CN111007161B

CN111007161B - 一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒

Info

Publication number: CN111007161B
Application number: CN201911064881.2A
Authority: CN
Inventors: 余鹏; 江寒冰; 张可; 丁尧
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN111007161A

Abstract

本发明公开了一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒，所述肽段组合物包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P‑gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如Seq ID No.1至Seq ID No.5所示。本发明方案的特征性肽段，特征性强、质谱特性和酶解特性好，准确性高且稳定性强。

Description

一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒。

背景技术

大多数药物通过与器官、组织、细胞上的靶点作用，影响和改变人体的功能，产生药理效应(简称“药效”)。药物与机体生物大分子的结合部位即药物靶点，大多数的药物靶点在细胞内部，药物从血液进入细胞，在细胞中发挥药理作用，整个过程主要受转运蛋白、代谢酶和外排蛋白等功能蛋白的主导。功能蛋白表达情况的不同，是造成药物代谢过程和药效发挥过程差异的主要原因。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)可通过内流转运体-还原型叶酸载体(reducedfolate carrier RFC)进入细胞，然后在叶酰多聚谷氨合成酶(Folypolyglutamatesyn-thetase，FPGS)的作用下生成多聚谷氨酸甲氨蝶呤(Methotrexate polyglutamate，MTX-PGs)，MTX-PGs在谷氨酰水解酶(Gamma-glutamyl hydrolase，GGH)的作用下又可还原生成MTX，最后经外排转运体P 糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP)排出细胞外。

研究发现，在使用MTX治疗类风湿性关节炎时，RFC的表达量与MTX的疗效具有极强的相关性。又由于MTX-PGs自身无法出胞，易在胞内蓄积，因此，MTX的细胞毒作用主要由细胞内MTX-PGs的浓度水平决定。而长期用药会导致P-gp和BCRP过量表达，导致细胞对药物外排作用的增加，降低靶细胞内药物浓度，使得疗效降低，进而产生耐药效应。而且中国人群中不同个体间P-gp等外排转运体的表达量相差5倍以上。由此可见，在MTX作用于靶细胞的过程中，RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白对其药效的发挥具有重要的影响。因此，在个体化给药过程中，有必要对靶细胞关键蛋白进行监测，基于RFC、FPGS、 GGH、P-gp和BCRP的表达，反应MTX的药物代谢和药效发挥，对于临床个体化给药具有重要意义。

与小分子药物不同，蛋白质药物大多是来源于生物体内的活性物质，与内源性物质的结构极为类似，给蛋白质药物的定量分析带来了极大的困难。目前，经典的蛋白质定量主要运用的是传统的配体结合测定方法(Ligand-bindingassays，LBA)，其中以酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)为代表，该方法具有一定的缺点，如：1) 自选商场建立时间长，LBA方法开发的步骤包括关键试剂的优化、内源性干扰物质的检查、不同来源样品的交叉验证。建立LBA法需要开发关键试剂，要耗费大量的时间，通常需要 6-12个月，而且耗费成本较高。2)易受内源性抗体的干扰且定量范围窄，LBA的关键试剂都是通过生物过程产生的，容易受到蛋白质翻译后修饰等因素的干扰，而且LBA方法难以使用内标来纠正定量偏差，很难保持较高的批间/实验室间的一致性。3)非特异性结合以及交叉免疫等问题严重，LBA法很难应用在不同的基质(血浆或组织)以及不同的物种之间。不同的基质成分引起的干扰和交叉反应非常明显，对LBA的特异性有很大的影响。4)样本量要求大且分析速度慢，LBA方法则很难一次性分析多种蛋白质，且每次分析所需样本量大。因此，目前临床上还未能通过同时监测RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达水平进而指导MTX临床应用，开发一种能够对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达水平进行准确定量的方案迫在眉捷。

高效液相色谱-串联质谱(High performance liquid chromatography tandemmass spectrometry，HPLC-MS/MS)分析方法在蛋白药物定量分析中，具有良好的选择性、准确性、精确性、定量范围宽、开发时间短(约几周时间)、分析通量高以及多重分析能力的优点。若能通过HPLC-MS/MS对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP同时进行定量分析，将有望解决上述问题。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物，能够用于对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达水平进行准确定量。

本发明还提出一种上述肽段组合物的定量检测方法。

本发明还提出用于检测上述肽段组合物的检测试剂盒。

根据本发明的第一方面实施例的肽段组合物，包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如SeqID No.1 至Seq ID No.5所示。

