CN116223651A - 基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法 - Google Patents

基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素‑6的定值方法，包括如下步骤：(1)特征肽段的选择：选择EK、ER、VK三条肽段为特征肽段，EK、ER、VK的序列如SEQ ID NO：1‑3所示；(2)化学合成三条特征肽段和相应同位素标记肽段；(3)采用氨基酸的同位素稀释质谱法分别测定三条特征肽段纯度的测定；(4)IL‑6经胰蛋白酶酶解；(5)采用肽段的同位素稀释质谱法对酶解液中三条特征肽段进行准确定量；(6)IL‑6酶解肽段的高效液相色谱‑同位素稀释质谱分析；(7)IL‑6含量的计算。本发明得到了IL‑6的三条特征肽段，均为IL‑6的特异性肽段，不易受到干扰组分的影响，提高了定量结果的准确性。与氨基酸的同位素稀释质谱法相比，本发明定值方法具有特异性。

Description

基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法
技术领域
本发明涉及蛋白标准物质定值技术领域，特别是涉及一种白细胞介素-6的定值方法。
背景技术
白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)，简称白介素-6，是由212个氨基酸组成的多功能糖蛋白，是一种细胞炎性因子。它在健康人群体内含量很低，当机体受到细菌感染时，其含量与细菌感染程度呈正相关。IL-6在机体病理和生理活动中发挥着多种作用，例如急性炎症反应、自身免疫性疾病、冠心病、肿瘤形成、脓毒症等。连续监测重症监护患者IL-6的水平能够有效评估系统性炎症反应综合征的严重程度，脓毒症以及脓毒症性休克的预后情况。另外，IL-6还能作为脓毒症的早期警告指标。血清中IL-6含量的测定对于多种疾病的诊断及预后具有重要的意义。
目前，国内尚未有IL-6标准物质，英国生物标准和检定研究所(NIBSC)研制的重组人白介素6(rhIL-6)活性测定国际标准品(Code89/548)，1.0×105IU/支，100,000IU/1.0ug为活性标准物质。但是，现有的标准物质无法实现蛋白含量的绝对定量。因此，研制量值准确、具有溯源性的标准物质具有迫切的需求。
氨基酸的同位素稀释质谱法为测定蛋白质含量的常用方法，但该方法无法区分来自蛋白质或是杂质的氨基酸，该方法一是对蛋白的纯度要求高，二是其定值结果有可能会偏高。
因此，开发一种可实现白细胞介素-6绝对定量、测量结果可溯源至SI单位的定值方法成为了本领域亟需解决的技术问题之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6定值方法。本方法采用肽段的同位素稀释质谱法进行定值，所选肽段为IL-6的特异性肽段，特异性好，准确性高，测量结果可溯源至SI单位kg。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，包括以下步骤：
(1)特征肽段的选择：选择EK、ER、VK为特征肽段，EK、ER、VK的序列分别为EALAENNLNLPK、EFLQSSLR、VLIQFLQK，如SEQ ID NO：1-3所示；
(2)特征肽段的合成：合成特征肽段EK、ER、VK及三条同位素标记肽段，三条同位素标记肽段的序列分别为EAL(13C6,15N)AENNLNLPK、EFL(13C6,15N)QSSLR、VL(13C6,15N)IQFLQK；
(3)特征肽段纯度的准确定量：以亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标准物质，同位素标记13C9-苯丙氨酸、13C5-脯氨酸、D10-亮氨酸为内标，采用氨基酸同位素稀释质谱法对合成的三条特征肽段进行定量；
(4)将白细胞介素-6经胰蛋白酶酶解；
(5)采用肽段的同位素稀释质谱法对酶解液中三条特征肽段进行准确定量；
(6)三条特征肽段液相条件、质谱条件的优化：确定特征肽段及同位素标记肽段母离子、子离子，并对质谱参数进行优化；
(7)分别计算酶解液中三条特征肽段的含量，以特征肽段的含量计算IL-6的浓度作为白细胞介素-6标准物质的定值结果。
其中，所述白细胞介素-6的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
其中，所述步骤(3)中，以亮氨酸、脯氨酸的同位素的稀释质谱法对肽段EK进行定量，以亮氨酸、苯丙氨酸对肽段ER进行定量，以亮氨酸、苯丙氨酸对VK进行定量。
