ES2907024T3 - Métodos para la cuantificación absoluta de polipéptidos de baja abundancia usando espectrometría de masas - Google Patents
Métodos para la cuantificación absoluta de polipéptidos de baja abundancia usando espectrometría de masas Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido es al menos 10 veces menos abundante que el segundo polipéptido y el segundo polipéptido tiene una concentración conocida en la muestra, comprendiendo el método: (a) obtener señales de MS de iones de productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos, obteniéndose dichas señales de MS de iones de los productos peptídicos analizando los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos usando una técnica de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS), obteniéndose señales de MS de los productos peptídicos para cada una de una pluralidad de cantidades de carga de muestra que comprenden una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, y siendo la primera cantidad de carga de muestra mayor que la segunda cantidad de carga de muestra; (b) calcular el promedio o la suma de una señal de MS para: (i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); (ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); (iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y (iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y (c) determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula: [(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)].
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para la cuantificación absoluta de polipéptidos de baja abundancia usando espectrometría de masas
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica prioridad con respecto a la solicitud provisional estadounidense n° 62/514.587, presentada del 2 de junio de 2017.
CAMPO TÉCNICO
La presente invención proporciona métodos para la cuantificación absoluta de polipéptidos de baja abundancia mediante el análisis por cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) de productos peptídicos obtenidos de mezclas polipeptídicas simples o complejas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Una variedad diversa de técnicas basadas en espectrometría de masas (MS) para la cuantificación de polipéptidos se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden cuantificarse polipéptidos usando técnicas de base metabólica (por ejemplo, etiquetado de isótopos estables usando aminoácidos en cultivo celular (SILAC)), técnicas basadas en patrones peptídicos (por ejemplo, monitorización de reacciones seleccionadas (SRM) y monitorización de reacciones múltiples (MRM)), y técnicas basadas en etiquetas (por ejemplo, etiquetas de masa en tándem (TMT)). Estos métodos tienen desventajas bien documentadas, tales como fuentes de muestras limitadas para SILAC, el amplio desarrollo y coste de SRM y MRM, y el procesamiento de muestras adicionales y producción de abundancias relativas de las técnicas basadas en etiquetas.
Se han desarrollado técnicas de cuantificación libres de etiquetas basadas en MS para simplificar los métodos de cuantificación de polipéptidos basados en MS y para eludir algunas de las limitaciones mencionadas anteriormente. Sin embargo, las técnicas de cuantificación libres de etiquetas actuales pueden sufrir de una baja exactitud y una alta variabilidad, y la mayoría de las técnicas libres de etiquetas pueden proporcionar solo una relación de cuantificación relativa entre dos o más muestras (por ejemplo, recuento espectral).
Un enfoque para la cuantificación absoluta libre de etiquetas basada en MS de proteínas implica usar un patrón proteico para crear una medición de calibración de punto único que se aplica a análisis de espectrometría de masas posteriores para la cuantificación absoluta de otras proteínas. J. C. Silva et al., Mol Cell Proteomics, 5, 144-56, 2006; patente estadounidense n.° 8.271.207. Sin embargo, el uso de una calibración de punto único y las diferencias creadas por digestiones enzimáticas independientes de la muestra y el patrón proteico pueden ser fuentes importantes de variabilidad de cuantificación para este método.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de técnicas de cuantificación absoluta libres de etiquetas basadas en MS mejoradas que sean sensibles, exactas y precisas, y puedan aplicarse a una variedad diversa de muestras polipeptídicas de una manera de alto rendimiento.
El documento WO2006133109 describe métodos y un aparato para análisis químicos basados en fraccionamiento, en los que un método para analizar productos químicos incluye fraccionar una muestra compleja en al menos dos porciones de muestra que incluyen cada una porciones de dos polipéptidos aunque en diferentes relaciones de concentración, digerirlas y realizar LC/MS en cada una de la porciones de muestra, y asociar iones precursores observados a través de LC/MS con su polipéptido correspondiente en respuesta a datos de intensidad proporcionados por LC/MS. Se determina que un conjunto de iones precursores que tiene relaciones de intensidad sustancialmente similares en ambas porciones de muestra está asociado con el mismo polipéptido.
El documento WO2006132994 describe un sistema y un método en los que se proporciona una cuantificación absoluta de proteína en una muestra al comparar una suma o un promedio de las N intensidades de ionización más altas observadas para péptidos de una proteína particular junto con un patrón de calibración. El patrón de calibración puede estar en forma de una tabla generada mediante un análisis peptídico de proteínas previo realizado usando una o más proteínas predeterminadas. La comparación se usa para determinar una cantidad absoluta correspondiente de proteína basándose en la suma o el promedio observado de intensidades de ionización.
El documento CA2487821 describe el uso de perfilado peptídico para identificar, caracterizar y clasificar muestras biológicas. En muestras complejas, muchos miles de péptidos diferentes estarán presentes a concentraciones variables. La invención usa cromatografía de líquidos y métodos similares para separar péptidos, que entonces se identifican y cuantifican usando espectrometría de masas. Por identificación quiere decirse que se establece la secuencia correcta del péptido a través de comparaciones con bases de datos de secuencias de genoma, dado que la mayoría de los péptidos y las proteínas no están anotados y no tienen un nombre o una función asignada. Cuantificación significa una estimación de la abundancia absoluta o relativa de las especies peptídicas usando espectrometría de masas y técnicas relacionadas incluyendo, pero sin limitarse a, incorporación de isótopos estables
o inestables pre- o postexperimental, etiquetado de masa molecular, etiquetado de masa diferencial y análisis de aminoácidos.
El documento WO2014016586 proporciona métodos para potenciar la síntesis de proteínas nativas etiquetadas con isótopos en rutas biológicas específicas con el propósito de la cuantificación y cualificación de proteínas. También proporciona muestras de referencia para su uso en diversos métodos basados en espectrometría de masas de análisis de proteínas.
El documento WO03089937 describe métodos y un aparato, incluyendo productos de programa informático, para cuantificar péptidos en una mezcla de péptidos. Se recibe una mezcla de péptidos que contiene una pluralidad de péptidos. Uno o más péptidos se separan de la mezcla de péptidos a lo largo de un periodo de tiempo. Uno o más de los péptidos separados en un momento particular se someten a un análisis de masa/carga y se calcula una abundancia de uno o más de los péptidos analizados en cuanto a la masa. Se calcula una cantidad relativa para el uno o más péptidos analizados en cuanto a la masa comparando la abundancia calculada de los péptidos con una abundancia de uno o más péptidos en una muestra de referencia que es externa a la primera mezcla de péptidos.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona métodos para la cuantificación absoluta libre de etiquetas de polipéptidos de baja abundancia en una muestra que comprende otro polipéptido de abundancia alta relativa. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para cuantificar proteínas de célula huésped de baja abundancia en un sistema de cultivo, o un producto posterior de las mismas, que comprende una célula huésped capaz de producir un polipéptido recombinante, tal como un polipéptido terapéutico. Los métodos usan la concentración y señales de MS de producto peptídico de un polipéptido de alta abundancia y señales de MS de producto peptídico de un polipéptido de baja abundancia para calcular la cantidad absoluta del polipéptido de baja abundancia. La invención reivindicada en el presente documento se define en las reivindicaciones adjuntas que deben interpretarse según el protocolo interpretativo del artículo 69 CPE.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido, en los que el primer polipéptido es al menos 10 veces menos abundante que el segundo polipéptido, comprendiendo el método: (a) analizar productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos a una pluralidad de cantidades de carga de muestra usando una técnica de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) para obtener señales de MS de iones de los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos a cada una de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, comprendiendo la pluralidad de cantidades de carga de muestra una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, y siendo la primera cantidad de carga de muestra mayor que la segunda cantidad de carga de muestra; (b) calcular el promedio o la suma de una señal de MS para: (i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); (ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); (iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y (iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y (c) determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula:
[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)].
La presente invención proporciona métodos para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido, en los que el primer polipéptido es al menos 10 veces menos abundante que el segundo polipéptido y el segundo polipéptido tiene una concentración conocida en la muestra, comprendiendo el método: (a) obtener señales de MS de iones de productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos, obteniéndose dichas señales de MS de iones de los productos peptídicos analizando los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos usando una técnica de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS), obteniéndose señales de MS de los productos peptídicos para cada una de una pluralidad de cantidades de carga de muestra que comprenden una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, y siendo la primera cantidad de carga de muestra mayor que la segunda cantidad de carga de muestra; (b) calcular el promedio o la suma de una señal de MS para: (i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); (ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); (iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y (iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos
usando el promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y (c) determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula:
[(^)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(fí)],
o equivalentes matemáticos de la misma.
En algunas realizaciones, el promedio de la señal de MS se usa para determinar la cantidad absoluta del primer polipéptido.
En algunas realizaciones, la suma de la señal de MS se usa para determinar la cantidad absoluta del primer polipéptido. En algunas realizaciones, el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se selecciona basándose en el error de cuantificación de los iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, o la primera cantidad de carga de muestra y/o la segunda cantidad de carga de muestra.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para seleccionar un conjunto de iones cualificados de productos peptídicos para la cuantificación absoluta según el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el método: (a) analizar los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos a una pluralidad de cantidades de carga de muestra usando una técnica de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) para obtener señales de MS de iones de los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos a cada una de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, comprendiendo la pluralidad de cantidades de carga de muestra una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, y siendo la primera cantidad de carga de muestra mayor que la segunda cantidad de carga de muestra; y (b) seleccionar un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido, seleccionándose el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido basándose en el error de cuantificación de los iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, o la primera cantidad de carga de muestra y/o la segunda cantidad de carga de muestra. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además seleccionar un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra.
En algunas realizaciones, cada uno del conjunto superior de iones cualificados de productos peptídicos es diferente de cada uno del conjunto central de iones cualificados.
En algunas realizaciones, la señal de MS es intensidad de ionización o altura de pico o área de pico o volumen de pico.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además obtener la muestra.
