溶液，漩涡混匀，置于沸水浴中反应10分钟，冷却，然后再加入碘代乙酰胺溶液，置于暗处反应30分钟。
在本发明中，所述冷却的温度优选为20～25℃。
在本发明中，所述酶解处理的酶优选为重组人胰蛋白酶，所述重组人胰蛋白酶的浓度优选为50～150μg/mL，进一步优选为100μg/mL，所述预处理样品与重组人胰蛋白酶的体积比优选为(100～300)：20，进一步优选为200:20。
在本发明中，所述重组人胰蛋白酶优选活性≥2500USP units/mg蛋白。本发明的重组人胰蛋白酶优选购买自上海雅心生物技术有限公司。
在本发明中，所述酶解处理的步骤优选在变性处理后的溶液中加入重组人胰蛋白酶，混匀，进行酶解反应。
在本发明中，所述酶解反应的温度优选为40～50℃，进一步优选为45℃；所述酶解反应的时间优选为15～20h，进一步优选为18h。
在本发明中，所述终止处理的试剂优选为甲酸，进一步优选为纯甲酸，所述预处理样品与甲酸的体积比优选为(100～300)：10，进一步优选为200:10。
在本发明中，优选在终止处理后的溶液中加入超纯水补足溶液体系，便于定量计算。
在本发明中，优选对加入超纯水的溶液进行固液分离，所述固液分离优选为离心，所述离心优选为在4℃下，以12000转/分钟，离心10分钟，取上清，得到待测样品。
本发明制得待测样品后，优选采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，得到所述标签肽与所述内标肽的峰面积，并计算得到所述标签肽与所述内标肽的峰面积比。
在本发明中，所述高效液相色谱的检测条件：Acquity UPLC BEH Peptide 300C18柱2.1×100mm，1.7μm；柱温优选：35～45℃，进一步优选为40℃；进样体积优选为：5μL；流动相A优选为：0.1％甲酸-水，流动相B优选为：0.1％甲酸-乙腈；梯度洗脱优选为：0min-1min，5％流动相B；1min-3min，5％流动相B线性变化至25％流动相B；3min-3.5min，线性变化至40％流动相B；3.5min-4.5min，线性变化至100％流动相B；4.5min-5.8min，保持100％流动相B；5.8min-6.0min，线性降至5％流动相B；6.0min-8.0min，保持5％流动相B；流速优选为0.3mL/min。
在本发明中，所述质谱的条件：电喷雾模式优选为：ESI+；质谱扫描方式优选为：多反应监测；毛细管电压优选为3.5kV；离子源温度优选为：125～175℃，进一步优选为150℃；脱溶剂温度优选为：325～375℃，进一步优选为350℃；脱溶剂气流速优选为：800L/h；锥孔气流速优选为：50L/h；进样量优选为：5μL；所述金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽的监测离子对优选为：601.4→189.1(碰撞电压优选为：30eV)，601.4→217.1(碰撞电压优选为：25eV)和601.4→242.2(碰撞电压优选为：20eV)；锥孔电压优选为：30V；定量离子对优选为：601.4→217.1(碰撞电压优选为：25eV)；所述内标肽的监测离子对优选为：608.2→189.1(碰撞电压优选为：30eV)，608.2→217.1(碰撞电压优选为：25eV)和608.2→750.3(碰撞电压优选为：20eV)；锥孔电压优选为：32V；定量离子对优选为：608.2→217.1(碰撞电压优选为：25eV)。
在本发明中，优选将步骤(2)中的待测样品替换成所述标签肽的系列标准溶液，按照步骤(3)的方法检测和计算，得到以所述标签肽与所述内标肽峰面积比为纵坐标，以所述标签肽的浓度为横坐标的标准曲线，所述系列标准溶液是在所述标签肽的标准溶液中加入所述内标肽后，再用甲酸水溶液稀释制得；
在本发明中，所述标签肽的标准溶液的浓度优选为15～25nM，进一步优选为20nM。
在本发明中，所述甲酸的质量浓度优选为0.1％。
在本发明中，所述标签肽的系列标准溶液的浓度优选为0.5nM、1.0nM、2.0nM、4.0nM、8.0nM、16.0nM。
在本发明中，所述系列标准溶液中内标肽的浓度优选为1～4nM，进一步优选为2nM。
本发明绘制好标准曲线后，将步骤(3)中所述标签肽与所述内标肽的峰面积比代入得到的所述标准曲线中，得到金黄色葡萄球菌肠毒素A的浓度，根据金黄色葡萄球菌A及其标签肽的等摩尔对应关系，计算得到样品中金黄色葡萄球菌A的含量。
本发明还提供了一种检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的试剂盒，所述试剂盒包括金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其内标肽，所述标签肽的氨基酸序列如SEQID No.1所示，所述内标肽是将所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的亮氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段。
下面结合实施例对本发明提供的一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
建立标准曲线：
准确吸取浓度为20nM的SEA标签肽的标准溶液25μL，50μL，100μL，200μL，400μL，800μL分别置于1.5mL塑料离心管中，各加入100μL 20nM的内标肽溶液，然后分别用0.1％甲酸水溶液将体积补至1mL，配制成浓度分别为0.5nM，1.0nM，2.0nM，4.0nM，8.0nM，16.0nM的标签肽的系列标准溶液。
采用高效液相色谱-质谱联用技术对配制的标签肽的系列标准溶液进行检测。
