KR102509880B1 - 질량 분광분석법을 이용한 소량 폴리펩티드의 절대 정량화 방법 - Google Patents
질량 분광분석법을 이용한 소량 폴리펩티드의 절대 정량화 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 단순 또는 복합 폴리펩티드 혼합물로부터 수득한 펩티드 생성물의 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법 분석에 의한 상대적으로 소량의 폴리펩티드의 개선된 무라벨 절대 정량화 방법을 제공한다. 이 절대 정량화 방법은 상대적으로 소량의 폴리펩티드의 정량화를 개선하기 위하여 상대적으로 다량의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온 세트로부터의 MS 신호를 포함한다.
Description
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 참고로 포함되는 2017년 6월 2일자 출원된 미국 가출원번호 62/514,587에 대한 우선권을 주장한다.
[기술분야]
본 발명은 단순 또는 복합 폴리펩티드 혼합물로부터 수득한 펩티드 생성물의 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 분석에 의한 소량 폴리펩티드의 절대 정량화 방법을 제공한다.
폴리펩티드 정량을 위한 다양한 종류의 질량 분광분석법(MS) 기반 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 대사 기반 기술(예를 들어, 세포 배양에서 아미노산을 사용한 안정적인 동위 원소 라벨링(SILAC)), 펩티드 표준 기반 기술(예를 들어, 선택된 반응 모니터링(SRM) 및 다중 반응 모니터링(MRM)), 및 라벨 기반 기술(예를 들어, 탠덤 질량 태그(TMT))을 이용하여 정량화될 수 있다. 이러한 방법에는 SILAC의 경우 제한된 샘플 공급원, SRM과 MRM의 대규모 개발과 비용, 그리고 라벨 기반 기술의 추가 샘플 처리와 상대 존재비(relative abundance) 산출과 같은 잘 기록된 단점이 있다.
MS 기반의 무라벨 정량화 기술은 MS 기반의 폴리펩티드 정량화 방법을 단순화하고 위에 언급된 한계 중 일부를 회피하고자 개발되었다. 그러나 현재의 무라벨 정량화 기술은 낮은 정확도와 높은 변동성이 문제가 될 수 있으며, 대부분의 무라벨 기술은 2개 이상의 샘플 사이의 상대적인 정량화 비율(예컨대, 스펙트럼 카운팅)만 제공할 수 있다.
MS 기반 단백질의 무라벨 절대 정량화를 위한 한 가지 접근법은 단백질 표준을 사용하여 단일 점 보정 측정을 생성하는 것을 포함하며, 이는 다른 단백질의 절대 정량화를 위한 후속 질량 분광분석법에 적용된다. J. C. Silva et al., Mol Cell Proteomics, 5, 144-56, 2006; 미국 특허 번호 8,271,207. 그러나 단일 점 보정의 사용 및 샘플과 단백질 표준의 별도의 효소 분해에 의해 생성된 차이는 이 방법의 정량화 변동성의 주요 원천이 될 수 있다.
따라서, 당해 기술 분야에서는 민감하고 정확하고 정밀하며 고처리량 방식으로 다양한 종류의 폴리펩티드 샘플에 적용할 수 있는 개선된 MS 기반 무라벨 절대 정량화 기술이 필요하다.
