CN117647606A - 适于lc-ms/ms能同时检测多种蛋白的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明关于适于LC‑MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒，包括：内标品，包括各蛋白的特征肽段的第一个亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸经C13、N15同位素重标；校准品，包括特征肽段N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列。应用所述试剂盒，基于LC‑MS/MS仅需2μL血清或者血浆样本仅需即可完成同时测定11种相关蛋白标志物的检测，方法一致性好，不存在抗原‑抗体非特异反应造成的干扰，填补了多种蛋白标志物缺少成熟的商品化临床检验方法的空白，通过本方法对上述指标的定量检测对于判断心血管风险具有一定的潜在意义。

Description

适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒
技术领域
本发明主要关于以LC-MS/MS方法检测多种蛋白检测的技术领域，具体是一种适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒。
背景技术
载脂蛋白即(Apolipoprotein)是血浆脂蛋白(lipoprotein)中的蛋白质部分，载脂蛋白的主要功能是作为脂蛋白的结构成分，通过血液和淋巴运输脂质。人类内载脂蛋白的主要包括A、B、C、D、E、H、L和(a)几类，各类又可细分几个亚类，以罗马数字表示。载脂蛋白的基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构，某些载脂蛋白还有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能，载脂蛋白的合成发生在肠道和肝脏。他们的合成受饮食中脂肪含量和其他内部因素的调节。载脂蛋白除了作为脂蛋白的结构成分外，还作为细胞表面受体的配体和酶的辅助因子。
目前，APOA1、APOB等载脂蛋白的检测主要采用免疫透射比浊法(immunoturbidimetry，ITA)。商业化试剂盒中的抗体对抗原亲和力的差异、抗原决定簇的异质性、APOA1和APOB在不同脂蛋白中的结构等因素，造成不同品牌试剂盒检测结果存在差异。
现有技术如申请号为CN201880062552.1的发明专利公开了通过质谱法进行的载脂蛋白E同种型检测的方法，具体提供了通过质谱法确定样品中载脂蛋白E(APOE)表型的方法，其中由通过质谱法检测到的离子身份确定样品中存在的APOE的等位基因(一种或多种)，然而该技术仅涉及定量APOE蛋白，没有定量其它载脂蛋白。另有现有技术如申请号为N201680077646.7的发明专利公开了载脂蛋白检测方法，具体提供了用于检测和定量样品中的载脂蛋白及其同种型的方法，以及基于根据该发明所述的检测方法确定的载脂蛋白水平来预测神经退行性或心血管疾病发展概率的方法，然而该技术仅仅采用基于抗体的方法进行检测，而抗原抗体的检测方法有其自身局限性。
现有测定载脂蛋白及C-反应蛋白的技术主要包括免疫比浊法、胶乳增强免疫比浊法、免疫透射比浊法等，这些方法学操作简便，自动化程度高，已成为实验室常规检测载脂蛋白和C-反应蛋白的方法学获得了广泛的应用。然而上述方法均有一定的共性固有缺点：1.商业化试剂盒中的抗体对抗原亲和力的差异、抗原决定簇的异质性、APOA1和APOB在不同脂蛋白中的结构等因素，造成不同品牌试剂盒检测结果存在差异。2.样本需求量大；3.除APOA1、APOB、CRP等少数蛋白外，大部分尚无明确的参考物质和参考方法。
因此现有技术存在下述至少五种问题亟待解决：1.不能同时检测多种指标，而且用现有技术，各个蛋白的检测方法不一，也没有统一的参考方法；2.样本需求量大，不便于采血和推广宣教；3.抗原抗体交叉反应会使测定浓度与实际浓度相比偏高；4.现有技术下，抗体无法识别非异质性蛋白结构域，蛋白分子量依据生物个体不同可能存在不同，现有技术应用质量浓度易造成误差；5.部分待测蛋白，如APOA4、APOD和APOF，目前没有成熟的商品化方法学用于临床检验，而这些指标对于心血管风险的判断是有一定潜在意义的。本申请方案基于液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测技术，可以同时定量检测多种载脂蛋白，能够同时前述多种技术问题。
前述背景技术知识的记载旨在帮助本领域普通技术人员理解与本发明较为接近的现有技术，同时便于对本申请发明构思及技术方案的理解，应当明确的是，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请技术方案的新创性。
发明内容
