TWI808975B - 使用質譜絕對定量低豐度多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了用於通過液相層析/質譜分析獲自簡單或複雜多肽混合物的肽產物而改善地無標記絕對定量相對低豐度多肽的方法。用於絕對定量的方法包括來自相對高豐度多肽的一組有資格的肽產物的離子的MS信號以改善相對低豐度多肽的定量。
Description
本申請要求2017年6月2日提交的美國臨時申請號62/514,587的優先權，其公開內容通過提述以其整體併入本文。
本發明提供了通過液相層析/質譜(LC/MS)分析獲自簡單或複雜多肽混合物的肽產物來絕對定量低豐度多肽的方法。
用於多肽定量的多種基於質譜(MS)的技術是業內已知的。例如，可以使用基於代謝的技術(例如，使用在細胞培養物中的胺基酸的穩定同位素標記(SILAC))、基於肽標準品的技術(例如，選擇的反應監控(SRM)和多反應監控(MRM))和基於標記的技術(例如，串聯質譜標簽(TMT))來定量多肽。這些方法具有充分記錄的缺點，諸如SILAC的有限樣品來源、SRM和MRM的廣泛開發和成本以及基於標記的技術的額外樣品處理和相對豐度的產率。
開發基於MS的無標記定量技術以簡化基於MS的多肽定量方法並避免一些上述限制。然而，目前無標記定量技術可能遭受低準確度和高可變性，並且大多數無標記技術可能僅提供兩個或更多個樣品之間的相對定量比(例如，光譜計數)。
用於基於MS的蛋白質的無標記絕對定量的一種方法涉及使用蛋白質標準品來產生單點校準量測，其應用於隨後的質譜分析以用於其他蛋白質的絕對定量。J.C.Silva et al.,Mol Cell Proteomics,5,144-56,2006；美國專利號8,271,207。然而，單點校準的使用和通過樣品 和蛋白質標準品的單獨酶消化產生的差異可能是該方法的定量可變性的主要來源。
因此，業內需要改進的基於MS的無標記絕對定量技術，其是靈敏的、準確的和精確的，並且可以高通量方式應用於多個多肽樣品。
本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，均通過提述以其整體併入。
本發明提供了用於無標記絕對定量樣品中的低豐度多肽的方法，所述樣品包含相對高豐度的另一種多肽。例如，本發明提供了用於定量培養系統中的低豐度宿主細胞蛋白質或其下游產物的方法，所述培養系統包含能夠產生重組多肽諸如治療性多肽的宿主細胞。該方法使用濃度和高豐度多肽的肽產物MS信號以及低豐度多肽的肽產物MS信號來計算低豐度多肽的絕對量。
在一態樣，本發明提供了用於絕對定量樣品中的第一多肽的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少10倍，所述方法包括：(a)使用液相層析/質譜(LC/MS)技術分析在多個樣品裝載量下的所述多個多肽的肽產物，以獲得在各所述多個樣品裝載量的所述多個多肽的肽產物離子的MS信號，其中所述多個樣品裝載量包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載量，並且其中所述第一樣品裝載量大於所述第二樣品裝載量；(b)對於以下各項計算MS信號的平均數或MS信號的總和：(i)在所述第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的(qualified)肽產物離子的組(A)；(ii)在所述第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；(iii)在所述第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；及(iv)在所述第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總 和計算；和(c)基於下式，確定在所述第一樣品裝載量下的所述第一多肽的絕對量：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物。
在另一態樣，本發明提供了用於絕對定量樣品中的第一多肽的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少10倍，所述方法包括：(a)獲得所述多個多肽的肽產物離子的MS信號，其中通過使用液相層析/質譜(LC/MS)技術分析所述多個多肽的肽產物而獲得所述肽產物離子的MS信號，其中獲得在包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載量的多個樣品裝載量中的每個下的所述肽產物的MS信號，並且其中所述第一樣品裝載量大於所述第二樣品裝載量；(b)對於以下各項計算MS信號的平均數或MS信號的總和：(i)在所述第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；(ii)在所述第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；(iii)在所述第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和(iv)在所述第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算；和(c)基於下式，在所述第一樣品裝載量中確定所述第一樣品的絕對定量：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物。
在一些實施例中，所述MS信號的平均數用於確定所述第一多肽的絕對定量。
在一些實施例中，所述MS信號的總和用於確定所述第一多肽的絕對定量。
在一些實施例中，所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組係基於來自所述多個樣品裝載量或所述第一樣品裝載量和/或 所述第二樣品裝載量的所述第二多肽的有資格的肽產物離子的定量誤差來選擇。
在另一態樣，本發明提供了用於選擇用於絕對定量樣品中的第一多肽的一組有資格的肽產物離子的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少10倍，所述方法包括：(a)使用液相層析/質譜(LC/MS)技術分析在多個樣品裝載量下的所述多個多肽的肽產物，以獲得在各所述多個樣品裝載量的所述多個多肽的肽產物離子的MS信號，其中所述多個樣品裝載量包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載量，並且其中所述第一樣品裝載量大於所述第二樣品裝載量；和(b)選擇所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物的離子的組，其中所述第二多肽的中間的有資格的肽產物的離子的組係基於來自所述多個樣品裝載量或所述第一樣品裝載量和/或所述第二樣品裝載量的所述第二多肽的有資格的肽產物的離子的定量誤差來選擇。在一些實施例中，所述方法進一步包括選擇在所述第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組。
在一些實施例中，所述前面的有資格的肽產物離子的組中的每個不同於所述中間的有資格的離子的組中的每個。
在一些實施例中，所述MS信號是電離強度或峰高度或峰面積或峰體積。
在一些實施例中，所述方法進一步包括獲得所述樣品。
在一些實施例中，所述樣品已經被純化或增濃。在一些實施例中，所述方法進一步包括處理所述樣品中的所述多個多肽以產生所述肽產物。在一些實施例中，處理所述樣品包括以下中一項或多項：(a)將所述樣品離心以分離所述多個多肽；(b)純化所述樣品中的所述多個多肽；(c)從所述樣品中去除與隨後的處理和質譜分析不相容的組分；(d)消化所述多個多肽以產生所述肽產物；和(e)純化所述肽產物。
在一些實施例中，所述LC/MS技術包括經由液相層析技術分離所述肽產物。
在一些實施例中，所述LC/MS技術包括處理獲得的所述肽產物的MS信號。
在一些實施例中，所述LC/MS技術進一步包括以下的一項或多項：(a)通過胺基酸序列鑑別所述肽產物；(b)通過蛋白質標識(identifier)鑑別所述第一多肽；和(c)通過蛋白質標識鑑別所述多個多肽中的一個或多個。
在一些實施例中，所述方法進一步包括確定所述第二多肽的絕對定量。
在一些實施例中，所述第一多肽是宿主細胞蛋白質或生物標記。在一些實施例中，所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少100倍。
在一些實施例中，所述第二多肽是由宿主細胞產生的重組多肽或治療性多肽或血清白蛋白。在一些實施例中，所述第二多肽是從轉染到宿主細胞(諸如哺乳動物宿主細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中的載體表現的。
在一些實施例中，所述樣品是細胞培養物樣品或血液或血清樣品或藥物產品或其中間體。
在一些實施例中，所述樣品中的所述多個多肽的肽產物是在使用LC/MS技術分析所述肽產物之前經由樣品消化獲得的。在一些實施例中，所述肽產物是所述多個多肽的胰蛋白酶肽產物。
在一些實施例中，所述多個樣品裝載量包含約0.1-25μg總蛋白的範疇內的樣品裝載量。在一些實施例中，所述第一樣品裝載量為約10μg總蛋白。在一些實施例中，所述第二樣品裝載量為約0.5μg至10μg，或者3μg至6μg或者1μg、2μg、3μg、4μg、5μg或6μg總蛋白。
