CN110498838B

CN110498838B - 用于fpgs和ggh蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用

Info

Publication number: CN110498838B
Application number: CN201910711103.1A
Authority: CN
Inventors: 余鹏; 蒋蕾; 孟凡奇; 丁尧
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-08-02
Also published as: CN110498838A

Abstract

本发明公开了用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用，用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。基于上述特征性肽段定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，包括以下步骤：通过液相色谱‑质谱联用法或QconCAT法对用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段进行定量检测，进而实现对FPGS和GGH蛋白表达量的定量检测。本发明提供的特征性肽段序列能够实现同时、高效、灵敏、准确且可重复地对FPGS与GGH进行绝对定量分析，进而实现临床中MTX精准给药的临床指导。

Description

用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用。

背景技术

叶酰多聚谷氨合成酶(Folypolyglutamatesyn-thetase，FPGS)与谷氨酰水解酶(Gamma-glutamyl hydrolase，GGH)介导甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)在效应细胞内的多聚谷氨酸化过程与去谷氨酸化过程。多聚谷氨酸甲氨蝶呤(Methotrexate polyglutamate，MTXPGs)自身无法出胞，易在胞内蓄积，可长时间作用于靶点，因此，MTX的细胞毒作用的强弱主要取决于细胞内MTXPGs浓度。FPGS与GGH介导的代谢作用存在平衡状态，这导致在相同给药剂量下，由于FPGS与GGH的代谢作用达到平衡，快速输注(高血液浓度)和慢速输注(低血液浓度)两种环境下的胞内MTXPGs的净生成速率差别不大。因此，慢速输注时，血液中MTX的暴露时间长，胞内MTXPGs蓄积作用更强，MTXPGs浓度更高，其产生的副作用更强。

快慢速输注下副作用发生情况与临床用药的普遍规律相反，需要在临床用药过程中格外关注，即通过监测FPGS与GGH指导临床使用MTX。但目前对于FPGS与GGH的分析主要停留在酶活性的测定层面，该方式过程复杂、耗时长且结果可重复性较差，导致不同批次间及实验室间的分析结果可比性弱，分析结果无法被广泛应用。有研究报道表明FPGS与GGH的酶活性与其表达量成正比，虽有研究者对二者的表达量进行了研究分析，但其采取的分析手段主要包括逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase ChainReaction，RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)，其中，RT-PCR从mRNA水平进行分析，由于多种因素的影响，如转录后修饰，蛋白质与mRNA的半衰期不同等，mRNA水平与翻译水平无法对等，且蛋白质才是发挥生理作用的最终形式，因此RT-PCR无法实现准确的分析；而Western Blot虽然从蛋白质表达层面进行分析，但是其灵敏度较低，无法对细胞间FPGS与GGH表达量的微量区别进行辨别，根本无法指导临床用药；其次，FPGS与GGH属于内源性蛋白，与其他内源性蛋白间具有一定的序列同源性，可能伴有一定的抗原-抗体交叉反应，进而导致定量结果出错。因此，该种检测方法仅能进行定性或半定量研究且结果可重复性较低，目前临床中还未能实现以定量监测FPGS与GGH进而为临床指导提供帮助。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种能够实现FPGS和GGH蛋白表达量定量分析且可重现性好的特征性肽段。

本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种上述特征性肽段在FPGS和GGH蛋白表达量定量分析中的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段，其中，用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。

本发明的有益效果在于：本发明方案提供的特征性肽段序列能够实现同时、高效、灵敏、准确且可重复地对FPGS与GGH进行绝对定量分析，进而实现临床中MTX精准给药的临床指导。

为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的方法，包括以下步骤：

取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或定量肽段串联体法(Quantification concatamers，QconCAT)对样本溶液中用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段进行定量检测，进而实现对FPGS和GGH蛋白表达量的定量检测，所述用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。

进一步地，通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：

S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；分别取定量的用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段标准品和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段标准品配制成标准工作液；

