CN111551739A - 一种免疫球蛋白a和免疫球蛋白a1的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
一种免疫球蛋白a和免疫球蛋白a1的检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的检测技术领域，本发明提供了一种免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的检测方法及其试剂盒。本发明所述免疫球蛋白A特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述免疫球蛋白A1特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽分别用于检测人乳中免疫球蛋白A的含量和免疫球蛋白A1的含量。本发明通过筛选IgA特征肽及其亚型IgA1特征肽，并获取两条特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱‑质谱联用的分析技术，实现了人乳中IgA及其亚型IgA1的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
Description
技术领域
本发明涉及免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的检测技术领域，尤其涉及一种免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的检测方法及其试剂盒。
背景技术
免疫球蛋白A(ImmunoglobulinA,IgA)是一种广泛存在于哺乳动物血清及乳汁、唾液、胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道粘膜等多种分泌液中的主要体液免疫物质。在人体中，IgA主要以单体和二聚体的形式存在。IgA单体分子由外部两条相对分子质量较大的相同的重链和内部两条相对分子质量较小的相同的轻链组成，以链间二硫键的形式连接形成“Y”字形对称结构，分子量约为160KD。IgA肽链可分为可变区、恒定区和铰链区。可变区为轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域，其中变化程度相对更高的区域又被称为高变区，构成IgA分子的抗原结合部位，能与相应抗原表位特异性结合，决定了IgA抗体的特异性。恒定区的氨基酸序列在同一种属物种的同类Ig中相对较为恒定。铰链区是位于重链两个不同结构域之间的连接区域。
根据IgA铰链区的氨基酸组成及重链二硫键的数目和位置的差异，IgA可分为免疫球蛋白A1(IgA1)和免疫球蛋白A2(IgA2)两种不同的亚型，两者都是高度糖基化的蛋白质，其中IgA1在血清及分泌液中的占比(约90％)均高于IgA2，IgA2在分泌液中的占比(约48％)要高于血清。根据IgA在人体体内的分布不同，又可分为血清型IgA和分泌型IgA(SecretoryImmunoglobulinA,sIgA)。血清型IgA为单体，存在于血清中。sIgA主要分布于乳汁等外分泌液中，多为二聚体，由两个IgA单体、一条J链和一条分泌片组成。
IgA在人体中主要发挥免疫功能，尤其是sIgA，在人初乳的免疫球蛋白中约占89.8％，可通过阻碍病原体对上皮细胞的粘附以及免疫排斥作用来抵抗多种病原微生物的感染，是机体局部粘膜抗感染的主要抗体，相比普通抗体分子具有更强的免疫作用。
目前IgA的定量检测方法以酶联免疫吸附法(ELISA)为主，其方法的准确性和灵敏度受到相关抗体质量的影响，同时可能易受到人乳中其他物质的交叉反应干扰，呈现假阳性。同时，鲜有将IgA的亚型IgA1进行定量检测的报道。因此，目前缺少一种准确性强，灵敏度高的IgA及其亚型IgA1的检测方法，用于人乳中IgA和IgA1的定量测定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的检测方法及其试剂盒，能够用于定量检测人乳中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种免疫球蛋白A特征肽，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A特征肽的内标肽，所述内标肽是将所述免疫球蛋白A的特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸。
本发明提供了一种免疫球蛋白A1特征肽，其中，免疫球蛋白A1为免疫球蛋白A的亚型，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A1特征肽的内标肽，所述内标肽是将所述免疫球蛋白A1的特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为苯丙氨酸。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽在检测人乳中免疫球蛋白A的含量和免疫球蛋白A1的含量中的应用。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽检测人乳中免疫球蛋白A的含量和免疫球蛋白A1的含量的方法，包括如下步骤：
(1)制备待测样品：在人乳样品中加入混合内标肽溶液，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(2)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，计算得到免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值和免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值；