En algunas realizaciones, la muestra se ha purificado o enriquecido. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además procesar la pluralidad de polipéptidos en la muestra para producir los productos peptídicos. En algunas realizaciones, procesar la muestra comprende uno o más de los siguientes: (a) centrifugar la muestra para aislar la pluralidad de polipéptidos; (b) purificar la pluralidad de polipéptidos en la muestra; (c) retirar de la muestra componentes incompatibles con el procesamiento posterior y el análisis de espectrometría de masas; (d) digerir la pluralidad de polipéptidos para producir los productos peptídicos; y (e) purificar los productos peptídicos.
En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende separar los productos peptídicos a través de una técnica de cromatografía de líquidos.
En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende procesar las señales de MS obtenidas de los productos peptídicos.
En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende además uno o más los siguientes: (a) identificar los productos peptídicos mediante secuencia de aminoácidos; (b) identificar el primer polipéptido mediante un identificador de proteína; y (c) identificar uno o más de la pluralidad de polipéptidos mediante un identificador de proteína.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además determinar la cantidad absoluta del segundo polipéptido.
En algunas realizaciones, el primer polipéptido es una proteína de célula huésped o un biomarcador. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es al menos 100 veces menos abundante que el segundo polipéptido.
En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un polipéptido recombinante producido por una célula huésped o un polipéptido terapéutico o albúmina sérica. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido se expresa a partir de un vector transfectado a una célula huésped, tal como una célula huésped de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO).
En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de cultivo celular o una sangre o una muestra de suero o un producto farmacéutico o un producto intermedio del mismo.
En algunas realizaciones, los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos en la muestra se obtienen a través de la digestión de la muestra antes de analizar los productos peptídicos usando la técnica de LC/MS. En algunas realizaciones, los productos peptídicos son productos peptídicos trípticos de la pluralidad de polipéptidos.
En algunas realizaciones, la pluralidad de cantidades de carga de muestra comprende cantidades de carga de muestra en el intervalo de aproximadamente 0,1-25 pg de proteína total. En algunas realizaciones, la primera cantidad de carga de muestra es de aproximadamente 10 pg de proteína total. En algunas realizaciones, la segunda cantidad de carga de muestra es de aproximadamente 0,5 pg a 10 pg, o de 3 pg a 6 pg, o de 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg o 6 pg de proteína total.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además seleccionar la segunda cantidad de carga de muestra basándose en señales de MS del segundo conjunto de productos peptídicos.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además seleccionar la primera cantidad de carga de muestra basándose en señales de MS del primer conjunto de productos peptídicos.
En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de cantidades de carga de muestra tiene el mismo volumen total.
En algunas realizaciones, n es 1 o mayor o n es 3.
En algunas realizaciones, m es 1 o mayor o m es 3.
En algunas realizaciones, el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se seleccionan basándose en las secuencias de cada de los productos peptídicos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para detectar un polipéptido contaminante en la producción de un polipéptido terapéutico, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra que comprende el polipéptido terapéutico; (b) determinar si el polipéptido contaminante está presente en la muestra; basándose la presencia del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos de cuantificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 y 5-15.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona sistemas para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende el primer polipéptido y un segundo polipéptido, comprendiendo el sistema: (a) un espectrómetro de masas; (b) un ordenador que comprende; (c) un medio legible por ordenador no transitorio que incluye instrucciones almacenadas en el mismo que, cuando se ejecutan, realizan un procesamiento que incluye: calcular el promedio o la suma de una señal de MS para: (i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); (ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); (iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y (iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula:
[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)],
o equivalentes matemáticos de la misma. En algunas realizaciones, los sistemas comprenden además un cromatógrafo de líquidos.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona medios legibles por ordenador no transitorios que incluyen instrucciones almacenadas en los mismos que, cuando se ejecutan, realizan un procesamiento para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende el primer polipéptido y un segundo polipéptido, incluyendo el procesamiento: calcular el promedio o la suma de una señal de MS para: (i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); (ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); (iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y (iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula:
[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)],
o equivalentes matemáticos de la misma.
Estos y otros aspectos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada posterior y las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en el presente documento pueden combinarse para formar otras realizaciones de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra un histograma de áreas de pico de MS para los cuarenta iones de productos peptídicos más abundantes observados a partir de un análisis de LC/MS de una muestra que comprende esfingomielina fosfodiesterasa (ASM) a diferentes cantidades de carga de muestra (la cantidad de carga de muestra por análisis de LC/MS se ordena como 1 gg, 2,5 gg, 5 gg, 7,5 gg, 10 gg, 12,5 gg, 15 gg, 18 gg y 20 gg, de izquierda a derecha para cada conjunto de barras de producto peptídico). El error porcentual promedio para cada ion de producto peptídico entre las cantidades de carga de muestra se muestra por encima del conjunto de barras de producto peptídico.
La FIG. 2 muestra el área de pico sumada de un conjunto central de tres productos peptídicos (3 centrales; cuadrados) y un conjunto superior de tres productos peptídicos (3 superiores; rombos) a lo largo de seis puntos de concentración. El R2 para una regresión lineal de los 3 productos peptídicos centrales es 0,98 y para los 3 productos peptídicos superiores es 0,87.
Las FIGS. 3A-3B muestran una comparación de los métodos de cuantificación de los 3 superiores (FIG. 3A) y los 3 centrales (FIG. 3B) para cuatro muestras (lote 1, lote 2, lote 3, lote 4, de izquierda a derecha para cada conjunto de barras) en cuatro ocasiones de ensayo diferentes (ocasión A, ocasión B, ocasión C, ocasión D). Había una desviación estándar relativa del 82% para el método de los 3 superiores (FIG. 3A) y una desviación estándar relativa del 16% para el método de los 3 centrales (FIG. 3B).
La FIG. 4 muestra la abundancia relativa de las 8 proteínas de célula huésped identificadas superiores entre diversos lotes de producción de proteínas terapéuticas.
La FIG. 5 muestra la abundancia relativa de proteínas de célula huésped identificadas entre fases de un proceso de purificación para una proteína terapéutica.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación proporciona métodos para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido, comprendiendo los métodos determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido en la muestra basándose en el promedio o la suma de señales de MS para: un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de señales de MS. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es menos abundante que un segundo polipéptido en la muestra. En algunas realizaciones, la cantidad absoluta de un primer polipéptido se determina mediante la siguiente fórmula:
[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)].
Los métodos de la presente invención constituyen una versión más específica de la misma y se definen en las reivindicaciones. También se denominan en el presente documento los 3 centrales. Tal como se usa en el presente documento, “cualificado”, tal como se usa en referencia a iones, se refiere a iones de productos peptídicos que son adecuados para los métodos de cuantificación descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los iones de productos peptídicos cualificados excluyen iones de productos peptídicos no trípticos o iones de productos peptídicos con modificaciones postraduccionales.
Los métodos de la presente invención descritos en el presente documento proporcionan, por ejemplo, una exactitud y reproducibilidad mejoradas de la cuantificación de polipéptidos a lo largo de un intervalo dinámico más grande de concentraciones de polipéptido en una muestra, en comparación con métodos de cuantificación absoluta libres de etiquetas conocidos en la técnica (por ejemplo, los 3 superiores; J. C. Silva et al., citado anteriormente). Sin querer restringirse a la teoría, los métodos de cuantificación absoluta libres de etiquetas se basan en el hallazgo de que, asumiendo una cantidad equimolar de cada uno de una pluralidad de polipéptidos en una muestra, la respuesta del
detector de MS promedio de los n iones más abundantes superiores de un producto peptídico de un polipéptido es similar entre cada uno de la pluralidad de polipéptidos (es decir, la concentración de producto peptídico se correlaciona con la respuesta de detector). Por tanto, la cantidad de un polipéptido de concentración desconocida puede determinarse mediante la comparación con un polipéptido estándar de concentración conocida. Sin embargo, usar los iones más abundantes de productos peptídicos de un polipéptido estándar para la cuantificación absoluta puede conducir a una exactitud y reproducibilidad escasas. Por ejemplo, puede surgir inexactitud de cuantificación debido a la observación de un comportamiento no lineal para productos peptídicos ionizantes superiores debido a la saturación del detector de MS. Además, tales métodos pueden basarse en la adición conocida en una cantidad conocida de un polipéptido estándar o el análisis de una cantidad conocida de una muestra de proteína estándar en un análisis de LC/MS independiente de la muestra que contiene el polipéptido de concentración desconocida. Ambos enfoques pueden conducir a una reducción en la exactitud de cuantificación y un aumento en la variabilidad. Por ejemplo, tomar alícuotas de manera reproducible de una cantidad conocida de un polipéptido estándar con respecto a cualquier número de muestras puede ser desafiante y calibrar un cálculo de cuantificación basándose en un polipéptido estándar que se digiere en una reacción enzimática independiente de la muestra que contiene el polipéptido desconocido puede crear variación adicional basándose en el grado de finalización de la digestión.
La presente invención proporciona métodos de cuantificación que integran elementos para conseguir una exactitud y reproducibilidad mejoradas de cuantificación de polipéptido. En primer lugar, los métodos de cuantificación absoluta de la presente invención aprovechan sistemas de muestras de polipéptidos que comprenden un polipéptido con una concentración conocida y que está en una abundancia alta en relación con otros polipéptidos en la muestra (por ejemplo, una proteína terapéutica en una muestra de fabricación o albúmina en una muestra de suero) y no requieren comparación con un polipéptido estándar añadido de manera conocida o analizado por separado. En segundo lugar, los métodos de cuantificación absoluta de la presente invención usan mediciones de MS a dos concentraciones para evitar la saturación del detector de MS de los n iones de productos peptídicos superiores del polipéptido de alta abundancia. En tercer lugar, los métodos de cuantificación absoluta de la presente invención utilizan además un conjunto central de iones de productos peptídicos con un error de cuantificación reducido en comparación con los péptidos superiores para reducir el error de cuantificación global. Las ventajas de los métodos de la presente invención se demostraron en una comparación directa con el método de cuantificación absoluta libre de etiquetas conocido en la técnica (es decir, los 3 superiores). Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo 2, entre una serie de ensayos y muestras, los métodos dados a conocer en la presente invención consiguieron una desviación estándar relativa del 16%, mientras que el método de los 3 superiores tenía una desviación estándar relativa del 82%.
