CN107817311B

CN107817311B - 一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法

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Publication number: CN107817311B
Application number: CN201710886096.XA
Authority: CN
Inventors: 房芳; 何鹏飞; 陈启; 郝星凯; 孙姗姗; 章虎
Original assignee: Greentown Agricultural Detection Technology Co Ltd
Current assignee: Greentown Agricultural Detection Technology Co Ltd
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107817311A

Abstract

本发明公开了一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，包括以下步骤：(1)在配方奶粉样品中加入质量浓度为10～70％的乙腈水溶液，提取得到配方奶粉中的标记肽，通过液质联用检测标记肽的含量，得到配方奶粉中标记肽含量；(2)采用与步骤(1)相同的方法提取所述配方奶粉样品中所使用的酪蛋白磷酸肽原料中的标记肽，通过液质联用检测标记肽的含量，得到酪蛋白磷酸肽原料中标记肽含量；(3)按照下列公式计算得到所述配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量，配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量＝配方奶粉中标记肽含量/酪蛋白磷酸肽原料中标记肽含量；其中，所述标记肽的序列为VLPVPQK。本发明可用于检测市场上大多数CPP产品。

Description

一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法。

背景技术

酪蛋白是奶中的主要蛋白质，经肠胃道消化后，会水解形成多种具有生物活性的多肽。在这些水解多肽中，有部分多肽富含丝氨酸，丝氨酸易与磷酸基团结合，故将这部分多肽总称为酪蛋白磷酸肽(CPP)。CPP能够在特定的pH 环境下与钙、锌等金属离子结合，增加其水溶性、促进吸收、提高这些金属离子的生物利用率。

由于婴幼儿的消化功能尚未发育完全，无法有效消化酪蛋白。所以婴幼儿配方乳粉企业通过体外酶解酪蛋白获得CPP，并且将其添加到婴幼儿配方奶粉中，以期获得促进钙吸收的效果。但是由于缺乏CPP相关标准品与检测方法，给生产企业对产品质量控制带来了不便，也对监管单位的监管活动带来的困难。

目前检测方法是在将pH调节至4.6以除去未水解酪蛋白之后，将CPP用钡离子与乙醇沉淀出来，再通过重量法计算其含量。该方法仅适用于高浓度原料中CPP含量的测定，并不适用于配方乳粉，主要原因是CPP在配方乳粉中的加入量通常很低，该方法无法提供足够的灵敏度；其次，该方法的特异性不佳，配方乳粉中的乳清蛋白也会影响检测结果。

另外有部分学者尝试使用HPLC法检测配方乳粉中的CPP，他们通过对比CPP原料和配方乳粉的色谱峰，选择CPP所特有的色谱峰用来建立标准曲线以及检测配方乳粉中CPP的添加量。但是该方法也存在着以下不足：

首先由于缺乏CPP单一多肽的标准品，难以判断样品色谱峰的来源；其次 HPLC法通常采用紫外检测器，其灵敏度不佳，所以样品需要经过繁琐的浓缩过程；同时紫外检测器特异性低，配方乳粉中许多物质也同样会在280nm波长下检测出来，导致特征峰无法和杂质峰基线分离。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种酪蛋白磷酸肽的标记肽，可以用于对配方奶粉中酪蛋白磷酸肽的检测。

本发明的技术方案为：一种酪蛋白磷酸肽的标记肽，所述标记肽的氨基酸序列为VLPVPQK。

本发明还提供了一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的试剂盒，包括标记肽，所述标记肽为上述的标记肽。

作为优选，还包括同位素标记肽，所述同位素标记肽的序列为VL*PV*PQK，其中L*为[¹³C₆，¹⁵N]-亮氨酸，V*为[¹³C₆，¹⁵N]-缬氨酸。

本发明还提供了上述的试剂盒在检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的应用。

本发明还提供了一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，包括以下步骤：

(1)在配方奶粉样品中加入质量浓度为10～70％的乙腈水溶液，提取得到配方奶粉中的标记肽，通过液质联用检测标记肽的含量，得到配方奶粉中标记肽含量；

(2)采用与步骤(1)相同的方法提取所述配方奶粉样品中所使用的酪蛋白磷酸肽原料中的标记肽，通过液质联用检测标记肽的含量，得到酪蛋白磷酸肽原料中标记肽含量；

(3)按照下列公式计算得到所述配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量，

配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量＝配方奶粉中标记肽含量/酪蛋白磷酸肽原料中标记肽含量；