其中，所述步骤(4)中，酶解时间为12h，样品与胰蛋白酶酶的比例为30:1。
其中，所述步骤(5)中，采用以下公式计算合成的特征肽段的含量，
Figure SMS_1
其中，CAA：溶液中氨基酸的浓度；
P：氨基酸标物纯度；
m标：肽段中加入标记氨基酸的质量，mg；
R样：样品中氨基酸色谱峰面积比，非标记/标记；
I1：低标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
I2：高标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
R1：低标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
R2：高标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
M：平行样中EK、ER、VK样品溶液的质量，mg；
Figure SMS_2
式中，Ci代表每种氨基酸计算得到的IL-6浓度，CAA代表测得氨基酸的浓度，MIL-6代表IL-6相对分子质量，MAA代表每种氨基酸的相对分子质量，n代表EK、ER、VK中对应氨基酸的个数。
其中，所述步骤(6)中，所用色谱柱为ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，2.1mm×100mm，1.7μm；
流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，流速为0.2ml/min，进样量为2μL；
流动梯度：(0～20)min，(10％～28％)B，(20～22)min，(28％～50％)B；(22～24)min，(50％～80％)B；(24.1～30)min，10％B；
EK(663.4/244.2)，ER(490.3/462.3)，VK(495.0/185.2)，13C-EK(667.0/244.10)，13C-ER(493.7/590.2)，13C-VK(498.4/220.1)；并对DP，CE值进行优化。
其中，所述步骤(7)具体为，
1)根据三条特征肽段的纯度计算酶切后三条特征肽段的质量，配置相应浓度的特征肽段和同位素标记肽段；
2)将三条特征肽段同位素内标溶液配制成与样品溶液中肽段质量比为1:1的混合溶液；肽段标准品溶液与同位素内标的比为0.9:1，1:1，1.1:1；
3)称量待测体积的Il-6蛋白溶液，加入并称量同体积的同位素内标混合溶液，待测IL-6的特征肽段浓度应在确定的线性范围中间位置；
4)采用以下公式计算IL-6的浓度
Figure SMS_3
其中，Ci：溶液中EK、ER、VK的浓度；
P：特征肽段的纯度；
m标：特征肽段中加入标记肽段的质量，mg；
R样：样品中特征肽段色谱峰面积比，非标记/标记；
I1：低标肽段实际质量比，非标记/标记；
I2：高标肽段实际质量比，非标记/标记；
R1：低标肽段峰面积比，非标记/标记；
R2：高标肽段面积比，非标记/标记；
M：平行样中IL-6样品溶液的质量，mg；
Figure SMS_4
式中，CIL-6：溶液中IL-6的浓度；Ci：溶液中EK、ER、VK的浓度；MIL-6：IL-6的相对分子质量；n：IL-6序列中对应EK、ER、VK片段的数量；Mi：EK、ER、VK的相对分子质量。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
(1)本发明将定性与定量方法相结合，提高了测定结果的准确性。采用飞行时间质谱、高分辨质谱和三重四极杆串联质谱仪相结合的方法，使定性方法与定量方法相结合，飞行时间质谱、高分辨质谱选择特征肽段用于三重四级杆串联质谱的定量，使得用于三重四极杆液质联用的定量的特异性肽段不易受到干扰组分的影响，从而提高定量结果的准确性。
(2)本发明方法对IL-6的定值，同时选择3条特征肽段同位素稀释质谱法测定结果的平均值，同时3条特征肽段选用同位素标记的氨基酸进行定值，提高了定值结果的准确性。
(3)本发明基于肽段同位素稀释质谱的方法对IL-6质量浓度进行测定，作为标准物质的标准值。同位素稀释质谱法是国际公认的潜在基准测量方法，以GBW09236 L-缬氨酸、GBW09237 L-亮氨酸、GBW09235 L-苯丙氨酸纯度国家一级标准物质为量值溯源参考标准，并使用经过检定/校准的称量等计量器具，确保了标准物质的量值溯源至SI基本单位千克(kg)和摩尔(mol)。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法作进一步说明。
附图说明