(3)绘制标准曲线：将步骤(1)中的待测样品替换成免疫球蛋白A系列标准溶液，按照步骤(2)的方法检测和计算，得到免疫球蛋白A的标准曲线和免疫球蛋白A1的标准曲线；所述免疫球蛋白A的标准曲线是以免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A的浓度为横坐标，所述免疫球蛋白A1的标准曲线是以免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A1的浓度为横坐标；
(4)计算人乳样品中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的含量：将步骤(2)得到的免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A的标准曲线，得到免疫球蛋白A的浓度，计算得到免疫球蛋白A的含量；将免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A1的标准曲线，得到免疫球蛋白A1的浓度，计算得到免疫球蛋白A1的含量。
优选的，所述混合内标肽溶液中包括100nM的免疫球蛋白A特征肽的内标肽和100nM的免疫球蛋白A1特征肽的内标肽，所述人乳样品和混合内标肽溶液的体积比为2：(0.5～2)。
优选的，所述变性处理的试剂包括碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液，所述碳酸氢铵溶液的浓度为50～200nM，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为200～800mM，所述碘代乙酰胺溶液的浓度为200～800mM，所述人乳样品、碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液的体积比为(50～150)：790：10：30。
优选的，所述酶解处理的酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的浓度为0.5～2mg/ml，所述胰蛋白酶与人乳样品的体积比为(5～20):100。
本发明还提供了一种检测人乳中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1含量的试剂盒，所述试剂盒包括人血清免疫球蛋白A标准物质、免疫球蛋白A特征肽、免疫球蛋白A1特征肽、免疫球蛋白A特征肽的内标肽、免疫球蛋白A1特征肽的内标肽、胰蛋白酶、碳酸氢钠溶液、碘代乙酰胺溶液、二硫苏糖醇溶液，所述免疫球蛋白A特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述疫球蛋白A1特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述免疫球蛋白A特征肽的内标肽是将所述免疫球蛋白A的特征肽中的缬氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述免疫球蛋白A1特征肽的内标肽是将所述免疫球蛋白A1特征肽中的苯丙氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过筛选IgA的特征肽及其亚型IgA1的特征肽，并获取两条特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱-质谱联用的分析技术，实现了IgA及其亚型IgA1的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
(2)本发明选择IgA的特征肽及其亚型IgA1的特征肽段作为检测物质，不仅适用于变性蛋白的检测，还可以满足样品中的变性与非变性蛋白的同时检测，保证了方法的准确性。
附图说明
图1为标准溶液和人乳样品的质谱图；
图2为免疫球蛋白A特征肽的酶解曲线；
图3为免疫球蛋白A1特征肽的酶解曲线；
图4为免疫球蛋白A特征肽的标准曲线；
图5为免疫球蛋白A1特征肽的标准曲线。
具体实施方式
特异肽段的选择是靶向蛋白质组学检测技术中的关键步骤，它直接关系到定量方法的准确性。本发明对人乳中IgA的两个亚型IgA1和IgA2重链恒定区可能存在的胰蛋白酶酶切肽段进行预测与计算。IgA1和IgA2两种亚型的重链恒定区中均存在的肽段即可作为IgA的特征肽段，只存在于亚型IgA1中的肽段即可作为亚型IgA1的特征肽段。研究发现，VAAEDWK(SEQ ID No.1)作为IgA的特征肽具有较高的灵敏度，TFTCTAAYPESK(SEQ ID No.2)作为亚型IgA1的特征肽具有较高的酶解稳定性。因此，本发明以VAAEDWK(SEQ ID No.1)为IgA的特征肽，以TFTCTAAYPESK(SEQ ID No.2)作为亚型IgA1的特征肽。此外，特征肽的酶解特性会影响方法的准确性和效率。
本发明采用化学合成法合成相应的内标肽，化学合成法是采用稳定13C、15N标记的氨基酸替代未标记氨基酸，在高效缩合剂作用下反应得到稳定同位素标记的特异性肽段，是目前在基于靶向蛋白质组学的乳蛋白质定量研究中最为常用的方法。
本发明提供了一种免疫球蛋白A特征肽，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A特征肽的内标肽，所述内标肽是将所述免疫球蛋白A的特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸。