其中，所述标记肽的序列为VLPVPQK。

本发明采用液相色谱串联质谱法，该方法应用蛋白组学原理对蛋白质多肽进行分析，选择其中的特异多肽作为目标的标记肽建立检测方法。通过人工合成的标准品多肽，可对样品中的特异多肽进行定量分析。在此基础上，还设计开发了稳定同位素标记的多肽，进一步提高此方法的准确度。该方法现在普遍应用于检测由高度特异性酶切产生的多肽，例如胰蛋白酶酶切产物和胃蛋白酶酶切产物，但是缺乏类似CPP这样非特异酶切产物的检测方法。

本发明选择序列为VLPVPQK作为CPP的标记肽，通过对CPP原料中的标记肽进行定性检测，以及对配方奶粉中的标记肽进行检测，最后将配方奶粉中标记肽含量除以酪蛋白磷酸肽原料中标记肽含量，即得到所述配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量。

本发明还提供了另外一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，包括以下步骤：

(1)通过液质联用检测方法，构建不同酪蛋白磷酸肽原料浓度的标准曲线；

(2)在配方奶粉样品中加入质量浓度为10～70％的乙腈水溶液，提取得到配方奶粉中的标记肽，通过液质联用检测得到配方奶粉中标记肽含量，并将检测得到配方奶粉中标记肽含量代入步骤(1)中所获得的标准曲线中，即可计算得到配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量；

其中，所述标记肽的序列为VLPVPQK。

本发明选择序列为VLPVPQK作为CPP的标记肽，首先制作CPP原料浓度的标准曲线，然后对配方奶粉样品中的的标记肽进行检测，将检测得到的配方奶粉中标记肽含量带入步骤(1)中所获得的标准曲线中，即可计算得到配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量。

作为优选，所述步骤(1)和所述步骤(2)中均加入同位素标记的同位素标记肽作为内标，所述同位素标记肽的序列为VL*PV*PQK，其中L*为[¹³C₆，¹⁵N]-亮氨酸，V*为[¹³C₆，¹⁵N]-缬氨酸。本发明合成了同位素标记的标记肽作为内标，建立检测方法学，并对其进行方法学验证。

作为优选，所述乙腈水溶液的质量浓度为60％。

作为优选，使用乙腈水溶液提取所述标记肽时，加入乙腈水溶液混匀之后，超声提取30min，离心10min，取上清液用0.22μm滤膜过滤后得到进样样品液。

作为优选，所述液质联用检测系统为超高效液相色谱串联三重四级杆质谱。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明通过对多种CPP原料产品进行分析，发现采用不同水解工艺所产生的CPP多肽种类和含量有着显著区别。本发明从中选择了一条普遍存在并含量范围波动稳定的多肽作为标记肽，可用于检测市场上大多数CPP产品。为了克服多肽检测中的基质效应，本发明合成了同位素标记肽，提高了检测结果的稳定性。而且本发明通过一系列方法学验证，证实本方法在灵敏度、准确度和精密度方法面满足检测要求。

附图说明

图1为本发明中四种CPP产品的UPLC-Q-ToF色谱图。

图2本发明中蛋白质序列上每个氨基酸上CPP多肽的测得频率(横坐标为氨基酸序列的序号，纵坐标为多肽测得频率)。

图3为本发明中进样溶液中的不同乙腈含量对色谱行为的影响(上图为含量为60％乙腈、下图为含量为70％乙腈)。

图4为本发明中残差图(标准曲线实际测得值和拟合值之间的差)。

图5为本发明中标准曲线图[纵坐标是质谱信号(峰面积)，横坐标是浓度]。

具体实施方式

实施例1

1、获得CPP原料中标记肽

1.1 CPP原料中标记肽的鉴定

CPP是由牛奶中酪蛋白经酶解工艺生产的多肽总称。根据各个生产厂家的酶解工艺以及纯化工艺不同，所产出的CPP原料所包含的多肽种类也有可能不同。本实施例选择了市场上常见的四种CPP原料，将其用水配制成1％的溶液，并且用0.22μm微孔滤膜过滤后，用飞行时间质谱进行检测，其总离子色谱图见图1。应用蛋白质组学软件ProteinLynx GlobalServer Version 2.5(PLGS)软件对该色谱图与网上数据库进行分析比对。本实施例所比对的网上数据库为 Uniprot，将该数据库中的β酪蛋白(P02666)、αs1酪蛋白(P02662)、αs2酪蛋白(P02663)和κ酪蛋白(P02668)的序列输入PLGS软件后，搜索非特异性多肽碎片。