本实施中高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Acquity UPLC BEH Peptide 300C18柱(2.1×100mm，1.7μm)；柱温：40℃；进样体积：5μL；流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈；梯度洗脱：0min-1min，5％流动相B；1min-3min，5％流动相B线性变化至25％流动相B；3min-3.5min，线性变化至40％流动相B；3.5min-4.5min，线性变化至100％流动相B；4.5min-5.8min，保持100％流动相B；5.8min-6.0min，线性降至5％流动相B；6.0min-8.0min，保持5％流动相B；流速为0.3mL/min。
质谱的检测条件为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压3.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流速：800L/h；锥孔气流速：50L/h；进样量：5μL。SEA标签肽SELQGAALGNLK的监测离子对为：601.4→189.1(碰撞电压：30eV)，601.4→217.1(碰撞电压：25eV)和601.4→242.2(碰撞电压：20eV)；锥孔电压：30V。定量离子对：601.4→217.1(碰撞电压：25eV)。其同位素标记肽SE(L-13C6,15N)QGAA(L-13C6,15N)GNLK的监测离子对为：608.2→189.1(碰撞电压：30eV)，608.2→217.1(碰撞电压：25eV)和608.2→750.3(碰撞电压：20eV)；锥孔电压：32V。定量离子对：608.2→217.1(碰撞电压：25eV)。
按照上述检测条件对标签肽的系列标准溶液进行检测，得到标签肽和内标肽的峰面积，进一步计算得到标签肽与内标肽的峰面积比，绘制得到以标签肽与内标肽的峰面积比为纵坐标，以标签肽浓度为横坐标的标准曲线。标准曲线公式：y＝1.306x+0.1425，R2＝0.9958。其中x为SEA标签肽的浓度(nM)，y为SEA标签肽与内标肽的峰面积比。
实施例2
牛奶中SEA含量的测定：
称取25g牛奶样品，用盐酸调pH至3.8，在4℃下，以10000转/分钟，离心15min。移取上清液至新的离心管中，用5M氢氧化钠溶液调pH至约7.5，在4℃下，以10000转/分，离心15min。移取上清，加入相同体积的20wt％三氯乙酸溶液，于4℃静置30min后，在4℃下，以10000转/分钟，离心10min。弃去上清，沉淀用5mL冰乙醇(预先冷至4℃)洗涤，涡旋混匀，在4℃下，以10000转/分钟，离心10min，弃去清液，重复此洗涤操作两次。将洗涤后的沉淀在氮气流下吹干(温度低于30℃)。用5mL 100mM的Tris-HCl(pH8.5)缓冲液溶解沉淀，得到预处理样品。
移取200μL预处理样品，加入100μL 20nM的内标肽溶液，依次加20μL 1wt％Rapigest SF溶液，20μL 100mM DTT溶液，涡旋混匀，置于沸水浴中煮10min。冷却至室温后加20μL 200mM IAA溶液，摇匀，置于暗处反应30min。再加20μL 100μg/mL重组人胰蛋白酶，摇匀，置于45℃反应18h后，加10μL甲酸终止反应。加610μL超纯水，涡旋混匀，在4℃下，以12000转/分钟，离心10min，取上清液，得到待测样品。
按照实施例1提供的高效液相色谱-质谱联用技术及其检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品中SEA标签肽和内标肽的峰面积，并进一步计算得到SEA标签肽和内标肽的峰面积比，将该峰面积比代入实施例1建立的标准曲线中，得到SEA标签肽的浓度为0，因此本实施例提供的牛奶样品中不含金黄色葡萄球菌肠毒素A。
实施例3
奶粉中SEA含量的测定：
将奶粉按照制造商包装上的冲泡比例复原成奶液，均质混合后称取25g奶液。按照与实施例2相同的方法制备得到待测样品，并按照实施例1提供的高效液相色谱-质谱联用技术及其检测条件对待测样品进行检测。检测结果：本实施例提供的奶粉中不含有金黄色葡萄球菌肠毒素A。
实施例4
对高效液相色谱-质谱联用的检测方法进行精密度分析：
选择实施例2和3的牛奶和奶粉样品，分别添加三个不同浓度水平的金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白，涡旋混匀，使得人工污染的样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的含量分别为0.5nM，2.0nM和5.0nM，每个污染浓度水平重复三次，计算污染样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的回收率(回收率＝测得量/加标量×100％)并进行分析评价，精密度则通过RSD(相对标准偏差)来表示。
表1人工污染牛奶样品中SEA毒素蛋白的回收率与精密度
Figure BDA0002469858060000111
Figure BDA0002469858060000121
由表1结果可得知，牛奶样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白在低、中、高加标水平下都具有较好的回收率和重复性，回收率均在80％以上，RSD％均在8％以下。且人工污染样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A蛋白的回收率随着添加水平的增加而提高，说明本发明提供的方法具有较高的准确度和重复性。
由以上实施例可知，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用，并利用高效液相色谱-质谱联用的分析技术，实现了SEA的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省疾病预防控制中心
<120> 一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Glu Leu Gln Gly Ala Ala Leu Gly Asn Leu Lys