根据本发明实施例的肽段组合物，至少具有如下有益效果：本发明方案特征肽段能够准确表征RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白，可满足高效液相色谱法过程中同时、高效、灵敏和准确地对五种蛋白的绝对定量化检测，以实现对MTX药效的精准预测；本发明方案的特征性肽段，特征性强、质谱特性和酶解特性好，准确性高且稳定性强。

根据本发明的第二方面实施例的定量检测方法，包括以下步骤：

取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或定量肽段联体法 (Quantification concatamers，QconCAT)对样本溶液中的用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，进行定量检测，进而实现对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达量的定量检测，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如Seq IDNo.1至Seq ID No.5所示。

根据本发明实施例的定量检测方法，至少具有如下有益效果：通过对本发明方案特征性肽段进行定量分析，特征性强，选择性好，定量范围宽，灵敏度高，定量下限可达0.09ng·mL^-1；本发明方案的定量检测方法，重现性好，不同批次间及实验室间的分析结果可比较性强。

根据本发明的一些实施例，通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：

S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；

S2、通过液相色谱-质谱联用仪对所述肽段组合物进行检测及定量分析。

通过液质联用对蛋白进行定量检测，可一次性实现对同一样本中的五种蛋白同时进行定量分析，所需样品量少、耗时短，快速高效，开发时间短(约2～3周即可完成开发)、分析通量高且具有多重分析能力。

根据本发明的一些实施例，在进行定量分析前还包括以下步骤：

取所述肽段组合物的标准品配制成标准工作液，通过高效液相色谱-质谱联用仪进行检测，并根据检测结果绘制成标准工作曲线。

根据本发明的一些实施例，采用同位素内标法对样品进行定量分析。采用同位素标记的肽段或蛋白质作为内标，可以有效地校正分析过程中的偏差和基质效应，只要正确的维护仪器和执行相关的质量控制标准，即可确定方法的稳定可靠性。通过色谱分离与同位素标记内标物的校正，可以最大程度地降低基质效应的影响，并且能够适用于不同的生物基质。

根据本发明一些实施例，通过在待测样品供试液中加入以下序列结构的同位素肽段对所述肽段组合物中的各肽段进行定量分析：RFC：AAQAL(¹³C,¹⁵N)SVQDK；FPGS：SGL(¹³C,¹⁵N) QVEDLDR；GGH：YLESAGAR(¹³C,¹⁵N)；P-gp：IATEAIENFR(¹³C,¹⁵N)；BCRP：SSLLDVLAAR (¹³C,¹⁵N)。

根据本发明的一些实施例，所述液相色谱-质谱联用仪为液相色谱-串联质谱联用仪；优选为超高效液相色谱-串联质谱联用仪(ultra performance liquidchromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)。

根据本发明的一些实施例，液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，使用的色谱柱为C18 柱；优选地，所述色谱柱的粒径为1.7μm。

根据本发明的一些实施例，液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，流动相由A相和B 相组成，A相为0.1％的甲酸-水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液，流动相的洗脱梯度如下：

0～1min B相体积分数维持在5％

1～3min B相体积分数由5％上升到60％

3～4min B相体积分数维持在60％

4～5min B相体积分数由60％下降到5％。

根据本发明的一些实施例，液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，色谱条件还包括流速为0.2ml·min^-1，柱温为60℃。

根据本发明的一些实施例，液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，进样量为5μL。采用液质联用法，不仅可以一次性分析几百种蛋白质，而且方法灵敏度高，只需少量的样品即可进行分析，相比于传统LBA法所需的样品量大幅降低。

根据本发明的第三方面实施例的试剂盒，包括所述第一肽段的标准品、所述第二肽段的标准品、所述第三肽段的标准品、所述第四肽段的标准品、所述第五肽段的标准品和用于蛋白质酶解试剂。

根据本发明实施例的试剂盒，至少具有以下有益效果：本发明试剂盒基于液质联用法，借助特征肽段表征RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白，进而建立一种能够同时、高效、灵敏且准确地对预测甲氨蝶呤药效相关联蛋白绝对定量的方法，可以准确有效地对甲氨蝶呤药效进行预测，预测最适合患者的个体化给药方式，从而实现精准用药。