本发明提供了一种免疫球蛋白A1特征肽，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A1特征肽的内标肽，所述内标肽是将所述免疫球蛋白A1的特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为苯丙氨酸。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽在检测人乳中免疫球蛋白A的含量和免疫球蛋白A1的含量中的应用。
本发明还提供了一种免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽检测人乳中免疫球蛋白A的含量和免疫球蛋白A1的含量的方法，包括如下步骤：
(1)制备待测样品：在人乳样品中加入混合内标肽溶液，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(2)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，计算得到免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积额比值和免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值；
(3)绘制标准曲线：将步骤(1)中的待测样品替换成免疫球蛋白A系列标准溶液，按照步骤(2)的方法检测和计算，得到免疫球蛋白A的标准曲线和免疫球蛋白A1的标准曲线；所述免疫球蛋白A的标准曲线是以免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A的浓度为横坐标，所述免疫球蛋白A1的标准曲线是以免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A1的浓度为横坐标；
(4)计算人乳样品中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的含量：将步骤(2)得到的免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A的标准曲线，得到免疫球蛋白A的浓度，计算得到免疫球蛋白A的含量；将免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A1的标准曲线，得到免疫球蛋白A1的浓度，计算得到免疫球蛋白A1的含量。
本发明在人乳样品中加入混合内标肽溶液后，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品。
在本发明中，还优选对所述人乳样品进行前处理，所述前处理优选包括均质和稀释。
在本发明中，所述均质的条件优选使用超声波细胞粉碎机进行均质，超声功率优选为500～800，进一步优选为600，总时间为2min，工作时间与间隙时间均为10s，报警温度为28℃。
在本发明中，所述稀释的倍数优选为100～1000倍，进一步优选为300～800倍，再进一步优选为500倍。
在本发明中，所述稀释优选采用超纯水进行稀释。
在本发明中，所述混合内标肽溶液包括免疫球蛋白A特征肽的内标肽和免疫球蛋白A1特征肽的内标肽；所述免疫球蛋白A特征肽的内标肽在混合特征肽溶液中的浓度优选为5～200nM，进一步优选为100nM，所述免疫球蛋白A1特征肽的内标肽在混合特征肽溶液中的浓度优选为50～200nM，进一步优选为100nM。
在本发明中，所述人乳样品和混合内标肽溶液的体积比优选为2：(0.5～2)，进一步优选为2:1。
在本发明中，所述变性处理的试剂包括碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液，所述碳酸氢铵溶液的浓度优选为50～200nM，进一步优选为100nM，所述二硫苏糖醇溶液的浓度优选为200～800mM，进一步优选为500mM，所述碘代乙酰胺溶液的浓度为200～800mM，进一步优选为500mM。
在本发明中，所述人乳样品、碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液的体积比优选为(50～150)：790：10：30，进一步优选为100：790：10：30。
在本发明中，所述变性处理的步骤优选为在人乳样品中加入混合内标肽溶液后，先加入碳酸氢铵溶液和二硫苏糖醇溶液，涡旋均匀，进行变性反应，冷却，再加入碘代乙酰胺溶液，混匀后静置。
在本发明中，所述变性反应的温度优选为50～80℃，进一步优选为70℃；所述变性反应的时间优选为20～40min，进一步优选为30min。
在本发明中，所述冷却的温度优选为20～25℃，进一步优选为25℃。
在本发明中，所述静置优选为避光静置，所述静置的温度优选为25℃，所述静置的时间优选为30min。
在本发明中，所述酶解处理的酶优选为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的浓度优选为0.5～2mg/ml，进一步优选为1mg/ml。
在本发明中，所述胰蛋白酶与人乳样品的体积比优选为(5～20):100，进一步优选为10:100。
在本发明中，所述酶解处理优选在并行处理后的溶液中加入胰蛋白酶，混合均匀，进行酶解反应。
在本发明中，所述酶解反应的温度优选为37℃，所述酶解反应的时间优选为0.5～4h，进一步优选为1～3h，再进一步优选为2h。
在本发明中，所述终止处理的试剂优选为甲酸，进一步优选为纯甲酸。
在本发明中，所述甲酸与人乳样品的体积比优选为0.1：1。
在本发明中，还优选对所述待测样品进行过膜处理，所述过膜处理的滤膜的孔径优选为0.22μm。