图1为基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法的流程图；
图2为IL-6酶解肽段样品Q-TOF下的TIC图；
图3为IL-6酶解肽段高分辨质谱图；
图4为不同酶解时间优化图；
图5为不同比例酶量优化图；
图6为IL-6酶解肽段及同位素肽段MRM图。
具体实施方式
以下实施例所用到的试剂及仪器包括：
试剂：
GBW09237 L-亮氨酸纯度标准物质：纯度99.8％，U＝1.5％(k＝2)，中国计量科学研究院。
GBW09236缬氨酸纯度标准物质：纯度99.4％，U＝0.6％(k＝2)，中国计量科学研究院。
GBW09235苯丙氨酸纯度标准物质：纯度99.8％，U＝1.5％(k＝2)，中国计量科学研究院。
GBW(E)100084脯氨酸纯度标准物质：纯度99.0％，U＝1.5％(k＝2)，中国计量科学研究院。
13C9-苯丙氨酸、13C5-脯氨酸、D10-亮氨酸，13C5-缬氨酸同位素标记氨基酸为美国剑桥同位素实验室，纯度＞98％。
乙腈，德国Merck公司，色谱级。
EK、ER、VK，L-EK、L-ER、L-VK为南京金斯瑞生物科技有限公司，纯度＞92％。
三氟乙酸，美国Sigma-Aldirich，色谱纯；
甲酸，Supelco公司，色谱纯；
胰蛋白酶，美国Promega；
二硫苏糖醇(DTT)美国inalco；
碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAM)美国Inalco公司；
仪器：
高效液相三重四杆质谱仪，AB SCIEX 5500；
高效液相飞行时间质谱仪，AB Q-TOF X500B；
电子天平：赛多利斯；
高分辨质谱液相联用仪(纳升液相)：赛默飞Orbitrap Exploris240；
超高效液相色谱仪，Waters BIO H-CLASS；
高效液相色谱仪，Waters Alliance e2695
结合图1所示，基于肽段同位素稀释质谱对白细胞介素-6进行定值，具体步骤如下：
1.特征肽段的选择，IL-6样品经胰蛋白酶酶解，酶解后样品经飞行时间质谱和高分辨质谱分析。实验操作步骤如下：
(1)润洗：加入100μL 50mM碳酸氢铵于10k的超滤管中润洗。
(2)溶液置换：16000r离心10min。100μL(1μg/uL)样品加入超滤管滤膜。
(3)变性：加入100μL 7M盐酸胍变性。
(4)还原：加入4μL 1M DTT置于42℃恒温1h。
(5)烷基化：加入10μL 1M IAA室温避光30min。
(6)离心，加入100μL 50mM碳酸氢铵离心，16000g，离心15min，至超滤膜溶液至干，重复三次。
(7)酶解：样品与胰蛋白酶30:1(质量比)，37℃烘箱恒温12h。
(8)倒置离心1min，加FA终止反应，溶液中FA的终浓度为1％。分别进飞行时间质谱和高分辨质谱分析。
飞行时间串联质谱系统进行条件为：
色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 Column，130A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg，柱温30℃，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，进样量2μL。
表1飞行时间质谱流动相梯度表
Time Flow(mL/min) A(％) B(％)
0 0.3 98.0 2.0
1.00 0.3 98.0 2.0
20.00 0.3 65.0 35.0
50.0 0.3 55.0 45.0
52.0 0.3 20.0 80.0
55.10 0.3 98.0 2.0
60.0 0.3 98.0 2.0
质谱条件：正离子扫描，IDA模式，TOF MS扫描范围：(200～2000)Da，TOF MS/MS扫描范围：(100～2000)Da，DP：100V，CE：15V。
分析软件为BioPharmaView。
Orbitrap Exploris240高分辨质谱液相联用仪(纳升液相)进样条件为：
液相条件：预柱：Acclaim PepMapTM 100 75μm×2cm，nanoViper 2Pk C18，3μm，100A.色谱柱：Acclaim PepMapTM RSLC 50μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A。
柱温：室温，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈水溶液(80％乙腈+20％水)；进样量1μL。