根据本发明的一些实施例，所述用于蛋白质酶解的试剂包括还原剂、烷基化试剂及蛋白酶。

根据本发明的一些实施例，所述还原剂为二硫苏糖醇，所述烷基化试剂为碘乙酰胺，所述蛋白酶为胰蛋白酶。

根据本发明的一些实施例，所述试剂盒还包括细胞提取及裂解试剂。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例2中绘制的第一肽段的标准工作曲线图；

图2为本发明实施例2中绘制的第二肽段的标准工作曲线图；

图3为本发明实施例2中绘制的第三肽段的标准工作曲线图；

图4为本发明实施例2中绘制的第四肽段的标准工作曲线图；

图5为本发明实施例2中绘制的第五肽段的标准工作曲线图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明的实施例一为：一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物，包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段(序列为：AAQALSVQDK)、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段(序列为：SGLQVEDLDR)、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段(序列为： YLESAGAR)、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段(序列为：SSLLDVLAAR)和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段(序列为：IATEAIENFR)。上述肽段经理论筛选初步得出：首先，确定以RFC、FPGS、GGH、P-gp、BCRP五种蛋白用于预测甲氨蝶呤药效，以NCBI-protein数据库获得人体目标蛋白的全序列信息，利用Skyline软件预测胰蛋白酶消化后的潜在肽段。其次，为了保证肽段的特异性，需要严格满足以下要求：序列长度应在7～22 个氨基酸的范围内；不存在细胞膜的无跨膜区；蛋白本身无翻译后的修饰区域，如磷酸化、糖基化等；无单核苷酸多态性(SNP)等遗传变异；无半胱氨酸、蛋氨酸等易快速氧化的氨基酸残基；不存在连续赖氨酸(K)和精氨酸(R)，如KK、RR、KR或RK；疏水氨基酸的比例不应超过50％。最后，利用Blast软件对肽段进行理论验证。

本发明的实施例二为：一种预测甲蝶呤药效的肽段组合物的定量检测方法，包括以下步骤：

1、提取待测目标的蛋白样本；

2、酶解处理待测目标的蛋白样本，制备成待测样品供试液；

3、通过UPLC-MS/MS结合内标法对待测样品供试液中的肽段组合物进行检测及定量分析。

其中，蛋白样本的提取操作参照现有技术的常规步骤即可，具体如下：

(1)取待测细胞，预冷磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗细胞三次，刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管。

(2)冰上操作，配制细胞裂解液，1mL Lysis Buffer中加入10μL磷酸酶抑制剂、1μL蛋白酶抑制剂、5μL 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。

(3)在洗涤好的细胞中按照每10个细胞加入1mL细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。 200μL移液枪反复吹打，至蛋白析出。

(4)4℃摇床，温和振摇15分钟。

(5)14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。

(6)BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-80℃冰箱，避免反复冻融。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。

蛋白样本的处理操作同样参照现有技术的常规步骤即可，具体如下：

(1)取上述提取蛋白样本100μL，转移置于洁净的EP管中，加入配置好的50mMNH₄HCO₃缓冲液(pH 7.8)50μL，充分混合，加入50mM二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT) 至最终浓度为10mM；

(2)将混合液于60℃环境下加热20min，向EP管中加入400mM碘乙酰胺(IAA)，至最终浓度50mmol/L；

(3)将混合物置于室温中避光反应6h，精密加入浓度为300ng/mL的内标混合液20μL，涡旋混匀30s；

(4)按照肽段与酶比例为20:1(w/w)，加入质谱级胰酶在37℃避光条件下酶解24h；

(5)加入20μL 0.1％三氟乙酸终止反应；

(6)样品于4℃，16000×g下离心15min，取5μL上清液进分析。

标准储备溶液的配置：

(1)目标肽段标准品溶液：精密称取5mg目标肽段(RFC：AAQALSVQDK；FPGS：SGLQVEDLDR；GGH：YLESAGAR；P-gp：IATEAIENFR；BCRP：SSLLDVLAAR)，用去离子水溶解，配制成浓度为0.5mg·mL^-1目标肽段标准储备液，于-20℃保存备用。绘制工作曲线时，将浓度为0.5mg·mL^-1目标肽段标准储备液各取100μL，涡旋混匀30s后，用50％乙腈水溶液定容，得到浓度为1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1ng·mL^-1的工作溶液。

