CN116499822A - 基于三重四极杆质谱仪的igf-i样品前处理方法及试剂盒 - Google Patents
基于三重四极杆质谱仪的igf-i样品前处理方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116499822A CN116499822A CN202310013505.0A CN202310013505A CN116499822A CN 116499822 A CN116499822 A CN 116499822A CN 202310013505 A CN202310013505 A CN 202310013505A CN 116499822 A CN116499822 A CN 116499822A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igf
- mass spectrometer
- protein
- quadrupole mass
- triple quadrupole
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 84
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 42
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 32
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 23
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- AJEHNBIPLQJTNU-UHFFFAOYSA-N cyanomethyl acetate Chemical group CC(=O)OCC#N AJEHNBIPLQJTNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 3
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N formic acid;hydrate Chemical compound O.OC=O HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 2
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- RQBBFKINEJYDOB-UHFFFAOYSA-N acetic acid;acetonitrile Chemical compound CC#N.CC(O)=O RQBBFKINEJYDOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005173 quadrupole mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Electron Tubes For Measurement (AREA)
Abstract
本申请涉及一种基于三重四极杆质谱仪的IGF‑I样品前处理方法及试剂盒，该IGF‑I样品前处理方法通过向生物学样品中加入蛋白变性剂，使蛋白质复合物氢键解离、肽链伸展开，获得目标蛋白IGF‑I与非目标蛋白解离的混合溶液；向该混合溶液中加入蛋白沉淀剂，使非目标蛋白沉淀，并收集上清液，用于三重四极杆质谱仪检测。三重四极杆质谱仪分辨率低，灵敏度高，对样品的纯净度要求较高，常规方法处理后的样品杂质多，背景噪声高，本申请提供的IGF‑I样品前处理方法处理后的生物学样品杂质少，能用于三重四极杆质谱仪的检测，噪声低。
Description
技术领域
本申请涉及质谱样品前处理领域，具体涉及基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法及试剂盒。
背景技术
类胰岛素一号生长因子(IGF-I)是反映生长激素(GH)分泌情况的首选监测指标，血清中IGF-I定量检测对儿童生长发育、成人肢端肥大症的临床诊疗具有重要应用指导意义。现有的IGF-I检测技术难点主要在于：一、IGF-I在血浆中含量较低，对检测方法及仪器要求较高；二、IGF-I是含70个氨基酸的单链多肽，分子量为7649，在质谱检验方法学上有难度；三、现有的主要检测方法为化学发光法，方法学上存在交叉反应，出现假阳性，准确度大大较低，且现有的化学发光法IGF-I检测技术极其依赖于进口的试剂盒，一旦进口试剂盒断供，市面上就无法检测这个项目。