Tal como se discute más adelante más detalladamente, la presente divulgación proporciona métodos útiles para la cuantificación absoluta libre de etiquetas basada en MS de polipéptidos de baja abundancia (por ejemplo, un primer polipéptido) usando información de otro polipéptido (por ejemplo, el segundo polipéptido) que tiene una concentración conocida y es superior en abundancia relativa que los polipéptidos de baja abundancia, incluyendo los métodos uno cualquiera o más de los siguientes: (a) realizar un estudio de carga para determinar dos concentraciones de carga de muestra a las que se obtienen y/o analizan datos para la cuantificación de polipéptidos de baja abundancia (por ejemplo, la primera cantidad de carga de muestra y la segunda cantidad de carga de muestra); (b) seleccionar iones de productos peptídicos cualificados para la cuantificación de polipéptidos (por ejemplo, un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido, un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido, y un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido); y (c) determinar la cantidad de polipéptido absoluta de un polipéptido de baja abundancia usando señales de MS (por ejemplo, señales de MS de productos peptídicos del primer polipéptido y del segundo polipéptido).
Realizar un estudio de carga para determinar una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra
La presente divulgación proporciona métodos para realizar un estudio de carga de una muestra a lo largo del intervalo dinámico deseado del ensayo. La información de señal de MS obtenida del estudio de carga permite, por ejemplo, la selección de una primera cantidad de carga de muestra en la que los productos peptídicos del primer polipéptido son detectables (el primer polipéptido está en una abundancia baja en relación con el segundo polipéptido), la selección de una segunda cantidad de carga de muestra en la que el número n superior de iones de productos peptídicos más abundantes cualificados del segundo polipéptido no saturan el detector de MS, y la selección de una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra en las que un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido demuestran un error de cuantificación reducido (es decir, un comportamiento lineal aumentado en relación con los iones de productos peptídicos más abundantes).
En algunos ejemplos dados a conocer, los métodos comprenden analizar productos peptídicos de una pluralidad de polipéptidos a una pluralidad de cantidades de carga de muestra usando una técnica de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) para obtener señales de MS de iones de los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos a cada una de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, comprendiendo la pluralidad de cantidades de carga de muestra una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, y siendo la primera cantidad de carga de muestra mayor que la segunda cantidad de carga de muestra. En algunas realizaciones, la señal de MS es intensidad de ionización. En algunas realizaciones, la señal de MS es altura
de pico. En algunas realizaciones, la señal de MS es área de pico. En algunas realizaciones, la señal de MS es volumen de pico.
En algunas realizaciones, la información obtenida de un estudio de carga puede aplicarse a análisis de muestra posteriores para la cuantificación de un polipéptido (por ejemplo, seleccionando 2 cantidades de carga de muestra para análisis de muestra adicionales a través de una técnica de LC/MS).
En algunas realizaciones, la pluralidad de cantidades de carga de muestra comprende al menos 2 cantidades de carga de muestra. En algunas realizaciones, la pluralidad de cantidades de carga de muestra comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 cantidades de carga de muestra.
Las cantidades de carga de muestra pueden variar dependiendo de los instrumentos de LC/MS usados (por ejemplo, basándose en la capacidad de carga de una columna de cromatografía). En algunas realizaciones, la pluralidad de cantidades de carga de muestra comprende cantidades de carga de muestra en el intervalo de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 100 gg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 75 gg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 50 gg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 40 gg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 30 gg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 20 gg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 15 gg, de aproximadamente 0,1 gg a aproximadamente 10 gg, de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 30 gg, de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 20 gg, de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 15 gg o de aproximadamente 1 gg a aproximadamente 10 gg.
En algunas realizaciones, la cantidad de carga de muestra es de aproximadamente 0,5 gg, aproximadamente 1 gg, aproximadamente 1,5 gg, aproximadamente 2 gg, aproximadamente 2,5 gg, aproximadamente 3 gg, aproximadamente 3,5 gg, aproximadamente 4 gg, aproximadamente 4,5 gg, aproximadamente 5 gg, aproximadamente 5,5 gg, aproximadamente 6 gg, aproximadamente 6,5 gg, aproximadamente 7 gg, aproximadamente 7,5 gg, aproximadamente 8 gg, aproximadamente 8,5 gg, aproximadamente 9 gg, aproximadamente 9,5 gg, aproximadamente 10 gg, aproximadamente 10,5 gg, aproximadamente 11 gg, aproximadamente 11,5 gg, aproximadamente 12 gg, aproximadamente 12,5 gg, aproximadamente 13 gg, aproximadamente 13,5 gg, aproximadamente 14 gg, aproximadamente 14,5 gg, aproximadamente 15 gg, aproximadamente 16 gg, aproximadamente 17 gg, aproximadamente 18 gg, aproximadamente 19 gg, aproximadamente 20 gg, aproximadamente 21 gg, aproximadamente 22 gg, aproximadamente 23 gg, aproximadamente 24 gg, aproximadamente 25 gg, aproximadamente 26 gg, aproximadamente 27 gg, aproximadamente 28 gg, aproximadamente 29 gg o aproximadamente 30 gg.
En algunas realizaciones, la pluralidad de cantidades de carga de muestra comprende una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, siendo la primera cantidad de carga de muestra de aproximadamente 10 gg, y siendo la segunda cantidad de carga de muestra de aproximadamente 0,5 gg a 10 gg, o de 3 gg a 6 gg, o de 1 gg, 2 gg, 3 gg, 4 gg, 5 gg o 6 gg.
En algunas realizaciones, la primera cantidad de carga de muestra se selecciona basándose en señales de MS de productos peptídicos del primer polipéptido. En algunas realizaciones, la primera cantidad de carga de muestra se selecciona basándose en señales de MS de productos peptídicos del segundo polipéptido. En algunas realizaciones, la primera cantidad de carga de muestra se selecciona basándose en señales de MS de productos peptídicos del primer polipéptido y señales de MS de productos peptídicos del segundo polipéptido.
En algunas realizaciones, la segunda cantidad de carga de muestra se selecciona basándose en señales de MS de productos peptídicos del segundo polipéptido.
En algunas realizaciones, las cantidades de carga de muestra posteriores analizadas en un estudio de carga se basan en datos de una cantidad de carga de muestra analizada previamente.
El volumen de cada cantidad de carga de muestra puede variar dependiendo de los instrumentos de LC/MS usados (por ejemplo, basándose en el tamaño del bucle de muestra). En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de cantidades de carga de muestra tiene el mismo volumen total. En algunas realizaciones, el volumen de cada una de una pluralidad de cantidades de carga de muestra es de aproximadamente 1 gl a aproximadamente 60 gl, de aproximadamente 10 gl a aproximadamente 60 gl, de aproximadamente 20 gl a aproximadamente 50 gl o de aproximadamente 30 gl a aproximadamente 50 gl. En algunas realizaciones, el volumen de cada una de una pluralidad de cantidades de carga de muestra es la misma y es de aproximadamente 1 gl a aproximadamente 60 gl, de aproximadamente 10 gl a aproximadamente 60 gl, de aproximadamente 20 gl a aproximadamente 50 gl o de aproximadamente 30 gl a aproximadamente 50 gl. En algunas realizaciones, el volumen de cada una de una pluralidad de cantidades de carga de muestra es de aproximadamente 5 gl, 10 gl, 15 gl, 20 gl, 25 gl, 30 gl, 35 gl, 40 gl, 45 gl, 50 gl, 55 gl o 60 gl.
Seleccionar iones de productos peptídicos cualificados del primer polipéptido y del segundo polipéptido
La presente divulgación proporciona métodos para seleccionar conjuntos de iones cualificados de productos peptídicos para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido, estando el primer polipéptido en una abundancia menor en relación con el segundo polipéptido. Por ejemplo, la divulgación proporciona métodos para la selección de uno cualquiera de: un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido, un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido, y un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención comprenden seleccionar un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con la mayor señal de MS a la primera cantidad de carga de muestra.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención comprenden seleccionar un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra.
El número de productos peptídicos identificables de MS de un polipéptido puede variar dependiendo de la concentración y las características del polipéptido. En algunas realizaciones, la concentración y las características del primer polipéptido pueden dar como resultado la identificación de un número limitado de productos peptídicos a la primera cantidad de carga de muestra. En algunas realizaciones, n es 1 o mayor, siendo n un número entero. En algunas realizaciones, n es 3. En algunas realizaciones, n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En algunas realizaciones, los iones cualificados de productos peptídicos con las mayores señales de MS pueden excluir iones de productos peptídicos con ciertas características, incluyendo, por ejemplo, escisiones enzimáticas ausentes, modificaciones postraduccionales, y perfiles de elución de LC y distribuciones de isótopos solapantes. Por ejemplo, si una muestra se digiere con tripsina y el producto peptídico con la mayor señal de MS es un producto peptídico no tríptico, este producto peptídico puede excluirse de la selección de un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido o un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido. En algunas realizaciones, los iones cualificados de un producto peptídico con las mayores señales de MS pueden excluir iones de productos peptídicos que proceden de porciones de un polipéptido que no están presentes de manera reproducible como parte del polipéptido de origen (por ejemplo, el producto peptídico que procede de un producto de escisión del polipéptido y por tanto puede no estar presente en la muestra a la misma concentración que el polipéptido de origen).
Los métodos de la presente invención tal como se definen en la reivindicación 4 comprender seleccionar un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido, seleccionándose el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido basándose en el error de cuantificación de los iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, o la primera cantidad de carga de muestra y/o la segunda cantidad de carga de muestra. Generalmente, cada ion de producto peptídico del conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se selecciona basándose en tener el menor error de cuantificación en relación con el conjunto total de iones de productos peptídicos del segundo polipéptido. En algunas realizaciones, cada ion de producto peptídico del conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido tiene un menor error de cuantificación que el ion de producto peptídico más abundante del segundo polipéptido. En algunas realizaciones, los iones de productos peptídicos del conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos de un segundo polipéptido tienen un menor error de cuantificación que un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS.