由于CPP的酶解工艺中大多采用复合酶技术，即采用多种酶对酪蛋白进行酶切，导致其酶切位点多样化，产生的酶切产物种类也非常丰富。例如A、B、 C三种CPP产品均可测得千余中多肽，最高者可达1629种，然而D产品仅能测得161种多肽，具体结果见1。

表1：测得多肽数量统计

通过对蛋白质序列上每个氨基酸在测得CPP多肽中出现的次数进行统计，可获得图2。各个公司产品中，氨基酸出现频率走势有着显著区别。以β酪蛋白为例，A公司和B公司所生产的CPP多肽主要来自于β酪蛋白70位-200位氨基酸；而C公司出产的CPP多肽主要来自70-105位、140-170位以及200-220 位氨基酸；D公司所提供的CPP测得多肽种类较少，所以其多肽测得频率也并不高。同样，各个公司的CPP多肽在αs1、αs2和κ酪蛋白上的测得频率也互不相同。

综合表1和图2的结果发现，不同公司、不同工艺制造出来的CPP所包含的多肽种类有着显著区别，因此可能难以找到一个多肽，使之可适用于各种公司的CPP产品。

1.2特异性多肽的确认

本实施例将四种CPP产品所测得的多肽进行互相比较，试图发现同时存在于四种CPP产品中的多肽作为标记物。比较结果发现，多肽GPFPIIV(序列号为 SEQ ID No.2)、TLTDVENLHLPLPL(序列号为SEQ ID No.3)与VLPVPQK(序列号为SEQ ID No.1)这三条多肽均存在于4种CPP产品中。这三条多肽均来自于β酪蛋白，其中SEQ ID No.2和SEQ ID No.1为胰蛋白酶酶切产物，SEQ ID No.3的并不包含胰蛋白酶酶切位点，可能是复合酶切产物。这些多肽在各种CPP 产品中含量差异很大，虽然上述多肽均可应用UPLC-Q-ToF在1％的CPP溶液中测得，但是将各CPP产品用水继续稀释成100μg/mL溶液，应用表所述方法进行检测，则在来自A公司的CPP溶液中无法测得SEQ ID No.2多肽，在来自 A和D公司的CPP溶液中无法测得SEQ ID No.3多肽。配方奶粉中CPP的常规添加量为0.2g/100g，在不对样品溶液中多肽进行富集的情况下，上述两个多肽的灵敏度不足，须对进行富集浓缩操作。样品溶液的富集浓缩过程一方面会增加工作量以及实验成本，另一方面可能增加检测结果的不稳定性，故上述两条多肽不适宜作为标记物使用。

其中SEQ ID No.1多肽在各个CPP产品中普遍存在，且含量相对稳定，在 CPP含量为100μg/mL的浓度下，均能够在色谱图上产生明显的色谱峰。来自4 个公司所提供的16批次CPP产品中SEQ ID No.1多肽含量分析结果见表2表。结果表明，由于不同的生产工艺，不同生产厂家的CPP产品中SEQ ID No.1多肽含量具有显著性差异。即使在同一公司所出产的不同批次CPP产品中SEQ ID No.1多肽含量也有所波动，这可能由于工艺的不稳定所导致的。

多肽SEQ ID No.1存在于所有被测样品中，可以作为CPP的标志物使用。而且该多肽在低浓度下依然能提供足够的灵敏度，适合用于检测配方奶粉中CPP 含量。同时检测配方奶粉和CPP原料中多肽SEQ ID No.1含量，两者相除的结果即为配方奶粉中CPP含量。

表2：各CPP产品中VLPVPQK多肽含量

1.3预处理方法的优化

配方奶粉中含有大量杂质，尤其是蛋白质会对检测结果以及色谱柱寿命造成很大的影响。通过将样品溶液的pH值调节至等电点4.6以去除酪蛋白。然而配方奶粉中主要蛋白质为乳清蛋白，其pH 4.6的缓冲液中无法沉淀去除，导致样品提取液难以通过0.22μm滤膜过滤，并且会缩短色谱柱使用寿命。