为解决上述背景技术中提及的至少一种技术问题，本发明的目的旨在提供一种适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒及方法，仅需2μL样本仅需即可完成同时测定11种心血管疾病相关蛋白标志物的检测，方法一致性好，不存在抗原-抗体非特异反应造成的干扰，填补了多种蛋白标志物缺少成熟的商品化临床检验方法的空白，通过本方法对上述指标的定量检测对于判断心血管风险具有一定的潜在意义。
适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒，包括：
内标品，包括各蛋白的特征肽段的第一个亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸经C13、N15同位素重标；
校准品，包括特征肽段N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列；
其中，所述多种蛋白包括：载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白。
前述所述试剂盒在同时定量检测载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白中的用途。
基于前述所述试剂盒的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，包括：
S100、待测样本中加入内标品，经过预处理获得可供三重四极杆质谱检测的肽段，除盐净化后，采用液相色谱-串联质谱法对样品中的特征肽段进行检测，获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积；
S200、以校准品取代待测样本，以与步骤S100相同的步骤和参数进行检测获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积；
S300、以校准品中经同样处理过程后的特征肽段与对应内标品的峰面积比值为纵坐标y、以校准曲线理论浓度为横坐标x绘制标准曲线，将待测样本中特征肽段与对应内标品的峰面积比值代入标准曲线计算多种载脂蛋白的浓度；
其中所述多种蛋白包括：载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白。
优选的，所述内标品具体是各蛋白的特征肽段的第一个亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸经C13、N15同位素重标后获得。
优选的，所述预处理包括蛋白变性、还原烷基化、酶切消化。
优选的，所述蛋白变性采用脱氧胆酸钠溶液。
优选的，所述还原烷基化采用TCEP和IAA。
优选的，所述酶切消化采用LysC和trypsin。
优选的，所述校准品是特征肽段N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列。
优选的，所述校准品的添加是以相应肽段与人血清白蛋白、Tween-20和PBS缓冲液混合为混合基质的形式。
前述所述方法在同时定量检测载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白中的用途。
特征肽段APOA1：THLAPYSDELR；APOA2：EQLTPLIK；APOA4：LAPLAEDVR；APOB：TGISPLALIK；APOC2：TYLPAVDEK；APOC3：DALSSVQESQVAQQAR；APOD：VLNQELR；APOE：LGPLVEQGR；APOF：SGVQQLIQYYQDQK；APO(a)：LFLEPTQADIALLK；CRP：AFVFPK在制备可同时定量检测载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白的产品中的应用。所述产品包括试剂盒或制剂。
本申请的有益效果为：
本发明基于LysC-Trypsin联合酶解法，将载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A4、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白(a)以及超敏C反应蛋白等11种心血管疾病相关蛋白标志物通过筛选相应目标肽段，基于SDC-Tris体系的变性、还原烷基化、酶解反应以及除盐等前处理流程，仅需极少量血清/血浆样本，即可同时定量测定。
此外，方法采用颗粒浓度(nmol/L)来定量具有异质性的脂蛋白(a)，与使用质量浓度的现有技术相比，实用价值更大。方法一致性好，不存在抗原-抗体非特异反应造成的干扰，填补了多种蛋白标志物缺少成熟的商品化临床检验方法的空白，通过本方法对上述指标的定量检测对于判断心血管风险具有一定的潜在意义。
附图说明
为让本发明的上述和/或其他目的、特征、优点与实例能更明显易懂，下面将对本发明的具体实施方式中所需要使用的附图进行简单的介绍，显然地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的情况下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是APOA1的标准曲线；