En algunas realizaciones, los iones cualificados de productos peptídicos con el menor error de cuantificación pueden excluir iones de productos peptídicos con ciertas características, incluyendo, por ejemplo, escisiones enzimáticas ausentes, modificaciones postraduccionales, y perfiles de elución de LC y distribuciones de isótopos solapantes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, si una muestra se digiere con tripsina y el producto peptídico con el menor error de cuantificación es un producto peptídico no tríptico, este producto peptídico puede excluirse de la selección de un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido. En algunas realizaciones, los iones cualificados de un producto peptídico con las mayores señales de MS pueden excluir iones de productos peptídicos que proceden de porciones de un polipéptido que no están presentes de manera reproducible como parte del polipéptido de origen (por ejemplo, el producto peptídico que procede de un producto de escisión del polipéptido y por tanto puede no estar presente en la muestra a la misma concentración que el polipéptido de origen).
En algunas realizaciones, la selección de un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se basa en el error de cuantificación obtenido de un estudio de carga. En algunas realizaciones, la selección de un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del
segundo polipéptido se basa en el error de cuantificación obtenido de una pluralidad de cantidades de carga de muestra. En algunas realizaciones, el error de cuantificación es un error porcentual promedio de una pluralidad de cantidades de carga de muestra. En algunas realizaciones, la selección de un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se basa en el error de cuantificación obtenido de una primera cantidad de carga de muestra. En algunas realizaciones, la selección de un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se basa en el error de cuantificación obtenido de una segunda cantidad de carga de muestra. En algunas realizaciones, la selección de un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se basa en el error de cuantificación obtenido de una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra.
En algunas realizaciones, m es 1 o mayor, siendo m un número entero. En algunas realizaciones, m es 3. En algunas realizaciones, m es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En algunas realizaciones, n es igual a m. En algunas realizaciones, n no es igual a m. En algunas realizaciones, n y m son 2 o mayores, siendo n y m un número entero. En algunas realizaciones, n y m son 3.
En algunas realizaciones, cada uno del conjunto superior de iones cualificados de productos peptídicos de un segundo polipéptido es diferente de cada uno de un conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido. En algunas realizaciones, un ion de producto peptídico cualificado es un miembro de un conjunto superior de iones cualificados de productos peptídicos de un segundo polipéptido y un conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido.
En alguna realización, el ion de producto peptídico cualificado comprende una cisteína carbamidometilada. En alguna realización, el ion de producto peptídico cualificado comprende una cisteína carboximetilada.
Determinar la cantidad de polipéptido absoluta de polipéptidos de baja abundancia
La presente divulgación proporciona métodos para calcular la cantidad de polipéptido absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido, comprendiendo los métodos determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido en la muestra basándose en el promedio o la suma de señales de MS para: un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de señales de MS.
En el aspecto de la invención tal como se define en la reivindicación 1, la cantidad absoluta de un primer polipéptido se determina basándose en la siguiente fórmula:
[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)].
En algunas realizaciones, A, B, C y D se calculan todos usando el promedio de señales de MS. En algunas realizaciones, A, B, C y D se calculan todos usando la suma de señales de MS.
En algunas realizaciones, la señal de MS es intensidad de ionización. En algunas realizaciones, la señal de MS es altura de pico. En algunas realizaciones, la señal de MS es área de pico. En algunas realizaciones, la señal de MS es volumen de pico.
En algunas realizaciones, el conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos de un primer polipéptido con las mayores señales de MS está predeterminado. En algunas realizaciones, el conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos de un segundo polipéptido con las mayores señales de MS está predeterminado. En algunas realizaciones, el conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos de un segundo polipéptido está predeterminado. En algunas realizaciones, la relación de un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos de un segundo polipéptido con las mayores señales de MS a una segunda cantidad de carga de muestra (B) y un conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D) está predeterminado.
En algunas realizaciones, el promedio o la suma de señales de MS para: un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido
a la segunda cantidad de carga de muestra (D), se determinan a partir de 2 análisis de LC/MS de la muestra. En algunas realizaciones se realizan análisis replicados adicionales de los 2 análisis de LC/MS.
En algunas realizaciones, el promedio o la suma de señales de MS para: un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), se determinan a partir de 2 análisis de LC/MS de la muestra, no formando los análisis de LC/MS parte del estudio de carga. En algunas realizaciones se realizan análisis replicados adicionales de los 2 análisis de LC/MS.
En algunas realizaciones, el método de cuantificación comprende señales de MS de dos o más polipéptidos de cantidad conocida.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden además determinar la cantidad absoluta de un segundo polipéptido. Los métodos para determinar la cantidad de proteína de un segundo polipéptido incluyen, por ejemplo, ELISA e inmunotransferencia de tipo Western.
Se contempla que más de un polipéptido de concentración desconocida por ensayo pueda identificarse y cuantificarse usando los métodos de la presente invención. Por ejemplo, a partir de la ecuación dada a conocer anteriormente, el conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A) puede sustituirse por un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos de otro polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra para calcular la cantidad del otro polipéptido.
Muestras y preparación de muestras
Los métodos de la presente invención son útiles para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido, estando el primer polipéptido en una abundancia menor en relación con el segundo polipéptido.
En los métodos de la invención, el primer polipéptido es al menos aproximadamente 10 veces menos abundante que un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es al menos aproximadamente 100 veces menos abundante que un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es al menos aproximadamente 1000 veces menos abundante que un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es de al menos aproximadamente 2 veces a aproximadamente 1x109 veces menos abundante que un segundo polipéptido. Por ejemplo, el primer polipéptido se mide a una cantidad de un parte por billón.
En los métodos de la invención, el segundo polipéptido es al menos aproximadamente 10 veces más abundante que un primer polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es al menos aproximadamente 100 veces más abundante que un primer polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es al menos aproximadamente 1000 veces más o 1x109 veces más abundante que un primer polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es de al menos aproximadamente 2 veces a aproximadamente 1x109 veces más abundante que un primer polipéptido.
Las técnicas de preparación de muestras necesarias para producir productos peptídicos de una pluralidad de polipéptidos en una muestra para su análisis a través de técnicas de LC/MS se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, los productos peptídicos de una pluralidad de polipéptidos en una muestra se obtienen a través de la digestión de la muestra antes de analizar los productos peptídicos usando una técnica de LC/MS. En algunas realizaciones, la digestión de la muestra comprende digestión enzimática usando una proteasa. En algunas realizaciones, la digestión enzimática se realiza usando uno o más de tripsina, Lys-C, IdeS, IdeZ, PNGasa F, termolisina, pepsina, elastasa, Arg-C, TEV, Glu-C, Asp-N y factor Xa. En algunas realizaciones, los productos peptídicos de una pluralidad de polipéptidos en una muestra son productos peptídicos trípticos.
En algunas realizaciones, la digestión de la muestra comprende digestión química, tal como hidrólisis ácida.
En algunas realizaciones, los métodos comprenden obtener una muestra. Las técnicas para obtener muestras para el análisis de LC/MS se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, recogida de tejidos (por ejemplo, sangre, plasma) y cultivo celular.
En algunas realizaciones, la muestra se ha purificado o enriquecido. En algunas realizaciones, los métodos comprenden procesar la pluralidad de polipéptidos en una muestra para producir productos peptídicos. En algunas realizaciones, procesar la pluralidad de polipéptidos en una muestra comprende uno o más de: (a) centrifugar la
muestra para aislar la pluralidad de polipéptidos; (b) purificar la pluralidad de polipéptidos en la muestra; (c) retirar de la muestra componentes incompatibles con el procesamiento posterior y análisis de LC/MS; (d) digerir la pluralidad de polipéptidos para producir los productos peptídicos; y (e) purificar los productos peptídicos antes del análisis de LC/MS.
En algunas realizaciones, el primer polipéptido es una proteína de célula huésped. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un polipéptido recombinante producido por una célula huésped. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un polipéptido terapéutico, tal como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo recombinante), o una enzima (por ejemplo, una enzima recombinante) o un péptido (por ejemplo, una insulina). En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es proteína viral, tal como una cápside de una partícula viral (por ejemplo, tal como para una terapia génica). En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de cultivo celular. En algunas realizaciones, la muestra es un producto farmacéutico o un producto intermedio del mismo.
En algunas realizaciones, el primer polipéptido es un biomarcador, tal como un biomarcador circulante. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es albúmina sérica. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre o de suero.
Técnicas de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS)
La presente invención contempla una variedad diversa de técnicas de LC/MS para generar espectros de masas en tándem de una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido.
En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende separar los productos peptídicos a través de una técnica de cromatografía de líquidos. Las técnicas de cromatografía de líquidos contempladas por la presente solicitud incluyen métodos para separar polipéptidos y técnicas de cromatografía de líquidos compatibles con técnicas de espectrometría de masas. En algunas realizaciones, la técnica de cromatografía de líquidos comprende una técnica de cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Por tanto, en algunas realizaciones, la técnica de cromatografía de líquidos comprende una técnica de cromatografía de líquidos de rendimiento ultraalto. En algunas realizaciones, la técnica de cromatografía de líquidos comprende una técnica de cromatografía de líquidos de flujo alto. En algunas realizaciones, la técnica de cromatografía de líquidos comprende una técnica de cromatografía de líquidos de flujo bajo, tal como una técnica de cromatografía de líquidos de flujo micrométrico o una técnica de cromatografía de líquidos de flujo nanométrico. En algunas realizaciones, la técnica de cromatografía de líquidos comprende una técnica de cromatografía de líquidos en línea acoplada a un espectrómetro de masas. En algunas realizaciones, la técnica de cromatografía de líquidos en línea es una técnica de cromatografía de líquidos de alto rendimiento. En algunas realizaciones, la técnica de cromatografía de líquidos en línea es una técnica de cromatografía de líquidos de rendimiento ultraalto.