특허 출원 및 공보물을 포함하여, 본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 상대적으로 다량의 또 다른 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 소량 폴리펩티드의 무라벨 절대 정량화 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 치료적 폴리펩티드와 같은 재조합 폴리펩티드를 생성할 수 있는 숙주 세포를 포함하는 배양 시스템 또는 이의 하류 생성물에서 소량 숙주 세포 단백질을 정량화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 다량 폴리펩티드의 농도와 펩티드 생성물 MS 신호 및 소량 폴리펩티드의 펩티드 생성물 MS 신호를 이용하여 소량 폴리펩티드의 절대량을 계산한다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화 방법을 제공하며, 이때, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 10배 더 소량이며, 다음 단계를 포함한다: (a) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술을 이용하여 복수의 샘플 로딩 양에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 분석하여 복수의 샘플 로딩 양 각각에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 MS 신호를 획득하는 단계로서, 복수의 샘플 로딩 양은 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하고, 제1 샘플 로딩 양은 제2 샘플 로딩 양보다 더 많은 것인, 단계; (b) 다음에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계: (i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); (ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); (iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 (iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D), 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및 (c) 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화 방법을 제공하며, 이때, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 10배 더 소량이며, 다음 단계를 포함한다: (a) 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 MS 신호를 획득하는 단계로서, 이때, 펩티드 생성물의 이온의 상기 MS 신호는 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술을 이용하여 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 분석함으로써 획득되고, 펩티드 생성물의 MS 신호는 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하는 복수의 샘플 로딩 양 각각에 대해 획득되고, 제1 샘플 로딩 양은 제2 샘플 로딩 양보다 더 많은 것인, 단계; (b) 다음에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계: (i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); (ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); (iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 (iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D), 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및 (c) 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계.
일부 구현예에서, MS 신호의 평균은 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, MS 신호의 총합은 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트는 복수의 샘플 로딩 양, 또는 제1 샘플 로딩 양 및/또는 제2 샘플 로딩 양으로부터의 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 정량화 오차를 기반으로 하여 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화를 위한 펩티드 생성물의 적격 이온의 세트를 선택하는 방법을 제공하며, 이때, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 10배 더 소량이며, 다음 단계를 포함한다: (a) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술을 이용하여 복수의 샘플 로딩 양에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 분석하여 복수의 샘플 로딩 양 각각에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 MS 신호를 획득하는 단계로서, 복수의 샘플 로딩 양은 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하고, 제1 샘플 로딩 양은 제2 샘플 로딩 양보다 더 많은 것인, 단계; 및 (b) 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트를 선택하는 단계로서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트는 복수의 샘플 로딩 양, 또는 제1 샘플 로딩 양 및/또는 제2 샘플 로딩 양으로부터의 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 정량화 오차를 기반으로 하여 선택되는 것인, 단계. 일부 구현예에서, 방법은 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트를 선택하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 펩티드 생성물의 적격 이온의 상위 세트 각각은 적격 이온의 중위 세트 각각과 상이하다.
일부 구현예에서, MS 신호는 이온화 강도 또는 피크 높이 또는 피크 면적 또는 피크 부피이다.
일부 구현예에서, 방법은 샘플을 수득하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 정제되었거나 농축되었다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플에서 복수의 폴리펩티드를 처리하여 펩티드 생성물을 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플을 처리하는 단계는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (a) 샘플을 원심분리하여 복수의 폴리펩티드를 단리하는 단계; (b) 샘플의 복수의 폴리펩티드를 정제하는 단계; (c) 샘플로부터 후속 처리 및 질량 분광분석법 분석에 적합하지 않은 성분을 제거하는 단계; (d) 복수의 폴리펩티드를 소화시켜 펩티드 생성물을 생성하는 단계; 및 (d) 펩티드 생성물을 정제하는 단계.
일부 구현예에서, LC/MS 기술은 액체 크로마토그래피 기술을 통해 펩티드 생성물을 분리하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물의 획득된 MS 신호를 처리하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, LC/MS 기술은 다음 중 하나 이상을 더 포함한다: (a) 아미노산 서열에 의해 펩티드 생성물을 식별하는 것; (b) 단백질 식별자에 의해 제1 폴리펩티드를 식별하는 것; 및 (c) 단백질 식별자에 의해 복수의 폴리펩티드 중 1종 이상을 식별하는 것.
일부 구현예에서, 방법은 제2 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질 또는 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 100배 더 소량이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드 또는 치료적 폴리펩티드 또는 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 숙주 세포, 예컨대, 포유동물 숙주 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 내로 형질감염시킨 벡터로부터 발현된다.
일부 구현예에서, 샘플은 세포 배양 샘플 또는 혈액 또는 혈청 샘플 또는 약제학적 생성물 또는 이의 중간체이다.
일부 구현예에서, 샘플의 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물은 LC/MS 기술을 이용한 펩티드 생성물의 분석 전 샘플 소화를 통해 수득된다. 일부 구현예에서, 펩티드 생성물은 복수의 폴리펩티드의 트립신 분해 펩티드 생성물이다.