为验证本发明方案选择的肽段在分析环境和样本中的特异性，向上述操作制得的工作溶液中加入空白基质溶液：精密吸取工作溶液20μl，置于2mL EP管中，精密加入含0.2％人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)的PBS溶液(空白基质)180μL，涡旋30s，得到浓度分别为100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1ng·mL^-1的裸肽标准样本。

(2)内标肽段：精密称取1mg内标肽段RFC：AAQAL(¹³C,¹⁵N)SVQDK；FPGS： SGL(¹³C，¹⁵N)QVEDLDR；GGH：YLESAGAR(¹³C，¹⁵N)；P-gp：IATEAIENFR(¹³C,¹⁵N)； BCRP：SSLLDVLAAR(¹³C,¹⁵N)，用去离子水溶解，配制成浓度为0.1mg·mL^-1的内标肽段标准储备液，于-20℃保存备用。

(3)质控样本：按照裸肽标准样本相同步骤配置方法验证所需质控样本溶液，浓度分别为0.5、5和50ng·mL^-1。

定量分析过程中，所有样品(肽段样品及待测目标物供试液等)的色谱条件及质谱条件均一致，具体包括：

1)色谱条件：

色谱仪：Waters ACQUITY UPLC I-Class液相色谱仪；色谱柱：ACQΜITY

Peptide C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相：A：0.1％FA水，B：含0.1％FA乙腈；流速：0.2mL·min^-1；柱温60℃；进样量5μL。洗脱程序如下：

2)质谱条件：

质谱型号：Waters Xevo TQ-S；离子源：电喷雾离子源(Electrospray ionizationsource， ESI)；离子源温度(℃)：150；毛细管电压(KV)：1；脱溶剂气流(L/h)：1000；脱溶剂温度(℃)：500；电离模式：正离子；信号采集模式：MRM。各肽段的监测离子信息如下表所示：

根据上述检测条件对肽段标准品浓度与对应的响应值，以特征性肽段峰面积内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，以特征性肽段在基质中的浓度(X)为横坐标，绘制五种特征性肽段的工作曲线如图1～5所示。由图1～5可以看出，第一肽段的线性范围为：0.09～100ng·mL^-1，直线回归方程：Y＝0.000887X-0.00025；第二肽段的线性范围为：0.09～100ng·mL^-1，直线回归方程：Y＝0.00194X-0.000237；第三肽段的线性范围为：0.09～100ng·mL^-1，直线回归方程： Y＝0.000465X+0.000316；第四肽段的线性范围为：0.09～100ng·mL^-1，直线回归方程：Y＝ 0.000516X-0.000859；第五肽段的线性范围为：0.09～100ng·mL^-1，直线回归方程：Y＝ 0.00109X-0.000598。利用以上方程，可以得到进样后RFC、FPGS、GGH、BCRP和P-gp表达量。此外，由图1～5可以看出，本发明方案选择的肽段并不会受到基质的干扰，特异性强，通过本发明方案的特征性肽段进行定量，结果准确可靠。