本发明优选采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，测得免疫球蛋白A特征肽的峰面积、免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积、免疫球蛋白A1特征肽的峰面积、免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积，并进一步计算得到免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值和免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值。
在本发明中，所述高效液相色谱的条件优选为：色谱柱优选为：Acquity BEHPeptide 300C18柱(1.7μm，2.1×100mm)；柱温优选为：35℃；进样体积优选为：5μL；样品温度优选为：15℃；流动相A：0.1％甲酸-水，流动相B：0.1％甲酸-乙腈；采用梯度稀释，流速为0.3mL/min。
在本发明中，所述质谱的条件优选为：电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压3.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：800L/hour；鞘气温度：375℃，鞘气流量：50L/hour。
本发明采用下述方法绘制标准曲线：优选的将步骤(1)中的待测样品替换成免疫球蛋白A系列标准溶液，按照步骤(2)的方法检测和计算，得到免疫球蛋白A的标准曲线和免疫球蛋白A1的标准曲线。
在本发明中，所述免疫球蛋白A系列标准溶液优选将人血清免疫球蛋白A标准物质，加入所述混合内标肽溶液后，再加入碳酸氢铵溶液进行稀释，配置成免疫球蛋白A系列标准溶液。
在本发明中，所述碳酸氢铵溶液的浓度优选为100nM。
在本发明中，所述免疫球蛋白A系列标准溶液的浓度优选为0.5nmol/L、1nmol/L、2nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L、20nmol/L。
在本发明中，所述免疫球蛋白A的标准曲线优选是以免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A的浓度为横坐标。
在本发明中，所述免疫球蛋白A1的标准曲线优选是以免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A1的浓度为横坐标。
本发明在绘制好标准曲线后，将将步骤(2)得到的免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A的标准曲线，得到免疫球蛋白A的浓度，计算得到免疫球蛋白A的含量；将免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A1的标准曲线，得到免疫球蛋白A1的浓度，计算得到免疫球蛋白A1的含量。
本发明还提供了一种检测人乳中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1含量的试剂盒，优选的所述试剂盒包括人血清免疫球蛋白A标准物质、免疫球蛋白A特征肽、免疫球蛋白A1特征肽、免疫球蛋白A特征肽的内标肽、免疫球蛋白A1特征肽的内标肽、胰蛋白酶、碳酸氢钠、碘代乙酰胺、二硫苏糖醇。
在本发明中，所述免疫球蛋白A特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述疫球蛋白A1特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述免疫球蛋白A特征肽的内标肽是将所述免疫球蛋白A的特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述免疫球蛋白A1特征肽的内标肽是将所述免疫球蛋白A1特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段。
在本发明中，优选的所述试剂盒中还包括纯甲酸。
下面结合实施例对本发明提供的一种免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的检测方法及其试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
准确吸取100μL均质的人乳于15mL塑料离心管中，加入4.9mL超纯水稀释，涡旋混匀。准确吸取100μL稀释后的人乳，加入50μL混合内标肽溶液，其中，混合内标肽溶液中包括100nM的免疫球蛋白A特征肽的内标肽和100nM的免疫球蛋白A1特征肽的内标肽。再加入790μL 100nM碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液，10μL 500mM二流苏糖醇(DTT)溶液，涡旋混匀后于70℃反应30min，取出冷却至25℃，加入30μL 500mM碘代乙酰胺(IAA)溶液，混匀后于25℃避光静置30min，再加入10μL1 mg/mL胰蛋白酶溶液，混匀后于37℃恒温酶解2小时，酶解完成后，加入10μL纯甲酸终止反应，混匀后于25℃反应30min，过0.22μm滤膜，得到待测人乳样品溶液。
准确吸取10nM的人血清免疫球蛋白A标准物质100μL于15mL塑料离心管中，加入4.9mL超纯水稀释，涡旋混匀。然后吸取100μL稀释后的标准溶液，之后按照与人乳同样的方法加入同样的混合内标肽溶液，进行变性处理、酶解处理和终止处理，过滤，得到待测标准溶液。
采用高效液相色谱-质谱联用技术对制备的待测标准溶液和待测人乳样品进行检测。
本实施例采用的仪器设备为：超高效液相色谱串联四级杆质谱(Xevo TQ-XS，Waters公司，美国)。
采用的液相色谱条件如下：
(1)硅烷基C18柱，柱长100mm，柱内径2.1mm；填料粒径1.7μm，孔径
或等效者，柱温35℃；
(2)流动相A相0.1％甲酸-水；B相0.1％甲酸-乙腈；