本发明利用蛋白质和标记肽在有机溶液中溶解度不同这一特性，在不溶解蛋白质的情况下提取样品中的标记肽。由于本实施例的液相色谱采用水/乙腈系统，所以配制了不同比例的乙腈水溶液来提取配方奶粉中的标记肽。0.1g样品在加入1mL各种不同比例的乙腈水溶液后，用涡旋仪和超声仪对其进行萃取。在溶解萃取过程中，配方乳粉在10～70％溶液中可均匀分散，形成溶液或悬浊液。在80％以上的乙腈溶液中，样品会迅速结成大块状，不利于萃取。样品经过离心后，当乙腈含量为10～50％时，样品中只有少量蛋白质沉淀，上清液依然是乳白色浑浊液体，难以用0.22μm滤膜过滤，可能是大量蛋白质依然存在于溶液中导致的，该溶液不宜进样分析。然而当乙腈含量大于60％时沉淀立即增多，且上清液透明，易于过滤。本实施例设计在0.1g空白配方乳粉中加入1mg/L的标记肽和同位素标记肽各50μL，用60-90％的乙腈水溶液萃取，离心、过滤、用水 1：1稀释后进样分析，60％和70％乙腈提取液中标记肽绝对回收率任然在80％左右；在用80％和90％乙腈提取液重复同样的实验，两者的绝对回收率掉至 10％以下。这可能是由于样品结块对标记肽和同位素标记肽有较强吸附作用所导致的。

然而进样溶液中含有高浓度的乙腈，会对色谱行为产生影响。当进样溶液中含有60％以下乙腈不时会对色谱行为造成影响；将乙腈比例提高至70％时，色谱峰出现明显的前沿，见图3。

综合考虑溶液的萃取能力、除蛋白质能力和液相色谱行为，本实施例选择了60％乙腈水溶液进行提取，提取液在经过离心过滤后可直接进样分析。

3.4内标的选择

以本实施例所选择的标记肽SEQ ID No.1用水配制成浓度为50μg/L的溶液，其峰面积仅为5492；用60％乙腈配制同样浓度的标准溶液，该峰面积上升为 8477。在选择了4种不同的空白配方乳粉和全脂乳粉作为基质，用60％乙腈溶液提取后，用该提取液配制同样浓度的标准溶液，其峰面积继续增加至 8997-10449之间(见表3)。标记肽易于在离子化过程中受到基质干扰而导致信号增益，所以应用外标法无法获得可靠准确的检测结果。

本实施例按照标记肽SEQ ID No.1的序列，设计了同位素标记肽 VL*PV*PQK，其中L*为[¹³C₆,¹⁵N]-亮氨酸，V*为[¹³C₆,¹⁵N]-缬氨酸。该同位素标记肽理论上具有与标记肽相同的理化性质，所以其在不同基质的信号波动可以得以校正，其内外标峰面积能够保持在1.30-1.38范围内(见表)，可提供精准的检测结果。

表3：内标法峰面积比和外标法峰面积统计

3.5方法学验证

在实际样品中，CPP在配方乳粉中的加入量通常为0.2～0.3％。本实施例将标记肽含量较低的A4样品用水配制成1％的溶液，取10、30或50μL加入到0.1g 空白配方乳粉中，使CPP干物质的含量占空白配方乳粉的0.1％、0.3％或0.5％，并静置过夜，用以模拟实际样品的加标水平。该样品经过预处理后进样分析，标准曲线见图5，其线性R²>0.99，各浓度点的残差均小于7％。通过CPP原料与加标样品中标记肽比例可计算出回收率(见表4)，其回收率均在99.0～101.5％之间，相对标准偏差(RSD)<5.7％。在低加标浓度0.1％的样品中，本方法依然能够提供100.6±5.7％的回收率。所以本方法在准确度、精密度和灵敏度方面均满足检测要求。

表4：回收率和精密度

3.6实际样品的检测

3.6.1以SEQ ID No.1为标准物质的检测

用SEQ ID No.1配制浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ng/mL的标准曲线，其中均含有同位素标记肽VL*PV*PQK 0.5ng/mL，液质分析后绘制标准曲线。

取同一厂家10个不同批次的样品进行检测，设计酪蛋白磷酸肽含量为1.5 g/kg。取0.1g样品，加入10μL同位素标记肽溶液和990μL乙腈/水溶液(60/40)，涡旋混匀后超声提取30分钟，于5000g离心10分钟。将上清液用0.22μm滤膜过滤后进样。检测结果代入标准曲线，计算特异肽SEQ ID No.1在奶粉样品中的浓度(见表5)。