表2高分辨质谱流动相梯度表
Figure SMS_5
Figure SMS_6
质谱条件：正离子扫描，扫描范围：(200～2000)Da，分辨率：15000，带点：1-6。
所用分析软件Thermo BioPharma Finder5.1。
根据飞行时间质谱和高分辨质谱结果，最终挑选出能够稳定出现、质谱响应强度较高、无漏切位点且序列长度适宜的EK、ER、VK为特征肽段，EK、ER、VK的序列分别为EALAENNLNLPK、EFLQSSLR、VLIQFLQK，如SEQ ID NO：1-3所示，IL-6氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。IL-6酶解肽段样品Q-TOF下的TIC图如图2所示；IL-6酶解肽段样品高分辨质谱图下的TIC图如图3所示。
2.特征肽段的合成：合成特征肽段EK、ER、VK及三条同位素标记肽段，三条同位素标记肽段的序列分别为EA{L(13C6，15N)}AENNLNLPK、EF{L(13C6，15N)}QSSLR、V{L(13C6，15N)}IQFLQK。
3.特征肽段纯度的准确定量：以缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标准物质，同位素标记13C9-苯丙氨酸、13C5-脯氨酸、13C5-缬氨酸、D10-亮氨酸为内标，采用氨基酸同位素稀释质谱法对合成的三条特征肽段进行定量；
其中，以亮氨酸、脯氨酸的同位素的稀释质谱法对肽段EK进行定量，以亮氨酸、苯丙氨酸对肽段ER进行定量，以缬氨酸、苯丙氨酸对VK进行定量。
操作步骤如下：分别精确称量配置的EK、ER、VK溶液置于安瓿瓶中，记录称量质量，EK溶液中加入同等质量的亮氨酸、脯氨酸标记标准溶液，ER溶液中加入同等质量的亮氨酸，苯丙氨酸标记标准溶液，VK溶液中加入同等质量标记缬氨酸、苯丙氨酸标记标准溶液，离心浓缩至干，然后加入800μL 6mol/L盐酸溶液混匀，通氮气除氧密封，于110℃烘箱内水解36h，取出后氮气吹干，加0.1％甲酸-水溶液复溶，过0.22μm滤膜，待测。
采用以下公式计算合成的特征肽段的含量，
Figure SMS_7
其中，CAA：溶液中氨基酸的浓度；
P：氨基酸标物纯度；
m标：肽段中加入标记氨基酸的质量，mg；
R样：样品中氨基酸色谱峰面积比，非标记/标记；
I1：低标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
I2：高标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
R1：低标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
R2：高标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
M：平行样中EK、ER、VK样品溶液的质量，mg；
Figure SMS_8
式中，Ci代表每种氨基酸计算得到的IL-6浓度，CAA代表测得氨基酸的浓度，MIL-6代表IL-6相对分子质量20808.31，MAA代表每种氨基酸的相对分子质量，n代表EK、ER、VK中对应氨基酸的个数。
液相条件：色谱柱：ACQUITY UPLC Peptide BEH C18 Column，130A，1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg，柱温30℃，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈，洗脱梯度：(0～10)min，(5～95)％B，(10～14)min，95％B，(14.10～16)min，5％B，流速0.2mL/min，进样量2μL。
表3氨基酸同位素稀释质谱法质谱条件
ID Q1 Q3 DP(V) CE(V)
Phe 166.1 120.1 50 19
Pro 116.1 70.0 50 23
Val 118.10 72.10 40 16
Leu 131.80 86.10 110. 15
13C9-Phe 175.1 128.1 50 19
13C5-Pro 121.0 74.1 50 22
13C5-Val 123.10 76.10 40 15
D10-Leu 142.10 96.10 70 15
表4肽段纯度
肽段 EK VK ER
浓度(％) 92.15 93.89 93.52
4.白细胞介素-6标准品通过胰蛋白酶酶解，并对酶解条件进行优化。