图2是APOA2的标准曲线；
图3是APOA4的标准曲线；
图4是APOB的标准曲线；
图5是APOC2的标准曲线；
图6是APOC3的标准曲线；
图7是APOD的标准曲线；
图8是APOE的标准曲线；
图9是APOF的标准曲线；
图10是APO(a)的标准曲线；
图11是CRP的标准曲线；
图12是APOC3、APOA2、CRP、APOA4、APO(a)、APOC2的TIC色谱图；
图13是待测肽段APOF、APOB、APOA1、APOD、APOE的TIC色谱图。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当替换和/或改动工艺参数实现，然而特别需要指出的是，所有类似的替换和/或改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和制备方法已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本发明使用本文中所描述的方法和材料；但本领域中已知的其他合适的方法和材料也可以被使用。本文中所描述的材料、方法和实例仅是说明性的，并不是用来作为限制。所有出版物、专利申请案、专利案、临时申请案、数据库条目及本文中提及的其它参考文献等，其整体被并入本文中作为参考。若有冲突，以本说明书包括定义为准。
除非具体说明，本文所描述的材料、方法和实例仅是示例性的，而非限制性的。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但本文仍描述了合适的方法和材料。
应当明确的是，本申请完全不涉及疾病的诊断方法或治疗方法。本申请的部分技术方案旨为检测获得样本中的相关物质的含量，并非直接获得疾病诊断结果或人体健康状况，本领域技术人员依据所述含量亦不能获得疾病诊断结果或人体健康状况。
为了便于理解本发明的实施例，首先对本发明实施例中可能涉及的缩略语和关键术语进行解释说明或定义。
LC-MS/MS：液相色谱-串联质谱法；
Apolipoprotein、APO：载脂蛋白；
HSA：人血清白蛋白；
SDC：脱氧胆酸钠；
Tris：三羟甲基氨基甲烷；
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、Tris盐酸盐；
Lyc-C：胞内蛋白酶Lys-C；
Trypsin：胰蛋白酶；
APOA1：载脂蛋白A1；临床常规检查方法为免疫比浊法，临床意义在于：APOA1是高密度脂蛋白的主要组成成分，临床上主要用于脑血管病风险度的估计；当APOA1降低时，脑血管病的风险加大；
APOA2：载脂蛋白A2；临床常规检查方法为免疫比浊法，临床意义在于：降低见于冠心病、糖尿病、肾病综合征、遗传性ApoA-Ⅰ缺乏症(Tangier病)、家族性低α-脂蛋白血症、鱼眼病、重度营养不良、肝炎活动期、肝功能低下；
APOA4：载脂蛋白A4；临床常规检查方法为免疫比浊法，临床意义在于：
APOB：载脂蛋白B；临床常规检查方法为免疫比浊法，临床意义在于：血清APOB是低密度脂蛋白的主要组成成分，临床上主要用于冠心病的风险度的估计；当APOB升高时，冠心病的风险加大；
APOC2：载脂蛋白C2；临床常规检查方法为免疫比浊法，临床意义在于：血清APOC2水平改变可能比血清胆固醇异常更早、更敏感的反映脂质代谢异常状态；积极控制脂代谢紊乱对脑梗死的防治具有重要作用；
APOC3：载脂蛋白C3；临床常规检查方法为免疫比浊法，临床意义在于：APOC3的含量反映机体有无高脂血症的情况；升高可见于高脂血症；
APOD：载脂蛋白D；
APOE：载脂蛋白E；临床常规检查方法为免疫比浊法，临床意义在于：对于高血压、心梗、脑梗的诊治和预防都有十分重要的意义；
APOF：载脂蛋白F；
APO(a)：脂蛋白a；
CRP：超敏C反应蛋白；临床常规检查方法为乳胶免疫比浊法/免疫层析等，临床意义在于：作为冠状动脉性心脏病辅助诊断的指标。
以下详细描述本发明。
提供一种适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒，包括：
内标品，包括各蛋白的特征肽段的第一个亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸经C13、N15同位素重标；
校准品，包括特征肽段N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列；
其中，所述多种蛋白包括：载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白。
优选的，所述试剂盒中还包括对所述待测样本、内标品、校准品进行蛋白变性、还原烷基化、酶切消化的试剂。
优选的，所述进行蛋白变性的试剂包括脱氧胆酸钠溶液。
优选的，所述进行还原烷基化的试剂包括TCEP和IAA。
优选的，所述进行酶切消化的试剂包括LysC和trypsin。
优选的，所述校准品的存在形式为单独存在或以相应肽段与人血清白蛋白、Tween-20和PBS缓冲液混合为混合基质的形式。