取上述样品的酪蛋白磷酸肽原料0.1g，用10mL水溶解后，取10μL溶液，加入10μL同位素标记肽溶液和990μL乙腈/水溶液(60/40)，涡旋混匀后超声提取30分钟，于5000g离心10分钟。将上清液用0.22μm滤膜过滤后进样。检测结果代入标准曲线计算得特异肽SEQ IDNo.1的浓度，特异肽SEQ ID No.1 在奶粉中的浓度除以在原料中的浓度，即可计算得样品中酪蛋白磷酸肽含量(表 5)，由表5可知，检测结果符合预期。

表5

3.6.2以酪蛋白磷酸肽原料建立标准曲线的检测

取0.1g酪蛋白磷酸肽原料，溶解于1mL乙腈/水溶液(60/40)中。取上述原料，继续用乙腈/水溶液(60/40)稀释至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L，其中均含有同位素标记肽VL*PV*PQK 0.5ng/mL，液质分析后绘制标准曲线。

取同一厂家10个不同批次的样品进行检测，设计酪蛋白磷酸肽含量为1.5 g/kg。取0.1g样品，加入10μL同位素标记肽溶液和990μL乙腈/水溶液(60/40)，涡旋混匀后超声提取30分钟，于5000g离心10分钟。将上清液用0.22μm滤膜过滤后进样，检测结果代入标准曲线，计算酪蛋白磷酸肽在奶粉样品中的浓度(见表6)，由表6可知，检测结果符合预期。

表6

上述方法中的材料来源以及检测条件如下：

(1)试剂

甲酸，乙腈，[¹³C₆,¹⁵N]-亮氨酸(L*)，[¹³C₆,¹⁵N]-缬氨酸(V*)购自美国 Sigma-Aldrich公司。

标准物与内标：

标记肽VLPVPQK，同位素标记肽VL*PV*PQK，均由上海强耀公司合成。

(2)液相色谱条件

超高压液相色谱：Waters Acquity UPLC(美国)；

色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH300C18(填料1.7μm，内径2.1mm，长度100mm)；

流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；

流动相B：含0.1％甲酸的乙腈溶液；

流速：0.3mL/min；

梯度洗脱条件：流动相B在5分钟内从3％线性提升至40％。

(3)三重四级杆质谱条件

电离模式：ESI+；毛细管电压：3.5kV；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流量： 800L/min；锥孔反吹气流量：50L/h；碰撞室压力：3.0×10^-3mbar；低端分辨率 1：2.5V；高端分辨率1：15.0V；离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V；高端分辨率2：15.0V；离子能量2：1.0；离子源温度：150℃；提取器电压：3.0V；入口透镜电压：0.5V；出口电压：0.5V；碰撞梯度：1.0；其他质谱参数参见表 7。

表7：多反应监测参数

#号标记的子离子为定量子离子。

序列表

<110> 绿城农科检测技术有限公司

陈启

<120> 一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(unkonw)

<400> 1

Val Leu Pro Val Pro Gln Lys

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(unkonw)

<400> 2

Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(unkonw)

<400> 3

Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu

1 5 10

Claims

1.一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在配方奶粉样品中加入质量浓度为60～70％的乙腈水溶液，提取得到配方奶粉中的标记肽，通过液质联用检测标记肽的含量，得到配方奶粉中标记肽含量；

其中，所述标记肽的序列为VLPVPQK。

2.一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)在配方奶粉样品中加入质量浓度为60～70％的乙腈水溶液，提取得到配方奶粉中的标记肽，通过液质联用检测得到配方奶粉中标记肽含量，并将检测得到的配方奶粉中标记肽含量代入步骤(1)中所获得的标准曲线中，即可计算得到配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量；

其中，所述标记肽的序列为VLPVPQK。

3.如权利要求1或2所述的液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)和所述步骤(2)中均加入同位素标记的同位素标记肽作为内标，所述同位素标记肽的序列为VL*PV*PQK，其中L*为[¹³C₆，¹⁵N]-亮氨酸，V*为[¹³C₆，¹⁵N]-缬氨酸。

4.如权利要求3所述的液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，其特征在于，所述乙腈水溶液的质量浓度为60％。

5.如权利要求4所述的液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，其特征在于，使用乙腈水溶液提取所述标记肽时，加入乙腈水溶液混匀之后，超声提取30min，离心10min，取上清液用0.22μm滤膜过滤后得到进样样品液。

6.如权利要求5所述的液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法，其特征在于，所述液质联用检测系统为超高效液相色谱串联三重四级杆质谱。