高液相色谱-质谱串联检测技术因具有灵敏度高、专属性强、分析时间短及重现性好等特点，近年来发展极为迅速，不但在医药、化工、食品、农业等领域被广泛应用，也逐渐应用于临床检测和辅助诊断，为精准医疗提供技术支持。而且高液相色谱-质谱串联检测技术具有特异性强、选择性好、灵敏度高且无交叉污染的优点，该方法的检测限低、检测范围广、精密度好，能准确定量生物学样品中低浓度的IGF-I，可以真实反应人体内的水平，适用于临床医疗的生化检测。
目前已有采用高分辨率质谱量化IGF-I的先例，但是高分辨率质谱价格昂贵，导致该检测技术成本高。与高分辨率质谱相比，三重四极杆质谱仪具有高灵敏度、分析速度快、样品用量少、价格低等特点，但是三重四极杆质谱仪存在分辨率低的缺点，加上生物学样品中IGF-I含量极低、结构类似物非常多、背景十分复杂，如果前处理过程中IGF-I纯化不好，就无法采用三重四极杆质谱仪进行定量。
发明内容
针对三重四极杆质谱仪分辨率低，生物学样品中IGF-I含量极低、结构类似物非常多、背景复杂，很难采用三重四极杆质谱仪进行定量的问题，本申请提供一种基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法及IGF-I样品前处理试剂盒。
在本申请的第一方面，提供一种基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法，该IGF-I样品前处理方法包括：
向生物学样品中加入蛋白变性剂，使蛋白质复合物氢键解离、肽链伸展开，获得目标蛋白IGF-I与非目标蛋白解离的混合溶液；
向所述混合溶液中加入蛋白沉淀剂，使非目标蛋白沉淀，并收集上清液，用于三重四极杆质谱仪检测。
在一些实施方式中，所述生物学样品为血浆或血清。
在一些实施方式中，向生物学样品中加入尿素，其中尿素的浓度为4～8M。
在一些实施方式中，所述蛋白变性剂为尿素，向生物学样品中加入尿素后，尿素的浓度为4～8M。
在一些实施方式中，所述蛋白沉淀剂为乙酸乙腈溶液，乙酸的浓度为1wt.％～5wt.％。
在一些实施方式中，该IGF-I样品前处理方法还包括：向上清液中加入缓冲液，将其置于固相萃取多孔板中，依次加入甲醇、水进行活化，再加入5wt.％的氨水、含0.5wt.％～2wt.％乙酸的甲醇进行淋洗，最后酸性洗脱液进行洗脱；酸性洗脱液为乙酸、甲醇、水三者的混合液，其中，乙酸的体积比为1％～10％，甲醇的体积比为60％。
第二方面，本申请提供一种基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理试剂盒，该IGF-I样品前处理试剂盒包括：
蛋白变性剂，其用于使蛋白质复合物肽链伸展开，使目标蛋白IGF-I与非目标蛋白解离，获得混合溶液；和
蛋白沉淀剂，其用于使混合溶液中的非目标蛋白沉淀。
在一些实施方式中，所述尿素溶液的浓度为4～8M，所述蛋白沉淀剂为乙酸乙腈溶液，乙酸的浓度为1wt.％～5wt.％。
在一些实施方式中，该IGF-I样品前处理试剂盒还包括：固相萃取多孔板、缓冲液、活化液I、活化液II、碱性淋洗液、酸性淋洗液以及酸性洗脱液。
在一些实施方式中，所述缓冲液是浓度为1wt.％～5wt.％的氨水；所述活化液I为甲醇；所述活化液II为水；所述碱性淋洗液为5wt.％的氨水；所述酸性淋洗液为含0.5wt.％～2wt.％乙酸的甲醇；所述酸性洗脱液为乙酸、甲醇、水三者的混合液，其中，乙酸的体积比为1％～10％，甲醇的体积比为60％。
在一些实施方式中，所述IGF-I样品前处理试剂盒还包括：含有IGF-I的校准品、内标准品、质控品，具体的，校准品、质控品为采用1％牛血清白蛋白溶液配制的一系列冻干品；内标准品为200ng/mL的15N-IGF-1的溶液。
与现有技术相比，本申请具有如下优点和有益效果：
三重四极杆质谱仪分辨率低、灵敏度高，对样品的纯净度要求较高，常规方法处理后的样品杂质多，背景噪声高，本申请提供的IGF-I样品前处理方法处理后的生物学样品杂质少，能用于三重四极杆质谱仪的检测，噪声低。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请的实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法包括：通过向生物学样品中加入蛋白变性剂，使蛋白质复合物氢键解离、肽链伸展开，获得目标蛋白IGF-I与非目标蛋白解离的混合溶液；向该混合溶液中加入蛋白沉淀剂，使非目标蛋白沉淀，并收集上清液，用于三重四极杆质谱仪检测。