优选的，所述内标品具体是各载脂蛋白的特征肽段的第一个亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸经C13、N15同位素重标后获得。
优选的，所述特征肽段具体如表1所示。
表1、特征肽段
优选的，所述校准品包括特征肽段N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列。
优选的，所述校准品具体如表2所示。
表2、校准品肽段序列
本发明方法使用特征肽段的N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列作为校准品定量使用，其特点是相比于重组蛋白，更易于合成和精确定值，同时也满足模拟酶切过程的需求，我们也从成本上评估了两种方法的可行性，最终选择了这种肽段作为校准品分析物。
提供一种基于前述所述试剂盒的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，包括：
S100、待测样本中加入内标品，经过预处理获得可供三重四极杆质谱检测的肽段，除盐净化后，采用液相色谱-串联质谱法对样品中的特征肽段进行检测，获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积；
S200、以校准品取代待测样本，以与步骤S100相同的步骤和参数进行检测获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积；
S300、以校准品中经同样处理过程后的特征肽段与对应内标品的峰面积比值为纵坐标y、以校准曲线理论浓度为横坐标x绘制标准曲线，将待测样本中特征肽段与对应内标品的峰面积比值代入标准曲线计算多种载脂蛋白的浓度；
其中所述多种蛋白包括：载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白。
优选的，所述待测样本包括血清样本或血浆样本。
优选的，采用50-200mmol/L的pH为7.5-9.5的Tris-HCl溶液作为缓冲体系，对待测样本进行预处理。
优选的，所述预处理包括蛋白变性、还原烷基化、酶切消化。
优选的，所述蛋白变性采用0.05-0.4%的SDC溶液在40-70℃条件下进行。
优选的，所述还原采用1-5mmol/L的TCEP溶液在40-70℃条件下进行。
优选的，所述烷基化采用10-15mmol/L的IAA溶液在30-40℃、避光条件下进行。
优选的，所述酶切采用100-400ng的LysC在30-40℃条件下进行。
优选的，所述消化采用10-20μg的trypsin在30-40℃条件下进行。
优选的，采用0.1-3%的甲酸进行酶解终止反应。
优选的，所述除盐净化采用HLB或同等效用的除盐柱对样本进行除盐处理，以保护液相色谱、色谱柱及质谱仪。
优选的，所述方法中采用超高效液相色谱柱对目标待测物进行分离。
优选的，所述方法中采用三重四极杆质谱仪对目标待测物进行质谱分析。
优选的，所述校准品的添加采用将相应肽段与人血清白蛋白、Tween-20和PBS缓冲液混合为混合基质的形式。
优选的，所述人血清白蛋白的质量百分含量是3-5%。
优选的，所述Tween-20的质量百分含量是0.05-0.5%
本方法中，校准品的配制采用了3-5%的人血清白蛋白、0.05%-0.5%的Tween-20和PBS缓冲液作为混合基质，模拟实际样本检测的环境，经过基质效应评估，人血清白蛋白相比于其他蛋白的基质效应更小，生物适用性更强，混合基质的配制还可并对疏水肽段的非特异性吸附进行保护。
本发明方法基于LysC-Trypsin联合酶解法，待测样本经变性→还原烷基化→酶解消化→终止→除盐→上机检测，最终根据本申请技术方案获得定量检测结果，一次实验约需24h；由校准曲线测定结果可得出线性相关系数均在0.99以上。方法仅需2μL血清/血浆样本量即可完成检测，一致性好且不存在抗原-抗体非特异反应造成的干扰，定量限满足预设标准，在定量下限处可准确定量，精密度及回收率均可满足预设标准，能够准确、迅速的定量检测本申请所述的11种载脂蛋白，上述指标的定量检测对于判断心血管风险具有一定的潜在意义。
实施例1：
提供一种液相色谱-串联质谱法检测载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白等多种蛋白的方法，具体包括下述步骤：
步骤一、样本前处理
(1)配制内标品稀释液、样本稀释液及校准品：
将表1相应肽段溶于30%乙腈得内标品工作液，配制过程如表3所示，然后以0.1%SDC-tris溶液将内标品工作液稀释10倍至5mL蛋白低吸附离心管中得内标品稀释液；
表3、配制内标品工作液
将血清样本用0.1%SDC-tris溶液稀释10倍至5mL蛋白低吸附离心管中得样本稀释液；
首先将4%人血清白蛋白、0.2%Tween-20和余量PBS缓冲液(pH7.3)混合为混合基质，然后将表2相应校准品肽段按照表4配制得到相应的校准品工作液；
表4、配制校准品工作液
然后使用校准品工作液与4%HSA按12:88稀释为S7校准品稀释液，然后按照如表5所示比例依次稀释为S6-S1校准品稀释液。