准确称取内标肽段混合溶液，混合液中每条肽段的质量与样品酶解后各肽段的质量相当。将IL-6标准溶液与内标肽段混合溶液按质量比1:1混合，在不同酶解时间和不同比例酶使用量下进行优化。酶切效率高低以酶解肽段与内标肽段的峰面积比为判定依据。最终采用酶解时间为12h，样品与胰蛋白酶酶的比例为30:1。不同酶解时间优化图如图4所示，不同比例酶量优化图如图5所示。
5.采用肽段的同位素稀释质谱法对酶解液中三条特征肽段进行准确定量，操作步骤如下：
准确称取一定质量的IL-6溶液，加入含有等量混合标记肽段的溶液，加入100μL50mM碳酸氢铵，100μL 7M盐酸胍，4μL 1M DTT置于42℃恒温1h。随后加入10μL1M IAA室温避光30min。加入50mM碳酸氢铵溶液稀释，使盐酸胍浓度降至1mol/L以下，样品与胰蛋白酶30:1(质量比)，37℃酶解12h。加甲酸终止反应，溶液中甲酸的终浓度为1％。过滤膜，待测。
6.三条特征肽段液相条件、质谱条件的优化
对液相条件进行优化，流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈。梯度洗脱条件如表5所示。
表5肽段同位素稀释质谱法流动相梯度表
Time Flow A B
0 0.2 90.0 10.0
20.0 0.2 72.0 28.0
22.0 0.2 50.0 50.0
24.0 0.2 20.0 80.0
24.10 0.2 90.0 10.0
30.0 0.2 90.0 10.0
对质谱条件进行优化，确定特征肽段及同位素标记肽段母离子、子离子，并对质谱参数进行优化，如表6所示。
表6肽段同位素稀释质谱法流动相质谱条件
Q1 Q3 ID DP(V) CE(V)
663.4 244.2 EK 140 27
667.0 244.10 13C-EK 90 27
493.7 590.2 13C-ER 80 25
490.3 462.3 ER 120 23
495.0 185.2 VK 100 24
498.4 220.1 13C-VK 80 22
IL-6酶解肽段、同位素内标肽段MRM图如图6所示。
7.分别计算酶解液中三条特征肽段的含量，以特征肽段的含量计算IL-6的浓度作为白细胞介素-6标准物质的定值结果。IL-6的含量取3条特征肽段测出结果的平均值。
1)根据三条特征肽段的纯度计算酶切后三条特征肽段的质量，配置相应浓度的特征肽段和同位素标记肽段；
2)将三条特征肽段同位素内标溶液配制成与样品溶液中肽段质量比为1:1的混合溶液；肽段标准品溶液与同位素内标的比为0.9:1，1:1，1.1:1；
3)称量待测体积的Il-6蛋白溶液，加入并称量同体积的同位素内标混合溶液，待测IL-6的特征肽段浓度应在确定的线性范围中间位置；
4)采用以下公式计算IL-6的浓度
Figure SMS_9
其中，Ci：溶液中EK、ER、VK的浓度；
P：特征肽段EK、ER、VK的纯度；
m标：特征肽段中加入标记肽段的质量，mg；
R样：样品中特征肽段色谱峰面积比，非标记/标记；
I1：低标肽段实际质量比，非标记/标记；
I2：高标肽段实际质量比，非标记/标记；
R1：低标肽段峰面积比，非标记/标记；
R2：高标肽段面积比，非标记/标记；
M：平行样中IL-6样品溶液的质量，mg；
Figure SMS_10
式中，CIL-6：溶液中IL-6的浓度；Ci：溶液中EK、ER、VK的浓度；MIL-6：IL-6的相对分子质量20808.31；n：IL-6序列中对应EK、ER、VK片段的数量；Mi：EK、ER、VK的相对分子质量。白介素-6的定值结果取EK、ER、VK三个特征肽段定值的平均值。
表7肽段同位素稀释质谱法流动相质谱条件
Figure SMS_11
Figure SMS_12
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)特征肽段的选择：选择EK、ER、VK为特征肽段，EK、ER、VK的序列分别为EALAENNLNLPK、EFLQSSLR、VLIQFLQK，如SEQ ID NO：1-3所示；
(2)特征肽段的合成：合成特征肽段EK、ER、VK及三条同位素标记肽段，三条同位素标记肽段的序列分别为EAL(13C6,15N)AENNLNLPK、EFL(13C6,15N)QSSLR、VL(13C6,15N)IQFLQK；
(3)特征肽段纯度的准确定量：以亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸标准物质，同位素标记13C9-苯丙氨酸、13C5-脯氨酸、D10-亮氨酸为内标，采用氨基酸同位素稀释质谱法对合成的三条特征肽段进行定量；
(4)白细胞介素-6经胰蛋白酶酶解；
(5)采用肽段的同位素稀释质谱法对酶解液中三条特征肽段进行准确定量；