本申请对IGF-I样品进行前处理的原理如下：IGF-I在组织或血液中均与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)以氢键的形式相结合，以蛋白质复合物的形式存在，不利于三重四极杆质谱仪进行定量检测。本申请向生物学样品中加入蛋白变性剂破坏蛋白质复合物中的氢键，导致蛋白质分子结构松弛，使蛋白质变性，蛋白质变性后肽链伸展开，目标蛋白IGF-I与非目标蛋白解离开，此时加入蛋白沉淀剂使非目标蛋白沉淀，目标蛋白IGF-I仍溶解在上清液中，提取上清液用于三重四极杆质谱仪检测。
在一些实施方式中，生物学样品为血浆或血清，血清和血浆样品中IGF-I含量极低、结构类似物非常多、背景十分复杂，本申请提供的IGF-I样品前处理方法特别适合处理该类生物学样品。
在一些实施方式中，蛋白变性剂为尿素，向生物学样品中加入尿素后，生物学样品中尿素的浓度为4～8M，尿素浓度过低时，蛋白质变性不完全，尿素浓度过高会造成成本过高。优选地，尿素以尿素水溶液的形式加入生物学样品中，一方面以便于定量，另一方面，尿素溶液相比尿素颗粒能更快速得分散在生物学样品中。
在一些实施方式中，蛋白沉淀剂为乙酸乙腈溶液，其浓度为1wt.％～5wt.％。不同蛋白有不同的等电点，蛋白在等电点处，静电荷为零，溶解度最低，本发明蛋白沉淀剂中加酸是为了调节混合溶液的pH值，通过改变混合溶液的pH值选择性地沉淀等电点为酸性的蛋白，最终优化得到乙酸乙腈溶液中乙酸浓度为5wt.％时，提取到的IGF-I最多。
在一些实施方式中，该IGF-I样品前处理方法还包括：向上清液中加入缓冲液，将其置于固相萃取多孔板中，依次加入甲醇、水进行活化，再加入5wt.％的氨水、含0.5wt.％～2wt.％乙酸的甲醇进行淋洗，最后酸性洗脱液进行洗脱；酸性洗脱液为乙酸、甲醇、水三者的混合液，其中，乙酸的体积比为1％～10％，甲醇的体积比为60％。
第二方面，本申请提供一种基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理试剂盒，该IGF-I样品前处理试剂盒包括：
蛋白变性剂，其用于使蛋白质复合物肽链伸展开，使目标蛋白IGF-I与非目标蛋白解离，获得混合溶液；和
蛋白沉淀剂，其用于使混合溶液中的非目标蛋白沉淀。
在一些实施方式中，蛋白变性剂为浓度为4～8M的尿素溶液，蛋白沉淀剂为乙酸乙腈溶液，乙酸的浓度为1wt.％～5wt.％。
在一些实施方式中，该IGF-I样品前处理试剂盒还包括：固相萃取多孔板、缓冲液、活化液I、活化液II、碱性淋洗液、酸性淋洗液以及酸性洗脱液，活化液I活化SPE板、活化液II平衡SPE板，碱性淋洗液、酸性淋洗液除去酸碱性的杂质，酸性洗脱液：将目标成分洗脱下来收集。
在一些实施方式中，所述缓冲液是浓度为1wt.％～5wt.％的氨水；所述活化液I为甲醇；所述活化液II为水；所述碱性淋洗液为5wt.％的氨水；所述酸性淋洗液为含0.5wt.％～2wt.％乙酸的甲醇；所述酸性洗脱液为乙酸、甲醇、水三者的混合液，其中，乙酸的体积比为1％～10％，甲醇的体积比为60％。
在一些实施方式中，所述IGF-I样品前处理试剂盒还包括：含有IGF-I的校准品、内标准品、质控品，其中，含有IGF-I的校准品包括6个不同浓度的校准品，质控品包括浓度为40ng/mL、300ng/mL、600ng/mL的IGF-I溶液。
以下通过具体实施例对本申请的技术方案进行详细说明：
本申请中“SPE板”指的是固相萃取多孔板，本申请实施例中采用的SPE板购于岛津公司，产品名为SHIMSEN Plateo 96-well SPE。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的试剂为市售。
流动相A：0.1％～2％甲酸-水；流动相B：0.1％～2％甲酸-乙腈；8M尿素溶液；乙酸溶液：溶剂为乙腈，乙酸的浓度为1wt.％～5wt.％；缓冲液：5wt.％的氨水；活化液I：甲醇；活化液II：水；碱性淋洗液：5wt.％氨水；酸性淋洗液：2wt.％乙酸的甲醇；酸性洗脱液为乙酸、甲醇、水三者的混合液，其中，乙酸的体积比为10％，甲醇的体积比为60％；内标准品为200ng/mL的15N-IGF-I的溶液。
以下实施例中涉及到的校准品和质控品的浓度具体如下：
表1IGF-I校准品
| 剂量点 | IGF-Ⅰ(ng/mL) |
| 校准品1 | 10 |
| 校准品2 | 50 |
| 校准品3 | 100 |
| 校准品4 | 200 |
| 校准品5 | 500 |
| 校准品6 | 1000 |
表2IGF-I质控品
实施例1：样品前处理
本实施例处理的待测样本为人血清，处理步骤如下：