在一些實施例中，所述方法進一步包括基於第二組肽產物的MS信號選擇所述第二樣品裝載量。
在一些實施例中，所述方法進一步包括基於第一組肽產物的MS信號選擇所述第一樣品裝載量。
在一些實施例中，所述多個樣品裝載量各具有相同總體積。
在一些實施例中，n為1或更大或者n為3。
在一些實施例中，m為1或更大或者m為3。
在一些實施例中，所述第二多肽的中間的有資格的肽產物的離子的組係基於各個所述肽產物的序列來選擇。
在另一態樣，本發明提供了用於在治療性多肽的產生中偵測汙染的多肽的方法，所述方法包括：(a)獲得包含所述治療性多肽的樣品；(b)確定所述汙染的多肽是否存在於所述樣品中；其中所述汙染的多肽的存在基於使用本文提供的定量方法絕對定量所述樣品中的所述汙染的多肽。
在另一態樣，本發明提供了用於絕對定量樣品中的第一多肽的系統，所述樣品包含所述第一多肽和第二多肽，所述系統包含：(a)質譜儀；(b)電腦，其包含：(c)包含儲存在其上的指令的非暫態電腦可讀媒體，當執行所述指令時進行包括以下的處理：對於以下各項計算MS信號的平均數或總和：(i)在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；(ii)在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；(iii)在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和(iv)在第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算；和基於下式，確定在第一樣品裝載量中所述第一樣品的絕對量：[(A)/(C)]*(在第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物。在一些實施例中，所述系統進一步包含液相層析儀。
在另一態樣，本發明提供了包含儲存在其上的指令的非暫態電腦可讀媒體，當執行所述指令時進行用於絕對定量樣品中的第一多肽的處理，所述樣品包含所述第一多肽和第二多肽，所述處理包括：對於以下各項計算MS信號的平均數或總和：(i)在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離 子的組(A)；(ii)在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；(iii)在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和(iv)在第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算；和基於下式，確定在第一樣品裝載量中的所述第一多肽的絕對量：[(A)/(C)]*(在第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物(mathematical equivalents)。
本發明的這些和其他態樣以及優點會從隨後的詳細描述和所附發明申請專利範疇變得顯而易見。應該理解，本文所述的多種實施例的一個、一些或所有性質可被組合以形成本發明的其他實施例。
圖1顯示了從在不同樣品裝載量下的包含鞘磷脂磷酸二酯酶(ASM)的樣品的LC/MS分析中觀察到的40種最大豐度的肽產物離子的MS峰面積的直方圖(對於每個肽產物柱組，每LC/MS分析的樣品裝載量按1μg、2.5μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg、15μg、18μg和20μg從左至右排序)。每個肽產物離子的遍及所有樣品裝載量的平均百分比誤差顯示在肽產物柱組上。
圖2顯示了六個濃度點上的中間3個肽產物的組(中間-3個；正方形)和前面3個肽產物的組(前面-3個；菱形)的加和的峰面積。中間-3個種肽產物的線性回歸的R2為0.98，前面-3個肽產物的R2為0.87。
圖3A-3B顯示了在四種不同的測定場合(場合A、場合B、場合C、場合D)對於四個樣品(批次1、批次2、批次3、批次4，對於每個柱組從左到右)的Hi-3(圖3A)和Mid-3(圖3B)定量方法的比較。Hi-3方法(圖3A)的相對標準偏差為82%，Mid-3方法(圖3B)的相對標準偏差為16%。
圖4顯示了在遍及多種治療性蛋白質生產批次中前8個鑑別的宿主細胞蛋白質的相對豐度。
圖5顯示了在遍及治療性蛋白質的純化過程的各階段中鑑別的宿主細胞蛋白質的相對豐度。
本發明提供了用於絕對定量樣品中的第一多肽的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，所述方法包括基於對於以下各項的MS信號的平均數或MS信號的總和確定所述樣品中的所述第一多肽的絕對量：在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和在第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算。在一些實施例中，在所述樣品中，所述第一多肽的豐度低於第二多肽的豐度。在一些實施例中，第一多肽的絕對量通過下式確定：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]。本發明的方法在本文中也稱為Mid-3。如本文所使用的，當提及離子時，“有資格的”指適合於本文所述的定量方法的肽產物離子。在一些實施例中，有資格的肽產物離子排除非胰蛋白酶肽產物離子或具有飯以後修飾的肽產物離子。
本文所述的本發明的方法提供了與業內已知的無標記絕對定量方法(例如，Hi-3；J.C.Silva et al.,同上)相比，例如在樣品中多肽濃度的較大動態範疇內的多肽定量的改善的準確性和再現性。不希望受理論束縛，無標記絕對定量方法基於以下發現，假設樣品中多個多肽中的每一個等莫耳量，來自多肽的前面n個最大豐度的肽產物離子的平均MS偵測器響應在多個多肽中的每一個中是相似的(即，肽產物濃度與偵測器響應相關)。因此，可以通過與已知濃度的標準多肽比較來確定未知濃度的多肽的量。然而，使用多肽標準物的最大豐度的肽產 物離子用於絕對定量可能導致差的準確性和再現性。例如，由於觀察到由於MS偵測器飽和而觀察到的前幾個離子化肽產物的非線性行為，可能出現定量不準確性。此外，這樣的方法可依賴於摻入已知量的標準多肽或在LC/MS中與含有未知濃度的所述多肽的所述樣品分開單獨分析已知量的標準蛋白質樣品。兩種方法都可能導致定量準確度降低和可變性增加。例如，可重複地將已知量的標準多肽等分成任何數量的樣品可能是具有挑戰性的，並且校準基於在與含有所述未知多肽的樣品分開單獨的酶反應中消化的標準多肽的定量計算，可以基於消化完成的程度而產生額外的變化。
本發明提供了整合元素以實現多肽定量的改善的準確性和再現性的定量方法。首先，本發明的絕對定量方法利用包含具有已知濃度的多肽的多肽樣品系統，並且所述已知濃度的多肽相對於所述樣品中的其他多肽是高豐度的(例如，製造性樣品中的治療性蛋白質或者血清樣品中的白蛋白)，並且不需要與摻入的或單獨分析的標準多肽進行比較。其次，本發明的絕對定量方法使用兩種濃度的MS量測以避免高豐度多肽的前面n個肽產物離子的MS偵測器飽和。第三，本發明的絕對定量方法進一步利用與前幾個肽相比具有降低的定量誤差的中間肽產物離子的組，以減少總體定量誤差。在與業內已知的無標記絕對定量方法(即Hi-3)的直接比較中證明了本發明的方法的優點。例如，如實例2中所示，遍及一系列測定和樣品中，本發明中所公開的方法實現16%的相對標準偏差，而Hi-3方法具有82%的相對標準偏差。
如下面更詳細討論的，本發明提供了基於MS的無標記絕對定量低豐度多肽(例如第一多肽)的方法，所述方法使用來自具有已知濃度並且相對豐度高於所述低豐度多肽的另一多肽(例如，第二多肽)的資訊，所述方法包括以下任何一項或多項：(a)進行裝載研究以確定兩個樣品裝載濃度(例如，第一樣品裝載量和第二樣品裝載量)，在所述裝載濃度下獲得和/或分析用於定量低豐度多肽的資料；(b)選擇用於多肽定量的有資格的肽產物離子(例如，所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組，所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組，和所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組)；和(c)使 用MS信號(例如，來自所述第一多肽和所述第二多肽的肽產物的MS信號)確定低豐度多肽的絕對多肽量。
本發明提供了用於在測定的所需的動態範疇內進行樣品的裝載研究的方法。從裝載研究獲得的MS信號資訊允許例如第一樣品裝載量的選擇，其中第一多肽的肽產物是可偵測的(第一多肽相對於第二多肽是低豐度的)；第二樣品裝載量的選擇，其中所述第二多肽的前面n個有資格的最高豐度的肽產物離子不會使MS偵測器飽和；以及第一樣品裝載量和第二樣品裝載量的選擇，其中所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組表現出降低的定量誤差(即，相對於最大豐度的肽產物離子增加的線性行為)。
在一些實施例中，所述方法包括使用液相層析/質譜(LC/MS)技術分析在多個樣品裝載量下的多個多肽的肽產物，以獲得在各所述多個樣品裝載量的所述多個多肽的肽產物離子的MS信號，其中所述多個樣品裝載量包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載量，並且其中所述第一樣品裝載量大於所述第二樣品裝載量。在一些實施例中，所述MS信號是電離強度。在一些實施例中，所述MS信號是峰高度。在一些實施例中，所述MS信號是峰面積。在一些實施例中，所述MS信號是峰體積。