En algunas realizaciones pueden usarse técnicas de electroforesis capilar (CE), o técnicas de electrospray o MALDI para introducir la muestra en el espectrómetro de masas.
En alguna realización, la técnica de espectrometría de masas comprende una técnica de ionización. Las técnicas de ionización contempladas por la presente solicitud incluyen técnicas capaces de cargar polipéptidos y productos peptídicos. Por tanto, en algunas realizaciones, la técnica de ionización es ionización por electrospray. En algunas realizaciones, la técnica de ionización es ionización por nanoelectrospray. En algunas realizaciones, la técnica de ionización es ionización química a presión atmosférica. En algunas realizaciones, la técnica de ionización es ionización por fotoionización a presión atmosférica. En algunas realizaciones, la técnica de ionización es desorción-ionización láser asistida por matriz (MALDI). En alguna realización, la técnica de espectrometría de masas comprende ionización por electrospray, ionización por nanoelectrospray o una técnica de desorción-ionización láser asistida por matriz (MALDI).
En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende analizar los productos peptídicos a través de una técnica de espectrometría de masas. Los espectrómetros de masas para su uso en los métodos reivindicados contemplados por la presente invención, a los que está acoplada una técnica de cromatografía de líquidos en línea, incluyen espectrómetros de masas de alta resolución y espectrómetros de masas de baja resolución. Por tanto, en algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF). En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (Q-TOF). En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con trampa de iones cuadrupolar (QIT-TOF). En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es una trampa de iones. En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un cuadrupolo simple. En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un cuadrupolo triple (QQQ). En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un Orbitrap. En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un Orbitrap cuadrupolar. En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier (FT). En algunas realizaciones, el espectrómetro de masas es un espectrómetro de masas de resonancia ciclotrónica de iones por transformada de Fourier cuadrupolar (Q-FT). En algunas realizaciones, la técnica de espectrometría de masas comprende el modo de ion positivo. En algunas realizaciones, la técnica de espectrometría de masas comprende el modo de ion negativo. En algunas realizaciones, la técnica de espectrometría de masas
comprende una técnica de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF). En algunas realizaciones, la técnica de espectrometría de masas comprende una técnica de espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (Q-TOF). En algunas realizaciones, la técnica de espectrometría de masas comprende una técnica de espectrometría de masas por movilidad iónica. En algunas realizaciones es apropiada una técnica de espectrometría de masas de baja resolución, tal como una trampa de iones, un enfoque cuadrupolar simple o triple.
En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende procesar las señales de MS obtenidas de los productos peptídicos. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende detección de picos. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende determinar la intensidad de ionización de un producto peptídico. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende determinar la altura de pico de un producto peptídico. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende determinar el área de pico de un producto peptídico. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende determinar el volumen de pico de un producto peptídico. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende identificar los productos peptídicos mediante secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende validar manualmente las asignaciones de secuencia de aminoácidos de producto peptídico. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende identificar el primer polipéptido mediante un identificador de proteína. En algunas realizaciones, la técnica de LC/MS comprende identificar uno o más de la pluralidad de polipéptidos mediante un identificador de proteína, que puede identificarse en una búsqueda en bases de datos o una búsqueda en bibliotecas.
En algunas realizaciones, la identificación de productos peptídicos de un polipéptido puede conseguirse usando bibliotecas espectrales. Generalmente, el uso de bibliotecas espectrales permite la imputación del conocimiento obtenido en cuanto a un sistema de polipéptidos y da como resultado una velocidad aumentada de análisis de datos y un error disminuido.
Uso de métodos de cuantificación absoluta
Los métodos de cuantificación absoluta libres de etiquetas a base de MS dados a conocer en el presente documento son especialmente adecuados para usos que comprenden la cuantificación de un polipéptido de baja abundancia en una muestra que comprende el polipéptido de baja abundancia y otro polipéptido de abundancia alta relativa. Los métodos de cuantificación absoluta libres de etiquetas a base de MS dados a conocer en el presente documento pueden, por ejemplo, constituir una única etapa en un proceso de múltiples etapas, tal como la cuantificación de una proteína de baja abundancia en la purificación de una proteína terapéutica.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos de detección de un polipéptido contaminante en la producción de un polipéptido terapéutico, comprendiendo los métodos: (a) obtener una muestra que comprende el polipéptido terapéutico; (b) determinar si el polipéptido contaminante está presente en la muestra, basándose la presencia del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos según las reivindicaciones 1-3 y 5-15. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína de célula huésped. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones se detecta más de un polipéptido contaminante en una muestra (por ejemplo, y se cuantifica la cantidad total de polipéptidos contaminantes en la muestra). En una realización, la muestra se toma en diversas etapas durante el proceso de producción de un polipéptido recombinante (por ejemplo, un polipéptido terapéutico), para someter a ensayo la pureza del polipéptido recombinante en las diversas etapas. Cuanto menor sea la cantidad de polipéptidos contaminantes (por ejemplo, polipéptidos de célula huésped) identificados, esto indicará que mayor es la pureza del polipéptido recombinante.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de producción de un polipéptido terapéutico, comprendiendo los métodos: (a) obtener una muestra que comprende el polipéptido terapéutico de una fase del proceso de producción, por ejemplo, recogida de cultivo celular o una etapa de purificación; (b) identificar un polipéptido contaminante en la muestra; (c) determinar el nivel del polipéptido contaminante en la muestra, basándose el nivel del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína de célula huésped. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones se detecta más de un polipéptido contaminante en una muestra (por ejemplo, y se cuantifica la cantidad total de polipéptidos contaminantes en la muestra). En una realización, la muestra se toma en diversas etapas durante el proceso de producción de un polipéptido recombinante (por ejemplo, un polipéptido terapéutico), para someter a ensayo la pureza del polipéptido recombinante en las diversas etapas. Cuanto menor sea la cantidad de polipéptidos contaminantes (por ejemplo, polipéptidos de célula huésped) identificados, esto indicará que es mayor la pureza del polipéptido recombinante.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de purificación de un polipéptido terapéutico, comprendiendo los métodos: (a) obtener una muestra que comprende el polipéptido terapéutico de una o más fases de un proceso de purificación, por ejemplo, recogida de cultivo celular o una etapa de purificación; (b) identificar un polipéptido contaminante en la muestra; (c) determinar el nivel del polipéptido contaminante en la muestra en la una o
más fases de un proceso de purificación, basándose el nivel del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína de célula huésped. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones se detecta más de un polipéptido contaminante en una muestra (por ejemplo, y se cuantifica la cantidad total de polipéptidos contaminantes en la muestra). En una realización, la muestra se toma en diversas etapas durante el proceso de producción de un polipéptido recombinante (por ejemplo, un polipéptido terapéutico), para someter a ensayo la pureza del polipéptido recombinante en las diversas etapas. Cuanto menor sea la cantidad de polipéptidos contaminantes (por ejemplo, polipéptidos de célula huésped) identificados, esto indicará que mayor es la pureza del polipéptido recombinante.
En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona métodos de detección de un polipéptido contaminante en un producto de terapia génica. Los métodos incluyen, por ejemplo, (a) obtener una muestra que comprende un vector de terapia génica, de una o más fases de un proceso de purificación, por ejemplo, recogida de cultivo celular o una etapa de purificación; (b) identificar un polipéptido contaminante en la muestra; (c) determinar el nivel del polipéptido contaminante en la muestra en la una o más fases de un proceso de purificación, basándose el nivel del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el producto de terapia génica está asociado con una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el producto de terapia génica comprende una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el vector de terapia génica está asociado con una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el vector de terapia génica forma parte de una partícula viral que comprende una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína de célula huésped. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral que no está asociada con el producto de terapia génica. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral que no forma parte del producto de terapia génica. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína vírica auxiliar. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones se detecta más de un polipéptido contaminante en una muestra (por ejemplo, y se cuantifica la cantidad total de polipéptidos contaminantes en la muestra). En una realización, la muestra se toma en diversas etapas durante el proceso de producción del producto de terapia génica, para someter a ensayo la pureza del producto de terapia génica en las diversas etapas. Cuanto menor sea la cantidad de polipéptidos contaminantes (por ejemplo, polipéptidos de célula huésped) identificados, esto indicará que mayor es la pureza del producto de terapia génica.
En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona métodos de producción de un producto de terapia génica. Los métodos incluyen, por ejemplo, (a) obtener una muestra que comprende un vector de terapia génica, de una o más fases de un proceso de purificación, por ejemplo, recogida de cultivo celular o una etapa de purificación; (b) identificar un polipéptido contaminante en la muestra; (c) determinar el nivel del polipéptido contaminante en la muestra en la una o más fases de un proceso de purificación, basándose el nivel del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el producto de terapia génica está asociado con una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el producto de terapia génica comprende una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el vector de terapia génica está asociado con una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el vector de terapia génica forma parte de una partícula viral que comprende una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína de célula huésped. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral que no está asociada con el producto de terapia génica. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral que no forma parte del producto de terapia génica. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína vírica auxiliar. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones se detecta más de un polipéptido contaminante en una muestra (por ejemplo, y se cuantifica la cantidad total de polipéptidos contaminantes en la muestra). En una realización, la muestra se toma en diversas etapas durante el proceso de producción del producto de terapia génica, para someter a ensayo la pureza del producto de terapia génica en las diversas etapas. Cuanto menor sea la cantidad de polipéptidos contaminantes (por ejemplo, polipéptidos de célula huésped) identificados, esto indicará que mayor es la pureza del producto de terapia génica.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de purificación de un producto de terapia génica. Los métodos incluyen, por ejemplo, (a) obtener una muestra que comprende un vector de terapia génica, de una o más fases de un proceso de purificación, por ejemplo, recogida de cultivo celular o una etapa de purificación; (b) identificar un polipéptido contaminante en la muestra; (c) determinar el nivel del polipéptido contaminante en la muestra en la una o más fases de un proceso de purificación, basándose el nivel del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, el producto de terapia génica está asociado con una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el producto de terapia génica comprende una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el vector de terapia génica está asociado con una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el vector de terapia génica forma parte de una partícula viral que comprende una proteína viral, tal como una cápside. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína de célula
huésped. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral que no está asociada con el producto de terapia génica. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína viral que no forma parte del producto de terapia génica. En algunas realizaciones, el polipéptido contaminante es una proteína vírica auxiliar. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es una proteína viral, tal como una proteína de cápside. En algunas realizaciones se detecta más de un polipéptido contaminante en una muestra (por ejemplo, y se cuantifica la cantidad total de polipéptidos contaminantes en la muestra). En una realización, la muestra se toma en diversas etapas durante el proceso de producción del producto de terapia génica, para someter a ensayo la pureza del producto de terapia génica en las diversas etapas. Cuanto menor sea la cantidad de polipéptidos contaminantes (por ejemplo, polipéptidos de célula huésped) identificados, esto indicará que mayor es la pureza del producto de terapia génica.