(3)梯度洗脱：参考梯度洗脱程序见表1；
表1流动相梯度洗脱程序
注：A相+B相＝100％；
(4)流动相流速：0.3mL/min；
(5)样品温度：15℃；
(6)进样体积：5μL。
采用的质谱条件如下：
电喷雾模式：ESI+；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压3.5kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：325℃，脱溶剂气流量：800L/hour；鞘气温度：375℃，鞘气流量：50L/hour；其它质谱参数见表2。
表2质谱参数
注：表中带*为定量离子；不同质谱仪器，质谱参数条件可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳。
经检测标准溶液和人乳样品的质谱图如图1所示，从图1中可以看出标准溶液和人乳样品的质谱图峰型和保留时间一致，表明人乳样品中，含有IgA和IgA1。
实施例2
免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽的酶解特性：
准确吸取500μL均质的人乳于15mL塑料离心管中，加入4.5mL超纯水稀释，涡旋混匀。准确吸取100μL稀释后的人乳，依次加入850μL100mM碳酸氢钠(NaHCO3)溶液和10μL500mM二硫苏糖醇(DTT)溶液，混匀后于70℃金属浴1000rpm振荡反应30min，待冷却至25℃后加入30μL 500mM碘代乙酰胺(IAA)溶液，混匀后于25℃避光反应30min。然后加入10μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，混匀后于37℃金属浴1000rpm振荡反应，选择1min，5min，10min，15min，30min，45min，60min，90min，120min，150min，180min，210min，240min，300min，360min，480min共16个酶解时间点取反应液作为样本，冷却至25℃后用0.22μm滤膜过滤，得到不同的时间点的酶解肽段溶液。
取500μL上述酶解肽段溶液，依次加入20μL4％(V/V)甲醛(CH2O)溶液和20μL600mM氰基硼氢化钠溶液，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应1h。然后加入80μL 1％(V/V)氨水溶液，涡旋混匀，再加入40μL纯甲酸，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应30min，制得二甲基衍生的肽段溶液。同时另取500μL酶解肽段溶液，加入20μL 4％(V/V)同位素甲醛(13CD2O)溶液和20μL 600mM氰基硼氢化钠溶液，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应1h。然后加入80μL 1％(V/V)氨水溶液，涡旋混匀，再加入40μL纯甲酸，混匀后于25℃金属浴1000rpm振荡反应30min，制得同位素二甲基衍生的肽段溶液，作为内标溶液。按1:1的体积混合二甲基衍生的肽段溶液和内标溶液，即制得待测液。然后采用超高液相色谱串联高分辨静电场轨道离子阱质谱(UPLC-Q-Exactive，ThermoFisher Scientific公司，美国)法检测人乳中二甲基衍生的肽段(轻链)和内标(重链)的峰面积，并计算轻链和重链的峰面积比值(light/heavy Ratio)。轻链与重链的峰面积比值随酶解时间的变化，如图2和图3所示，可知在酶解2h时酶解反应达到平稳。因此，本发明提供的免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽具有很好的稳定性，能够用来检测人乳中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的含量。
实施例3
绘制标准曲线：
分别准确吸取10nM的人血清免疫球蛋白A标准物质50μL，100μL，200μL和100nM的人血清免疫球蛋白A标准物质50μL，100μL，150μL，200μL于2mL塑料离心管中，各加入50μL的混合内标肽溶液，其中，混合内标肽溶液中包括100nM的免疫球蛋白A特征肽的内标肽和100nM的免疫球蛋白A1特征肽的内标肽，再分别加入100nM NH4HCO3溶液840μL，790μL，690μL，840μL，790μL，740μL，690μL；然后分别加入10μL 500mM二流苏糖醇(DTT)溶液，涡旋混匀后于70℃反应30min，取出冷却至25℃，加入30μL 500mM碘代乙酰胺(IAA)溶液，混匀后于25℃避光静置30min，再加入10μL1 mg/mL胰蛋白酶溶液，混匀后于37℃恒温酶解2小时，酶解完成后，加入10μL纯甲酸终止反应，混匀后于25℃反应30min，过0.22μm滤膜，得到浓度分别为0.5nmol/L、1nmol/L、2nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L、20nmol/L的免疫球蛋白A系列标准溶液。
采用实施例1中高效液相色谱和质谱的条件检测免疫球蛋白A系列标准溶液，每个样品平行检测6次。得到免疫球蛋白A系列标准溶液的免疫球蛋白A特征肽的峰面积、免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积、免疫球蛋白A1特征肽的峰面积、免疫球蛋白1A特征肽的内标肽的峰面积；并计算各浓度的免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值，和各浓度的免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值；并以免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A的浓度为横坐标，得到免疫球蛋白A的标准曲线如图4所示；以免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A1的浓度为横坐标，得到免疫球蛋白A1的标准曲线如图5所示。