(6)三条特征肽段液相条件、质谱条件的优化：确定特征肽段及同位素标记肽段母离子、子离子，并对质谱参数进行优化；
(7)分别计算酶解液中三条特征肽段的含量，以特征肽段的含量计算IL-6的浓度作为白细胞介素-6标准物质的定值结果。
2.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述白细胞介素-6的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(3)中，以亮氨酸、脯氨酸的同位素的稀释质谱法对肽段EK进行定量，以亮氨酸、苯丙氨酸对肽段ER进行定量，以缬氨酸、苯丙氨酸对VK进行定量。
4.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(4)中，酶解时间为12h，样品与胰蛋白酶酶的比例为30:1。
5.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(5)中，采用以下公式计算合成的特征肽段的含量，
Figure FDA0004000385760000011
其中，CAA：溶液中氨基酸的浓度；
P：氨基酸标物纯度；
m标：肽段中加入标记氨基酸的质量，mg；
R样：样品中氨基酸色谱峰面积比，非标记/标记；
I1：低标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
I2：高标氨基酸实际质量比，非标记/标记；
R1：低标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
R2：高标氨基酸峰面积比，非标记/标记；
M：平行样中EK、ER、VK样品溶液的质量，mg；
Figure FDA0004000385760000021
式中，Ci代表每种氨基酸计算得到的IL-6浓度，CAA代表测得氨基酸的浓度，MIL-6代表IL-6相对分子质量，MAA代表每种氨基酸的相对分子质量，n代表EK、ER、VK中对应氨基酸的个数。
6.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(6)中，所用色谱柱为ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，2.1mm×100mm，1.7μm；
流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为0.1％甲酸乙腈，流速为0.2ml/min，进样量为2μL；
流动梯度：0～20min，10％～28％B；20～22min，28％～50％B；22～24min，50％～80％B；24.1～30min，10％B；
EK 663.4/244.2，ER 490.3/462.3，VK 495.0/185.2，13C-EK 667.0/244.10，13C-ER
493.7/590.2，13C-VK 498.4/220.1；并对DP、CE值进行优化。
7.根据权利要求1所述的基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法，其特征在于：所述步骤(7)具体为，
1)根据三条特征肽段的纯度计算酶切后三条特征肽段的质量，配置相应浓度的特征肽段和同位素标记肽段；
2)将三条特征肽段同位素内标溶液配制成与样品溶液中肽段质量比为1:1的混合溶液；肽段标准品溶液与同位素内标的比为0.9:1，1:1，1.1:1；
3)称量待测体积的IL-6蛋白溶液，加入并称量同体积的同位素内标混合溶液，待测IL-6的特征肽段浓度应在确定的线性范围中间位置；
4)采用以下公式计算IL-6的浓度
Figure FDA0004000385760000031
其中，Ci：溶液中EK、ER、VK的浓度；
P：特征肽段的纯度；
m标：特征肽段中加入标记肽段的质量，mg；
R样：样品中特征肽段色谱峰面积比，非标记/标记；
I1：低标肽段实际质量比，非标记/标记；
I2：高标肽段实际质量比，非标记/标记；
R1：低标肽段峰面积比，非标记/标记；
R2：高标肽段面积比，非标记/标记；
M：平行样中IL-6样品溶液的质量，mg；
Figure FDA0004000385760000032
式中，CIL-6：溶液中IL-6的浓度；Ci：溶液中EK、ER、VK的浓度；MIL-6：IL-6的相对分子质量；n：IL-6序列中对应EK、ER、VK片段的数量；Mi：EK、ER、VK的相对分子质量。
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