(1)取校准品、质控品或待测样本各100μL，加入96孔板I的不同孔中，然后向各孔精确加入10μL质控品，振荡混匀；
(2)向各孔中加入100μL 8M尿素溶液，振荡混匀；
(3)向各孔中加入200μL5％乙酸乙腈溶液，振荡混匀，离心，取上清液；
(4)取出300μL上清液移至96孔板II中，向各孔加入900μL缓冲液混匀，获得预处理后的样本；
(5)活化：向SPE板各孔加入200μL活化液I，再加入200μL活化液II；
(6)上样：向SPE板各孔加入600μL预处理后的样本；
(7)向SPE板各孔加入200μL碱性淋洗液；
(8)向SPE板各孔加入200μL酸性淋洗液；
(9)向SPE板各孔分2次加入、每次25μL酸性洗脱液进行洗脱，取上清液备用。
实施例2：LC-MS/MS检测分析
高效液相色谱条件：
色谱柱：Peptide CSH C181.7μm，2.1*100mm Column；柱温箱温度：50℃；流动相A：0.1vol.％甲酸-水；流动相B：0.1vol.％甲酸-乙腈；总流速0.300mL/min；初始比例：23vol.％B；HPLC设定的程序如表3所示。
表3设定的HPLC程序
质谱条件：
三重四极杆型质谱仪：岛津LCMS-8050(日本京都岛津公司)，电离模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)；检测方式：多反应监测(MRM)；质谱其他条件见下表。
表4设定的MS条件
| 仪器参数 | 设置值 |
| 雾化气流量 | 3L/min |
| 干燥气流量 | 10L/min |
| 加热气流量 | 10L/min |
| 接口电压 | 4.0kV |
| 接口电流 | 7.4uA |
| 接口温度 | 300℃ |
| DL温度 | 250℃ |
| 加热块温度 | 400℃ |
| 转换打拿极电压 | 10.0kV |
| 检测器电压 | 1.75kV |
| IG真空度 | 2.0e-003Pa |
| PG真空度 | 1.1e+002Pa |
| CID气 | 270kpa |
表5设定的MS检测条件
(1)根据上述高效液相色谱条件和质谱条件对表1中6组校准品、表2中3组质控品、以及实施例1步骤(9)洗脱后所得的上清液进行LC/MS/MS检测分析。
(2)根据对6组校准品的检测分析结果进行校准曲线的绘制和拟合；所得结果如表5所示：
表6IGF-I的校准曲线
(3)根据对上清液的检测分析结果并结合步骤(2)所得的标准曲线计算上清液中IGF-I的浓度。
实施例3：三重四极杆质谱仪量化IGF-I样品的准确度和精准度
向表2中3个浓度的质控品中加入不同浓度的IGF-I溶液，按实施例2进行LC-MS/MS检测分析后计算不同浓度质控品的加标回收率、日内精密度和日间精密度，具体检测结果如表5所示：
表7IGF-I日内精密度
表8IGF-I日间精密度
表9加标回收实验结果
以上结果说明了该方法稳定性好，精密度高，准确度高，能够满足临床检测的需求。
实施例4：
本实施例处理的待测样本为人血清，处理步骤如下：
(1)取校准品、质控品或待测样本各100μL，加入96孔板I的不同孔中，然后向各孔精确加入10μL质控品，振荡混匀；
(2)向各孔中加入100μL 8M尿素溶液，振荡混匀；
(3)向各孔中加入200μL不同浓度的乙酸乙腈溶液(每个浓度做三组平行实验，见表10)，振荡混匀，离心，取上清液；
(4)取出300μL上清液移至96孔板II中，向各孔加入900μL缓冲液混匀，获得预处理后的样本；
(5)活化：向SPE板各孔加入200μL活化液I，再加入200μL活化液II；
(6)上样：向SPE板各孔加入600μL预处理后的样本；
(7)向SPE板各孔加入200μL碱性淋洗液；
(8)向SPE板各孔加入200μL酸性淋洗液；
(9)向SPE板各孔分2次加入、每次25μL酸性洗脱液进行洗脱，取上清液备用。
(10)按实施例2进行LC-MS/MS检测分析上清液，结果如表10所示：
表10：不同浓度的乙酸乙腈溶液对IGF-I提取量的影响
以上结果说明了当乙酸乙腈溶液中乙酸的浓度为5wt.％时，从上清液中提取到的IGF-I最多。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法，其特征在于，所述IGF-I样品前处理方法包括：
向生物学样品中加入蛋白变性剂，使蛋白质复合物氢键解离、肽链伸展开，获得目标蛋白IGF-I与非目标蛋白解离的混合溶液；
向所述混合溶液中加入蛋白沉淀剂，使非目标蛋白沉淀，并收集上清液，用于三重四极杆质谱仪检测。