其中，免疫球蛋白A的标准曲线的公式为y1＝1.9866x1-0.3912，R2＝0.9997；其中x1为IgA的浓度(nmol/L)，y1为IgA特征肽的峰面积与IgA内标肽的峰面积的比值。
免疫球蛋白A1的标准曲线的公式为y2＝0.991x2+0.0201，R2＝0.9999，其中x2为IgA1的浓度(nmol/L)，y2为IgA1特征肽的峰面积与IgA1内标肽的峰面积的比值。
实施例4
对本发明提供的高效液相色谱-质谱联用技术的回收率和精密度进行验证：
方法准确性主要通过低、中、高三个浓度水平加标实验来评估，每个加标水平实验平行六次，加标水平及回收率(回收率％＝(加标后测得的量-本底含量)/加标量×100％)，结果如表3所示。精密度则通过日间、日内(连续重复三天)RSD(相对标准偏差)来表示。
表3回收率及精密度结果
低、中、高三水平加标回收率在92.48％～99.97％之间，日内精密度在1.59％～5.90％之间，日间精密度在2.14％～5.65％之间，均满足方法学验证的基本要求。
实施例5
对不同地区人初乳和成熟乳中IgA和IgA1含量的检测：
选取青岛、武汉、呼和浩特三城共50份人初乳和53份成熟乳作为研究对象，进行人乳中IgA和其亚型IgA1含量的测定，具体方法如下：
准确吸取100μL均质的人乳于15mL塑料离心管中，加入4.9mL超纯水稀释，涡旋混匀。准确吸取100μL稀释后的母乳，加入50μL混合内标肽，其中，混合内标肽溶液中包括100nM的免疫球蛋白A特征肽的内标肽和100nM的免疫球蛋白A1特征肽的内标肽，790μL100nM碳酸氢铵(NH4HCO3)溶液，10μL 500mM二流苏糖醇(DTT)溶液，涡旋混匀后于70℃反应30min，取出冷却至25℃，加入30μL 500mM碘代乙酰胺(IAA)溶液，混匀后于25℃避光静置30min，再加入10μL1 mg/mL胰蛋白酶溶液，混匀后于37℃恒温酶解2小时，酶解完成后，加入10μL纯甲酸终止反应，混匀后于25℃反应30min，过0.22μm滤膜，得到待测样品溶液。将所得待测样品溶液作为进样液进行高效液相色谱-质谱联用分析(高效液相色谱-质谱条件同实施例1)，得到6组实验样品的免疫球蛋白A特征肽与其内标肽的峰面积比和免疫球蛋白A1特征肽与其内标肽的峰面积比，再分别代入免疫球蛋白A的标准曲线的公式为y1＝1.9866x1-0.3912和免疫球蛋白A1的标准曲线的公式为y2＝0.991x2+0.0201，计算得到各组样品中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的浓度，已知免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的分子量均为160000g/mol，稀释度为500倍，可进一步换算得到各组样品中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的含量。
结果如表4所示，三组及三组以上组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，p<0.05时认为差异有显著统计学意义。
表4不同地区和类型人乳样品中IgA和IgA1的含量
注：median(IQR)表示含量的中位数(四分位距)；
a、b表示差异有统计学意义(p<0.01)。
总结：该方法可以测定人乳中IgA含量及其亚型IgA1的含量，来自三座城市的初乳的IgA含量和其亚型IgA1含量均明显较成熟乳中的含量高。在成熟乳中，呼和浩特市的IgA含量和其亚型IgA1含量均在三地区中最高，分别为0.58(0.23)mg/mL和0.43(0.21)mg/mL，其次为武汉市，IgA含量和其亚型IgA1含量分别为0.51(0.26)mg/mL和0.33(0.25)mg/mL，青岛市的IgA含量和其亚型IgA1含量均为最低，分别为0.40(0.14)mg/mL和0.29(0.15)mg/mL。且三地区IgA含量之间和其亚型IgA1含量之间的差异均显著(p<0.01)。进一步两两比较发现该显著性差异来自于青岛与呼和浩特市之间。而在初乳中，三个地区的IgA含量和亚型IgA1含量呈现出与成熟乳相似的规律，青岛、武汉和呼和浩特市的IgA含量分别为0.99(1.38)mg/mL、1.19(1.74)mg/mL和1.50(1.35)mg/mL，IgA1含量分别为0.83(1.62)mg/mL、0.93(1.69)mg/mL和1.26(0.83)mg/mL，但差异均无统计学意义。
由以上实施例可知，本发明通过筛选IgA的特征肽及其亚型IgA1的特征肽，并获取两条特征肽相应的内标肽，并利用高效液相色谱-质谱联用的分析技术，实现了人乳中IgA及其亚型IgA1的定量检测，该方法具有较好的线性、灵敏度、回收率和精密度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州璞湃科技有限公司
<120> 一种免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的检测方法及其试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys
1 5
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser Lys
1 5 10