En algunas realizaciones, los métodos dados a conocer en el presente documento comprenden además ajustar un protocolo basándose en la presencia de un polipéptido contaminante. Por ejemplo, un proceso de purificación puede ajustarse basándose en la presencia de un polipéptido contaminante identificado y cuantificado. Tales ajustes proporcionan métodos para mejorar la pureza de un polipéptido diana, tal como un polipéptido terapéutico.
En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de una enfermedad en un individuo, seleccionándose el individuo para el tratamiento basándose en una cantidad de un biomarcador en el individuo. En algunas realizaciones, el biomarcador se cuantifica en una muestra de suero. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es un biomarcador. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es albúmina sérica.
En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona métodos de evaluación de una enfermedad en un individuo, evaluándose el individuo basándose en una cantidad de un biomarcador en el individuo. En algunas realizaciones, la cantidad del biomarcador se cuantifica en una muestra de suero. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es un biomarcador. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es albúmina sérica.
En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona métodos de diagnóstico de una enfermedad en un individuo, diagnosticándose el individuo con la enfermedad basándose en una cantidad de un biomarcador en el individuo. En algunas realizaciones, la cantidad del biomarcador se cuantifica en una muestra de suero. En algunas realizaciones, el primer polipéptido es un biomarcador. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es albúmina sérica.
Sistemas
La presente divulgación proporciona sistemas y medios legibles por ordenador no transitorios útiles para determinar la cantidad de polipéptido absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido.
En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un sistema para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende el primer polipéptido y un segundo polipéptido, comprendiendo el sistema: (a) un espectrómetro de masas; (b) un ordenador que comprende; (c) un medio legible por ordenador no transitorio que incluye instrucciones almacenadas en el mismo que, cuando se ejecutan, realizan un procesamiento que incluye: calcular el promedio o la suma de una señal de MS para: (i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); (ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); (iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y (iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula:
[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)],
o equivalentes matemáticos de la misma. En algunas realizaciones, el sistema comprende además un cromatógrafo de líquidos.
En algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un medio legible por ordenador no transitorio que incluye instrucciones almacenadas en el mismo que, cuando se ejecutan, realizan un procesamiento para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende el primer polipéptido y un segundo polipéptido, incluyendo el procesamiento: calcular el promedio o la suma de una señal de MS para: (i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A); (ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B); (iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y (iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D), calculándose A , B, C y D todos usando el
promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula:
[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(fí)],
o equivalentes matemáticos de la misma.
Los expertos en la técnica reconocerán que son posibles varias realizaciones dentro del alcance de esta invención. La invención se describirá ahora en mayor detalle mediante la referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Los siguientes ejemplos ilustran además la invención pero, naturalmente, no deben interpretarse como que limitan de manera alguna su alcance.
Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” se refiere a un polímero que comprende aminoácidos unidos covalentemente a través de enlaces peptídicos. En algunas realizaciones, el polipéptido es una proteína. En algunos ejemplos, una proteína comprende dos o más polipéptidos (por ejemplo, una proteína multimérica, una proteína homomérica, un complejo multiproteico). Los polipéptidos pueden estar modificados adicionalmente con restos no de aminoácido. Por ejemplo, un polipéptido puede comprender además modificaciones medidas enzimáticamente y/o modificaciones químicas (por ejemplo, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, formilación, glicosilación, oxidación). Tales modificaciones pueden producirse, por ejemplo, en entornos de base celular o como resultado de procesamiento de muestras y/o técnicas de análisis.
Tal como se usa en el presente documento, el término “producto peptídico” se refiere a un polímero que comprende dos o más aminoácidos unidos covalentemente a través de enlaces peptídicos obtenidos tras el procesamiento de descomposición de un polipéptido. Por ejemplo, los productos peptídicos se obtienen tras el procesamiento de descomposición de un polipéptido que incluye digestión química (por ejemplo, hidrólisis ácida) o digestión enzimática (por ejemplo, digestión por tripsina). En algunas realizaciones, el producto peptídico es un péptido tríptico. En algunas realizaciones, el producto peptídico es un fragmento terminal de un polipéptido más grande. En algunas realizaciones, el producto peptídico es un fragmento interno de un polipéptido.
El término “comprende” se usa en el presente documento para significar que otros componentes, ingredientes, etapas, etc. están opcionalmente presentes. Por ejemplo, un artículo “que comprende” los componentes A, B y C puede consistir en (es decir, contener solo) los componentes A, B y C, o puede contener no solo los componentes A, B y C sino también uno o más de otros componentes. Se entiende que “comprende” y equivalentes gramaticales del mismo incluyen “que consiste en” o “que consiste esencialmente en”.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor interviniente, hasta el décimo de la unidad del límite inferior a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o interviniente en ese intervalo establecido, está abarcado dentro de la divulgación, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos están también incluidos en la divulgación.
La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que se refieren a ese valor o parámetro en sí. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a “aproximadamente X” incluye la descripción de “X.”
Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un/una,” “o,” y “el/la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Estudio de carga de ASM que demuestra la respuesta de señal de MS lineal mejorada de un conjunto central de iones de productos peptídicos de ASM
Este ejemplo demuestra un estudio de carga que usa una muestra que comprende esfingomielina fosfodiesterasa (ASM) para la selección de una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga. Además, este ejemplo demuestra la respuesta de señal de MS lineal mejorada de un conjunto central de iones de productos peptídicos de ASM en comparación con un conjunto superior de iones de productos peptídicos de máxima abundancia de ASM.
Por triplicado, una muestra de ASM se desnaturalizó, redujo y alquiló antes de la digestión con LysC y tripsina. Se realizó un análisis de LC/MS en las muestras digeridas a 1 pg, 2,5 pg, 5 pg, 7,5 pg, 10 pg, 12,5 pg, 15 pg, 18 pg y 20 pg. Se realizó una cromatografía con un ACQUITY UPLC con una columna de 2,1 por 150 mm empaquetada con material CSH130 C18 1,7 pm. Se obtuvieron datos usando barridos alternantes de energía de colisión baja y elevada
en un Xevo Q-Tof G2-XS para generar información iónica de precursor y fragmento. Se calcularon las áreas de pico de MS y el error porcentual promedio para cada ion de producto peptídico a lo largo del intervalo de cantidades de muestra de los 40 iones de productos peptídicos más abundantes superiores de ASM.
La FIG. 1 muestra un histograma de áreas de pico de MS para los cuarenta iones de productos peptídicos más abundantes observados a partir de un análisis de LC/MS de una muestra que comprende esfingomielina fosfodiesterasa (ASM) a diferentes cantidades de carga de muestra (la cantidad de carga de muestra por análisis de LC/MS se ordena como 1 gg, 2,5 gg, 5 gg, 7,5 gg, 10 gg, 12,5 gg, 15 gg, 18 gg y 20 gg, de izquierda a derecha para cada conjunto de barras de péptido). El error porcentual promedio para cada ion de producto peptídico entre las cantidades de carga de muestra se muestra por encima del conjunto de barras de péptido.
Como se muestra en la FIG. 1, los productos peptídicos más intensos de ASM tienen un mayor error en relación con todos los iones de productos peptídicos, especialmente a medida que la cantidad de muestra total aumenta. Los péptidos en el centro de la distribución de iones de productos peptídicos se comportan de manera más lineal y tienen un menor error en relación con todos los iones de productos peptídicos, incluso hasta cantidades de carga de muestra totales de 20 gg.
Usando datos en el estudio de carga pueden seleccionarse un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido y un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido. Por ejemplo, el conjunto superior de un número n, por ejemplo, 3, de iones cualificados de productos peptídicos de ASM puede incluir iones de productos peptídicos seleccionados de péptido A (z=4), péptido B (z=3) y péptido C (z=4). El conjunto central de un número m, por ejemplo, 3, de iones cualificados de productos peptídicos de ASM puede incluir iones de productos peptídicos seleccionados de péptido D (z=2), péptido M (z=4), péptido O (z=1), péptido M (z=3), péptido B (z=2), péptido L (z=2), péptido P (z=1) y péptido Q (z=1).
Además, usando los datos recogidos del estudio de carga de ASM, el área de pico sumada frente a la muestra cargada en la columna (gg) se representó gráficamente para cada cantidad de carga de muestra usando el conjunto superior de los 3 iones de productos peptídicos más abundantes (3 superiores) y un conjunto central de 3 iones de productos peptídicos (3 centrales) (FIG.2). El comportamiento no lineal del conjunto de 3 productos peptídicos superiores puede verse muy por debajo de la cantidad de carga de muestra óptima (10 gg). El conjunto de 3 productos peptídicos centrales se comportó de manera lineal a lo largo de las cantidades de carga de muestra del estudio de carga, demostrando así que los 3 iones de productos peptídicos centrales son adecuados para las técnicas de cuantificación de la presente invención. El R2 para una regresión lineal también se mejora usando el conjunto de 3 productos peptídicos centrales (0,98 para el conjunto de 3 productos peptídicos centrales en comparación con 0,87 para el conjunto de 3 productos peptídicos superiores).