2.根据权利要求1所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法，其特征在于：所述生物学样品为血浆或血清。
3.根据权利要求1所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法，其特征在于：所述蛋白变性剂为尿素，向生物学样品中加入尿素后，尿素的浓度为4～8M。
4.根据权利要求1所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为乙酸乙腈溶液，乙酸的浓度为1wt.％～5wt.％。
5.根据权利要求1所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理方法，其特征在于：所述IGF-I样品前处理方法还包括：向上清液中加入缓冲液，将其置于固相萃取多孔板中，依次加入甲醇、水进行活化，再加入5wt.％的氨水、含0.5wt.％～2wt.％乙酸的甲醇进行淋洗，最后酸性洗脱液进行洗脱；所述酸性洗脱液为乙酸、甲醇、水三者的混合液，其中，乙酸的体积比为1％～10％，甲醇的体积比为60％。
6.一种基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理试剂盒，其特征在于，包括：
蛋白变性剂，其用于使蛋白质复合物肽链伸展开，使目标蛋白IGF-I与非目标蛋白解离，获得混合溶液；和
蛋白沉淀剂，其用于使混合溶液中的非目标蛋白沉淀。
7.根据权利要求6所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理试剂盒，其特征在于：所述蛋白变性剂为浓度为4～8M的尿素溶液，所述蛋白沉淀剂为乙酸乙腈溶液，乙酸的浓度为1wt.％～5wt.％。
8.根据权利要求6所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理试剂盒，其特征在于：所述IGF-I样品前处理试剂盒还包括：
固相萃取多孔板、缓冲液、活化液I、活化液II、碱性淋洗液、酸性淋洗液以及酸性洗脱液。
9.根据权利要求8所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理试剂盒，其特征在于：所述缓冲液是浓度为1wt.％～5wt.％的氨水；所述活化液I为甲醇；所述活化液II为水；所述碱性淋洗液为5wt.％的氨水；所述酸性淋洗液为含0.5wt.％～2wt.％乙酸的甲醇；所述酸性洗脱液为乙酸、甲醇、水三者的混合液，其中，乙酸的体积比为1％～10％，甲醇的体积比为60％。
10.根据权利要求6所述的基于三重四极杆质谱仪的IGF-I样品前处理试剂盒，其特征在于：所述IGF-I样品前处理试剂盒还包括含有IGF-I的校准品、内标准品以及质控品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310013505.0A CN116499822A (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 基于三重四极杆质谱仪的igf-i样品前处理方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310013505.0A CN116499822A (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 基于三重四极杆质谱仪的igf-i样品前处理方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116499822A true CN116499822A (zh) | 2023-07-28 |
Family
ID=87315507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310013505.0A Pending CN116499822A (zh) | 2023-01-05 | 2023-01-05 | 基于三重四极杆质谱仪的igf-i样品前处理方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116499822A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117783389A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-03-29 | 广州金域医学检验中心有限公司 | Igf-1及其变异体的质控品的制备方法 |