Claims (10)
1.一种免疫球蛋白A特征肽，其特征在于，所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的免疫球蛋白A特征肽的内标肽，其特征在于，所述内标肽是将所述免疫球蛋白A特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为缬氨酸。
3.一种免疫球蛋白A1特征肽，其特征在于，其中，免疫球蛋白A1为权利要求1中免疫球蛋白A的亚型；所述特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.权利要求3所述的免疫球蛋白A1特征肽的内标肽，其特征在于，所述内标肽是将所述免疫球蛋白A1特征肽中的氨基酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述氨基酸为苯丙氨酸。
5.一种免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽在检测人乳中免疫球蛋白A的含量和免疫球蛋白A1的含量中的应用。
6.一种免疫球蛋白A特征肽和免疫球蛋白A1特征肽检测人乳中免疫球蛋白A的含量和免疫球蛋白A1的含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备待测样品：在人乳样品中加入混合内标肽溶液，依次进行变性处理、酶解处理和终止处理，得到待测样品；
(2)检测：采用高效液相色谱-质谱联用技术检测待测样品，计算得到免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值和免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值；
(3)绘制标准曲线：将步骤(1)中的待测样品替换成免疫球蛋白A系列标准溶液，按照步骤(2)的方法检测和计算，得到免疫球蛋白A的标准曲线和免疫球蛋白A1的标准曲线；所述免疫球蛋白A的标准曲线是以免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A的浓度为横坐标，所述免疫球蛋白A1的标准曲线是以免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值为纵坐标，以免疫球蛋白A1的浓度为横坐标；
(4)计算人乳样品中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1的含量：将步骤(2)得到的免疫球蛋白A特征肽的峰面积与免疫球蛋白A特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A的标准曲线，得到免疫球蛋白A的浓度，计算得到免疫球蛋白A的含量；将免疫球蛋白A1特征肽的峰面积与免疫球蛋白A1特征肽的内标肽的峰面积的比值代入免疫球蛋白A1的标准曲线，得到免疫球蛋白A1的浓度，计算得到免疫球蛋白A1的含量。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述混合内标肽溶液中包括100nM的免疫球蛋白A特征肽的内标肽和100nM的免疫球蛋白A1特征肽的内标肽，所述人乳样品和混合内标肽溶液的体积比为2：(0.5～2)。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述变性处理的试剂包括碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液，所述碳酸氢铵溶液的浓度为50～200nM，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为200～800nM，所述碘代乙酰胺溶液的浓度为200～800nM，所述人乳样品、碳酸氢铵溶液、二硫苏糖醇溶液和碘代乙酰胺溶液的体积比为(50～150)：790：10：30。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶解处理的酶为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶的浓度为0.5～2mg/ml，所述胰蛋白酶与人乳样品的体积比为(5～20):100。
10.一种检测人乳中免疫球蛋白A和免疫球蛋白A1含量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括人血清免疫球蛋白A标准物质、免疫球蛋白A特征肽、免疫球蛋白A1特征肽、免疫球蛋白A特征肽的内标肽、免疫球蛋白A1特征肽的内标肽、胰蛋白酶、碳酸氢钠溶液、碘代乙酰胺溶液、二硫苏糖醇溶液，所述免疫球蛋白A特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述疫球蛋白A1特征肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述免疫球蛋白A特征肽的内标肽是将所述免疫球蛋白A的特征肽中的缬氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段，所述免疫球蛋白A1特征肽的内标肽是将所述免疫球蛋白A1特征肽中的苯丙氨酸用13C和15N同位素标记后的肽段。
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| CN117647606A (zh) * | 2024-01-30 | 2024-03-05 | 西湖欧米(杭州)生物科技有限公司 | 适于lc-ms/ms能同时检测多种蛋白的试剂盒 |
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