El error porcentual para cada conjunto de productos peptídicos a cada concentración en relación con la carga de 2,5 gg se proporciona en la tabla 1. El error porcentual entre la relación esperada y la relación observada para el conjunto de 3 productos peptídicos centrales era menor que para el conjunto de 3 productos peptídicos superiores para todas las cantidades de carga de muestra.
Tabla 1. Error porcentual del conjunto de 3 productos peptídicos superiores y del conjunto
de 3 productos peptídicos centrales en cada cantidad de carga de muestra
en relación con el conjunto de productos peptídicos de 2,5 gg de carga.
Ejemplo 2
Métodos de determinación de la cantidad para polipéptidos
Este ejemplo demuestra la mejora de la reproducibilidad de la cuantificación del método de los 3 centrales en comparación con el método de los 3 superiores usando cuatro lotes de producción de proteína de un producto de proteína terapéutica sometido a ensayo en cuatro ocasiones diferentes.
Cuatro lotes de producción de proteína (lote 1, lote 2, lote 3, lote 4) de la proteína X se prepararon y analizaron tal como se da a conocer en el ejemplo 1. Para el método de los 3 superiores, se añadieron de manera conocida 200 fmol de productos peptídicos de un patrón ClpB (chaperona ClpB de E. coli) a cada muestra como patrón interno.
Tal como se mide mediante el método de los 3 superiores, las ppm totales de proteína de célula huésped en relación con los productos peptídicos ClpB añadidos de manera conocida se representaron gráficamente para cada lote de producción de proteína (FIG. 3A). Las medidas de cuantificación del método de los 3 superiores tienen una desviación estándar relativa del 82%.
Tal como se mide mediante el método de los 3 centrales, las ppm totales de proteína de célula huésped (HCP) se representaron gráficamente para cada lote de producción de proteína (FIG. 3B). Las medidas de cuantificación del método de los 3 centrales tienen una desviación estándar relativa del 16%.
La ecuación usada para calcular la cantidad de polipéptido para el método de los 3 centrales es tal como sigue:
[(Suma del área de pico de 3 iones de productos peptídicos superiores de HCP a la carga de cantidad de muestra alta)/(Suma del área de pico de 3 iones de productos peptídicos centrales del producto de proteína terapéutica a la carga de cantidad de muestra alta)] * (fmol del producto de proteína terapéutica a la carga de cantidad de muestra alta) * [(Suma del área de pico de 3 iones de productos peptídicos centrales del producto de proteína terapéutica a la carga de cantidad de muestra baja)/(Suma del área de pico de 3 iones de productos peptídicos superiores del producto de proteína terapéutica a la carga de cantidad de muestra baja)].
Usar el método de los 3 superiores con 200 fmol de péptidos ClpB como patrón interno dio un error mayor, en comparación con el método de los 3 centrales. La cuantificación absoluta era mucho más reproducible usando el método de los 3 centrales. La mayor variabilidad se debía al patrón interno añadido de manera conocida, aunque también pueden haberse producido diferencias en la digestión enzimática. A 10 pg en la columna, el conjunto central de productos peptídicos era más apropiado de usar para la cuantificación ya que se comportaban de manera lineal.
Ejemplo 3
Aplicación del método de cuantificación de los 3 centrales para la detección y el seguimiento de proteínas de célula huésped durante la purificación de una proteína terapéutica
Este ejemplo demuestra una aplicación del método de cuantificación de los 3 centrales dados a conocer en el presente documento para la detección y el seguimiento de alto rendimiento de proteínas de célula huésped contaminantes (HCP) en múltiples fases durante un proceso de purificación de una proteína terapéutica, incluyendo de muestras recogidas de una recogida de cultivo celular a muestras recogidas tras un protocolo de desalación final. Este ejemplo demuestra además el uso de software para el seguimiento de péptidos de HCP mediante el tiempo de retención y m/z para la cuantificación libre de etiquetas de HCP en muestras de purificación de fase tardía, y el uso de búsquedas basadas en bibliotecas espectrales para mejorar adicionalmente el rendimiento y optimizar la cuantificación absoluta.
Métodos:
Tras la producción basada en cultivo celular de una proteína terapéutica (proteína X), se recogieron muestras de la recogida de cultivo celular y en 5 fases de un proceso de purificación de proteínas, incluyendo muestras de sustancia farmacológica finales. El uso de triplicados proporcionó potencia estadística de mediciones posteriores, incluyendo datos de reproducibilidad y de producción. Tras recoger las muestras, las muestras recogidas se filtraron a través de un filtro 3k MWCO Amicon Ultra-15 (EMD Millipore) según las instrucciones del fabricante para concentrar y retirar los aditivos que impiden el análisis espectrométrico de masas antes de desnaturalizarse y digerirse con el resto de las muestras. Brevemente, se completó una etapa de aclarado con agua de dispositivos Amicon y entonces se añadieron 400 pg de proteína total o proteína terapéutica por muestra con el bicarbonato de amonio 50 mM (Ambic) añadido encima hasta un volumen total de 15 ml. Posteriormente se completó un lavado de 15 ml de Ambic 50 mM, antes de una etapa de centrifugación final. Las concentraciones finales se midieron como entre 1,4 y 1,7 mg/ml de proteína total o proteína terapéutica. Alícuotas por triplicado de cada muestra (de sustancia farmacológica (DS) a través de recolección filtrada con Amicon, así como un digesto en blanco) se diluyeron hasta 1 mg/ml en Ambic 50 mM, y se mezclaron 1:1 con Rapigest (Waters, reconstituido con Ambic 50 mM hasta una concentración del 0,1%), creando una disolución final de 0,5 mg/ml de proteína en un 0,05% de Rapigest, Ambic 50 mM. Las muestras se incubaron a 60°C durante 15 minutos para garantizar la desnaturalización de las proteínas. Se realizó un reducción de los disulfuros con 1,4-ditiothreitol (DTT) 10 mM (Pierce) en Ambic 50 mM a 60°C durante 1 hora. Se permitió que las muestras se enfriasen hasta temperatura ambiente antes de la alquilación con 2-yodoacetamida (IAA) 20 mM (Pierce) en Ambic 50 mM y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Se reconstituyó Lys-C (Promega, 15 pg/vial) en Ambic 50 mM a una concentración de 0,125 pg/pl y se añadió a cada muestra a una relación de enzima:sustrato de 1:50. Las muestras se incubaron durante la noche a 37°C. La mañana siguiente se preparó una disolución de tripsina (Promega, 100 pg/vial) a 0,4 pg/pl en Ambic 50 mM y se añadió a la muestra a una relación de 1:25 y se incubó a 37°C durante 3 horas. Se retiró el Rapigest mediante escisión ácida con la adición de un 2,05% de
ácido fórmico (EMD Millipore). Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 37°C antes de centrifugarse a 12.000 rpm durante 15 minutos para sedimentar el Rapigest escindido y cualquier proteína no digerida. Cada vial de automuestreador se preparó con 20 gg de muestra digerida, 400 fmol de patrón de E. coli Hi3 (Waters) y se diluyó hasta un volumen final de 60 gl con un 0,1% de ácido fórmico para la inyección en la LC-MS.
Las muestras digeridas (30 gl o 10 gg en la columna) se inyectaron en un sistema Waters ACQUITY H-Class UPLC conectado a un espectrómetro de masas Waters XEVO G2-XS QTof para el análisis de LC-MS usando una columna 1,7 gm CSH C18 (2,1 mm X 150 mm, Waters). El espectrómetro de masas se ajustó para recoger datos de MSE a lo largo del intervalo de masas de 50 a 2000 con barridos de 0,3 segundos en el modo de sensibilidad. Todas las muestras se hicieron pasar en un orden aleatorio dentro de la fase de limpieza (es decir, blancos y sustancia farmacológica se aleatorizaron conjuntamente y se hicieron pasar en primer lugar; muestras de eluido de columna de proceso central se aleatorizaron y se hicieron pasar a continuación; y recogida de cultivo celular se aleatorizó y se hizo pasar en último lugar). El UPLC usó agua y acetonitrilo (ACN) con un 0,1% de ácido fórmico como aditivos y un gradiente del 5 al 40% de ACN a lo largo de 30 minutos, subiendo hasta el 85% de ACN a lo largo de 5 minutos, manteniéndolo durante 2 minutos, y volviendo a las condiciones iniciales a lo largo de 3 minutos, y manteniéndolas durante 5 minutos con una tasa de flujo de 250 gl/min y un tiempo de gradiente total de 45 minutos.
Los archivos de datos de MS se importaron al software Progenesis Qi for Proteomics (Nonlinear Dynamics) para escoger los picos y la alineación iónica de precursor/producto antes de buscarse frente a una base de datos de secuencias usando el algoritmo de búsqueda MSE (Waters). La base de datos combinaba secuencias de productos de proteína terapéutica, proteínas contaminantes comunes, la base de datos Uniprot de hámster chino y una versión invertida de cada una (69.916 secuencias totales). Se realizaron identificaciones con el requisito de 3 fragmentos por péptido, 7 fragmentos por proteína y al menos 2 péptidos por proteína con un 4% o menos de FDR. Se empleó un filtrado adicional para obtener <1% de FDR usando una puntuación de péptido >5 y un error de masa de péptido <10 ppm. Generalmente, las identificaciones de péptido se hicieron en las muestras de proceso más aguas arriba, por ejemplo, muestras de recogida, pero este no era siempre el caso. Los péptidos que no coincidían con la tendencia para la proteína no se incluyeron para la cuantificación. Las proteínas se cuantificaron basándose en la abundancia de los tres péptidos superiores por proteína (a lo largo de las tres inyecciones) en comparación con los tres péptidos superiores para ClpB (3 superiores) o los péptidos que se comportan de manera lineal con respecto al producto (los 3 centrales) para determinar la cantidad relativa de proteínas presente en cada muestra.