在一些實施例中，從裝載研究獲得的資訊可以應用於隨後的樣品分析用於定量多肽(例如，選擇2個樣品裝載量用於經由LC/MS技術的另外的樣品分析)。
在一些實施例中，所述多個樣品裝載量包含至少2個樣品裝載量。在一些實施例中，所述多個樣品裝載量包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個樣品裝載量。
樣品裝載量可以根據使用的LC/MS儀器而變化(例如，基於層析柱的負載能力)。在一些實施例中，所述多個樣品裝載量包括在約0.1μg至約100μg、約0.1μg至約75μg、約0.1μg至約50μg、約0.1μg至約40μg、約0.1μg至約30μg、約0.1μg至約20μg、約0.1μg至約15μg、 約0.1μg至約10μg、約1μg至約30μg、約1μg至約20μg、約1μg至約15μg或約1μg至約10μg的範疇內的樣品裝載量。
在一些實施例中，所述樣品裝載量為約0.5μg、約1μg、約1.5μg、約2μg、約2.5μg、約3μg、約3.5μg、約4μg、約4.5μg、約5μg、約5.5μg、約6μg、約6.5μg、約7μg、約7.5μg、約8μg、約8.5μg、約9μg、約9.5μg、約10μg、約10.5μg、約11μg、約11.5μg、約12μg、約12.5μg、約13μg、約13.5μg、約14μg、約14.5μg、約15μg、約16μg、約17μg、約18μg、約19μg、約20μg、約21μg、約22μg、約23μg、約24μg、約25μg、約26μg、約27μg、約28μg、約29μg或約30μg。
在一些實施例中，所述多個樣品裝載量包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載量，其中所述第一樣品裝載量為約10μg，並且其中所述第二樣品裝載量為約0.5μg至10μg,或者3μg至6μg,或者1μg、2μg、3μg、4μg、5μg或6μg。
在一些實施例中，基於第一多肽的肽產物的MS信號選擇第一樣品裝載量。在一些實施例中，基於第二多肽的肽產物的MS信號選擇第一樣品裝載量。在一些實施例中，基於第一多肽的肽產物的MS信號和第二多肽的肽產物的MS信號選擇第一樣品裝載量。
在一些實施例中，基於第二多肽的肽產物的MS信號選擇第二樣品裝載量。
在一些實施例中，在裝載研究中分析的隨後的樣品裝載量基於來自先前分析的樣品裝載量的資料。
每個樣品裝載量的體積可以根據所使用的LC/MS儀器(例如，基於樣品環的大小)而變化。在一些實施例中，多個樣品裝載量中的每一個具有相同的總體積。在一些實施例中，多個樣品裝載量中的每一個的體積為約1μL至約60μL、約10μL至約60μL、約20μL至約50μL或約30μL至約50μL。在一些實施例中，多個樣品裝載量中的每一個的體積相同並且為約約1μL至約60μL、約10μL至約60μL、約20μL至約50μL或約30μL至約50μL。在一些實施例中，多個樣品裝載量中的每一個的體積為約5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL或60μL。
本發明提供了用於選擇用於絕對定量樣品中的第一多肽的有資格的肽產物離子的組的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度相對於所述第二種多肽的豐度較低。例如，本發明提供了用於選擇以下任何一項的方法：第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組，第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組，和第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組。
在一些實施例中，本發明的方法包括選擇在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組。
在一些實施例中，本發明的方法包括選擇在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組。
多肽的MS可識別的肽產物的數量可以根據多肽的濃度和特徵而變化。在一些實施例中，第一多肽的濃度和特徵可以導致在第一樣品裝載量下鑑別有限數量的肽產物。在一些實施例中，n為1或更大，其中n為整數。在一些實施例中，n為3。在一些實施例中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些實施例中，具有最高MS信號的有資格的肽產物離子可排除具有某些特徵的肽產物離子，包括例如錯過的酶促切割、翻譯後的修飾以及重疊的LC溶離譜(overlapping LC elution profiles)和同位素分佈。例如，如果用胰蛋白酶消化樣品並且具有最高MS信號的肽產物是非胰蛋白酶肽產物，則該肽產物可以從第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組或第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組的選擇中排除。在一些實施例中，具有最高MS信號的有資格的肽產物離子可排除源自多肽的部分的肽產物離子，該多肽的部分不可再現地作為起始多肽的一部分存在(例如，肽產物源自多肽的切割產物，因此可能不以與起始多肽相同的濃度存在於樣品中)。
在一些實施例中，本發明的方法包括選擇第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組，其中第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組係基於來自多個樣品裝載量或第一樣品裝載量和/或第二樣品裝載量的第二多肽的有資格的肽產物離子的定量誤差來選擇。一般地，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的每個肽產物離子基於相對於第二多肽的總的肽產物離子的組具有最低定量誤差來選擇。在一些實施例中，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的每個肽產物離子具有比第二多肽的最大豐度的肽產物離子更低的定量誤差。在一些實施例中，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的肽產物離子具有比具有最高MS信號的第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組更低的定量誤差。
在一些實施例中，具有最低定量誤差的有資格的肽產物離子可以排除具有某些特徵的肽產物離子，包括例如錯過的酶促切割、翻譯後的修飾和重疊的LC溶離譜和同位素分佈。例如，在一些實施例中，如果用胰蛋白酶消化樣品並且具有最低定量誤差的肽產物是非胰蛋白酶肽產物，則該肽產物可以從第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的選擇中排除。在一些實施例中，具有最高MS信號的有資格的肽產物離子可以排除源自多肽的部分的肽產物離子，該多肽的部分不可再現地作為起始多肽的一部分存在(例如，肽產物源自多肽的切割產物，因此可以不以與起始多肽相同的濃度存在於樣品中)。
在一些實施例中，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的選擇基於從裝載研究獲得的定量誤差。在一些實施例中，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的選擇基於從多個樣品裝載量獲得的定量誤差。在一些實施例中，定量誤差是多個樣品裝載量的平均百分比誤差。在一些實施例中，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的選擇基於從第一樣品裝載量獲得的定量誤差。在一些實施例中，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的選擇基於從第二樣品裝載量獲得的定量誤差。在一些實施例中，第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組的選擇基於從第一樣品裝載量和第二樣品裝載量獲得的定量誤差。
在一些實施例中，m為1或更大，其中m為整數。在一些實施例中，m為3。在一些實施例中，m為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些實施例中，n等於m。在一些實施例中，n不等於m。在一些實施例中，n和m為2或更大，其中n和m為整數。在一些實施例中，n和m為3。
在一些實施例中，第二多肽的前面有資格的肽產物離子的組中的每一個不同於第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組中的每一個。在一些實施例中，有資格的肽產物離子是第二多肽的前面有資格的肽產物離子的組和第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組的成員。