综上所述，本发明提供的特征性肽段，专属性强，能较好地避免被干扰，将其与HPLC-MS/MS结合可实现一次性对五种蛋白高灵敏度、高精密度和高重现性的定量检测。

本发明中涉及的术语可作如下理解：(1)RFC：还原叶酸载体蛋白(reduced folatecarrier protein)，内流转运体，可将甲氨蝶呤由胞外转运到胞内，升高靶细胞内药物浓度；(2)FPGS：叶酰多聚谷氨合成酶(Folypolyglutamatesyn-thetase)，负责甲氨蝶呤的细胞内多聚谷氨酸化过程；(3)GGH：谷氨酰水解酶(Gamma-glutamyl hydrolase)，负责细胞内多聚谷氨酸甲氨蝶呤的去谷氨酸化过程；(4)P-gp：P糖蛋白(P-glycoprotein)，外排蛋白，可将甲氨蝶呤由胞内转运到胞外，降低靶细胞内药物浓度；(5)BCRP：乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein)，外排转运体，可将甲氨蝶呤由胞内转运到胞外，降低靶细胞内药物浓度。本发明方案的定量检测方法主要用于医学研究。MTX从血液进入细胞发挥作用，首先需要通过细胞膜上的功能蛋白，其中内流转运体表达情况是决定靶细胞药物摄取的主要因素，研究发现，在使用MTX治疗类风湿性关节炎时，MTX转运体RFC的表达量与DAS 28评分呈显著的负相关关系(r²＝0.576,P<0.0001)，表明RFC表达量与MTX的疗效相关性非常强。MTX在细胞内的代谢过程由相关蛋白酶表达量决定，患者体细胞内相关代谢酶系表达情况的不同，是造成临床药物代谢差异的关键原因。MTX在细胞中的代谢过程主要受FPGS和GGH的介导，是代谢的关键酶。而代谢酶的表达量是细胞内代谢过程的决定性因素。细胞实验发现，在表达不同水平FPGS的CHO AUXB1细胞系中，FPGS的基因表达量与细胞内FPGS酶活性呈线性关系。长期用药会导致外排蛋白(如P-gp、BCRP等)过量表达，导致细胞对药物外排作用的增加，降低靶细胞内药物浓度，使得疗效降低。在我们的前期研究中，也发现P-gp、 BCRP外排蛋白表达量与细胞外排速率呈现明显正相关。中国人群中不同个体间P-gp等外排蛋白的表达量差异最高可达5倍以上。MTX在细胞内发挥作用，不仅仅与其代谢的关键酶 (FPGS、GGH)相关，与MTX进出细胞的转运蛋白也相关，而细胞膜上关键转运蛋白的含量可直接影响细胞内药物浓度，RFC、P-gp、BCRP的表达量与MTX细胞内浓度及药效密切相关。基于此，本发明方案通过对五种蛋白同时进行定量检测，可以更加全面、准确地评价MTX发挥药效与关键蛋白之间的关系。因此，通过监测MTX关键蛋白的含量，建立MTX 体内细胞动力学模型，进而预测MTX细胞内药物动力学模型，有望基于患者体细胞内相关蛋白的表达情况，预测最适合患者的个体化给药方式，从而达成精准用药。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 中南大学

<120> 一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物及其定量检测方法与检测试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala Ala Gln Ala Leu Ser Val Gln Asp Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Gly Leu Gln Val Glu Asp Leu Asp Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Tyr Leu Glu Ser Ala Gly Ala Arg

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ile Ala Thr Glu Ala Ile Glu Asn Phe Arg

1 5 10

Claims

1.一种预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物，其特征在于：包括用于RFC蛋白表达量定量检测的第一肽段、用于FPGS蛋白表达量定量检测的第二肽段、用于GGH蛋白表达量定量检测的第三肽段、用于BCRP蛋白表达量定量检测的第四肽段和用于P-gp蛋白表达量定量检测的第五肽段，所述第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段的氨基酸序列依次如SeqID No.1至Seq ID No.5所示。

2.一种如权利要求1所述的预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物的非诊断目的定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

取待测样本进行前处理，得到样本溶液，通过液相色谱-质谱联用法或QconCAT对样本溶液中的第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段，进行定量检测，进而实现对RFC、FPGS、GGH、P-gp和BCRP五种蛋白表达量的定量检测。

3.根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于：通过液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，包括以下步骤：

S1、酶解处理待测目标的蛋白样本，制成待测样品供试液；

4.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：通过在待测样品供试液中加入以下序列结构的同位素肽段对所述肽段组合物中的各肽段进行定量分析：RFC：AAQAL(¹³C,¹⁵N)SVQDK；FPGS：SGL(¹³C,¹⁵N)QVEDLDR；GGH：YLESAGAR(¹³C,¹⁵N)；P-gp：IATEAIENFR(¹³C,¹⁵N)；BCRP：SSLLDVLAAR(¹³C,¹⁵N)。

5.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪为UPLC-MS/MS。

6.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，使用的色谱柱为C18柱。

7.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，流动相由A相和B相组成，A相为0.1％的甲酸-水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈溶液，流动相的洗脱梯度如下：

0～1min B相体积分数维持在5％

1～3min B相体积分数由5％上升到60％

3～4min B相体积分数维持在60％

4～5min B相体积分数由60％下降到5％。

8.根据权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：液相色谱-质谱联用法进行定量检测时，色谱条件还包括流速为0.2ml·min^-1，柱温为60℃。

9.一种如权利要求1所述的预测甲氨蝶呤药效的肽段组合物的检测试剂盒，其特征在于：包括所述第一肽段的标准品、所述第二肽段的标准品、所述第三肽段的标准品、所述第四肽段的标准品、所述第五肽段的标准品和用于蛋白质酶解试剂。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括细胞提取及裂解试剂。