Resultados y discusión:
Un riesgo de usar herramientas de software de descubrimiento de proteómica para el análisis de HCP de abundancia relativamente baja en una mezcla de producción de proteína terapéutica es que iones abundantes de la proteína terapéutica pueden identificarse incorrectamente como HCP. Recientemente se ha mostrado que artefactos en proteínas abundantes pueden identificarse incorrectamente como otras proteínas a una tasa que es mucho mayor que la tasa de señuelo (Kong et al. Nature methods. 2017;14(5):513-520). También es posible que los HCP también pueden identificarse correctamente al nivel de proteína, pero algunos péptidos con respecto a estas HCP pueden ser incorrectos o podrían verse interferidos por otros iones, de modo que no deberían usarse para la cuantificación.
El método dado a conocer en el presente documento usa la propiedad fisicoquímica ortogonal del patrón de intensidad por todo el proceso de purificación para eliminar mediante filtración tales identificaciones de falsos positivos así como péptidos con interferencias. Dentro de Progenesis Qi for Proteomics, cada péptido se listó junto con la puntuación de identificación y la exactitud de masa, así como una visualización de la tendencia del péptido en todo el experimento. También se mostró una imagen que muestra la detección de cada péptido en m/z y el tiempo de retención, de modo que pueden observarse otros iones interferentes. Los péptidos que tienen, por ejemplo, interferencia observada, no se usaron para la cuantificación.
El tiempo de análisis de LC-MS para el análisis de muestras de todo el proceso de purificación se completó en aproximadamente dos días (el tiempo de análisis de LC-MS para una única muestra era de aproximadamente 45 minutos). La validación manual de la identificación de todos los péptidos, incluyendo péptidos de HCP, tardó aproximadamente dos semanas. Tras la validación, se cuantificó una lista final de HCP identificadas de las muestras de producción de proteína terapéutica. Como se muestra en la FIG. 4 , se identificaron HCP comunes entre siete lotes de producción. Se realizaron análisis estadísticos para entender el proceso de purificación, por ejemplo, análisis de componentes principales (PCA), que proporcionaron una ilustración de la retirada de las HCP durante cada etapa del proceso de purificación. El análisis adicional de las HCP incluyó el agrupamiento jerárquico, que agrupa proteínas que se comportan de manera similar durante el proceso de purificación. El agrupamiento jerárquico permitió la investigación de nodos para descubrir qué proteínas se estaban retirando durante cada etapa en el proceso de purificación. Estos datos se usaron para entender y optimizar los procesos de purificación para garantizar que HCP específicas se eliminaban del producto de proteína terapéutica final. Las HCP que no se purificaron adecuadamente de la proteína terapéutica se retiraron optimizando el proceso de purificación basándose en, por ejemplo, las propiedades fisicoquímicas de las HCP, incluyendo pl, peso molecular, hidrofobicidad, actividad e inmunogenicidad. El software se usó también para monitorizar automáticamente la presencia de HCP a lo largo del transcurso de un proceso de purificación.
La mayor fuente de variabilidad en la cuantificación absoluta de HCP entre ocasiones de ensayo ha sido o bien la cantidad de patrón interno añadido de manera conocida o bien la cantidad de ese patrón interno a nivel de péptido con respecto a las HCP, que eran proteínas digeridas. El patrón interno añadido de manera conocida era habitualmente los 3 péptidos ClpB superiores que están previstos para usarse para la cuantificación absoluta. Se tuvo un gran cuidado para solubilizar, tomar alícuotas y almacenar el patrón, pero puede haberse producido variabilidad debido a diferencias de pipeteo entre, por ejemplo, operadores o cambios en la digestión enzimática entre ocasiones de ensayo. En lugar de usar un patrón interno añadido de manera conocida, tal como se muestra en el presente documento, pueden usarse péptidos de la proteína terapéutica, sin embargo, los péptidos más abundantes de la proteína terapéutica están a menudo en una abundancia que está más allá del intervalo dinámico del espectrómetro de masas, es decir los péptidos más abundantes de una proteína terapéutica pueden sobresaturar el detector del espectrómetro de masas. Usando el método de los péptidos más abundantes (método de los 3 superiores), se observó que los péptidos más abundantes tenían un comportamiento no lineal debido a, por ejemplo, la saturación del detector. Por el contrario, se observó que los péptidos en el centro de la distribución de ionización, que se denominan 3 péptidos centrales, tenían un comportamiento lineal de señal basado en la abundancia. Como se muestra en el presente documento, el método de los 3 péptidos centrales, que incorpora datos de los 3 péptidos centrales, produjo un menor error y mostró un comportamiento lineal hasta 18 |ug en la columna.
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1 Un método para la cuantificación absoluta de un primer polipéptido en una muestra que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y un segundo polipéptido,en el que el primer polipéptido es al menos 10 veces menos abundante que el segundo polipéptido y el segundo polipéptido tiene una concentración conocida en la muestra,comprendiendo el método:(a) obtener señales de MS de iones de productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos, obteniéndose dichas señales de MS de iones de los productos peptídicos analizando los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos usando una técnica de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS),obteniéndose señales de MS de los productos peptídicos para cada una de una pluralidad de cantidades de carga de muestra que comprenden una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, ysiendo la primera cantidad de carga de muestra mayor que la segunda cantidad de carga de muestra;(b) calcular el promedio o la suma de una señal de MS para:(i) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del primer polipéptido con las mayores señales de MS a la primera cantidad de carga de muestra (A);(ii) un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra (B);(iii) un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra (C); y(iv) el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido a la segunda cantidad de carga de muestra (D),calculándose A, B, C y D todos usando el promedio o calculándose todos usando la suma de la señal de MS; y (c) determinar una cantidad absoluta del primer polipéptido a la primera cantidad de carga de muestra basándose en la siguiente fórmula:[(A)/(C)] * (mol del segundo polipéptido a la primera cantidad de carga) * [(D)/(B)].
- 2. - El método según la reivindicación 1, en el que el promedio de la señal de MS se usa para determinar la cantidad absoluta del primer polipéptido, o en el que la suma de la señal de MS se usa para determinar la cantidad absoluta del primer polipéptido.
- 3. - El método según la reivindicación 1 o 2, en el que el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido se selecciona basándose en el error de cuantificación de los iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, o la primera cantidad de carga de muestra y/o la segunda cantidad de carga de muestra, que comprende opcionalmente además seleccionar el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido.
- 4. - Un método para seleccionar un conjunto de iones cualificados de productos peptídicos para la cuantificación absoluta según el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3comprendiendo el método:(a) analizar los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos a una pluralidad de cantidades de carga de muestra usando una técnica de cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) para obtener señales de MS de iones de los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos a cada una de la pluralidad de cantidades de carga de muestra,comprendiendo la pluralidad de cantidades de carga de muestra una primera cantidad de carga de muestra y una segunda cantidad de carga de muestra, ysiendo la primera cantidad de carga de muestra mayor que la segunda cantidad de carga de muestra; y (b) seleccionar un conjunto central de un número m de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido,seleccionándose el conjunto central de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido basándose en el error de cuantificación de los iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido de la pluralidad de cantidades de carga de muestra, o la primera cantidad de carga de muestra y/o la segunda cantidad de carga de muestra.
- 5. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que cada uno del conjunto superior de iones cualificados de productos peptídicos es diferente de cada uno del conjunto central de iones cualificados.
- 6. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la señal de MS es intensidad de ionización, altura de pico, área de pico o volumen de pico.
- 7. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que los productos peptídicos de la pluralidad de polipéptidos en la muestra se obtienen a través de la digestión de la muestra antes de analizar los productos peptídicos usando la técnica de LC/MS.
- 8. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la técnica de LC/MS comprende además uno o más los siguientes:(a) identificar los productos peptídicos mediante secuencia de aminoácidos;(b) identificar el primer polipéptido mediante un identificador de proteína; y(c) identificar uno o más de la pluralidad de polipéptidos mediante un identificador de proteína.
- 9. - El método según cualquier reivindicación anterior, que comprende además determinar la cantidad absoluta del segundo polipéptido.
- 10. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que el primer polipéptido es una proteína de célula huésped y/o un biomarcador; y/o el segundo polipéptido es un polipéptido recombinante producido por una célula huésped y/o un polipéptido terapéutico.
- 11. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la muestra es una muestra de cultivo celular, una muestra de sangre o una muestra de suero, opcionalmente en el que la muestra es una muestra de sangre o muestra de suero y el segundo polipéptido es albúmina sérica y/o, en el que la muestra es un producto farmacéutico o un producto intermedio del mismo y/o en el que la muestra se ha purificado o enriquecido.
- 12. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que la pluralidad de cantidades de carga de muestra comprende cantidades de carga de muestra en el intervalo de aproximadamente 0,1-25 gg de proteína total, por ejemplo, en el que la primera cantidad de carga de muestra es de aproximadamente 10 gg de proteína total, y/o la segunda cantidad de carga de muestra es de aproximadamente 1 gg de proteína total.
- 13. - El método según cualquier reivindicación anterior, que comprende además seleccionar la segunda cantidad de carga de muestra basándose en señales de MS del segundo conjunto de productos peptídicos y/o seleccionar la primera cantidad de carga de muestra basándose en señales de MS del primer conjunto de productos peptídicos.
- 14. - El método según cualquier reivindicación anterior, en el que n y/o m es 1 o mayor, opcionalmente en el que n y/o m es 3.
- 15. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, que comprende además seleccionar un conjunto superior de un número n de iones cualificados de productos peptídicos del segundo polipéptido con las mayores señales de MS a la segunda cantidad de carga de muestra.
- 16. - Un método para detectar un polipéptido contaminante en la producción de un polipéptido terapéutico, comprendiendo el método:(a) obtener una muestra que comprende el polipéptido terapéutico;(b) determinar si el polipéptido contaminante está presente en la muestra;basándose la presencia del polipéptido contaminante en la cuantificación absoluta del polipéptido contaminante en la muestra usando los métodos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, 5-15.
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