在一些實施例中，有資格的肽產物離子包含脲基甲基化半胱胺酸。在一些實施例中，有資格的肽產物離子包含羧甲基化半胱胺酸。
本發明提供了用於計算樣品中第一多肽的絕對多肽量的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，所述方法包括基於對於以下各項的MS信號的平均數或總和來確定所述樣品中的所述第一多肽的絕對量：在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；(ii)在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和在第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算。
在一些實施例中，第一多肽的絕對量基於下式確定：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物。
在一些實施例中，A、B、C和D全部使用MS信號的平均數計算。在一些實施例中，A、B、C和D全部使用MS信號的總和來計算。
在一些實施例中，所述MS信號是電離強度。在一些實施例中，所述MS信號是峰高度。在一些實施例中，所述MS信號是峰面積。在一些實施例中，所述MS信號是峰體積。
在一些實施例中，預先確定具有最高MS信號的第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組。在一些實施例中，預先確定具有最高MS信號的第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組。在一些實施例中，預先確定第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組。在一些實施例中，預先確定在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)與在第二樣品裝載量下的第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)的比率。
在一些實施例中，從樣品的2個LC/MS分析確定對於以下各項的MS信號的平均數或總和：在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和在第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)。在一些實施例中，進行2個LC/MS分析的額外的一式兩份的分析。
在一些實施例中，從樣品的2個LC/MS分析確定對於以下各項的MS信號的平均數或總和：在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和在第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中LC/MS分析不是裝載研究的一部分。在一些實施例中，進行2個LC/MS分析的額外的一式兩份的分析。
在一些實施例中，定量方法包括來自兩個或更多個已知量的多肽的MS信號。
在一些實施例中，該方法進一步包括確定第二多肽的絕對量。確定第二多肽的蛋白質量的方法包括例如ELISA和西方墨點法。
考慮到可以使用本發明的方法鑑別和定量每個測定中多於一種未知濃度的多肽。例如，從上面公開的等式，在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)可以用在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的另一種多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組替換，以計算所述其它多肽的量。
本發明的方法可用於絕對定量樣品中的第一多肽，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度相對於所述第二多肽的豐度較低。
在一些實施例中，第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少10倍。在一些實施例中，第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少100倍。在一些實施例中，第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少1000倍。在一些實施例中，第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少約2倍至約1x109倍。例如，第一種多肽的量測的量為十億分之一。
在一些實施例中，第二多肽的豐度比第一多肽的豐度大至少約10倍。在一些實施例中，第二多肽的豐度比第一多肽的豐度大至少約100倍。在一些實施例中，第二多肽的豐度比第一多肽的豐度大至少約1000倍或1x109倍。在一些實施例中，第二多肽的豐度比第一多肽的豐度大至少約2倍至約1x109倍。
產生用於經由LC/MS技術進行分析的樣品中的多個多肽的肽產物樣品製備技術是業內已知的。
在一些實施例中，在使用LC/MS技術分析肽產物之前，經由樣品消化獲得樣品中多個多肽的肽產物。在一些實施例中，樣品消化包括使用蛋白酶的酶消化。在一些實施例中，酶消化使用胰蛋白酶、Lys-C、IdeS、IdeZ、PNGase F、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶、彈性 蛋白酶、Arg-C、TEV、Glu-C、Asp-N和因子Xa中的一個或多個進行。在一些實施例中，樣品中的多個多肽的肽產物是胰蛋白酶的肽產物。
在一些實施例中，樣品消化包括化學消化，諸如酸水解。
在一些實施例中，該方法包括獲得樣品。用於獲得用於LC/MS分析的樣品的技術是業內已知的，並且包括例如組織(例如，血液、血漿)收集和細胞培養。
在一些實施例中，樣品已經被純化或增濃。在一些實施例中，所述方法包括處理樣品中的多個多肽以產生肽產物。在一些實施例中，處理樣品中的多個多肽包括以下中一項或多項：(a)將所述樣品離心以分離所述多個多肽；(b)純化所述樣品中的所述多個多肽；(c)從所述樣品中去除與隨後的處理和質譜分析不相容的組分；(d)消化所述多個多肽以產生所述肽產物；和(e)在LC/MS之前純化所述肽產物。
在一些實施例中，所述第一多肽是宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，所述第二多肽是由宿主細胞產生的重組多肽。在一些實施例中，所述第二多肽是治療性多肽，諸如抗體(例如重組抗體)，或酶(例如，重組酶)，或肽(例如，胰島素)。在一些實施例中，所述第二多肽是病毒蛋白，諸如病毒顆粒的殼體(例如，諸如用於基因治療的)。在一些實施例中，所述樣品是細胞培養物樣品。在一些實施例中，所述樣品是藥物產品或其中間體。
在一些實施例中，所述第一多肽是生物標記，諸如循環生物標記。在一些實施例中，所述第二多肽是血清白蛋白。在一些實施例中，所述樣品是血液或血清樣品。
本發明考慮用於產生包含多個多肽的樣品的串聯質譜的多種LC/MS技術，所述多個多肽包含第一多肽和第二多肽。
在一些實施例中，LC/MS技術包括經由液相層析技術分離肽產物。本申請考慮的液相層析技術包括用於分離多肽的方法和與質譜技術兼容的液相層析技術。在一些實施例中，液相層析技術包括高效液相層析技術。因此，在一些實施例中，液相層析技術包括超高效液相層析技術。在一些實施例中，液相層析技術包括高流(high-flow) 液相層析技術。在一些實施例中，液相層析技術包括低流(low-flow)液相層析技術，諸如微流液相層析技術或納米流液相層析技術。在一些實施例中，液相層析技術包括與質譜儀結合的在線液相層析技術。在一些實施例中，在線液相層析技術是高效液相層析技術。在一些實施例中，在線液相層析技術是超高效液相層析技術。
在一些實施例中，毛細管電泳(CE)技術，或電噴霧或MALDI技術可用於將樣品引到質譜儀。
在一些實施例中，質譜技術包括電離技術。本申請考慮的電離技術包括能夠使多肽和肽產物帶電荷的技術。因此，在一些實施例中，電離技術是電噴霧電離。在一些實施例中，電離技術是納米電噴霧電離。在一些實施例中，電離技術是大氣壓化學電離。在一些實施例中，電離技術是大氣壓光致電離。在一些實施例中，電離技術是基質輔助雷射解吸電離(MALDI)。在一些實施例中，質譜技術包括電噴霧電離、納米電噴霧電離或基質輔助雷射解吸電離(MALDI)技術。
在一些實施例中，LC/MS技術包括經由質譜技術分析肽產物。本發明考慮的與在線層析技術結合的質譜儀包括高分辨率質譜儀和低分辨率質譜儀。因此，在一些實施例中，質譜儀是飛行時間(TOF)質譜儀。在一些實施例中，質譜儀是四極飛行時間(Q-TOF)質譜儀。在一些實施例中，質譜儀是四極離子阱飛行時間(QIT-TOF)質譜儀。在一些實施例中，質譜儀是離子阱。在一些實施例中，質譜儀是單四極杆。在一些實施例中，質譜儀是三重四極杆(QQQ)。在一些實施例中，質譜儀是軌道阱(orbitrap)。在一些實施例中，質譜儀是四極杆軌道阱。在一些實施例中，質譜儀是傅裡葉變換離子回旋共振(FT)質譜儀。在一些實施例中，質譜儀是四極杆傅立葉變換離子回旋共振(Q-FT)質譜儀。在一些實施例中，質譜技術包括正離子模式。在一些實施例中，質譜技術包括負離子模式。在一些實施例中，質譜技術包括飛行時間(TOF)質譜技術。在一些實施例中，質譜技術包括四極杆飛行時間(Q-TOF)質譜技術。在一些實施例中，質譜技術包括離子淌度質譜技術。在一些實施例中，低分辨率質譜技術，諸如離子阱，或單或三重四極杆方法是合適的。
在一些實施例中，LC/MS技術包括處理所獲得的肽產物的MS信號。在一些實施例中，LC/MS技術包括峰值偵測。在一些實施例中，LC/MS技術包括確定肽產物的電離強度。在一些實施例中，LC/MS技術包括確定肽產物的峰高度。在一些實施例中，LC/MS技術包括確定肽產物的峰面積。在一些實施例中，LC/MS技術包括確定肽產物的峰體積。在一些實施例中，LC/MS技術包括通過胺基酸序列鑑別肽產物。在一些實施例中，LC/MS技術包括手動驗證肽產物胺基酸序列分配。在一些實施例中，LC/MS技術包括通過蛋白質標識鑑別第一多肽。在一些實施例中，LC/MS技術包括通過蛋白質標識鑑別多個多肽中的一個或多個，這可以在資料庫檢索或文庫檢索中鑑別。
在一些實施例中，可以使用譜庫(spectral library)實現多肽的肽產物的鑑別。通常，譜庫的使用允許輸入所得關於多肽系統的知識，並導致增加的資料分析速度和減少的誤差。
本文公開的基於MS的無標記絕對定量方法尤其適用於包括對包含低豐度多肽和另一相對高豐度的多肽的樣品中的低豐度多肽進行定量的用途。本文公開的基於MS的無標記絕對定量方法可以例如構成多步過程中的單個步驟，諸如在治療性蛋白質的純化中對低豐度蛋白質的定量。
在一些實施例中，本發明提供偵測治療性多肽的產生中汙染的多肽的方法，所述方法包括：(a)獲得包含所述治療性多肽的樣品；(b)確定所述汙染的多肽是否存在於所述樣品中；其中所述汙染的多肽的存在基於使用本文所公開的方法絕對定量所述樣品中的所述汙染的多肽。在一些實施例中，汙染的多肽是宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，第二多肽是治療性多肽。在一些實施例中，在樣品中偵測到多於一種汙染的多肽(例如，和定量樣品中汙染的多肽的總量)。在一個實施例中，在重組多肽(例如，治療性多肽)的產生過程期間的多個步驟中獲取樣品，以測定多個步驟中的重組多肽的純度。鑑別的汙染的多肽(例如宿主細胞多肽)的量越低，會表明重組多肽的純度越高。
在一些實施例中，本發明提供產生治療性多肽的方法，所述方法包括：(a)從產生過程的階段(例如細胞培養物收穫或純化步驟)獲得包含治療性多肽的樣品；(b)鑑別樣品中汙染的多肽；(c)確定樣品中汙染的多肽的水準，其中汙染的多肽的水準基於使用本文所公開的方法絕對定量樣品中汙染的多肽。在一些實施例中，汙染的多肽是宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，第二多肽是治療性多肽。在一些實施例中，在樣品中偵測到多於一種汙染的多肽(例如，和定量樣品中汙染的多肽的總量)。在一個實施例中，在重組多肽(例如，治療性多肽)的產生過程期間的多個步驟中獲取樣品，以測定多個步驟中的重組多肽的純度。鑑別的汙染的多肽(例如宿主細胞多肽)的量越低，會表明重組多肽的純度越高。
在一些實施例中，本發明提供純化治療性多肽的方法，所述方法包括：(a)從純化過程的一個或多個階段(例如細胞培養物收穫或純化步驟)獲得包含治療性多肽的樣品；(b)鑑別樣品中汙染的多肽；(c)確定純化過程的一個或多個階段的樣品中汙染的多肽的水準，其中汙染的多肽的水準基於使用本文所公開的方法絕對定量樣品中汙染的多肽。在一些實施例中，汙染的多肽是宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，第二多肽是治療性多肽。在一些實施例中，在樣品中偵測到多於一種汙染的多肽(例如，和定量樣品中汙染的多肽的總量)。在一個實施例中，在重組多肽(例如，治療性多肽)的產生過程期間的多個步驟中獲取樣品，以測定多個步驟中的重組多肽的純度。鑑別的汙染的多肽(例如宿主細胞多肽)的量越低，會表明重組多肽的純度越高。
在一些實施例中，本發明提供偵測基因治療產品中汙染的多肽的方法。所述方法包括例如(a)從純化過程的一個或多個階段(例如細胞培養物收穫或純化步驟)獲得包含基因治療載體的樣品；(b)鑑別樣品中汙染的多肽；(c)確定純化過程的一個或多個階段的樣品中汙染的多肽的水準，其中汙染的多肽的水準基於使用本文所公開的方法絕對定量樣品中汙染的多肽。在一些實施例中，基因治療產品與病毒蛋 白質(諸如殼體)相關。在一些實施例中，基因治療產品包含病毒蛋白質，諸如殼體。在一些實施例中，基因治療載體與病毒蛋白質(諸如殼體)相關。在一些實施例中，基因治療載體是包含病毒蛋白質(諸如殼體)的病毒顆粒的一部分。在一些實施例中，汙染的多肽是宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，汙染的多肽是與基因治療產品不相關的病毒蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽為不是基因治療產品的一部分的病毒蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是輔助病毒蛋白質。在一些實施例中，第二多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，在樣品中偵測到多於一種汙染的多肽(例如，和定量樣品中汙染的多肽的總量)。在一個實施例中，在基因治療產品的產生過程期間的多個步驟取得樣品，以測定多個步驟的基因治療產品的純度。鑑別的汙染的多肽(例如宿主細胞多肽)的量越低，會表明基因治療產品的純度越高。
在一些實施例中，本發明提供了產生基因治療產品的方法。所述方法包括例如(a)從純化過程的一個或多個階段(例如細胞培養物收穫或純化步驟)獲得包含基因治療載體的樣品；(b)鑑別樣品中汙染的多肽；(c)確定純化過程的一個或多個階段的樣品中汙染的多肽的水準，其中汙染的多肽的水準基於使用本文所公開的方法絕對定量樣品中汙染的多肽。在一些實施例中，基因治療產品與病毒蛋白質(諸如殼體)相關。在一些實施例中，基因治療產品包含病毒蛋白質，諸如殼體。在一些實施例中，基因治療載體與病毒蛋白質(諸如殼體)相關。在一些實施例中，基因治療載體是包含病毒蛋白質(諸如殼體)的病毒顆粒的一部分。在一些實施例中，汙染的多肽是宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽為與基因治療產品不相關的病毒蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽為不是基因治療產品的一部分的病毒蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是輔助病毒蛋白質。在一些實施例中，第二多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，在樣品中偵測到多於一種汙染的多肽(例如，和定量樣品中汙染的多肽的總 量)。在一個實施例中，在基因治療產品的產生過程期間的多個步驟取得樣品，以測定多個步驟的基因治療產品的純度。鑑別的汙染的多肽(例如宿主細胞多肽)的量越低，會表明基因治療產品的純度越高。
在一些實施例中，本發明提供了純化基因治療產品的方法。所述方法包括例如(a)從純化過程的一個或多個階段(例如細胞培養物收穫或純化步驟)獲得包含基因治療載體的樣品；(b)鑑別樣品中汙染的多肽；(c)確定純化過程的一個或多個階段的樣品中汙染的多肽的水準，其中汙染的多肽的水準基於使用本文所公開的方法絕對定量樣品中汙染的多肽。在一些實施例中，基因治療產品與病毒蛋白質(諸如殼體)相關。在一些實施例中，基因治療產品包含病毒蛋白質，諸如殼體。在一些實施例中，基因治療載體與病毒蛋白質(諸如殼體)相關。在一些實施例中，基因治療載體是包含病毒蛋白質(諸如殼體)的病毒顆粒的一部分。在一些實施例中，汙染的多肽是宿主細胞蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，汙染的多肽是與基因治療產品不相關的病毒蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽為不是基因治療產品的一部分的病毒蛋白質。在一些實施例中，汙染的多肽是輔助病毒蛋白質。在一些實施例中，第二多肽是病毒蛋白質，諸如殼體蛋白。在一些實施例中，在樣品中偵測到多於一種汙染的多肽(例如，和定量樣品中汙染的多肽的總量)。在一個實施例中，在基因治療產品的產生過程期間的多個步驟取得樣品，以測定多個步驟的基因治療產品的純度。鑑別的汙染的多肽(例如宿主細胞多肽)的量越低，會表明基因治療產品的純度越高。
在一些實施例中，本文公開的方法進一步包括基於汙染的多肽的存在而調整方案。例如，可基於鑑別和定量的汙染的多肽的存在而調整純化過程。此類調整提供了用於改善靶多肽(諸如治療性多肽)的純度的方法。
在一些實施例中，本發明提供了治療個體中的疾病的方法，其中基於所述個體中的生物標記的量選擇個體進行治療。在一些實施例中，在血清樣品中定量生物標記。在一些實施例中，第一多肽是生物標記。在一些實施例中，第二多肽是血清白蛋白。
在一些實施例中，本發明提供了評估個體中的疾病的方法，其中基於所述個體中的生物標記的量評估所述個體。在一些實施例中，在血清樣品中定量生物標記的量。在一些實施例中，第一多肽是生物標記。在一些實施例中，第二多肽是血清白蛋白。
在一些實施例中，本發明提供了診斷個體中的疾病的方法，其中基於所述個體中的生物標記的量診斷所述個體患有該疾病。在一些實施例中，在血清樣品中定量生物標記的量。在一些實施例中，第一多肽是生物標記。在一些實施例中，第二多肽是血清白蛋白。
本發明提供了用於確定包含多個多肽的樣品中第一多肽的絕對多肽量的系統和非暫態電腦可讀媒體，所述多個多肽包含第一多肽和第二多肽。
在一些實施例中，本發明提供了用於絕對定量樣品中的第一多肽的系統，所述樣品包含所述第一多肽和第二多肽，所述系統包含：(a)質譜儀；(b)電腦，其包含；(c)包含儲存在其上的指令的非暫態電腦可讀媒體，當執行所述指令時進行包括以下的處理：對於以下各項計算MS信號的平均數或總和用於：(i)在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；(ii)在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；(iii)在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和(iv)在第二樣品裝載量的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算；和基於下式，確定在第一樣品裝載量中的所述第一樣品的絕對量：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物。在一些實施例中，所述系統進一步包含液相層析儀。
在一些實施例中，本發明提供了包含儲存在其上的指令的非暫態電腦可讀媒體，當執行所述指令時進行用於絕對定量樣品中的第一多肽的處理，所述樣品包含所述第一多肽和第二多肽，所述處 理包括：對於以下各項計算MS信號的平均數或總和：(i)在第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(A)；(ii)在第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組(B)；(iii)在第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組(C)；和(iv)在第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算；和基於下式，確定在第一樣品裝載量中的所述第一樣品的絕對量：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等值。
熟習此項技術者會認識到，在本發明的範疇和精神內，一些實施例是可能的。現在會參考以下非限制性實例更詳細地描述本發明。以下實例進一步示例說明本發明，但當然不應被解釋為以任何方式限制其範疇。
如本文所使用的，術語“多肽”指包含經由肽鍵共價連接的胺基酸的聚合物。在一些實施例中，所述多肽是蛋白質。在一些情況下，蛋白質包含兩個或更多個多肽(例如，多聚體蛋白質、同聚體蛋白質(homomeric protein)、多蛋白複合體)。多肽可進一步用非胺基酸部分修飾。例如，多肽可進一步包含酶介導的修飾和/或化學修飾(例如，乙醯化、磷酸化、泛素化、甲醯化、醣基化、氧化)。這樣的修改可發生，例如在基於細胞的環境中或作為樣品處理和/或分析技術的結果。
如本文所使用的，術語“肽產物”指在多肽的分解處理之後獲得的包含經由肽鍵共價連接的兩個或更多個胺基酸的聚合物。例如，在包括化學消化(例如，酸水解)或酶消化(例如，胰蛋白酶消化)在內的多肽的分解處理之後獲得肽產物。在一些實施例中，肽產物是胰蛋白酶肽。在一些實施例中，肽產物是較大多肽的末端片段。在一些實施例中，肽產物是多肽的內部片段。
本文所使用的術語“包含”意指任選地存在其它組分、成分、步驟等。例如，包含組分A、B和C的製品可以由(即，僅含有)組分A、B和C組成，或者可以不但含有組分A、B和C，而且含有一個或多個其他組分。應當理解的是，“包含”及其語法等同物包括“由......組成”或“基本上由......組成”。
在提供數值範疇的情況下，應當理解的是，除非上下文另有明確規定，否則在該範疇的上限值和下限值之間的為下限值的單位的十分之一的每個中間值以及該所述的範疇內的任何其他所述的或中間值涵蓋在本公開內，受限於在該所述的範疇中的任何具體排除的限制。在該聲明的範疇包括限值中的一者或兩者的情況下，排除那些所包含的限值中的任一者或兩者的範疇也包括在本公開中。
本文提及“約”一個值或參數包括(並描述)針對該值或參數本身的變化。例如，提及“約X”的描述包括“X”的描述。
如本文和所附申請專利範圍中所使用的單數形式“一”，“或”和“所述”包括複數指示物，除非上下文另有明確規定。
本實例證實了使用包含鞘磷脂磷酸二酯酶(ASM)的樣品的用於選擇第一樣品裝載量和第二裝載量的裝載研究。此外，該實例證實了與ASM的前面最高豐度肽產物離子的組相比，ASM的中間肽產物離子的組的改善的線性MS信號響應。
於三重複(triplicate)下，在用LysC和胰蛋白酶消化之前變性、還原和烷基化ASM樣品。在消化的樣品上以1μg、2.5μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg、15μg、18μg和20μg進行LC/MS分析。用具有用CSH130 C18 1.7μm材料包裝的2.1×150mm柱的ACQUITY UPLC進行層析。使用Xevo Q-Tof G2-XS上的低和升高的碰撞能量的交替掃描來獲取資料，以生成前體和片段離子資訊。計算ASM的前面40種最 大豐度的肽產物離子的MS峰面積和遍及所有樣品量範疇的每個肽產物離子的平均百分比誤差。
圖1顯示了從在不同樣品裝載量下的包含鞘磷脂磷酸二酯酶(ASM)的樣品的LC/MS分析中觀察到的40種最大豐度的肽產物離子的MS峰面積的直方圖(對於每個肽產物柱組，每LC/MS分析的樣品裝載量按1μg、2.5μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg、15μg、18μg和20μg從左至右排序)。每個肽產物離子的遍及所有樣品裝載量的平均百分比誤差顯示在肽產物柱組上。
如圖1所示，ASM的最強的肽產物相對於所有肽產物離子具有更高的誤差，尤其是隨著總樣品量增加。肽產物離子分佈中間的肽表現得更線性，並且相對於所有肽產物離子具有較低的誤差，甚至在最高達20μg的總樣品裝載量的情況下。
使用裝載研究中的資料，可選擇第二多肽的前面n個有資格的肽產物離子的組和第二多肽的中間m個有資格的肽產物離子的組。例如，ASM的前面n個(例如3個)有資格的肽產物離子的組可包括選自肽A(z=4)、肽B(z=3)和肽C(z=4)的肽產物離子。ASM的中間m個(例如3個)有資格的肽產物離子的組可包括選自肽D(z=2)、肽M(z=4)、肽O(z=1)、肽M(z=3)、肽B(z=2)、肽L(z=2)、肽P(z=1)和肽Q(z=1)的肽產物離子。
此外，使用從ASM裝載研究收集的資料，使用前3個最大豐度肽產物離子的組(前面-3個)和中間3個肽產物離子的組(中間-3個)(圖2)，針對每個樣品裝載量繪製求和的峰面積相對在柱(μg)上裝載的樣品。前面-3個肽產物組的非線性行為可以在最佳樣品裝載量(10μg)以下良好地看到。中間-3個肽產物組在裝載研究的樣品裝載量上線性地表現，因此證實了中間-3個肽產物離子適用於本發明的定量技術。使用中間-3個肽產物組也改善了線性回歸的R2(與前面-3個肽產物組為0.87相比，中間-3個肽產物組為0.98)。
表1中提供了每種肽產物的每個濃度相對於2.5μg裝載量的百分比誤差。中間-3個肽產物組的預期比率和觀察比率之間的百分比誤差低於所有樣品裝載量的前面-3個肽產物組。
該實例使用四種不同場合下測定的治療性蛋白質產物的四個蛋白質生產批次，證實了與Hi-3方法相比Mid-3方法的定量可再現性的改進。
如實例1中所公開的製備並分析蛋白質X的四個蛋白質生產批次(批次1、批次2、批次3、批次4)。對於Hi-3方法，將200fmol的ClpB標準(大腸桿菌伴護蛋白ClpB)肽產物摻入在每個樣品中作為內部標準物。
如通過Hi-3方法量測的，對每個蛋白質生產批次繪製相對於摻入的ClpB肽產物的宿主細胞蛋白質的總ppm(圖3A)。Hi-3方法的定量量測具有82%的相對標準偏差。
如通過Mid-3方法量測的，對每個蛋白質生產批次繪製宿主細胞蛋白(HCP)的總ppm(圖3B)。Mid-3方法的定量量測具有16%的相對標準偏差。
用於計算Mid-3方法的多肽量的方程式如下：[(在高樣品量裝載量下的HCP的前3個肽產物離子的峰面積的總和)/(在高樣品量裝載量下的治療性蛋白質產物的中間3個肽產物離子的峰面積的總和)]*(在高樣品量裝載量下的治療性蛋白質產品的fmol 量)*[(在低樣品量裝載量下的治療性蛋白質產物的中間3個肽產物離子的峰面積的總和)/(在低樣品量裝載量下的治療性蛋白質的前3個肽產物離子的峰面積的總和)]。
與Mid-3方法相比，使用具有200fmol的ClpB肽作為內部標準物的Hi-3方法產生更高的誤差。使用Mid-3方法，絕對定量是更加可再現的。最大可變性是由於摻入的內部標準物，儘管也可能發生酶消化的差異。在柱上的10μg的情況下，中間肽產物組更適合用於定量，因為它們線性地表現。
本實例證實了本文所公開的Mid-3定量方法用於高通量偵測和追蹤在治療性蛋白質的純化過程期間在多個階段的汙染物宿主細胞蛋白質(HCP)的應用，包括從細胞培養收穫物收集的樣品至在最終脫鹽過程之後收集的樣品。該實例進一步證實了用於通過保留時間和m/z追蹤HCP的肽的軟體用於在後期純化樣品中無標記定量HCP的用途，以及基於譜庫的檢索用於進一步提高通量(throughput)和優化絕對定量的用途。
在基於細胞培養的治療性蛋白質(蛋白質X)的生產之後，從細胞培養收穫物中並在5個階段的蛋白質純化過程收集樣品，其包括最終的藥物物質樣品。使用三重複提供了下游量測的統計能力，包括再現性和產量資料。收集樣品後，根據製造商的說明書通過3k MWCO Amicon Ultra-15過濾器(EMD Millipore)過濾收穫樣品，以在變性和消化剩餘樣品之前濃縮並且去除阻礙質譜分析的添加劑。簡言之，完成Amicon裝置的水沖洗步驟，然後添加每樣品400μg總蛋白質或治療性蛋白質，同時在頂部添加50mM碳酸氫銨(Ambic)，至15mL總體積。隨後，在最終離心步驟之前，完成15mL的50mM Ambic的洗滌。量測最終濃度為1.4-1.7mg/mL總蛋白質或治療性蛋白質。將來自每個樣品的三重複等分試樣(來自過濾通過Amicon的收穫物的藥物物 質(DS)，以及空白消化物)在50mM Ambic中稀釋至1mg/mL，並與Rapigest(Waters，用50mM Ambic複水至0.1%的濃度)以1：1混合，產生在0.05% Rapigest、50mM Ambic中的0.5mg/mL蛋白質的最終溶液。在60℃溫育樣品15分鐘以確保蛋白質的變性。在60℃在50mM Ambic中用10mM 1,4-二硫蘇糖醇(DTT)(Pierce)進行二硫化物還原1小時。在50mM Ambic中用20mM 2-碘乙醯胺(IAA)(Pierce)進行烷基化並在室溫在黑暗中溫育30分鐘之前，允許樣品冷卻至室溫。Lys-C(Promega,15μg/小瓶)以0.125μg/μL的濃度在50mM Ambic中複水，並以1：50的酶：底物比例添加到每個樣品中。將樣品在37℃溫育隔夜。第二天早晨，在50mM AmbIC中以0.4μg/μL製備胰蛋白酶(Promega,100μg/小瓶)溶液，並以1：25的比例添加到樣品中並在37℃溫育3小時。加入2.05%甲酸通過酸裂解除去Rapigest。在以12,000rpm離心15分鐘以離心沉澱裂解的Rapigest和任何未消化的蛋白質之前，將樣品在37℃溫育30分鐘。用20μg經消化的樣品、400 fmol的Hi3大腸桿菌標準(Waters)製備每個自動取樣器小瓶，用0.1%甲酸稀釋至60μL的最終體積，用於在LC-MS上注射。
將消化的樣品(在柱上的30μg或10μg)注射到與Waters XEVO G2-XS QTof質譜儀連接的Waters ACQUITY H-Class UPLC系統上用於使用1.7μm CSH C18柱(2.1mm X 150mm,Waters)進行LC-MS分析。設置質譜儀以在靈敏度模式下以0.3秒掃描收集50至2000的質量範疇內的MSE資料。在清潔階段內以隨機順序運行所有樣品(即，空白和藥物物質被在一起隨機化並首先運行；中間過程的柱溶離物樣品被隨機化並接下來運行；以及細胞培養收穫物被隨機化並最後運行)。UPLC使用含有作為添加劑的0.1%甲酸的水和乙腈(ACN)，在30分鐘內使用5至40%ACN的梯度，在5分鐘內升至85%ACN，保持2分鐘，並在3分鐘內恢復到初始狀態，保持5分鐘，流速為250μL/min，總梯度時間為45分鐘。
將MS資料文件導入蛋白質體學軟體Progenesis Qi(Nonlinear Dynamics)，用於在使用MSE檢索算法(Waters)在與序列資料庫進行檢索之前進行峰值選取和前體/產物離子對齊。資料庫匯合了 治療性蛋白質產品序列、常見汙染物蛋白質、中國倉鼠Uniprot資料庫和每個的反向版本(reversed version)(總共69,916條序列)。以每個肽3個片段、每個蛋白質7個片段和每個蛋白質至少2個肽的要求進行鑑別，具有4%或更小的FDR。使用肽評分>5且肽質量誤差<10ppm採用進一步的過濾以獲得<1%FDR。一般地，在最上游的過程樣品(例如收穫樣品)中進行肽鑑別，但情況並非總是如此。不包括不匹配蛋白質趨勢的肽進行定量。基於與ClpB的前三種肽(Hi-3)或產品的線性表現肽(Mid-3)相比的每個蛋白質的前三個肽的豐度(在所有三個注射上)來定量蛋白質，以確定存在於每個樣品中的蛋白質的相對量。
使用蛋白質體學發現軟體工具來分析治療性蛋白質產物混合物中相對低豐度的HCP的一個風險是，來自治療性蛋白質的豐富的離子可能被不正確地鑑別為HCP。最近，已經顯示出豐富蛋白質上的偽象(artifact)可以以遠高於誘餌率(decoy rate)的比率被不正確地鑑別為其它蛋白質(Kong et al.Nature methods.2017；14(5)：513-520)。還可能的是，也可以在蛋白質水準上正確地鑑別HCP，但是這些HCP的一些肽可能是不正確的或者可能被其它離子干擾，因此它們不應當用於定量。
本文公開的方法在整個純化過程中使用強度模式的正交生理化學性質來過濾掉這樣的假陽性鑑別以及具有干擾的肽。在用於蛋白質體學的Progenesis Qi中，每個肽與鑑別評分和質量準確性以及整個實驗中肽趨勢的可視化一起列出。還示出了顯示每種肽m/z和保留時間的偵測的圖像，從而可以觀察到其它干擾離子。具有例如觀察到的干擾的肽不用於定量。
用於來自整個純化過程的樣品的分析的LC-MS分析時間在約兩天內完成(對於單個樣品的LC-MS分析時間為約45分鐘)。人工驗證所有肽(包括來自HCP的肽)的鑑別花費大約兩周。驗證後，定量來自治療性蛋白質生產樣品的鑑別的HCP的最終列表。如圖4所示，在7個生產批次之間鑑別了常見的HCP。進行統計分析以理解純化過程，例如主成分分析(Principal Components Analysis，PCA)，其提供了在純 化過程的每個步驟期間去除HCP的圖示說明。HCP的進一步分析包括分層聚類，其對在純化過程中表現類似的蛋白質進行分組。分層聚類允許允許研究節點，以發現在純化過程的每個步驟中哪些蛋白質被去除。這些資料用於理解和優化純化過程，以確保從最終治療性蛋白質產物中消除特定的HCP。通過基於例如HCP的物理化學性質(包括PI、分子量、疏水性、活性和免疫原性)優化純化過程，來去除未從治療性蛋白質充分純化的HCP。該軟體還用於在純化過程的整個過程中自動監控HCP的存在。
測定場合之間的HCP絕對定量的可變性的最大來源是一定量的摻入的內部標準物的量或HCP的肽-水準的內部標準物(即消化的蛋白質)的量。摻入的內部標準物通常是意在用於絕對定量的Hi-3ClpB肽。非常小心地溶解、等分試樣並儲存該標準物，但由於例如操作者之間的移液差異或測定場合之間酶消化的變化可能發生可變性。如本文所示，可使用治療性蛋白質的肽來代替使用摻入的內部標準誤，然而，來自治療性蛋白質的最大豐度的肽通常處於超過質譜儀的動態範疇的豐度，即治療性蛋白質的最大豐度的肽可使質譜儀的偵測器過飽和。使用最大豐度的肽方法(Hi-3方法)，觀察到最大豐度的肽由於例如偵測器飽和而具有非線性行為。相反，觀察到稱為Mid-3肽的在電離分佈中間的肽，具有基於豐度的信號的線性行為。如本文所示，合併了來自Mid-3肽的資料的Mid-3肽方法得到較低的誤差和在最高達在柱上18μg的情況下顯示出線性行為。
Claims (46)
- 一種用於絕對定量樣品中的第一多肽的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少10倍，所述方法包括：(a)使用液相層析/質譜(LC/MS)技術分析在多個樣品裝載量下的所述多個多肽的肽產物，以獲得在各所述多個樣品裝載量下的所述多個多肽之所述肽產物的離子的MS信號，其中所述多個樣品裝載量包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載量，且其中所述第一樣品裝載量大於所述第二樣品裝載量；(b)對於以下各項計算MS信號的平均數或總和：(i)在所述第一樣品裝載量下具有最高MS信號之所述第一多肽之前面n個有資格的肽產物的離子的組(A)；(ii)在所述第二樣品裝載量下具有最高MS信號之所述第二多肽之前面n個有資格的肽產物的離子的組(B)；(iii)在所述第一樣品裝載量下所述第二多肽之中間m個有資格的肽產物的離子的組(C)，其中所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組具有比所述第二多肽的前面有資格的肽產物的離子的組更低的定量誤差；及(iv)在所述第二樣品裝載量下所述第二多肽之中間有資格的肽產物的離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全部使用所述MS信號的總和計算；及(c)基於下式，確定在所述第一樣品裝載量中所述第一多肽的絕對量：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物(mathematical equivalents)。
- 如請求項1的方法，其中所述MS信號的平均數用於確定所述第一多肽的絕對量。
- 如請求項1的方法，其中所述MS信號的總和用於確定所述第一多肽的絕對量。
- 一種用於絕對定量樣品中的第一多肽的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少10倍，所述方法包括：(a)獲得所述多個多肽之肽產物的離子的MS信號，其中通過使用液相層析/質譜(LC/MS)技術分析所述多個多肽的肽產物而獲得所述肽產物的離子的MS信號，其中對於包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載量的多個樣品裝載量中的每個獲得所述肽產物的MS信號，且其中所述第一樣品裝載量大於所述第二樣品裝載量；(b)對於以下各項計算MS信號的平均數或總和：(i)在所述第一樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第一多肽的前面n個有資格的肽產物的離子的組(A)；(ii)在所述第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物的離子的組(B)；(iii)在所述第一樣品裝載量下的所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物的離子的組(C)，其中所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組具有比所述第二多肽的前面有資格的肽產物的離子的組更低的定量誤差；及(iv)在所述第二樣品裝載量下的所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組(D)，其中A、B、C和D全部使用所述MS信號的平均數計算或全 部使用所述MS信號的總和計算；及(c)基於下式，確定在所述第一樣品裝載量中的所述第一多肽的絕對定量：[(A)/(C)]*(在所述第一裝載量下的所述第二多肽的莫耳)*[(D)/(B)]，或其數學等同物。
- 如請求項4的方法，其中所述MS信號的平均數用於確定所述第一多肽的絕對量。
- 如請求項4的方法，其中所述MS信號的總和用於確定所述第一多肽的絕對量。
- 如請求項1的方法，其中所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組係基於來自所述多個樣品裝載量、或所述第一樣品裝載量和/或所述第二樣品裝載量的所述第二多肽的有資格的肽產物的離子之定量誤差來選擇。
- 如請求項7的方法，其進一步包括選擇所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組。
- 一種用於選擇用於絕對定量樣品中第一多肽的一組有資格的肽產物的離子的方法，所述樣品包含多個多肽，所述多個多肽包含所述第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少10倍，所述方法包括：(a)使用液相層析/質譜(LC/MS)技術分析在多個樣品裝載量下的所述多個多肽的肽產物，以獲得在各所述多個樣品裝載量的所述多個多肽的肽產物的離子的MS信號，其中所述多個樣品裝載量包含第一樣品裝載量和第二樣品裝載 量，且其中所述第一樣品裝載量大於所述第二樣品裝載量；及(b)選擇所述第二多肽的中間m個有資格的肽產物的離子的組，其中所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組係基於來自所述多個樣品裝載量、或所述第一樣品裝載量和/或所述第二樣品裝載量的所述第二多肽的所述有資格的肽產物的離子的定量誤差來選擇，以及其中所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組具有比所述第二多肽的前面有資格的肽產物的離子的組更低的定量誤差。
- 如請求項9的方法，其進一步包括選擇在所述第二樣品裝載量下的具有最高MS信號的所述第二多肽的前面n個有資格的肽產物的離子的組。
- 如請求項1的方法，其中各所述前面有資格的肽產物的離子的組不同於各所述中間有資格的離子的組。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述MS信號是電離強度。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述MS信號是峰高度。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述MS信號是峰面積。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述MS信號是峰體積。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述樣品中的所述多個多肽的肽產物在使用所述LC/MS技術分析所述肽產物前經由樣品消化(sample digestion)獲得。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其進一步包括獲得所述樣品。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其進一步包括處理所述樣品中的所述多個多肽以產生所述肽產物。
- 如請求項18的方法，其中處理所述樣品包括以下一項或多項步驟：(a)將所述樣品離心以分離所述多個多肽；(b)純化所述樣品中的所述多個多肽；(c)去除與隨後的處理和質譜分析不相容的樣品組分；(d)消化所述多個多肽以產生所述肽產物；及(e)純化所述肽產物。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述LC/MS技術包括經由液相層析技術分離所述肽產物。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述LC/MS技術包括處理獲得的所述肽產物的MS信號。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述LC/MS技術進一步包含以下一項或多項步驟：(a)通過胺基酸序列鑑別所述肽產物；(b)通過蛋白質標識(protein identifier)鑑別所述第一多肽；及(c)通過蛋白質標識鑑別所述多個多肽的一個或多個。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其進一步包括確定所述第二多肽的絕對量。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第一多肽是宿主細胞蛋白質。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第一多肽是生物標記。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第一多肽的豐度比所述第二多肽低至少100倍。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第二多肽是由宿主細胞產生的重組多肽。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第二多肽是治療性多肽。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述樣品是細胞培養物樣品。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述樣品是血液或血清樣品。
- 如請求項30的方法，其中所述第二多肽是血清白蛋白。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述樣品是藥物產品或其中間體。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述樣品已經被純化或增濃。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述肽產物是所述多個多肽的胰蛋白酶肽產物。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述多個樣品裝載量包括約0.1-25μg總蛋白的範疇內的樣品裝載量。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第一樣品裝載量為約10μg總蛋白。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第二樣品裝載量為約1μg總蛋白。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其進一步包括基於第二組肽產物的MS信號選擇所述第二樣品裝載量。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其進一步包括基於第一組肽產物的MS信號選擇所述第一樣品裝載量。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述多個樣品裝載量各具有相同的總體積。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中n為1或更大。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中n為3。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中m為1或更大。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中m為3。
- 如請求項1-11中任一項的方法，其中所述第二多肽的中間有資格的肽產物的離子的組係基於各個所述肽產物的序列來選擇。
- 一種用於偵測在治療性多肽產生中汙染的多肽的方法，所述方法包括：(a)獲得包含所述治療性多肽的樣品；(b)確定所述汙染的多肽是否存在於所述樣品中；其中所述汙染的多肽的存在係基於使用請求項1-8及11至45中任一項所述的方法絕對定量所述樣品中所述汙染的多肽。
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