S2、通过液相色谱-质谱联用仪对所述特征性肽段进行定量检测。

优选地，所述液相色谱-质谱联用仪为超高效液相色谱-串联质谱联用仪(UltraHigh Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS)。

进一步地，所述步骤S2中的检测过程中，色谱条件包括：以含有0.1％甲酸(Formicacid，FA)的水溶液为A流动相，以含有0.1％甲酸(Formic acid，FA)的乙腈溶液为B流动相，按照以下洗脱程序进行洗脱分离：

0min，A：95％

1min，A：95％

3min，A：40％

4min，A：40％

5min，A：95％。

进一步地，色谱条件还包括：色谱柱为C18柱，流速：0.2mL·min^-1，柱温：60℃；进样量：5μL。

进一步地，检测过程中，质谱条件包括序列为SGLQVEDLDR肽段母离子m/z:[M+2H]²⁺566.3，子离子m/z:746.4；序列为YLESAGAR肽段母离子m/z:[M+2H]²⁺433.7，子离子m/z:590.3，其中，母离子均可存在±5Da的差值。

本发明的有益效果在于：本发明方案以特征性肽段为目标分子量，利用液相色谱与质谱联用仪对特征性肽段进行检测，进而实现目标蛋白的定量检测，操作简便且可重现性好。

为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案还可以为：一种基于上述特征性肽段定量检测FPGS和GGH蛋白表达量的试剂盒，所述试剂盒包括用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段标准品、用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段标准品和用于蛋白质酶解试剂。

进一步地，所述用于蛋白质酶解的试剂包括还原剂、烷基化试剂及蛋白酶。

进一步地，所述还原剂为二硫苏糖醇，所述烷基化试剂为碘乙酰胺，所述蛋白酶为胰蛋白酶。

进一步地，所述试剂盒还包括细胞提取及裂解试剂。

本发明的有益效果在于：将特征性肽段的处理试剂制备成试剂盒，使得操作更为简便。

附图说明

图1为本发明实施例1中FPGS特征性肽段BLAST验证结果图；

图2为本发明实施例1中GGH特征性肽段BLAST验证结果图；

图3为本发明实施例1中FPGS特征性肽段的定量工作曲线；

图4为本发明实施例1中GGH特征性肽段的定量工作曲线。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明实施例1为：用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用，其中，用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。

该肽段的设计过程包括特征性肽段的理论筛选、理论验证和实验验证：

一、理论筛选：首先，以NCBI获得目标蛋白序列，利用Skyline软件预测胰蛋白酶消化后的潜在肽段。其次，为了保证肽段的特异性，需要严格满足以下要求：序列长度应在7～22个氨基酸的范围内；不存在细胞膜的无跨膜区；蛋白本身无翻译后的修饰区域，如磷酸化、糖基化等；无单核苷酸多态性(SNP)等遗传变异；无半胱氨酸、蛋氨酸等易快速氧化的氨基酸残基；不存在连续赖氨酸(K)和精氨酸(R)，如KK、RR、KR或RK；疏水氨基酸的比例不应超过50％。最后，利用Blast软件对肽段进行理论验证。经以上理论筛选步骤，确定候选特征性肽段为FPGS：SGLQVEDLDR(如SeqIDNO.1所示)；GGH：YLESAGAR(如SeqIDNO.2所示)。

二、肽段特征性验理论验证：

以BLAST对所筛选FPGS特征性肽段(SGLQVEDLDR)进行理论特征性验证，结果如图1所示。从图1中可以看出，与该肽段序列及种属(人源性)完全匹配的只有人FPGS蛋白，即Query Cover(100％)与Per.Ident(100％)，由此表明该肽段可以特征性表征人FPGS蛋白。

同样地以BLAST对所筛选GGH特征性肽段(YLESAGAR)进行理论特征性验证，结果如图2所示。从图2中可以看出，与该肽段序列及种属(人源性)完全匹配的只有人GGH蛋白，即Query Cover(100％)与Per.Ident(100％)，由此表明该肽段可以特征性表征人GGH蛋白。