1 5 10

Claims (10)

1.一种金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽，其特征在于，所述标签肽的氨基酸序列如SEQID No.1所示。
2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽的内标肽，其特征在于，所述内标肽是将所述标签肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的亮氨酸。
3.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽在检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A中的应用。
4.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品预处理：取样品依次进行除杂、沉淀、洗涤和溶解，得到预处理样品；
(2)制备待测样品：在预处理样品中加入所述内标肽依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(3)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，计算得到所述标签肽与所述内标肽的峰面积比；
(4)绘制标准曲线：将步骤(2)中的待测样品替换成所述标签肽的系列标准溶液，按照步骤(3)的方法检测和计算，得到以所述标签肽与所述内标肽峰面积比为纵坐标，以所述标签肽的浓度为横坐标的标准曲线，所述系列标准溶液是在所述标签肽的标准溶液中加入所述内标肽后，再用甲酸水溶液稀释制得；
(5)计算样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量：将步骤(3)中所述标签肽与所述内标肽的峰面积比代入步骤(4)得到的所述标准曲线中，得到金黄色葡萄球菌肠毒素A的浓度，计算得到样品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的含量。
5.如权利要求4所述的检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，其特征在于，所述除杂是采用乙酸调节样品的pH至3.5～4.0，固液分离，取上清液1，用氢氧化钠溶液调节所述上清液1的pH至7.0～8.0，固液分离，取上清液2，备用。
6.如权利要求4所述的检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，其特征在于，所述沉淀是按照体积比1:(0.8～1.2)在上清液2中加入三氯乙酸溶液进行沉淀，静置，固液分离，取沉淀，备用；所述三氯乙酸溶液的质量浓度为15～25％。
7.如权利要求4所述的检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，其特征在于，所述洗涤的试剂为冰乙醇，所述溶解的试剂为Tris-HCl缓冲液。
8.如权利要求4所述的检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，其特征在于，所述变性处理的试剂包括Rapigest SF溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液，所述Rapigest SF溶液的质量浓度为0.5～1.5％，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为50～150mM，所述碘代乙酰胺溶液的浓度为100～300mM，所述预处理样品与Rapigest SF溶液、二硫苏糖醇溶液、碘代乙酰胺溶液的体积比为(100～300)：20:20:20；所述酶解处理的酶为重组人胰蛋白酶，所述重组人胰蛋白酶的浓度为50～150μg/mL，所述预处理样品与重组人胰蛋白酶的体积比为(100～300)：20；所述终止处理的试剂为甲酸，所述预处理样品与甲酸的体积比为(100～300)：10。
9.如权利要求4所述的检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测条件为：Acquity UPLC BEH Peptide 300C18柱2.1×100mm，1.7μm；柱温：35～45℃；进样体积：5μL；流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈；梯度洗脱：0min-1min，5％流动相B；1min-3min，5％流动相B线性变化至25％流动相B；3min-3.5min，线性变化至40％流动相B；3.5min-4.5min，线性变化至100％流动相B；4.5min-5.8min，保持100％流动相B；5.8min-6.0min，线性降至5％流动相B；6.0min-8.0min，保持5％流动相B；流速为0.3mL/min；所述质谱的条件为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测；毛细管电压3.5kV；离子源温度：125～175℃；脱溶剂温度：325～375℃；脱溶剂气流速：800L/h；锥孔气流速：50L/h；进样量：5μL。
10.一种检测乳和乳制品中金黄色葡萄球菌肠毒素A的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括金黄色葡萄球菌肠毒素A标签肽及其内标肽，所述标签肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述内标肽是将所述标签肽的氨基酸序列中的第3和第8位置上的的亮氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段。
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