-
2023
- 2023-01-05 CN CN202310013505.0A patent/CN116499822A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117783389A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-03-29 | 广州金域医学检验中心有限公司 | Igf-1及其变异体的质控品的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Loo et al. | Solvent‐induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray‐ionization mass spectrometry | |
| CN110850099B (zh) | 一种非疾病诊断目的的血清中c反应蛋白的定值方法 | |
| US20130316463A1 (en) | Method for the purification of a glycan and/or a glycoconjugate by chromatography using a stationary phase comprising cotton | |
| CN111381043B (zh) | 一种适合质谱检测的样本前处理组合物、样本前处理方法及应用 | |
| CN112898384B (zh) | 一种鹿角特征肽段及其检测方法 | |
| CN110988193B (zh) | 一种检测水产品中晚期糖基化终末产物的方法 | |
| CN116499822A (zh) | 基于三重四极杆质谱仪的igf-i样品前处理方法及试剂盒 | |
| CN113030293B (zh) | 一种快速检测血浆九种游离氨基酸的串联质谱法 | |
| CN113341027A (zh) | 高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法及试剂盒 | |
| Shively et al. | Highlights of protein structural analysis | |
| CN116087386A (zh) | 一种人胰岛素样生长因子检测方法及试剂盒 | |
| AU2018306539B2 (en) | Peptide mapping method for sequence identification of insulin and insulin analogues | |
| CN116223651A (zh) | 基于肽段同位素稀释质谱的白细胞介素-6的定值方法 | |
| CN112630338B (zh) | 反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法 | |
| CN114624362A (zh) | 一种检测血清中晚期糖基化终末产物的试剂盒及其应用 | |
| CN114264742A (zh) | 一种快速检测血浆中甲状腺球蛋白浓度的方法 | |
| KR20210117268A (ko) | Lc-ms 기초된 hba1c 계측을 위한 고속 표본 작업 흐름 | |
| Wu et al. | The simultaneous quantitative detection of multiple hormones based on PS-MS: affinity capture by a single antibody | |
| CN116046923B (zh) | 一种血清中降钙素原的定值方法 | |
| CN117347531B (zh) | 一种采用双重内标定量检测蛋白质的方法 | |
| CN115290778B (zh) | 一种环境水体中痕量糖皮质激素的分析识别方法 | |
| CN111518178B (zh) | 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a标签肽及其应用 | |
| CN114720571B (zh) | 一种检测鱼体中15种抗生素的方法 | |
| CN115047100B (zh) | 一种大豆低聚肽质量控制方法 | |
| CN115201385B (zh) | 一种使氨基小分子携带两个电荷的电喷雾质谱检测用衍生化试剂及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |