BR112019025095A2 - Métodos para a quantificação absoluta de polipeptídeos de baixa abundância utilizando espectrometria de massa - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a métodos para a quantificação absoluta sem marcador melhorada de polipeptídeos de abundância relativamente baixa através da análise por cromatografia em fase líquida/espectrometria de massa de produtos peptídicos obtidos a partir de misturas simples ou complexas de polipeptídeo. Os métodos para a quantificação absoluta incluem sinais de MS de um conjunto de íons qualificados de produtos peptídicos de um polipeptídeo de abundância relativamente elevada para melhorar a quantificação de um polipeptídeo de abundância relativamente baixa
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO-
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. No. 62/514.587, depositado em 2 de junho de 2017, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[0002] A presente invenção refere-se a métodos para a quantifica- ção absoluta de polipeptídeos de baixa abundância através da análise de cromatografia em fase líquida/espectrometria de massa (LC/MS) dos produtos peptídicos obtidos a partir das misturas simples ou com- plexas de polipeptídeos.
[0003] Uma disposição diversa de técnicas baseadas em espec- trometria de massa (MS) para a quantificação de polipeptídeos é co- nhecida na técnica. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser quantifi- cados utilizando técnicas com base metabólica (por exemplo, marca- ção isotópica estável utilizando aminoácidos em cultura de células (SI- LAC)), técnicas baseadas em padrão peptídico (por exemplo, monito- ramento de reação selecionado (SRM) e monitoramento de múltiplas reações (MRM)) e técnicas baseadas no marcador (por exemplo, Tan- dem Mass Tags (TMT)). Esses métodos possuem desvantagens bem documentadas, tais como fontes limitadas de amostra com relação à SILAC, desenvolvimento e custo extensos de SRM e MRM, e proces- samento adicional de amostras e rendimento de abundâncias relativas de técnicas baseadas em marcadores.
[0004] As técnicas de quantificação livre de marcador à base de MS foram desenvolvidas para simplificar os métodos de quantificação de polipeptídeo baseados em MS e para contornar algumas das limita- ções acima mencionadas. No entanto, as técnicas atuais de quantifi- cação livre de marcador podem sofrer de baixa precisão e alta variabi- lidade e, a maioria das técnicas livres de marcador, pode fornecer apenas uma taxa de quantificação relativa entre duas ou mais amos- tras (por exemplo, contagem espectral).
[0005] Uma abordagem para a quantificação absoluta livre de marcador baseada em MS de proteínas envolve o uso de um padrão de proteína para criar uma medição de calibração de ponto único que é aplicada nas análises subsequentes de espectrometria de massa para a quantificação absoluta de outras proteínas. J. C. Silva et al., Mol Cell Proteomics, 5, 144-56, 2006; U.S. Patent No. 8,271,207. No entanto, o uso de uma calibração de ponto único e as diferenças cria- das por digestões enzimáticas separadas da amostra e do padrão de proteína podem ser as principais fontes de variabilidade de quantifica- ção para esse método.
[0006] Assim, existe uma necessidade na especialidade de técni- cas aperfeiçoadas de quantificação absoluta livre de marcador basea- das em MS que sejam sensíveis, exatas e precisas e possam ser apli- cadas a uma disposição diversificada de amostras de polipeptídeo em uma maneira de alta produção.
[0007] Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de pa- tente e publicações, são incorporadas por referência na sua totalidade.
[0008] A presente invenção refere-se a métodos para quantifica- ção absoluta livre de marcador de polipeptídeos de baixa abundância em uma amostra que compreende outro polipeptídeo de abundância elevada relativa. Por exemplo, a invenção fornece métodos para a quantificação de proteínas de células hospedeiras de baixa abundân- cia em um sistema de cultura, ou seu produto a jusante, compreen-
dendo uma célula hospedeira capaz de produzir um polipeptídeo re- combinante, tal como um polipeptídeo terapêutico. Os métodos utili- zam os sinais de MS do produto de concentração e peptídeo de um polipeptídeo de alta abundância e os sinais de MS do produto peptídi- co de um polipeptídeo de baixa abundância para calcular a quantidade absoluta do polipeptídeo de baixa abundância.
[0009] Em um aspecto, A presente invenção refere-se a métodos para a quantificação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que compreende uma pluralidade de polipeptídeos compre- endendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo é pelo menos 10 vezes menor em abundância do que o segundo polipeptídeo, o método compreendendo: (a) a análise de produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em uma plura- lidade de quantidades de carga de amostra utilizando uma técnica de cromatografia em fase líquida/espectrometria de massa (LC/MS) para obter sinais de MS de íons dos produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em cada uma da pluralidade de quantidades de carga de amostras, em que a pluralidade de quantidades de carga de amostras compreende uma primeira quantidade de carga de amostras e uma segunda quantidade de carga de amostras, e em que a primeira quan- tidade de carga de amostras é maior do que a segunda quantidade de carga de amostras; (b) o cálculo da média ou soma de um sinal de MS para: (i) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptí- dicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto inter- mediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C);
e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptí- dicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e (c) de- terminar uma quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra com base na seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos.
[0010] Em outro aspecto, A presente invenção refere-se a méto- dos para a quantificação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra compreendendo uma pluralidade de polipeptídeos que com- preende o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo é pelo menos 10 vezes menor em abundância do que o segundo polipeptídeo, o método compreendendo: (a) a obtenção de sinais de MS de íons de produtos peptídicos da pluralidade de poli- peptídeos, em que ditos sinais de MS de íons dos produtos peptídicos são obtidos através da análise dos produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos utilizando uma técnica de cromatografia em fase lí- quida/espectrometria de massa (LC/MS), em que os sinais de MS dos produtos peptídicos são obtidos para cada uma de uma pluralidade de quantidades de carga de amostra compreendendo uma primeira quan- tidade de carga de amostra e uma segunda quantidade de carga de amostra, e em que a primeira quantidade de carga de amostra é maior do que a segunda quantidade de carga da amostra; (b) o cálculo da média ou soma de um sinal de MS para: (i) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro poli- peptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto intermediário de número m de íons quali- ficados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e (c) a determinação de uma quantidade absolu- ta do primeiro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amos- tra com base na seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quan- tidade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos.
[0011] Em algumas modalidades, a média do sinal de MS é utili- zada para determinar a quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo.
[0012] Em algumas modalidades, a soma do sinal de MS é utiliza- da para determinar a quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo.
[0013] Em algumas modalidades, o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é seleci- onado com base no erro de quantificação dos íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo a partir da pluralidade de quantidades de carga de amostra, ou da primeira quantidade de carga de amostra e/ou da segunda quantidade de carga de amostra.
[0014] Em outro aspecto, A presente invenção refere-se a méto- dos para selecionar um conjunto de íons qualificados de produtos pep- tídicos para quantificação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que compreende uma pluralidade de polipeptídeos com- preendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo é pelo menos 10 vezes menor em abun- dância do que o segundo polipeptídeo, o método compreendendo: (a)
analisar os produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em uma pluralidade de quantidades de carga de amostra utilizando uma técnica de cromatografia em fase líquida/espectrometria de massa (LC/MS) para obter sinais de MS de íons dos produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em cada uma da pluralidade de quantida- des de carga de amostra, em que a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende uma primeira quantidade de carga de amostra e uma segunda quantidade de carga de amostra, e em que a primeira a quantidade de carga de amostra é maior do que a segunda quantidade de carga da amostra; e (b) selecionar um conjunto inter- mediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo, em que o conjunto intermediário de íons qualifi- cados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é selecionado com base no erro de quantificação dos íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo da pluralidade de quantidades de carga de amostra ou da primeira quantidade de carga de amostra e/ou da segunda quantidade de carga de amostra. Em algumas modalida- des, os métodos compreendem ainda a seleção de um conjunto supe- rior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do se- gundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra.
[0015] Em algumas modalidades, cada um dos conjuntos superio- res de íons qualificados de produtos peptídicos é diferente de cada um dos conjuntos intermediários de íons qualificados.
[0016] Em algumas modalidades, o sinal de MS é a intensidade de ionização ou altura máxima ou área máxima ou volume máximo.
[0017] Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem obter a amostra.
[0018] Em algumas modalidades, a amostra foi purificada ou enri- quecida. Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem o processamento da pluralidade de polipeptídeos na amostra para pro- duzir os produtos peptídicos. Em algumas modalidades, o processa- mento da amostra compreende um ou mais dos seguintes itens: (a) centrifugar a amostra para isolar a pluralidade de polipeptídeos; (b) purificar a pluralidade de polipeptídeos na amostra; (c) remover da amostra os componentes incompatíveis com o processamento subse- quente e a análise por espectrometria de massa; (d) digerir a plurali- dade de polipeptídeos para produzir os produtos peptídicos; e (e) puri- ficar os produtos peptídicos.
[0019] Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende a separação dos produtos peptídicos por meio de uma técnica de cro- matografia em fase líquida.
[0020] Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende o processamento dos sinais de MS obtidos dos produtos peptídicos.
[0021] Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende ainda um ou mais dos seguintes: (a) a identificação dos produtos pep- tídicos através da sequência de aminoácido; (b) a identificação do pri- meiro polipeptídeo através de um identificador de proteína; e (c) a identificação de um ou mais da pluralidade de polipeptídeos por um identificador de proteína.
[0022] Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem determinar a quantidade absoluta do segundo polipeptídeo.
[0023] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é uma proteína de célula hospedeira ou um biomarcador. Em algumas moda- lidades, o primeiro polipeptídeo é pelo menos 100 vezes menor em abundância do que o segundo polipeptídeo.
[0024] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo recombinante produzido por uma célula hospedeira ou um polipeptídeo terapêutico ou albumina sérica. Em algumas modalida- des, o segundo polipeptídeo é expresso a partir de um vetor transfec-
tado em uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira de mamífero, tal como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).
[0025] Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de cultura de células ou uma amostra de sangue ou soro ou um produto farmacêutico ou um intermediário destes.
[0026] Em algumas modalidades, os produtos peptídicos da plura- lidade de polipeptídeos na amostra são obtidos por meio da digestão da amostra antes da análise dos produtos peptídicos utilizando a téc- nica de LC/MS. Em algumas modalidades, os produtos peptídicos são produtos peptídicos trípticos da pluralidade de polipeptídeos.
[0027] Em algumas modalidades, a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende quantidades de carga de amostra na faixa de cerca de 0,1 a 25 μg de proteína total. Em algumas modalida- des, a primeira quantidade de carga de amostra é ao redor de 10 μg de proteína total. Em algumas modalidades, a segunda quantidade de carga de amostra é de cerca de 0,5 µg a 10 µg ou 3 µg a 6 µg ou 1 µg, 2 µg, 3 µg, 4 µg, 5 µg ou 6 µg de proteína total.
[0028] Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem a seleção da segunda quantidade de carga de amostra com base nos sinais de MS do segundo conjunto de produtos peptídicos.
[0029] Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem a seleção da primeira quantidade de carga de amostra com base nos sinais de MS do primeiro conjunto de produtos peptídicos.
[0030] Em algumas modalidades, cada uma da pluralidade de quantidades de carga de amostra possui o mesmo volume total.
[0031] Em algumas modalidades, n é 1 ou maior ou n é 3.
[0032] Em algumas modalidades, m é 1 ou maior ou m é 3.
[0033] Em algumas modalidades, o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é seleci- onado com base nas sequências de cada um dos produtos peptídicos.
[0034] Em outro aspecto, A presente invenção refere-se a méto- dos para detectar um polipeptídeo contaminado na produção de um polipeptídeo terapêutico, o método compreendendo: (a) a obtenção de uma amostra que compreende o polipeptídeo terapêutico; (b) a deter- minação se o polipeptídeo contaminado está presente na amostra; em que a presença do polipeptídeo contaminado é baseada na quantifica- ção absoluta do polipeptídeo contaminante na amostra utilizando os métodos de quantificação aqui fornecidos.
[0035] Em outro aspecto, a presente invenção fornece sistemas para a quantificação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que compreende o primeiro polipeptídeo e um segundo poli- peptídeo, o sistema compreendendo: (a) um espectrômetro de massa; (b) um computador; (c) um meio legível por computador não transitório incluindo instruções nele armazenadas que, quando executadas, exe- cutam o processamento incluindo: o cálculo da média ou soma de um sinal de MS para: (i) um conjunto superior de número n de íons qualifi- cados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais eleva- dos na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e a de- terminação de uma quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra com base na seguinte fórmu- la:
[(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos. Em al- gumas modalidades, os sistemas ainda compreendem um cromatógra- fo líquido.
[0036] Em outro aspecto, A presente invenção refere-se a meios legíveis por computador não transitórios, incluindo instruções nele ar- mazenadas que, quando executadas, executam o processamento para a quantificação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, o processamento incluindo: calcular a média ou a soma de um sinal de MS para: (i) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptí- dicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto inter- mediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptí- dicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e deter- minar uma quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra com base na seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos.
[0037] Estes e outros aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada subsequente e das reivindicações anexas. Deve ficar entendido que uma, algumas,
ou todas as propriedades das várias modalidades aqui descritas po- dem ser combinadas para formar outras modalidades da presente in- venção.
[0038] A FIG. 1 mostra um histograma das áreas máximas de MS para os quarenta íons de produto peptídico mais abundantes observa- dos de uma análise de LC/MS de uma amostra que compreende es- fingomielina fosfodiesterase (ASM) em diferentes quantidades de car- ga de amostra (a quantidade de carga de amostra por análise de LC/MS é ordenada como 1 μg, 2,5 μg, 5 μg, 7,5 μg, 10 μg, 12 μg, 15 μg, 18 μg e 20 μg da esquerda para a direita para cada conjunto de barras do produto peptídico). O erro percentual médio para cada íon do produto peptídico nas quantidades de carga de amostra é mostrado acima do conjunto de barras do produto peptídico.
[0039] A FIG. 2 mostra a área máxima somada de um conjunto intermediário de três produtos peptídicos (Middle-3; quadrados) e um conjunto superior de três produtos peptídicos (Top-3; diamantes) em seis pontos de concentração. O R2 para uma regressão linear dos pro- dutos peptídicos Middle-3 é 0,98 e para os produtos peptídicos Top-3 é 0,87.
[0040] As FIGS. 3A a 3B mostram uma comparação dos métodos de quantificação Hi-3 (FIG. 3A) e Mid-3 (FIG. 3B) para as quatro amos- tras (Lote 1, Lote 2, Lote 3, Lote 4, da esquerda para a direita para ca- da conjunto de barras) em quatro ocasiões diferentes de ensaio (oca- sião A, ocasião B, ocasião C, ocasião D). Houve um desvio padrão relativo de 82% para o método Hi-3 (FIG. 3A) e um desvio padrão rela- tivo de 16% para o método Mid-3 (FIG. 3B).
[0041] A FIG. 4 mostra a abundância relativa das 8 principais pro- teínas de células hospedeiras identificadas sobre vários lotes de pro- dução de proteína terapêutica.
[0042] A FIG. 5 mostra a abundância relativa de proteínas de célu- las hospedeiras identificadas através de estágios de um processo de purificação para uma proteína terapêutica.
[0043] A presente invenção refere-se a métodos para a quantifica- ção absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que com- preende uma pluralidade de polipeptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, os métodos compreendendo a determinação de uma quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo na amostra com base na média ou soma dos sinais de MS para: um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptí- dicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo po- lipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e o conjunto intermediá- rio de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptí- deo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados utili- zando a soma dos sinais de MS. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é menos abundante do que um segundo polipeptídeo na amostra. Em algumas modalidades, a quantidade absoluta de um pri- meiro polipeptídeo é determinada pela seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)]. Os métodos da presente invenção também são aqui referidos como Mid-3. Como aqui utilizado, "qualificado", como usado em referência aos íons, refere-se aos íons de produtos peptídicos que são adequa-
dos para os métodos de quantificação aqui descritos. Em algumas modalidades, os íons de produtos peptídicos qualificados excluem íons de produtos peptídicos não trípticos ou íons de produtos peptídicos com modificações pós-translacionais.
[0044] Os métodos da presente invenção aqui descritos fornecem, por exemplo, precisão e reprodutibilidade melhoradas da quantificação de polipeptídeo em uma faixa dinâmica maior de concentrações de polipeptídeo em uma amostra, em comparação com os métodos de quantificação absoluta livre de marcador conhecidos na técnica (por exemplo, Hi-3; J. C. Silva et al., supra). Sem desejar ser limitado pela teoria, os métodos de quantificação absoluta livre de marcador basei- am-se na descoberta de que, assumindo uma quantidade equimolar de cada um de uma pluralidade de polipeptídeos em uma amostra, a resposta média do detector de MS dos n íons mais abundantes de um o produto peptídico de um polipeptídeo é semelhante sobre cada uma da pluralidade de polipeptídeos (isto é, a concentração do produto peptídico se correlaciona com a resposta do detector). Portanto, a quantidade de um polipeptídeo de concentração desconhecida pode ser determinada mediante a comparação com um polipeptídeo padrão de concentração conhecida. No entanto, o uso dos íons mais abun- dantes de produtos peptídicos de um padrão polipeptídico com relação à quantificação absoluta pode levar à fraca precisão e reprodutibilida- de. Por exemplo, a imprecisão da quantificação pode surgir devido à observação do comportamento não linear dos principais produtos pep- tídicos ionizantes devido à saturação do detector de MS. Além disso, esses métodos podem contar com reforço em uma quantidade conhe- cida de um polipeptídeo padrão ou análise de uma quantidade conhe- cida de uma amostra de proteína padrão em uma análise de LC/MS separada da amostra que contém o polipeptídeo de concentração des- conhecida. Ambas as abordagens podem levar a uma redução na pre-
cisão da quantificação e um aumento na variabilidade. Por exemplo, a alíquota reproduzível de uma quantidade conhecida de um polipeptí- deo padrão para qualquer número de amostras pode ser desafiadora e a calibragem de um cálculo de quantificação com base em um polipep- tídeo padrão que é digerido em uma reação enzimática separada da amostra que contém o polipeptídeo desconhecido pode criar variação adicional com base no grau de conclusão da digestão.
[0045] A presente invenção refere-se a métodos de quantificação que integram elementos para alcançar melhor precisão e reprodutibili- dade da quantificação de polipeptídeo. Em primeiro lugar, os métodos de quantificação absoluta da presente invenção levam vantagem dos sistemas de amostra de polipeptídeo que compreendem um polipeptí- deo com uma concentração conhecida e que está em alta abundância em relação a outros polipeptídeos da amostra (por exemplo, uma pro- teína terapêutica em uma amostra de fabricação ou albumina em uma amostra de soro) e não requerem comparação com um polipeptídeo padrão reforçado ou analisado separadamente. Em segundo lugar, os métodos de quantificação absoluta da presente invenção utilizam me- dições de MS em duas concentrações para evitar a saturação do de- tector de MS dos n íons de produto peptídico principais do polipeptídeo de abundância elevada. Em terceiro lugar, os métodos de quantifica- ção absoluta da presente invenção ainda utilizam um conjunto inter- mediário de íons de produtos peptídicos com erro de quantificação re- duzido em comparação com os peptídeos superiores para reduzir o erro geral de quantificação. As vantagens dos métodos da presente invenção foram demonstradas em uma comparação direta com o mé- todo de quantificação absoluta livre de marcador conhecido na técnica (isto é, Hi-3). Por exemplo, como mostrado no Exemplo 2, através de uma série de ensaios e amostras, os métodos divulgados na presente invenção alcançaram um desvio padrão relativo de 16%, enquanto que o método Hi-3 teve um desvio padrão relativo de 82%.
[0046] Como tratado abaixo com maiores detalhes, A presente in- venção refere-se a métodos úteis para a quantificação absoluta livre de marcador à base de MS de polipeptídeos de baixa abundância (por exemplo, um primeiro polipeptídeo) utilizando informações de outro polipeptídeo (por exemplo, o segundo polipeptídeo) que possui uma concentração conhecida e é maior em abundância relativa do que os polipeptídeos de baixa abundância, os métodos incluindo qualquer um ou mais dos seguintes: (a) a execução de um estudo de carga para determinar duas concentrações de carga de amostra nas quais os da- dos são obtidos e/ou analisados com relação à quantificação de poli- peptídeos de baixa abundância (por exemplo, a primeira quantidade de carga da amostra e a segunda quantidade de carga da amostra); (b) a seleção de íons de produtos peptídicos qualificados para quantifi- cação de polipeptídeo (por exemplo, um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo, um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo e um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo po- lipeptídeo); e (c) a determinação da quantidade absoluta de polipeptí- deo de um polipeptídeo de baixa abundância utilizando sinais de MS (por exemplo, sinais de MS de produtos peptídicos do primeiro poli- peptídeo e do segundo polipeptídeo). Execução de um estudo de carga para determinar uma primeira quan- tidade de carga de amostra e uma segunda quantidade de carga de amostra
[0047] A presente invenção refere-se a métodos para a execução de um estudo de carga de uma amostra ao longo da faixa dinâmica desejada do ensaio. A informação de sinal de MS obtida a partir do estudo de carga leva em conta, por exemplo, a seleção de uma primei-
ra quantidade de carga de amostra em que os produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo são detectáveis (o primeiro polipeptídeo está em baixa abundância em relação ao segundo polipeptídeo), a seleção de uma segunda quantidade de carga de amostra, em que o número n máximo de íons de produto peptídico abundante mais qualificado do segundo polipeptídeo não satura o detector de MS, e a seleção de uma primeira quantidade de carga de amostra e uma segunda quanti- dade de carga de amostra, em que um conjunto intermediário de nú- mero m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo poli- peptídeo demonstram erro de quantificação reduzido (isto é, compor- tamento linear aumentado em relação aos íons mais abundantes de produto peptídico).
[0048] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a análise de produtos peptídicos de uma pluralidade de polipeptídeos em uma pluralidade de quantidades de carga de amostra utilizando uma técnica de cromatografia em fase líquida/espectrometria de mas- sa (LC/MS) para obter sinais de MS de íons dos produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em cada uma da pluralidade de quan- tidades de carga de amostra, em que a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende uma primeira quantidade de carga de amostra e uma segunda quantidade de carga de amostra, e em que a primeira quantidade de carga de amostra é maior que a segunda quantidade de carga de amostra. Em algumas modalidades, o sinal de MS é a intensidade de ionização. Em algumas modalidades, o sinal de MS é a altura máxima. Em algumas modalidades, o sinal de MS é a área máxima. Em algumas modalidades, o sinal de MS é o volume máximo.
[0049] Em algumas modalidades, a informação obtida de um estu- do de carga pode ser aplicada nas análises de amostra subsequentes para a quantificação de um polipeptídeo (por exemplo, seleção de 2 quantidades de carga de amostra para análises adicionais de amostra por meio de uma técnica de LC/MS).
[0050] Em algumas modalidades, a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende pelo menos 2 quantidades de carga de amostra. Em algumas modalidades, a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 quantidades de carga de amostra.
[0051] As quantidades de carga de amostra podem variar depen- dendo da instrumentação de LC/MS utilizada (por exemplo, com base na capacidade de carga de uma coluna de cromatografia). Em algu- mas modalidades, a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende quantidades de carga de amostra na faixa de cerca de 0,1 μg a cerca de 100 μg, cerca de 0,1 μg a cerca de 75 μg, cerca de 0,1 μg a cerca de 50 μg, cerca de 0,1 μg a cerca de 40 μg, cerca de 0,1 μg a cerca de 30 μg, cerca de 0,1 μg a cerca de 20 μg, cerca de 0,1 μg a cerca de 15 μg, cerca de 0,1 μg a cerca de 10 μg, cerca de 1 μg a cerca de 30 μg, cerca de 1 μg a cerca de 30 μg, cerca de 1 μg a cerca de 20 μg, cerca de 1 μg a cerca de 15 μg ou cerca de 1 μg a cerca de 10 μg.
[0052] Em algumas modalidades, a quantidade de carga da amos- tra é ao redor de 0,5 μg, ao redor de 1 μg, ao redor de 1,5 μg, ao redor de 2 μg, ao redor de 2,5 μg, ao redor de 3 μg, ao redor de 3,5 μg, ao redor de 4 μg, ao redor de 4,5 μg, ao redor de 5 μg, ao redor de 5,5 μg, ao redor de 6 μg, ao redor de 6,5 μg, ao redor de 7 μg, ao redor de 7,5 μg, ao redor de 8 μg, ao redor de 8,5 μg, ao redor de 9 μg, ao re- dor de 9,5 μg, ao redor de 10 μg, ao redor de 10,5 μg, ao redor de 11 μg, ao redor de 11,5 μg, ao redor de 12 μg, ao redor de 12,5 μg, ao redor de 13 μg, ao redor de 13,5 μg, ao redor de 14 μg, ao redor de 14,5 μg, ao redor de 15 μg, ao redor de 16 μg, ao redor de 17 μg, ao redor de 18 μg, ao redor de 19 μg, ao redor de 20 μg, ao redor de 21 μg, ao redor de 22 μg, ao redor de 23 μg, ao redor de 24 μg, ao redor de 25 μg, ao redor de 26 μg, ao redor de 27 μg, ao redor de 28 μg, ao redor de 29 μg ou ao redor de 30 μg.
[0053] Em algumas modalidades, a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende uma primeira quantidade de carga de amostra e uma segunda quantidade de carga de amostra, em que a primeira quantidade de carga de amostra é de cerca de 10 μg e em que a segunda quantidade de carga de amostrasé de cerca de 0,5 µg a 10 µg ou 3 µg a 6 µg ou 1 µg, 2 µg, 3 µg, 4 µg, 5 µg ou 6 µg.
[0054] Em algumas modalidades, a primeira quantidade de carga de amostra é selecionada com base nos sinais de MS dos produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, a pri- meira quantidade de carga de amostra é selecionada com base nos sinais de MS dos produtos peptídicos do segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, a primeira quantidade de carga de amostra é selecionada com base nos sinais de MS dos produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo e nos sinais de MS dos produtos peptídicos do segundo polipeptídeo.
[0055] Em algumas modalidades, a segunda quantidade de carga de amostra é selecionada com base nos sinais de MS dos produtos peptídicos do segundo polipeptídeo.
[0056] Em algumas modalidades, as quantidades de carga de amostra subsequentes analisadas em um estudo de carga são basea- das em dados de uma quantidade de carga de amostra anteriormente analisada.
[0057] O volume de cada quantidade de carga de amostra pode variar dependendo da instrumentação de LC/MS utilizada (por exem- plo, com base no tamanho da estrutura de amostra). Em algumas mo- dalidades, cada uma da pluralidade de quantidades de carga de amos- tra possui o mesmo volume total. Em algumas modalidades, o volume de cada uma de uma pluralidade de quantidades de carga de amostra é de cerca de 1 μl a cerca de 60 μl, cerca de 10 μl a cerca de 60 μl, cerca de 20 μl a cerca de 50 μl ou cerca de 30 μl a cerca de 50 μl. Em algumas modalidades, o volume de cada uma de uma pluralidade de quantidades de carga de amostra é o mesmo e é de cerca de 1 μl a cerca de 60 μl, cerca de 10 μl a cerca de 60 μl, cerca de 20 μl a cerca de 50 μl ou cerca de 30 μl a cerca de 50 μl. Em algumas modalidades, o volume de cada uma de uma pluralidade de quantidades de carga de amostra é ao redor de 5 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 30 μl, 35 μl, 40 μl, 45 μl, 50 μl, 55 μl ou 60 μl. Seleção de íons qualificados de produto peptídico do primeiro polipep- tídeo e do segundo polipeptídeo
[0058] A presente invenção refere-se a métodos para a seleção de conjuntos de íons qualificados de produtos peptídicos para quantifica- ção absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que com- preende uma pluralidade de polipeptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptí- deo está em menor abundância em relação ao segundo polipeptídeo. Por exemplo, a invenção fornece métodos para a seleção de qualquer um dos seguintes: um conjunto superior de número n de íons qualifi- cados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo, um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo e um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo.
[0059] Em algumas modalidades, os métodos da presente inven- ção compreendem a seleção de um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com o sinal de MS mais elevado na primeira quantidade de carga de amos- tra.
[0060] Em algumas modalidades, os métodos da presente inven-
ção compreendem a seleção de um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra.
[0061] O número de produtos peptídicos identificáveis por MS de um polipeptídeo pode variar dependendo da concentração e das ca- racterísticas do polipeptídeo. Em algumas modalidades, a concentra- ção e as características do primeiro polipeptídeo podem resultar na identificação de um número limitado de produtos peptídicos na primei- ra quantidade de carga de amostra. Em algumas modalidades, n é 1 ou maior, em que n é um número inteiro. Em algumas modalidades, n é 3. Em algumas modalidades, n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[0062] Em algumas modalidades, os íons qualificados de produtos peptídicos com os sinais de MS mais elevados podem excluir íons de produtos peptídicos com certas características, incluindo, por exemplo, clivagens enzimáticas perdidas, modificações pós-translacionais, e perfis de eluição de LC e distribuição de isótopos sobrepostos. Por exemplo, se uma amostra for digerida com tripsina e o produto peptídi- co com o sinal de MS mais elevado for um produto peptídico não trípti- co, esse produto peptídico pode ser excluído da seleção de um con- junto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo ou um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo. Em al- gumas modalidades, os íons qualificados de um produto peptídico com os sinais de MS mais elevados podem excluir íons do produto peptídi- co originários de partes de um polipeptídeo que não estão de modo reproduzíveis presentes como parte do polipeptídeo de origem (por exemplo, o produto peptídico que se origina de um produto de cliva- gem do polipeptídeo e assim não pode estar presente na amostra na mesma concentração como o polipeptídeo de origem).
[0063] Em algumas modalidades, os métodos da presente inven- ção compreendem a seleção de um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptí- deo, em que o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é selecionado com base no erro de quantificação dos íons qualificados de produtos peptídicos do se- gundo polipeptídeo a partir da pluralidade de quantidades de carga de amostra, ou da primeira quantidade de carga de amostra e/ou da se- gunda quantidade de carga de amostra. Geralmente, cada íon de pro- duto peptídico do conjunto intermediário de número m de íons qualifi- cados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é selecionado com base em ter o menor erro de quantificação em relação ao conjun- to total de íons de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, cada íon de produto peptídico do conjunto in- termediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo possui um erro de quantificação mais baixo do que o íon de produto peptídico mais abundante do segundo poli- peptídeo. Em algumas modalidades, os íons de produto peptídico do conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos de um segundo polipeptídeo possuem um erro de quantifi- cação menor do que um conjunto superior de número n de íons qualifi- cados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados.
[0064] Em algumas modalidades, os íons qualificados de produtos peptídicos com o menor erro de quantificação podem excluir íons de produto peptídico com certas características, incluindo, por exemplo, clivagens enzimáticas perdidas, modificações pós-translacionais e per- fis de eluição de LC e distribuição de isótopos sobrepostos. Por exem- plo, em algumas modalidades, se uma amostra for digerida com tripsi- na e o produto peptídico com o menor erro de quantificação for um produto peptídico não tríptico, esse produto peptídico pode ser excluí- do da seleção de um conjunto intermediário de número m de íons qua- lificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, os íons qualificados de um produto peptídico com os si- nais de MS mais elevados podem excluir íons de produto peptídico originários de partes de um polipeptídeo que não estão de modo re- produzível como parte do polipeptídeo de origem (por exemplo, o pro- duto peptídico que se origina de um produto de clivagem do polipeptí- deo e assim pode não estar presente na amostra na mesma concen- tração como o polipeptídeo de origem).
[0065] Em algumas modalidades, a seleção de um conjunto inter- mediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo baseia-se no erro de quantificação obtido de um estudo de carga. Em algumas modalidades, a seleção de um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo baseia-se no erro de quantificação obtido a partir de uma pluralidade de quantidades de carga de amostra. Em al- gumas modalidades, o erro de quantificação é um erro percentual mé- dio de uma pluralidade de quantidades de carga de amostra. Em al- gumas modalidades, a seleção de um conjunto intermediário de núme- ro m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipep- tídeo baseia-se no erro de quantificação obtido a partir de uma primei- ra quantidade de carga de amostra. Em algumas modalidades, a sele- ção de um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo baseia-se no erro de quantificação obtido de uma segunda quantidade de carga de amostra. Em algumas modalidades, a seleção de um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo po- lipeptídeo baseia-se no erro de quantificação obtido a partir de uma primeira quantidade de carga de amostra e uma segunda quantidade de carga de amostra.
[0066] Em algumas modalidades, m é 1 ou maior, em que m é um número inteiro. Em algumas modalidades, m é 3. Em algumas modali- dades, m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[0067] Em algumas modalidades, n é igual a m. Em algumas mo- dalidades, n não é igual a m. Em algumas modalidades, n e m são 2 ou mais, em que n e m são um número inteiro. Em algumas modalida- des, n e m são 3.
[0068] Em algumas modalidades, cada um do conjunto superior de íons qualificados de produtos peptídicos de um segundo polipeptídeo é diferente de cada um de um conjunto intermediário de íons qualifica- dos de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo. Em algumas mo- dalidades, um íon de produto peptídico qualificado é um membro de um conjunto superior de íons qualificados de produtos peptídicos de um segundo polipeptídeo e um conjunto intermediário de íons qualifi- cados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo.
[0069] Em algumas modalidades, o íon produto peptídico qualifi- cado compreende uma cisteína carbamidometilada. Em algumas mo- dalidades, o íon de produto peptídico qualificado compreende uma cis- teína carboximetilada. Determinação da quantidade absoluta de polipeptídeo de polipeptí- deos de baixa abundância
[0070] A presente invenção refere-se a métodos para calcular a quantidade absoluta de polipeptídeo de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que compreende uma pluralidade de polipeptídeos com- preendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, os métodos compreendendo a determinação de uma quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo na amostra com base na média ou na soma dos sinais de MS para: um conjunto superior de número n de íons qua- lificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais eleva- dos na segunda quantidade de carga de amostra (B); um conjunto in- termediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptí- dicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados usando a soma dos sinais de MS.
[0071] Em algumas modalidades, a quantidade absoluta de um primeiro polipeptídeo é determinada com base na seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos.
[0072] Em algumas modalidades, A, B, C e D são todos calculados utilizando a média dos sinais de MS. Em algumas modalidades, A, B, C e D são todos calculados utilizando a soma dos sinais de MS.
[0073] Em algumas modalidades, o sinal de MS é a intensidade de ionização. Em algumas modalidades, o sinal de MS é a altura máxima. Em algumas modalidades, o sinal de MS é a área máxima. Em algu- mas modalidades, o sinal de MS é o volume máximo.
[0074] Em algumas modalidades, o conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos de um primeiro polipeptí- deo com os sinais de MS mais elevados é predeterminado. Em algu- mas modalidades, o conjunto superior de número n de íons qualifica- dos de produtos peptídicos de um segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados é predeterminado. Em algumas modalidades, o conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos de um segundo polipeptídeo é predeterminado. Em algu-
mas modalidades, a relação de um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos de um segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados em uma segunda quantidade de carga de amostra (B) e um conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo o polipeptídeo na segunda quanti- dade de carga da amostra (D) é predeterminada.
[0075] Em algumas modalidades, a média ou soma dos sinais de MS para: um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptí- dicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); um conjunto intermediá- rio de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do se- gundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga da amostra (D), são determinados a partir de 2 análises de LC/MS da amostra. Em algumas modalidades, análises adicionais de réplicas das 2 análises de LC/MS são executadas.
[0076] Em algumas modalidades, a média ou a soma dos sinais de MS para: um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptí- dicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); um conjunto intermediá- rio de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do se- gundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra (C); e o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), são determinados a partir de 2 análises de LC/MS da amostra, em que as análises de LC/MS não fazem parte do estudo de carga. Em algumas modalidades, análises adicionais de réplicas das 2 análises de LC/MS são executadas.
[0077] Em algumas modalidades, o método de quantificação com- preende sinais de MS de dois ou mais polipeptídeos de quantidade conhecida.
[0078] Em algumas modalidades, os métodos ainda compreendem determinar a quantidade absoluta de um segundo polipeptídeo. Os métodos para determinar a quantidade de proteína de um segundo polipeptídeo incluem, por exemplo, ELISA e Western blot.
[0079] É contemplado que mais do que um polipeptídeo de con- centração desconhecida por ensaio pode ser identificado e quantifica- do utilizando os métodos da presente invenção. Por exemplo, a partir da equação divulgada acima, o conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amos- tra (A) pode ser substituído por um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos de outro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amos- tra para calcular a quantidade do outro polipeptídeo. Amostras e preparação de amostras
[0080] Os métodos da presente invenção são úteis para a quantifi- cação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra compre- endendo uma pluralidade de polipeptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptí- deo está em menor abundância em relação ao segundo polipeptídeo.
[0081] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é pelo menos cerca de 10 vezes menor em abundância do que um segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é pelo menos cerca de 100 vezes menor em abundância do que um segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é pelo menos cerca de 1000 vezes menor em abundância do que um segun- do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é pelo menos cerca de 2 vezes a cerca de 1 x 109 vezes menor em abundância do que um segundo polipeptídeo. Por exemplo, o primeiro polipeptídeo é medido em uma quantidade de uma parte por bilhão.
[0082] Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é pelo menos cerca de 10 vezes maior em abundância do que um primeiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é pelo menos cerca de 100 vezes maior em abundância do que um primeiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é pelo menos cerca de 1000 vezes maior ou 1 x 109 vezes maior em abun- dância do que um primeiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é pelo menos cerca de 2 vezes a cerca de 1 x 109 vezes maior em abundância do que um primeiro polipeptídeo.
[0083] As técnicas de preparação de amostras necessárias para produzir produtos peptídicos de uma pluralidade de polipeptídeos em uma amostra para análise por meio de técnicas de LC/MS são conhe- cidas na especialidade.
[0084] Em algumas modalidades, os produtos peptídicos de uma pluralidade de polipeptídeos em uma amostra são obtidos por meio da digestão da amostra antes da análise dos produtos peptídicos utilizan- do uma técnica de LC/MS. Em algumas modalidades, a digestão de amostra compreende digestão enzimática utilizando uma protease. Em algumas modalidades, a digestão enzimática é executada utilizando uma ou mais de tripsina, Lys-C, IdeS, IdeZ, PNGase F, termolisina, pepsina, elastase, Arg-C, TEV, Glu-C, Asp-N e Fator Xa. Em algumas modalidades, os produtos peptídicos de uma pluralidade de polipeptí-
deos em uma amostra são produtos peptídicos trípticos.
[0085] Em algumas modalidades, a digestão de amostra compre- ende digestão química, tal como a hidrólise ácida.
[0086] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a ob- tenção de uma amostra. As técnicas para obter amostras para análise de LC/MS são conhecidas na especialidade e incluem, por exemplo, coleta de tecidos (por exemplo, sangue, plasma) e cultura celular.
[0087] Em algumas modalidades, a amostra foi purificada ou enri- quecida. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o pro- cessamento da pluralidade de polipeptídeos em uma amostra para produzir produtos peptídicos. Em algumas modalidades, o processa- mento da pluralidade de polipeptídeos em uma amostra compreende um ou mais de: (a) centrifugação da amostra para isolar a pluralidade de polipeptídeos; (b) purificação da pluralidade de polipeptídeos na amostra; (c) remoção dos componentes da amostra incompatíveis com o processamento subsequente e a análise de LC/MS; (d) digestão da pluralidade de polipeptídeos para produzir os produtos peptídicos; e (e) purificação dos produtos peptídicos antes da análise de LC/MS.
[0088] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é uma proteína de célula hospedeira. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo recombinante produzido por uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo terapêutico, tal como um anticorpo (por exemplo, um anti- corpo recombinante), ou uma enzima (por exemplo, uma enzima re- combinante), ou um peptídeo (por exemplo, uma insulina). Em algu- mas modalidades, o segundo polipeptídeo é a proteína viral, tal como um capsídeo de uma partícula viral (por exemplo, tal como para uma terapia genética). Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de cultura celular. Em algumas modalidades, a amostra é um produto farmacêutico ou um intermediário deste.
[0089] Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é um bi- omarcador, tal como um biomarcador em circulação. Em algumas mo- dalidades, o segundo polipeptídeo é albumina de soro. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue ou soro. Técnicas de cromatografia em fase líquida/espectrometria de massa (LC/MS)
[0090] A presente invenção contempla uma disposição diversa de técnicas de LC/MS para gerar espectros de massa em tandem de uma amostra que compreende uma pluralidade de polipeptídeos compre- endendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo.
[0091] Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende a separação dos produtos peptídicos por meio de uma técnica de cro- matografia em fase líquida. As técnicas de cromatografia em fase lí- quida contempladas pelo presente pedido incluem métodos para sepa- rar polipeptídeos e técnicas de cromatografia em fase líquida compatí- veis com as técnicas de espectrometria de massa. Em algumas moda- lidades, a técnica de cromatografia em fase líquida compreende uma técnica de cromatografia em fase líquida de alta eficiência. Assim, em algumas modalidades, a técnica de cromatografia em fase líquida compreende uma técnica de cromatografia em fase líquida de ultra- alta eficiência. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia em fase líquida compreende uma técnica de cromatografia em fase líquida de alto fluxo. Em algumas modalidades, a técnica de cromato- grafia em fase líquida compreende uma técnica de cromatografia em fase líquida de baixo fluxo, tal como uma técnica de cromatografia em fase líquida de micro fluxo ou uma técnica de cromatografia em fase líquida de nano fluxo. Em algumas modalidades, a técnica de croma- tografia em fase líquida compreende uma técnica de cromatografia em fase líquida online acoplada a um espectrômetro de massa. Em algu- mas modalidades, a técnica de cromatografia em fase líquida online é uma técnica de cromatografia em fase líquida de alta eficiência. Em algumas modalidades, a técnica de cromatografia em fase líquida onli- ne é uma técnica de cromatografia em fase líquida de ultra-alta efici- ência.
[0092] Em algumas modalidades, as técnicas de eletroforese capi- lar (CE), ou técnicas de eletropulverização ou MALDI, podem ser utili- zadas para introduzir a amostra no espectrômetro de massa.
[0093] Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massa compreende uma técnica de ionização. As técnicas de ioniza- ção contempladas pelo presente pedido incluem técnicas capazes de carregar polipeptídeos e produtos peptídicos. Assim, em algumas mo- dalidades, a técnica de ionização é a ionização por eletropulverização. Em algumas modalidades, a técnica de ionização é a ionização por nanoeletropulverização. Em algumas modalidades, a técnica de ioni- zação é a ionização química por pressão atmosférica. Em algumas modalidades, a técnica de ionização é a fotoionização de pressão at- mosférica. Em algumas modalidades, a técnica de ionização e dessor- ção a laser assistida por matriz (MALDI). Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massa compreende ionização por eletro- pulverização, ionização por nanoeletropulverização ou uma técnica de ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI).
[0094] Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende analisar os produtos peptídicos por meio de uma técnica de espectro- metria de massa. Os espectrômetros de massa contemplados pela presente invenção, à qual uma técnica de cromatografia em fase líqui- da online é acoplada, incluem espectrômetros de massa de alta reso- lução e espectrômetros de massa de baixa resolução. Assim, em al- gumas modalidades, o espectrômetro de massa é um espectrômetro de massa de tempo de trajetória (TOF). Em algumas modalidades, o espectrômetro de massa é um espectrômetro de massa quadripolar de tempo de trajetória (Q-TOF). Em algumas modalidades, o espectrôme- tro de massa é um espectrômetro de massa de tempo de trajetória de coletor de íons quadripolares (QIT-TOF). Em algumas modalidades, o espectrômetro de massa é um coletor de íons. Em algumas modalida- des, o espectrômetro de massa é um quadripolar único. Em algumas modalidades, o espectrômetro de massa é um quadripolar triplo (QQQ). Em algumas modalidades, o espectrômetro de massa é um analisador de massa de armadilha de íon (orbitrap). Em algumas mo- dalidades, o espectrômetro de massa é um analisador de massa de armadilha de íon (orbitrap) quadripolar. Em algumas modalidades, o espectrômetro de massa é um espectrômetro de massa de ressonân- cia de íon ciclotron com transformação de Fourier (FT). Em algumas modalidades, o espectrômetro de massa é um espectrômetro de mas- sa de ressonância de íon ciclotron com transformação de Fourier qua- dripolar (Q-FT). Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massa compreende o modo de íons positivos. Em algumas modali- dades, a técnica de espectrometria de massa compreende o modo de íons negativos. Em algumas modalidades, a técnica de espectrometria de massa compreende uma técnica de espectrometria de massa de tempo de trajetória (TOF). Em algumas modalidades, a técnica de es- pectrometria de massa compreende uma técnica de espectrometria de massa de tempo de trajetória quadripolar (Q-TOF). Em algumas moda- lidades, a técnica de espectrometria de massa compreende uma técni- ca de espectrometria de massa de mobilidade iônica. Em algumas modalidades, uma técnica de espectrometria de massa de baixa reso- lução, como um coletor de íons, ou uma abordagem quadripolar única ou tripla é apropriada.
[0095] Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende o processamento dos sinais de MS obtidos dos produtos peptídicos. Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende a detec-
ção máxima. Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compre- ende determinar a intensidade de ionização de um produto peptídico. Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende determi- nar a altura máxima de um produto peptídico. Em algumas modalida- des, a técnica de LC/MS compreende determinar a área máxima de um produto peptídico. Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende determinar o volume máximo de um produto peptídico. Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende identificar os produtos peptídicos através da sequência de aminoácido. Em al- gumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende a validação manual das designações de sequência de aminoácido do produto pep- tídico. Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende a identificação do primeiro polipeptídeo por um identificador de proteína. Em algumas modalidades, a técnica de LC/MS compreende a identifi- cação de um ou mais da pluralidade de polipeptídeos por um identifi- cador de proteína, que pode ser identificado em uma pesquisa em banco de dados ou em uma pesquisa em biblioteca.
[0096] Em algumas modalidades, a identificação de produtos pep- tídicos de um polipeptídeo pode ser alcançada utilizando bibliotecas espectrais. Geralmente, o uso de bibliotecas espectrais leva em conta a imputação do conhecimento adquirido em relação a um sistema de polipeptídeo e resulta em maior velocidade de análise de dados e me- nor erro. Uso de métodos de quantificação absoluta
[0097] Os métodos de quantificação absoluta livre de marcador baseados em MS aqui divulgados são especialmente adequados para uso compreendendo a quantificação de um polipeptídeo de baixa abundância em uma amostra que compreende o polipeptídeo de baixa abundância e outro polipeptídeo de relativa abundância elevada. Os métodos de quantificação absoluta livre de marcador com base na MS aqui divulgados podem, por exemplo, constituir uma única etapa em um processo de múltiplas etapas, tal como a quantificação de uma proteína de baixa abundância na purificação de uma proteína terapêu- tica.
[0098] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos para detectar um polipeptídeo contaminado na produção de um polipeptídeo terapêutico, os métodos compreendendo: (a) obter uma amostra que compreende o polipeptídeo terapêutico; (b) determinar se o polipeptídeo contaminado está presente na amostra, em que a pre- sença do polipeptídeo contaminado baseia-se na quantificação absolu- ta do polipeptídeo contaminado na amostra utilizando os métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína da célula hospedeira. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo contaminado é uma proteína viral, tal como uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um po- lipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, mais do que um po- lipeptídeo contaminado é detectado em uma amostra (por exemplo, e a quantidade total de polipeptídeos contaminados na amostra é quanti- ficada). Em uma modalidade, a amostra é tomada em várias etapas durante o processo de produção de um polipeptídeo recombinante (por exemplo, um polipeptídeo terapêutico), para analisar a pureza do poli- peptídeo recombinante nas várias etapas. Quanto mais baixa a quan- tidade de polipeptídeos contaminados (por exemplo, polipeptídeos da célula hospedeira) identificados, tanto mais elevada a pureza do poli- peptídeo recombinante será indicada.
[0099] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos de produção de um polipeptídeo terapêutico, os métodos com- preendendo: (a) a obtenção de uma amostra que compreende o poli- peptídeo terapêutico a partir de um estágio do processo de produção, por exemplo, colheita de cultura de células ou uma etapa de purifica-
ção; (b) a identificação de um polipeptídeo contaminado na amostra; (c) a determinação do nível do polipeptídeo contaminado na amostra, em que o nível do polipeptídeo contaminado baseia-se na quantifica- ção absoluta do polipeptídeo contaminado na amostra utilizando os métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína da célula hospedeira. Em algumas moda- lidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína viral, tal como uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, o segundo poli- peptídeo é um polipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, mais do que um polipeptídeo contaminado é detectado em uma amos- tra (por exemplo, e a quantidade total de polipeptídeos contaminados na amostra é quantificada). Em uma modalidade, a amostra é tomada em várias etapas durante o processo de produção de um polipeptídeo recombinante (por exemplo, um polipeptídeo terapêutico), para anali- sar a pureza do polipeptídeo recombinante nas várias etapas. Quanto mais baixa a quantidade de polipeptídeos contaminados (por exemplo, polipeptídeos da célula hospedeira) identificados, tanto mais elevada a pureza do polipeptídeo recombinante será indicada.
[00100] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos de purificação de um polipeptídeo terapêutico, os métodos com- preendendo: (a) a obtenção de uma amostra que compreende o poli- peptídeo terapêutico a partir de um ou mais estágios de um processo de purificação, por exemplo, colheita da cultura celular ou etapa de purificação; (b) a identificação de um polipeptídeo contaminado na amostra; (c) a determinação do nível do polipeptídeo contaminado na amostra nas um ou mais estágios de um processo de purificação, em que o nível do polipeptídeo contaminado é baseado na quantificação absoluta do polipeptídeo contaminado na amostra utilizando os méto- dos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o polipeptídeo conta- minado é uma proteína da célula hospedeira. Em algumas modalida-
des, o polipeptídeo contaminado é uma proteína viral, tal como uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptí- deo é um polipeptídeo terapêutico. Em algumas modalidades, mais do que um polipeptídeo contaminado é detectado em uma amostra (por exemplo, e a quantidade total de polipeptídeos contaminados na amostra é quantificada). Em uma modalidade, a amostra é tomada em várias etapas durante o processo de produção de um polipeptídeo re- combinante (por exemplo, um polipeptídeo terapêutico), para analisar a pureza do polipeptídeo recombinante nas várias etapas. Quanto me- nor a quantidade de polipeptídeos contaminados (por exemplo, poli- peptídeos da célula hospedeira) identificados, tanto maior a pureza do polipeptídeo recombinante será indicada.
[00101] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos para detectar um polipeptídeo contaminado em um produto de terapia genética. Os métodos incluem, por exemplo, (a) a obtenção de uma amostra compreendendo um vetor de terapia genética, a partir de um ou mais estágios de um processo de purificação, por exemplo, co- lheita de cultura celular ou uma etapa de purificação; (b) a identifica- ção de um polipeptídeo contaminado na amostra; (c) a determinação do nível do polipeptídeo contaminado na amostra no um ou mais está- gios de um processo de purificação, em que o nível do polipeptídeo contaminado é baseado na quantificação absoluta do polipeptídeo contaminado na amostra utilizando os métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o produto de terapia genética está associado a uma proteína viral, tal como um capsídeo. Em algumas modalidades, o produto de terapia genética compreende uma proteína viral, tal como um capsídeo. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética está associado com uma proteína viral, tal como um capsídeo. Em al- gumas modalidades, o vetor de terapia genética faz parte de uma par- tícula viral compreendendo uma proteína viral, tal como um capsídeo.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína da célula hospedeira. Em algumas modalidades, o polipeptídeo con- taminado é uma proteína viral, tal como uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína vi- ral que não está associada ao produto de terapia genética. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína viral que não faz parte do produto de terapia genética. Em algumas modali- dades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína de vírus auxiliar. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é uma proteína vi- ral, tal como uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, mais do que um polipeptídeo contaminado é detectado em uma amos- tra (por exemplo, e a quantidade total de polipeptídeos contaminados na amostra é quantificada). Em uma modalidade, a amostra é tomada em várias etapas durante o processo de produção do produto de tera- pia genética, para analisar a pureza do produto de terapia genética nas várias etapas. Quanto menor a quantidade de polipeptídeos con- taminados (por exemplo, polipeptídeos da célula hospedeira) identifi- cados, tanto maior a pureza do produto de terapia genética será indi- cada.
[00102] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos de produção de um produto de terapia genética. Os métodos incluem, por exemplo, (a) a obtenção de uma amostra que compreen- de um vetor de terapia genética, a partir de um ou mais estágios de um processo de purificação, por exemplo, colheita de cultura celular ou uma etapa de purificação; (b) a identificação de um polipeptídeo con- taminado na amostra; (c) a determinação do nível do polipeptídeo con- taminado na amostra no um ou mais estágios de um processo de puri- ficação, em que o nível do polipeptídeo contaminado baseia-se na quantificação absoluta do polipeptídeo contaminado na amostra utili- zando os métodos aqui divulgados. Em algumas modalidades, o pro-
duto de terapia genética está associado a uma proteína viral, tal como um capsídeo. Em algumas modalidades, o produto de terapia genética compreende uma proteína viral, tal como um capsídeo. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética está associado com uma pro- teína viral, tal como um capsídeo. Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética faz parte de uma partícula viral compreendendo uma proteína viral, tal como um capsídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína da célula hospedeira. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína vi- ral, tal como uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína viral que não está associada ao produto de terapia genética. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo contaminado é uma proteína viral que não faz parte do produto de terapia genética. Em algumas modalidades, o polipeptídeo contamina- do é uma proteína de vírus auxiliar. Em algumas modalidades, o se- gundo polipeptídeo é uma proteína viral, tal como uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, mais do que um polipeptídeo contaminado é detectado em uma amostra (por exemplo, e a quanti- dade total de polipeptídeos contaminados na amostra é quantificada). Em uma modalidade, a amostra é tomada em várias etapas durante o processo de produção do produto de terapia genética, para analisar a pureza do produto de terapia genética nas várias etapas. Quanto me- nor a quantidade de polipeptídeos contaminados (por exemplo, poli- peptídeos da célula hospedeira) identificados, tanto maior a pureza do produto de terapia genética será indicada.
[00103] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos para purificar um produto de terapia genética. Os métodos inclu- em, por exemplo, (a) a obtenção de uma amostra compreendendo um vetor de terapia genética, a partir de um ou mais estágios de um pro- cesso de purificação, por exemplo, colheita de cultura celular ou uma etapa de purificação; (b) a identificação de um polipeptídeo contami- nado na amostra; (c) a determinação do nível do polipeptídeo conta- minado na amostra no um ou mais estágios de um processo de purifi- cação, em que o nível do polipeptídeo contaminado baseia-se na quantificação absoluta do polipeptídeo contaminado na amostra utili- zando os métodos aqui divulgados.
Em algumas modalidades, o pro- duto de terapia genética está associado a uma proteína viral, tal como um capsídeo.
Em algumas modalidades, o produto de terapia genética compreende uma proteína viral, tal como um capsídeo.
Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética está associado a uma proteí- na viral, tal como um capsídeo.
Em algumas modalidades, o vetor de terapia genética faz parte de uma partícula viral que compreende uma proteína viral, tal como um capsídeo.
Em algumas modalidades, o po- lipeptídeo contaminado é uma proteína da célula hospedeira.
Em al- gumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína viral, tal como uma proteína do capsídeo.
Em algumas modalidades, o poli- peptídeo contaminado é uma proteína viral que não está associada ao produto de terapia genética.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína viral que não faz parte do produto de te- rapia genética.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo contaminado é uma proteína de vírus auxiliar.
Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é uma proteína viral, tal como uma proteína do capsídeo.
Em algumas modalidades, mais do que um polipeptídeo contaminado é detectado em uma amostra (por exemplo, e a quantidade total de polipeptídeos contaminados na amostra é quantificada). Em uma mo- dalidade, a amostra é tomada em várias etapas durante o processo de produção do produto de terapia genética, para analisar a pureza do produto de terapia genética nas várias etapas.
Quanto mais baixa a quantidade de polipeptídeos contaminados (por exemplo, polipeptí- deos da célula hospedeira) identificados, tanto mais elevada a pureza do produto de terapia genética será indicada.
[00104] Em algumas modalidades, os métodos aqui divulgados ain- da compreendem o ajuste de um protocolo com base na presença de um polipeptídeo contaminante. Por exemplo, um processo de purifica- ção pode ser ajustado com base na presença de um polipeptídeo con- taminante identificado e quantificado. Tais ajustes fornecem métodos para melhorar a pureza de um polipeptídeo alvo, tal como um polipep- tídeo terapêutico.
[00105] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos de tratamento de uma doença em um indivíduo, em que o indiví- duo é selecionado para tratamento com base em uma quantidade de um biomarcador no indivíduo. Em algumas modalidades, o biomarca- dor é quantificado em uma amostra de soro. Em algumas modalida- des, o primeiro polipeptídeo é um biomarcador. Em algumas modali- dades, o segundo polipeptídeo é albumina sérica.
[00106] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos para avaliar uma doença em um indivíduo, em que o indivíduo é avaliado com base em uma quantidade de um biomarcador no indiví- duo. Em algumas modalidades, a quantidade do biomarcador é quanti- ficada em uma amostra de soro. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é um biomarcador. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é albumina sérica.
[00107] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece mé- todos de diagnóstico de uma doença em um indivíduo, em que o indi- víduo é diagnosticado com a doença com base em uma quantidade de um biomarcador no indivíduo. Em algumas modalidades, a quantidade do biomarcador é quantificada em uma amostra de soro. Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo é um biomarcador. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é albumina sérica. Sistemas
[00108] A presente invenção fornece sistemas e meios legíveis por computador não transitórios úteis para determinar a quantidade abso- luta de polipeptídeo de um primeiro polipeptídeo em uma amostra compreendendo uma pluralidade de polipeptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo.
[00109] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um sistema para quantificação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que compreende o primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, o sistema compreendendo: (a) um espectrômetro de massa; (b) um computador; (c) um meio legível por computador não transitório, incluindo instruções nele armazenadas que, quando execu- tadas, executam o processamento incluindo: cálculo da média ou so- ma de um sinal de MS para: (i) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais altos na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra (C); e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados uti- lizando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e determinação de uma quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra com base na seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos. Em algumas modalida-
des, o sistema compreende ainda um cromatógrafo líquido.
[00110] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um meio legível por computador não transitório, incluindo instruções nele armazenadas que, quando executadas, executam o processamento para quantificação absoluta de um primeiro polipeptídeo em uma amostra que compreende o primeiro polipeptídeo e um segundo poli- peptídeo, o processamento incluindo: calcular a média ou a soma de um sinal de MS para: (i) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amos- tra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produ- tos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de car- ga de amostra (C); e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantida- de de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados usando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e determinar uma quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra com base na seguinte fórmu- la: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos.
[00111] Aqueles versados na técnica reconhecerão que várias mo- dalidades são possíveis dentro do escopo e espírito desta invenção. A invenção será agora descrita com maiores detalhes por referência aos seguintes exemplos não limitativos. Os seguintes exemplos ainda ilus- tram mais a invenção, mas, naturalmente, não devem ser interpreta-
dos como limitativos de seu escopo de qualquer maneira.
[00112] Como usado aqui, o termo "polipeptídeo" refere-se a um polímero que compreende aminoácidos covalentemente unidos por meio de ligações peptídicas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é uma proteína. Em alguns casos, uma proteína compreende dois ou mais polipeptídeos (por exemplo, uma proteína multimérica, uma pro- teína homomérica, um complexo de múltiplas proteínas). Os polipeptí- deos podem ser ainda modificados com componentes não aminoáci- dos. Por exemplo, um polipeptídeo pode ainda compreender modifica- ções enzimaticamente mediadas e/ou modificações químicas (por exemplo, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, formilação, glicosila- ção, oxidação). Tais modificações podem ocorrer, por exemplo, em ambientes baseados em células ou como um resultado de técnicas de processamento e/ou análise de amostras.
[00113] Como aqui utilizado, o termo "produto peptídico" refere-se a um polímero que compreende dois ou mais aminoácidos unidos cova- lentemente por meio de ligações peptídicas obtidas após o processa- mento de decomposição de um polipeptídeo. Por exemplo, os produ- tos peptídicos são obtidos após o processamento da decomposição de um polipeptídeo incluindo a digestão química (por exemplo, hidrólise ácida) ou digestão enzimática (por exemplo, digestão com tripsina). Em algumas modalidades, o produto peptídico é um peptídeo tríptico. Em algumas modalidades, o produto peptídico é um fragmento termi- nal de um polipeptídeo maior. Em algumas modalidades, o produto peptídico é um fragmento interno de um polipeptídeo.
[00114] O termo "compreende" é utilizado nesta invenção para sig- nificar que outros componentes, ingredientes, etapas etc. estão opcio- nalmente presentes. Por exemplo, um artigo "compreendendo" os componentes A, B e C pode consistir em (ou seja, conter apenas) componentes A, B e C, ou pode conter não apenas os componentes A,
B e C, mas também um ou mais de outros componentes. Entende-se que "compreende" e seus equivalentes gramaticais incluem "consistin- do em" ou "consistindo essencialmente em".
[00115] Onde uma faixa de valor é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto indique claramente o contrário, entre o limite superior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor mencionado ou interveniente nessa faixa mencionada, é incluído dentro da divulgação, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa mencionada. Onde a faixa mencionada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo cada um ou ambos os limites incluídos também são incluídas na divul- gação.
[00116] A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro nesta in- venção inclui (e descreve) variações direcionadas a esse valor ou pa- râmetro em si. Por exemplo, a descrição referente à "cerca de X" inclui a descrição de "X".
[00117] Conforme utilizado nesta invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "ou" "o" e "a" incluem refe- rentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
EXEMPLOS Exemplo 1 Estudo de carga da ASM que demonstra a resposta do sinal de MS linear melhorada de um conjunto intermediário de íons de produtos peptídicos de ASM
[00118] Este exemplo demonstra um estudo de carga utilizando uma amostra que compreende a esfingomielina fosfodiesterase (ASM) para a seleção de uma primeira quantidade de carga de amostra e uma segunda quantidade de carga. Além disso, este exemplo demons- tra a resposta de sinal de MS linear melhorada de um conjunto inter- mediário de íons de produto peptídico da ASM, em comparação com um conjunto superior de íons de produto peptídico mais abundantes de ASM.
[00119] Em triplicata, uma amostra de ASM foi desnaturada, redu- zida e alquilada antes da digestão com LysC e tripsina. A análise de LC/MS foi executada nas amostras digeridas em 1 μg, 2,5 μg, 5 μg, 7,5 μg, 10 μg, 12,5 μg, 15 μg, 18 μg e 20 μg. A cromatografia foi exe- cutadas com uma ACQUITY UPLC com uma coluna de 2,1 por 150 mm acondicionada com material CSH130 C18 1,7 µm. Os dados foram adquiridos utilizando varreduras alternadas de energia de colisão baixa e elevada em um Xevo Q-Tof G2-XS para gerar informações de íons precursores e de fragmentos. As áreas máximas de MS e o erro per- centual médio para cada íon do produto peptídico na faixa de quanti- dades de amostra dos 40 principais íons mais abundantes do produto peptídico de do ASM foram calculadas.
[00120] A FIG. 1 mostra um histograma das áreas máximas de MS para os quarenta íons de produto peptídico mais abundantes observa- dos em uma análise de LC/MS de uma amostra compreendendo es- fingomielina fosfodiesterase (ASM) em diferentes quantidades de car- ga de amostra (a quantidade de carga de amostra por análise de LC/MS é ordenada como 1 μg, 2,5 μg, 5 μg, 7,5 μg, 10 μg, 12 μg, 15 μg, 18 μg e 20 μg, da esquerda para a direita para cada conjunto de barras peptídicas). O erro percentual médio para cada íon do produto peptídico através das quantidades de carga de amostra é mostrado acima do conjunto de barras peptídicas.
[00121] Como mostrado na FIG. 1, os produtos peptídicos mais in- tensos de ASM possuem um erro maior em relação a todos os íons de produto peptídico, especialmente quando a quantidade total da amos- tra aumenta. Os peptídeos no centro da distribuição de íons do produ- to peptídico se comportam de maneira mais linear e possuem um erro menor em relação a todos os íons do produto peptídico, até mesmo as quantidades totais de carga de amostra de 20 µg.
[00122] Utilizando dados no estudo de carga, um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo e um conjunto intermediário de número m de íons qualifi- cados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo podem ser se- lecionados. Por exemplo, o conjunto superior de número n, por exem- plo, 3, de íons qualificados de produtos peptídicos de ASM, pode inclu- ir íons de produtos peptídicos selecionados de Peptídeo A (z = 4), Peptídeo B (z = 3) e Peptídeo C (z = 4). O conjunto intermediário de número m, por exemplo, 3, de íons qualificados de produtos peptídicos de ASM, pode incluir íons de produtos peptídicos selecionados de Peptídeo D (z = 2), Peptídeo M (z = 4), Peptídeo O (z = 1), Peptídeo M (z = 3), Peptídeo B (z = 2), Peptídeo L (z = 2), Peptídeo P (z = 1) e Peptídeo Q (z = 1).
[00123] Além disso, utilizando os dados coletados a partir do estudo de carga de ASM, a área máxima somada versus a amostra carregada na coluna (μg) foi traçada em gráfico para cada quantidade de carga de amostra utilizando o conjunto superior dos 3 íons mais abundantes de produto peptídico (Top-3) e um conjunto intermediário de 3 íons de produto peptídico (Middle-3) (FIG. 2). O comportamento não linear do conjunto de produtos peptídicos Top-3 pode ser visto bem abaixo da quantidade ideal de carga de amostra (10 µg). O conjunto de produtos peptídicos Middle-3 comportou-se linearmente sobre as quantidades de carga da amostra do estudo de carga, demonstrando assim que os íons de produto peptídico Middle-3 são adequados para as técnicas de quantificação da presente invenção. O R2 para uma regressão linear também é aprimorado utilizando o conjunto de produtos peptídicos Middle-3 (0,98 para o conjunto de produtos peptídicos Middle-3 em comparação com 0,87 para o conjunto de produtos peptídicos Top-3).
[00124] O erro percentual para cada conjunto de produtos peptídi-
cos em cada concentração em relação à carga de 2,5 µg é fornecido na Tabela 1. O erro percentual entre a relação esperada e a relação observada para o conjunto de produtos peptídicos Middle-3 foi menor do que o conjunto de produtos peptídicos Top-3 para todas as quanti- dades de carga de amostra. Carga (µg) Erro Hi-3 Erro Mid-3 20 76% 33% 18 73% 26% 15 68% 17% 12,5 61% 5% 10 53% 5% 7,5 42% 12% 5 27% 13% Tabela 1. Erro percentual do conjunto de produtos peptídicos Top-3 e do conjunto de produtos peptídicos Middle-3 em cada quantidade de carga de amostra em relação ao conjunto de produtos peptídicos de carga de 2,5 µg. Exemplo 2 Métodos de determinação da quantidade de polipeptídeos
[00125] Este exemplo demonstra a melhora da reprodutibilidade de quantificação do método Mid-3 em comparação com o método Hi-3 utilizando quatro lotes de produção de proteína de um produto de pro- teína terapêutica testado em quatro ocasiões diferentes.
[00126] Quatro lotes de produção de proteína (Lote 1, Lote 2, Lote 3, Lote 4) da proteína X foram preparados e analisados conforme di- vulgado no Exemplo 1. Para o método Hi-3, 200 fmol de um produto peptídico padrão ClpB (E. coli Chaperone ClpB) foram reforçados em cada amostra como um padrão interno.
[00127] Como medido pelo método Hi-3, a ppm total de proteína da célula hospedeira em relação aos produtos peptídicos de ClpB refor- çados foi traçada em gráfico para cada lote de produção de proteína (FIG. 3A). As medidas de quantificação do método Hi-3 tiveram um desvio padrão relativo de 82%.
[00128] Conforme medido pelo método Mid-3, a ppm total de prote- ína da célula hospedeira (HCP) foi traçada em gráfico para cada lote de produção de proteína (FIG. 3B). As medidas de quantificação do método Mid-3 tiveram um desvio padrão relativo de 16%.
[00129] A equação utilizada para calcular a quantidade de polipep- tídeo para o método Mid-3 é como se segue: [(Soma da área máxima dos 3 principais íons de produto peptídico de HCP na carga de quantidade de amostra elevada) / (Soma da área máxima de 3 íons de produto peptídico intermediários do produto de proteína terapêutica na carga de quantidade de amostra elevada)] * (fmol de o produto de proteína terapêutica em carga de quantidade de amostra elevada) * [(Soma da área máxima dos 3 íons de produto pep- tídico intermediários do produto de proteína terapêutica na carga de quantidade de amostra baixa) / (Soma da área máxima dos 3 íons de produto peptídico superior do produto de proteína terapêutica na carga de quantidade de amostra baixa)].
[00130] O uso do método Hi-3 com 200 fmol de peptídeos ClpB como o padrão interno gerou um erro maior, em comparação com o método Mid-3. A quantificação absoluta foi muito mais reproduzível utilizando o método Mid-3. A maior variabilidade foi devida ao padrão interno reforçado, embora as diferenças na digestão enzimática tam- bém possam ter ocorrido. Em 10 µg na coluna, o conjunto intermediá- rio de produtos peptídicos foi mais apropriado para uso na quantifica- ção, uma vez que se comportavam linearmente. Exemplo 3 Aplicação do método de quantificação Mid-3 para detecção e rastrea- mento de proteínas de células hospedeiras durante a purificação de uma proteína terapêutica
[00131] Este exemplo demonstra uma aplicação do método de quantificação Mid-3 aqui divulgado para detecção e rastreamento de alto rendimento de proteínas de células hospedeiras contaminantes (HCPs) em múltiplos estágios durante um processo de purificação de uma proteína terapêutica, incluindo amostras coletadas de uma colhei- ta de cultura celular para amostras coletadas seguindo um protocolo final de dessalinização. Este exemplo demonstra ainda o uso de sof- tware para rastrear peptídeos de HCPs por tempo de retenção e m/z para quantificação livre de marcador de HCPs nas amostras de purifi- cação em último estágio e uso de pesquisas baseadas em bibliotecas espectrais para melhorar ainda mais o rendimento e otimizar a quanti- ficação absoluta. Métodos:
[00132] Após a produção baseada na cultura celular de uma proteí- na terapêutica (proteína X), amostras foram coletadas da colheita de cultura de células e em 5 estágios de um processo de purificação de proteínas, incluindo amostras finais de substâncias medicamentosas. O uso de triplicatas forneceu poder estatístico de medições a jusante, incluindo a reprodutibilidade e dados de rendimento. Depois que as amostras foram coletadas, as amostras de colheita foram filtradas através de um filtro 3k MWCO Amicon Ultra-15 (EMD Millipore) de acordo com as instruções do fabricante para concentrar e remover adi- tivos que impedem a análise espectrométrica de massa antes de se- rem desnaturados e digeridos com o restante das amostras. Resumi- damente, uma etapa de enxágue com água dos dispositivos Amicon foi concluída e, em seguida, 400 µg de proteína total ou proteína tera- pêutica por amostra foram adicionados com o bicarbonato de amônio 50 mM (Ambic) adicionado em cima para um volume total de 15 ml. Subsequentemente, uma lavagem de 15 ml de Ambic 50 mM foi con- cluída, antes de uma etapa final de centrifugação. As concentrações finais foram medidas entre 1,4 e 1,7 mg/ml de proteína total ou proteí-
na terapêutica. Alíquotas em triplicata de cada amostra (da colheita filtrada por Amicon através da substância medicamentosa (DS), assim como uma digestão em branco) foram diluídas para 1 mg/ml em Ambic 50 mM e misturadas 1:1 com Rapigest (Waters, reconstituído com Ambic 50 mM até uma concentração de 0,1%), criando uma solução final de 0,5 mg/ml de proteína em Rapigest 0,05%, Ambic 50 mM. As amostras foram incubadas a 60 ºC durante 15 minutos para garantir a desnaturação das proteínas. A redução dos dissulfetos foi executada com 1,4-ditiotreitol 10 mM (DTT) (Pierce) em Ambic 50 mM a 60 ºC durante 1 hora. As amostras foram deixadas esfriar para a temperatura ambiente antes da alquilação com 2-Iodoacetamida 20 mM (IAA) (Pi- erce) em Ambic 50 mM e incubadas na temperatura ambiente no escu- ro durante 30 minutos. Lys-C (Promega, 15 µg/frasco) foi reconstituído em Ambic 50 mM em uma concentração de 0,125 µg/µl e adicionado a cada amostra em uma relação de enzima:substrato de 1:50. As amos- tras foram incubadas durante a noite a 37 ºC. Na manhã seguinte, a solução de tripsina (Promega, 100 µg/frasco) foi preparada em 0,4 µg/µl em Ambic 50 mM e adicionada à amostra em uma relação 1:25 e incubada a 37 ºC durante 3 horas. O Rapigest foi removido através da clivagem ácida com a adição de ácido fórmico a 2,05% (EMD Millipo- re). As amostras foram incubadas durante 30 minutos a 37 ºC antes de serem centrifugadas em 12.000 rpm durante 15 minutos para granular o Rapigest clivado e qualquer proteína não digerida. Cada frasco de amostrador automático foi preparado com 20 µg de amostra digerida, 400 fmol do padrão Hi3 E. coli (Waters) e diluído para um volume final de 60 µl com ácido fórmico a 0,1% para injeção sobre a LC-MS.
[00133] As amostras digeridas (30 µl ou 10 µg na coluna) foram in- jetadas em um sistema Waters ACQUITY H-Class UPLC acoplado a um espectrômetro de massa Waters XEVO G2-XS QTof para análise de LC-MS utilizando uma coluna CSH C18 1,7 µm (2,1 mm x 150 mm,
Waters). O espectrômetro de massa foi configurado para coletar dados MSE ao longo da faixa de massa de 50 a 2000 com varreduras de 0,3 segundos no modo de sensibilidade. Todas as amostras foram opera- das em ordem aleatória dentro do estágio de limpeza (isto é, amostras em branco e substância medicamentosa escolhida a esmo ao mesmo tempo e operadas em primeiro lugar; amostras de eluato da coluna do processo intermediária escolhidas a esmo e operadas logo depois; e a colheita de cultura celular distribuída aleatoriamente e operada por úl- timo). O UPLC utilizou água e acetonitrila (ACN) com ácido fórmico a 0,1% como aditivos e um gradiente de 5 a 40% de ACN durante 30 minutos, aumentando para 85% de ACN em 5 minutos, mantendo-se durante 2 minutos e retornando às condições iniciais em 3 minutos e mantendo durante 5 minutos com um fluxo volumétrico de 250 µl/min e tempo total de gradiente de 45 minutos.
[00134] Os arquivos de dados de MS foram importados para o sof- tware Progenesis Qi for Proteomics (Nonlinear Dynamics) para sele- ção máxima e alinhamento de íon precursor/produto antes de serem pesquisados junto a um banco de dados de sequência utilizando o al- goritmo de busca MSE (Waters). O banco de dados combinou se- quências de produto de proteína terapêutica, proteínas contaminantes comuns, o banco de dados Chinese hamster Uniprot, e uma versão reversa de cada uma (69.916 sequências totais). As identificações fo- ram executadas com a exigência de 3 fragmentos por peptídeo, 7 fra- gmentos por proteína e pelo menos 2 peptídeos por proteína com um FDR de 4% ou menos. Filtragem adicional foi usada para obter < 1% de FDR utilizando uma pontuação de peptídeo > 5 e erro de massa de peptídeo < 10 ppm. Geralmente, as identificações peptídicas foram executadas nas amostras de processo mais a montante, por exemplo, amostras de colheita, mas esse nem sempre foi o caso. Peptídeos que não correspondiam à tendência com relação à proteína não foram in-
cluídos para quantificação. As proteínas foram quantificadas com base na abundância dos três principais peptídeos por proteína (em todas as três injeções) em comparação com os três principais peptídeos para ClpB (Hi-3) ou com os peptídeos de comportamento linear no produto (Mid-3) para determinar a quantidade relativa de proteínas presentes em cada amostra. Resultados e debate:
[00135] Um risco do uso de ferramentas de software de descoberta proteômica para a análise de HCPs de abundância relativamente baixa em uma mistura de produção de proteína terapêutica é que íons abun- dantes da proteína terapêutica podem ser incorretamente identificados como HCPs. Recentemente, foi demonstrado que artefatos de proteí- nas abundantes podem ser identificados incorretamente como outras proteínas em uma taxa muito mais elevada do que a taxa de decai- mento (Kong et al. Nature methods. 2017; 14(5):513-520). Também é possível que as HCPs também possam ser identificadas corretamente no nível da proteína, mas alguns peptídeos dessas HCPs podem estar incorretos ou interferir com outros íons, desse modo, elas não devem ser utilizadas para quantificação.
[00136] O método divulgado nesta invenção utiliza a propriedade físico-química ortogonal do padrão de intensidade ao longo do proces- so de purificação para filtrar essas identificações falsas positivas, as- sim como peptídeos com interferências. Dentro do Progenesis Qi for Proteomics, cada peptídeo foi listado juntamente com a pontuação de identificação e a precisão da massa, assim como uma visualização da tendência do peptídeo em todo o experimento. Uma imagem que mos- tra a detecção de cada peptídeo em m/z e tempo de retenção também foi mostrada para que outros íons interferentes possam ser observa- dos. Os peptídeos que possuem, por exemplo, interferência observa- da, não foram utilizados para quantificação.
[00137] O tempo de análise de LC-MS para a análise de amostras de todo o processo de purificação foi concluído em cerca de dois dias (o tempo de análise de LC-MS para uma única amostra foi de cerca de 45 minutos). A validação manual da identificação de todos os peptí- deos, incluindo peptídeos de HCPs, levou aproximadamente duas se- manas. Após a validação, uma lista final de HCPs identificadas a partir das amostras de produção de proteínas terapêuticas foi quantificada. Conforme mostrado na FIG. 4, as HCPs comuns foram identificadas entre sete lotes de produção. As análises estatísticas foram executa- das para entender o processo de purificação, por exemplo, Principal Components Analysis (PCA), que forneceu uma ilustração da remoção das HCPs durante cada etapa do processo de purificação. Outra análi- se das HCPs incluiu agrupamentos hierárquicos, os quais agrupam proteínas que se comportam de maneira semelhante durante o pro- cesso de purificação. O agrupamento hierárquico levou em conta a investigação dos pontos centrais para descobrir quais proteínas estão sendo removidas durante cada etapa do processo de purificação. Es- ses dados foram utilizados para compreender e otimizar os processos de purificação para garantir que as HCPs específicas fossem elimina- dos do produto final de proteína terapêutica. As HCPs que não foram adequadamente purificadas da proteína terapêutica foram removidas mediante a otimização do processo de purificação com base, por exemplo, nas propriedades físico-químicas das HCPs, incluindo pI, pe- so molecular, hidrofobicidade, atividade e imunogenicidade. O softwa- re também foi utilizado para monitorar automaticamente a presença de HCPs ao longo do curso de um processo de purificação.
[00138] A maior fonte de variabilidade na quantificação absoluta de HCPs entre as ocasiões do ensaio tem sido a quantidade de padrão interno escolhido ou a quantidade desse padrão interno de nível de peptídeo para as HCPs, que são proteínas digeridas. O padrão interno escolhido era geralmente os peptídeos Hi-3 ClpB que deveriam ser utilizados para quantificação absoluta.
Muito cuidado foi tomado para solubilizar, dividir em alíquotas e armazenar o padrão, mas a variabili- dade pode ocorrer devido a diferenças das medições com pipeta entre, por exemplo, operadores, ou alterações na digestão enzimática entre as ocasiões do ensaio.
Em vez de utilizar um padrão interno de sele- ção, como mostrado nesta invenção, os peptídeos da proteína tera- pêutica podem ser utilizados, no entanto, os peptídeos mais abundan- tes da proteína terapêutica geralmente estão em abundância que está além da faixa dinâmica do espectrômetro de massa, ou seja, os peptí- deos mais abundantes de uma proteína terapêutica podem saturar com excesso o detector do espectrômetro de massa.
Utilizando o mé- todo peptídico mais abundante (método Hi-3), observou-se que os peptídeos mais abundantes apresentam comportamento não linear devido a, por exemplo, saturação do detector.
Por outro lado, os peptí- deos no meio da distribuição de ionização, que são chamados de pep- tídeos Mid-3, foram observados de ter um comportamento linear do sinal com base na abundância.
Como mostrado nesta invenção, o mé- todo de peptídeo Mid-3, que incorpora dados dos peptídeos Mid-3, produziu um erro menor e apresentou um comportamento linear de até 18 µg na coluna.
Claims (44)
1. Método para a quantificação absoluta de um primeiro po- lipeptídeo em uma amostra que compreende uma pluralidade de poli- peptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo poli- peptídeo, em que o primeiro polipeptídeo é pelo menos 10 vezes me- nor em abundância do que o segundo polipeptídeo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a análise dos produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em uma pluralidade de quantidades de carga de amostra utilizando uma técnica de cromatografia em fase líquida/espectro- metria de massa (LC/MS) para obter sinais de MS de íons dos produ- tos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em cada uma da plurali- dade de quantidades de carga de amostra, em que a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende uma primeira quantidade de carga de amostra e uma se- gunda quantidade de carga de amostra, e em que a primeira quantidade de carga de amostra é maior do que a segunda quantidade de carga de amostra; (b) o cálculo da média ou soma de um sinal de MS para: (i) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto intermediário de número m de íons quali- ficados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produ-
tos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e (c) a determinação de uma quantidade absoluta do primei- ro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra com base na seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos.
2. Método para quantificação absoluta de um primeiro poli- peptídeo em uma amostra que compreende uma pluralidade de poli- peptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo poli- peptídeo, em que o primeiro polipeptídeo é pelo menos 10 vezes me- nor em abundância do que o segundo polipeptídeo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a obtenção de sinais de MS de íons de produtos peptí- dicos da pluralidade de polipeptídeos, em que ditos sinais de MS de íons dos produtos peptídicos são obtidos através da análise dos produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos utilizando uma técnica de cromatografia em fase lí- quida/espectrometria de massa (LC/MS), em que os sinais de MS dos produtos peptídicos são obti- dos para cada uma de uma pluralidade de quantidades de carga de amostra compreendendo uma primeira quantidade de carga de amos- tra e uma segunda quantidade de carga de amostra, e em que a primeira quantidade de carga de amostra é maior do que a segunda quantidade de carga da amostra; (b) o cálculo da média ou soma de um sinal de MS para:
(i) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do primeiro polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na primeira quantidade de carga de amostra (A); (ii) um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quantidade de carga de amostra (B); (iii) um conjunto intermediário de número m de íons quali- ficados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo na primeira quantidade de carga da amostra (C); e (iv) o conjunto intermediário de íons qualificados de produ- tos peptídicos do segundo polipeptídeo na segunda quantidade de carga de amostra (D), em que A, B, C e D são todos calculados utilizando a média ou todos calculados utilizando a soma do sinal de MS; e (c) a determinação de uma quantidade absoluta do primei- ro polipeptídeo na primeira quantidade de carga de amostra com base na seguinte fórmula: [(A)/(C)] * (mol do segundo polipeptídeo na primeira quanti- dade de carga) * [(D)/(B)], ou seus equivalentes matemáticos.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a média do sinal de MS é utilizada para determi- nar a quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a soma do sinal de MS é utilizada para determi- nar a quantidade absoluta do primeiro polipeptídeo.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é seleci- onado com base no erro de quantificação dos íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo da pluralidade das quan- tidades de carga de amostra, ou a primeira quantidade de carga da amostra e/ou a segunda quantidade de carga da amostra.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a seleção do conjunto intermediá- rio de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptí- deo.
7. Método para selecionar um conjunto de íons qualificados de produtos peptídicos para quantificação absoluta de um primeiro po- lipeptídeo em uma amostra que compreende uma pluralidade de poli- peptídeos compreendendo o primeiro polipeptídeo e um segundo poli- peptídeo, em que o primeiro polipeptídeo é pelo menos 10 vezes me- nor em abundância do que o segundo polipeptídeo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) analisar os produtos peptídicos da pluralidade de poli- peptídeos em uma pluralidade de quantidades de carga de amostra utilizando uma técnica de cromatografia em fase líquida/espectro- metria de massa (LC/MS) para obter sinais de MS de íons dos produ- tos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos em cada uma da plurali- dade de quantidades de carga de amostra, em que a pluralidade de quantidades de carga de amostra compreende uma primeira quantidade de carga de amostra e uma se- gunda quantidade de carga de amostra, e em que a primeira a quantidade de carga de amostra é maior do que a segunda quantidade de carga da amostra; e (b) selecionar um conjunto intermediário de número m de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo, em que o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é selecionado com base no erro de quantificação dos íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo da pluralidade de quantidades de carga de amostra ou da primeira quantidade de carga de amostra e/ou da se- gunda quantidade de carga de amostra.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a seleção de um conjunto superior de número n de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo com os sinais de MS mais elevados na segunda quanti- dade de carga de amostra.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 8, caracterizado pelo fato de que cada um dos conjuntos supe- riores de íons qualificados de produtos peptídicos é diferente de cada um dos conjuntos intermediários de íons qualificados.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o sinal de MS é a intensida- de de ionização.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o sinal de MS é a altura má- xima.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o sinal de MS é a área má- xima.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o sinal de MS é o volume máximo.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que os produtos peptídicos da pluralidade de polipeptídeos na amostra são obtidos por meio da di- gestão de amostra antes da análise dos produtos peptídicos utilizando a técnica de LC/MS.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a ob- tenção da amostra.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o pro- cessamento da pluralidade de polipeptídeos na amostra para produzir os produtos peptídicos.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracteriza- do pelo fato de que o processamento da amostra compreende um ou mais dos seguintes: (a) centrifugar a amostra para isolar a pluralidade de poli- peptídeos; (b) purificar a pluralidade de polipeptídeos na amostra; (c) remover da amostra os componentes incompatíveis com o processamento subsequente e a análise por espectrometria de massa; (d) digerir a pluralidade de polipeptídeos para produzir os produtos peptídicos; e (e) purificar os produtos peptídicos.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a técnica de LC/MS com- preende a separação dos produtos peptídicos por meio de uma técnica de cromatografia em fase líquida.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a técnica de LC/MS com- preende processar os sinais de MS obtidos dos produtos peptídicos.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a técnica de LC/MS com- preende ainda um ou mais do que se segue: (a) a identificação dos produtos peptídicos através da se-
quência de aminoácido; (b) a identificação do primeiro polipeptídeo através de um identificador de proteína; e (c) a identificação de um ou mais da pluralidade de poli- peptídeos por um identificador de proteína.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a de- terminação da quantidade absoluta do segundo polipeptídeo.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo é uma proteína da célula hospedeira.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo é um biomarcador.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo é pelo menos 100 vezes menor em abundância do que o segundo poli- peptídeo.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo recombinante produzido por uma célula hospedeira.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo terapêutico.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra da cultura celular.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue ou soro.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracteriza- do pelo fato de que o segundo polipeptídeo é albumina do soro.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a amostra é um produto farmacêutico ou um intermediário deste.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 30, caracterizado pelo fato de que a amostra foi purificada ou enriquecida.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 31, caracterizado pelo fato de que os produtos peptídicos são produtos peptídicos trípticos da pluralidade de polipeptídeos.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de quantida- des de carga de amostra compreende quantidades de carga de amos- tra na faixa de cerca de 0,1 a 25 μg de proteína total.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 33, caracterizado pelo fato de que a primeira quantidade de carga de amostra é ao redor de 10 μg de proteína total.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 34, caracterizado pelo fato de que a segunda quantidade de carga de amostra é ao redor de 1 μg de proteína total.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 35, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a sele- ção da segunda quantidade de carga de amostra com base nos sinais de MS do segundo conjunto de produtos peptídicos.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 36, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a sele- ção da primeira quantidade de carga de amostra com base nos sinais de MS do primeiro conjunto de produtos peptídicos.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 37, caracterizado pelo fato de que cada uma da pluralidade de quantidades de carga de amostra possui o mesmo volume total.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 38, caracterizado pelo fato de que n é 1 ou maior.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 39, caracterizado pelo fato de que n é 3.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 40, caracterizado pelo fato de que m é 1 ou maior.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 41, caracterizado pelo fato de que m é 3.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 42, caracterizado pelo fato de que o conjunto intermediário de íons qualificados de produtos peptídicos do segundo polipeptídeo é selecionado com base nas sequências de cada um dos produtos pep- tídicos.
44. Método para detectar um polipeptídeo contaminado na produção de um polipeptídeo terapêutico, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a obtenção de uma amostra que compreende o poli- peptídeo terapêutico; (b) a determinação se o polipeptídeo contaminado está presente na amostra; em que a presença do polipeptídeo contaminado é baseada na quantificação absoluta do polipeptídeo contaminado na amostra utilizando os métodos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43.
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