表5、校准品系列稀释液
(2)在96孔板中依次加入140μL 0.1%SDC-tris溶液、20μL样本稀释液、20μL内标品稀释液，加入12μL的50mM TCEP，56℃、600rpm孵育30min；
(3)加入12μL 200mM碘乙酰胺(IAA)(800mM用tris稀释4倍)溶液，混匀，37℃避光，600rpm孵育30min；
(4)加入200ng LysC(用缓冲液稀释成100ng/μL，再用Tris稀释4倍，加8μL)，混匀，放置于恒温混匀仪里，37℃、600rpm孵育1h；
(5)加入12μL胰蛋白酶溶液(0.25μg/μL)，混匀，放置于恒温混匀仪里，37℃、600rpm孵育16h；
(6)加入15μL 10%甲酸水溶液，混匀，3900rpm离心20min，取上清。
随后按下述步骤完成多肽的除盐：
A、柱子活化：300μL甲醇，120g离心1分钟；
B、柱子平衡：300μL 0.1%TFA水溶液，120g离心2分钟；
C、上样：将消化完成的样本加入柱中，60g离心2分钟；
D、淋洗1：400μL 0.1%TFA水溶液，120g离心2分钟；此步骤重复2次；
E、淋洗2：400μL超纯水，120g离心2分钟；
F、多肽洗脱：更换为上样板收集洗脱液，100μL 40%乙腈/0.1%甲酸，60g离心2分钟；
(7)用上样的96孔板置于自动进样器，上机检测。
步骤二、进行液相色谱方法，其参数如表6所示。
表6、液相色谱方法
步骤三、质谱方法
(1)离子源类型：H-ESI；
(2)离子源电压(V)：3500；
(3)鞘气流量(Arb)：50；
(4)辅助气流量(Arb)：10；
(5)吹扫气流量(Arb)：1；
(6)离子传输管温度(℃)：325；
(7)雾化温度(℃)：350；
(8)极性：Positive；
(9)Cycle Time(sec)：1；
(10)Use Calibrated RF Lens：True；
(11)Q1 Resolution (FWHM)：0.7；
(12)Q3 Resolution (FWHM)：0.7；
(13)碰撞气(mTorr)：1.5；
(14)Source Fragmentation：0。
采用液相色谱-串联质谱法对样品中的特征肽段进行检测，获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积。
步骤四、以校准品取代待测样本，以与前述步骤一至步骤三相同的步骤和参数进行检测获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积。
步骤五、以校准品中经同样处理过程后的特征肽段与对应内标品的峰面积比值为纵坐标y、以校准曲线理论浓度为横坐标x绘制标准曲线，分别如图1-图11，线性相关系数均在0.99以上，将待测样本中特征肽段与对应内标品的峰面积比值代入标准曲线计算多种载脂蛋白的浓度。
所得11个待测肽段的TIC色谱图如图12和图13所示。
质谱检测的肽段序列和离子对列表如表7-表9所示。
表7、肽段序列和离子对列表1
表8、肽段序列和离子对列表2
表9、肽段序列和离子对列表3
本方法实际检测样本结果如表10所示，可以看到，本方法可以只采集2μL血清，即可以同时检测人血清中11种心血管疾病相关蛋白，并可以测定APO(a)的精确摩尔浓度。
表10、样本检测结果
实施例2：
在前述实施例的基础上，对液相色谱-串联质谱法检测多种载脂蛋白的方法进行方法性能验证，包括定量下限验证、精密度验证和回收率验证。
第一部分、定量下限验证
设定线性范围如表11所示。
表11、线性范围
方法建立后对定量下限进行验证，在4%HSA-PBS-0.1%Tween-20基质中添加校准品多肽至定量下限浓度，并平行处理10个测试，进样检测得到10个数据。根据本方法特点，设定接受标准为与理论浓度的平均相对偏差不大于20%，变异系数CV不大于20%。
测定结果如表12所示，11种待测物均可满足预设标准，在定量下限处可准确定量。
表12、定量下限测定结果
第二部分、精密度验证
方法建立后对精密度进行验证，在4%HSA-PBS-0.1%Tween-20基质中添加高低两个浓度的校准品多肽，每个浓度平行处理10个测试，进样检测得到20个数据。根据本方法特点，设定接受标准为变异系数CV不大于15%。
测定结果分别如表13-表15所示，可知11种待测物均可满足预设标准。
表13、低浓度下精密度验证测定结果
表14、高浓度下精密度验证测定结果
表15、高浓度下APOC3精密度验证测定结果
第三部分、回收率验证
方法建立后对添加回收率进行验证，在人血清基质中添加高、中、低三个浓度的校准品多肽，每个浓度平行处理5个测试，进样检测得到15个数据。根据本方法特点，设定接受标准为5个技术重复的平均回收率在85%-115%之间。
测定结果如表16所示，可知11种待测物均可满足回收率的要求。
表16、回收率验证测定结果
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