三、实验验证：考察候选特征性肽段在样本和分析环境中的特异性。分别配置空白基质溶液(含0.2％HSA的PBS溶液)、加入肽段溶液的空白基质溶液以及细胞样本溶液，判断候选特征性肽段是否会被相关涉及与加入的蛋白干扰。

1、肽段标准储备液的配置：

(1)肽段标准储备液的配制：精密称取5mg目标肽段(FPGS：SGLQVEDLDR；GGH：YLESAGAR)用去离子水溶解稀释成0.5mg/mL目标肽段标准储备液，-20℃保存备用。

(2)内标肽段标准储备液的配制：精密称取1mg内标肽段(FPGS：SGL(¹³C，¹⁵N)QVEDLDR；GGH：YLESAGAR(¹³C，¹⁵N))，用去离子水溶解并稀释成浓度为0.1mg/mL的内标肽段储备液，-20℃冰箱内保存备用。

2、标准样本的配制：

(1)取浓度为0.5mg/mL的肽段SGLQVEDLDR或YLESAGAR的标准储备液，各100μL，涡旋混匀30s；

(2)用50％乙腈水溶液梯度稀释并定容，得到浓度为(1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1)ng/mL的工作溶液；

(3)精密吸取工作溶液20μL，置于2mL EP管中，精密加入含0.2％HSA的PBS溶液(空白基质)180μL，涡旋30s，得到浓度分别为(100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1)ng/mL的肽段标准样本；

(4)以相同步骤配置方法验证所需质控样本溶液浓度分别为(0.16、4和80)ng/mL。

3、蛋白样本的提取：

(1)取需要测定的细胞样本，加入适量PBS溶液洗涤2～3次；

(2)加200μL Lysis Buffer(使用前，每1mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂和1μL浓度为1M DTT混匀)，将样品放置于冰上约15min，充分研磨约5min破碎细胞；

(3)将破碎好的细胞溶液转移至1.5mL离心管内，涡旋震荡30s；

(4)置于冰上降温约1min，重复此过程5次；

(5)然后于4℃，12000rpm离心10min，弃掉上清液，沉淀保存于-80℃下；

(6)利用BCA试剂盒分离总蛋白，然后用Bradford法进行总蛋白含量测定。

4、蛋白样本的处理：

(1)取上述提取蛋白样本100μL，转移置于洁净的EP管中，加入配置好的50mMNH₄HCO₃缓冲液(pH 7.8)50μL，充分混合，加入50mM DTT，至最终浓度为10mM；

(2)将混合液于60℃环境下加热20min，向EP管中加入400mM IAA碘乙酰胺，至最终浓度50mmol/L；

(3)将混合物置于室温中避光反应6h，精密加入浓度为300ng/mL的内标混合液20μL，涡旋混匀30s；

(4)按照肽段与酶比例为20:1(w/w)，加入质谱级胰酶在37℃避光条件下酶解24h；

(5)加入20μL 0.1％三氟乙酸终止反应；

(6)样品于4℃，16000×g下离心15min，取5μL上清液进液质分析。

5、色谱条件：

ACQΜITY

Peptide C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，流动相：A为含0.1％FA的水，B为含0.1％FA的乙腈；流速为0.2mL·min^-1；柱温60℃；进样量5μL。洗脱程序如下：

6、质谱条件：

7、数据的计算：

以特征性肽段峰面积内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，以特征性肽段在基质中的浓度(X)为横坐标，分别绘制FPGS与GGH特征性肽段的定量工作曲线如图3和4所示。从图3中可以看出，得到SGLQVEDLD的线性范围：0.09～100ng/mL，直线回归方程：Y＝0.00194X-0.000237；从图4中可以看出，YLESAGAR的线性范围：0.09～100ng/mL，直线回归方程：Y＝0.000465X+0.000316。利用以上方程，可以得到进样后FPGS与GGH表达量。