虽然上述具体实施方式已经显示、描述并指出应用于各种实施方案的新颖特征，但应理解，在不脱离本公开内容的精神的前提下，可对所说明的装置或方法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。另外，上述各种特征和方法可彼此独立地使用，或可以各种方式组合。所有可能的组合和子组合均旨在落在本公开内容的范围内。上述许多实施方案包括类似的组分，并且因此，这些类似的组分在不同的实施方案中可互换。虽然已经在某些实施方案和实施例的上下文中公开了本发明，但本领域技术人员应理解，本发明可超出具体公开的实施方案延伸至其它的替代实施方案和/或应用以及其明显的修改和等同物。因此，本发明不旨在受本文优选实施方案的具体公开内容限制。
本发明未尽事宜均为公知技术。

Claims (10)

1.适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒，其特征在于包括：
内标品，包括各蛋白的特征肽段的第一个亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸经C13、N15同位素重标；
校准品，包括特征肽段N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列；
其中，所述多种蛋白包括：载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白。
2.根据权利要求1所述的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的试剂盒，其特征在于：所述特征肽段具体包括：APOA1：THLAPYSDELR；APOA2：EQLTPLIK；APOA4：LAPLAEDVR；APOB：TGISPLALIK；APOC2：TYLPAVDEK；APOC3：DALSSVQESQVAQQAR；APOD：VLNQELR；APOE：LGPLVEQGR；APOF：SGVQQLIQYYQDQK；APO(a)：LFLEPTQADIALLK；CRP：AFVFPK。
3.权利要求1或2所述试剂盒在同时定量检测载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白中的用途。
4.基于权利要求1或2所述试剂盒的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，其特征在于包括：
S100、待测样本中加入内标品，经过预处理获得可供三重四极杆质谱检测的肽段，除盐净化后，采用液相色谱-串联质谱法对样品中的特征肽段进行检测，获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积；
S200、以校准品取代待测样本，以与步骤S100相同的步骤和参数进行检测获得色谱图、待测样本中特征肽段及对应内标品的峰面积；
S300、以校准品中经同样处理过程后的特征肽段与对应内标品的峰面积比值为纵坐标y、以校准曲线理论浓度为横坐标x绘制标准曲线，将待测样本中特征肽段与对应内标品的峰面积比值代入标准曲线计算多种载脂蛋白的浓度；
其中所述多种蛋白包括：载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白。
5.根据权利要求4所述的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，其特征在于：所述待测样本包括血清样本或血浆样本。
6.根据权利要求4所述的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，其特征在于：所述内标品具体是各载脂蛋白的特征肽段的第一个亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸经C13、N15同位素重标后获得。
7.根据权利要求4所述的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，其特征在于：所述预处理包括蛋白变性、还原烷基化、酶切消化。
8.根据权利要求5-7任一项所述的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，其特征在于：所述校准品包括特征肽段N端和C端各带有原蛋白序列前后三个氨基酸的肽段序列。
9.根据权利要求5-7任一项所述的适于LC-MS/MS能同时检测多种蛋白的方法，其特征在于：所述内标品与校准品的添加均采用将相应肽段与人血清白蛋白、Tween-20和PBS缓冲液混合为混合基质的形式。
10.权利要求5-7任一项所述方法在同时定量检测载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A3、载脂蛋白B、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白F、脂蛋白a和超敏C反应蛋白中的用途。
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