本实施例基于特征肽段，建立了能够同时对细胞内FPGS与GGH进行绝对定量的UPLC-MS/MS方法。首先，通过理论筛选特征性肽段，并以实验进行特征性肽段验证。之后以稳定同位素对标记的特征性肽段作为定量分析内标，建立基于特征性肽段的UPLC-MS/MS测试分析方法，同时实现对同一样本中FPGS与GGH的绝对定量分析。本发明实施例方案相对于现有技术，具有以下优点：1.该方法灵敏度较其他方法高，定量下限为0.09ng/mL；2.该方法耗时短，一个样本的运行时常仅为5min；3.该方法能够实现对同一样本中的两种蛋白同时进行定量分析，定量结果的可比性强；4.该方法相比于常用RT-RCR及Western Blot分析方法，能够实现绝对定量分析，且重复性更强；5.该方法能够满足快速、准确测定且费用适中的要求，更能广泛应用于临床指导中。

本发明实施例二为：用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用，其中，用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR；用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段序列为：YLESAGAR。上述特征性肽段在定量检测FPGS和GGH蛋白表达量中的应用，包括以下步骤：通过定量肽段串联体法(Quantification concatamers，QconCAT)对用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段和用于GGH蛋白表达量检测的特征性肽段进行定量检测，进而实现对FPGS和GGH蛋白表达量的定量检测。定量肽段串联体法(Quantificationconcatamers，QconCAT)：该方法利用重组DNA技术将多种目标蛋白的目标肽段串联构建成新的蛋白质，并将对应的质粒转入到细菌中，在含有同位素的培养液中培养，经纯化即可得到同位素标记的QconCAT蛋白。QconCAT蛋白在酶解前加入待测样本中，经酶解产生等摩尔数的不同定量肽段，从而实现多种蛋白同时定量。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 中南大学

<120> 用于FPGS和GGH蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> unkown

<400> 1

Ser Gly Leu Gln Val Glu Asp Leu Asp Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> unkown

<400> 2

Tyr Leu Glu Ser Ala Gly Ala Arg

1 5

Claims

1.用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段，其特征在于：用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR。

2.一种定量检测FPGS蛋白表达量的方法，包括以下步骤：其特征在于：

取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或QconCAT法对样本溶液中用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段进行定量检测，进而实现对FPGS蛋白表达量的定量检测，所述用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段的序列为：SGLQVEDLDR。

3.根据权利要求2所述的特征性肽段定量检测FPGS蛋白表达量的方法，其特征在于：通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：

S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；分别取定量的用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段标准品配制成标准工作液；

4.根据权利要求3所述的定量检测FPGS表达量的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪为UPLC-MS/MS。

5.根据权利要求3所述的定量检测FPGS表达量的方法，其特征在于：所述步骤S2中的检测过程中，色谱条件包括：以含有0.1％甲酸的水溶液为A流动相，以含有0.1％甲酸的乙腈溶液为B流动相，按照以下洗脱程序进行洗脱分离：

0min，A：95％

1min，A：95％

3min，A：40％

4min，A：40％

5min，A：95％。

6.根据权利要求3～5任一项所述的定量检测FPGS蛋白表达量的方法，其特征在于：检测过程中，质谱条件包括序列为SGLQVEDLDR肽段母离子m/z:[M+2H]²⁺566.3，子离子m/z:746.4；。

7.一种基于如权利要求1所述的特征性肽段定量检测FPGS蛋白表达量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于FPGS蛋白表达量检测的特征性肽段标准品和用于蛋白质酶解试剂。

8.根据权利要求7所述的特征性肽段定量检测FPGS蛋白表达量的试剂盒，其特征在于：所述用于蛋白质酶解的试剂包括还原剂、烷基化试剂及蛋白酶。

9.根据权利要求8所述的特征性肽段定量检测FPGS蛋白表达量的试剂盒，其特征在于：所述还原剂为二硫苏糖醇，所述烷基化试剂为碘乙酰胺，所述蛋白酶为胰蛋白酶或糜蛋白酶。

10.根据权利要求7-9任一项所述的特征性肽段定量检测FPGS蛋白表达量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括细胞提取试剂及裂解试剂。