일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양은 약 0.1 내지 25 μg 총 단백질 범위의 샘플 로딩 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 샘플 로딩 양은 약 10 μg 총 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 샘플 로딩 양은 약 0.5 μg 내지 10 μg, 또는 3 μg 내지 6 μg, 또는 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg, 5 μg, 또는 6 μg 총 단백질이다.
일부 구현예에서, 방법은 펩티드 생성물의 제2 세트의 MS 신호를 기반으로 한 제2 샘플 로딩 양을 선택하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 펩티드 생성물의 제1 세트의 MS 신호를 기반으로 한 제1 샘플 로딩 양을 선택하는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양 각각은 동일한 총 부피를 갖는다.
일부 구현예에서, n은 1 이상이거나 n은 3이다.
일부 구현예에서, m은 1 이상이거나 m은 3이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트는 펩티드 생성물 각각의 서열을 기반으로 하여 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료적 폴리펩티드의 생성에서 오염물질 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 치료적 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; (b) 오염물질 폴리펩티드가 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계로서, 이때, 오염물질 폴리펩티드의 존재는 본 명세서에 제공된 정량화 방법을 이용하는, 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기초로 하는 것인, 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화를 위한 시스템을 제공하며, 이 시스템은 다음을 포함한다: (a) 질량 분광분석기; (b) (c)를 포함하는 컴퓨터; (c) 실행 시 다음 단계를 포함하는 처리를 수행하는 비임시적 컴퓨터 판독 가능한 매체(이에 저장된 설명 포함): (i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); (ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); (iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 (iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계로서, 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 시스템은 액체 크로마토그래프를 더 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 실행 시 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화를 위한 처리를 수행하는 비임시적 컴퓨터 판독 가능한 매체(이에 저장된 설명 포함)를 제공하며, 처리는 다음 단계를 포함한다: (i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); (ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); (iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 (iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계로서, 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계.
본 발명의 이러한 및 기타 양태 및 장점은 이후의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다. 본 명세서에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부, 또는 전부는 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다.
도 1은 상이한 샘플 로딩 양에서 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(ASM)를 포함하는 샘플의 LC/MS 분석으로부터 관찰된 40개의 가장 풍부한 펩티드 생성물 이온에 대한 MS 피크 면적의 막대그래프를 보여준다(LC/MS 분석당 샘플 로딩 양은 각 펩티드 생성물 막대 세트에 대해 왼쪽으로부터 오른쪽으로 1 μg, 2.5 μg, 5 μg, 7.5 μg, 10 μg, 12.5 μg, 15 μg, 18 μg, 및 20 μg으로 배열된다). 샘플 로딩 양에 걸친 각 펩티드 생성물 이온에 대한 평균 오차(%)는 펩티드 생성물 막대 세트 위에 제시하였다.
도 2는 6개의 농도 점에 걸친 3개의 펩티드 생성물의 중위 세트(중위-3; 사각형) 및 3개의 펩티드 생성물의 상위 세트(상위-3; 다이아몬드)의 피크 면적 합산을 보여준다. 중위-3 펩티드 생성물의 선형 회귀에 대한 R2은 0.98이고, 상위-3 펩티드 생성물의 선형 회귀에 대한 R2은 0.87이다.
도 3a와 도 3b는 4가지의 상이한 분석 기회(기회 A, 기회 B, 기회 C, 기회 D)에서 4가지 샘플(각 막대 세트에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 로트 1, 로트 2, 로트 3, 로트 4)에 대한 Hi-3(도 3a) 및 Mid-3(도 3b) 정량화 방법의 비교를 보여준다. Hi-3 방법의 경우 상대 표준 편차가 82%였고(도 3a), Mid-3 방법의 경우 상대 표준 편차가 16%였다(도 3b).
도 4는 다양한 치료적 단백질 생산 로트에 걸쳐 상위 8개의 식별된 숙주 세포 단백질의 상대 존재비를 보여준다.
도 5는 치료적 단백질의 정제 공정의 단계에 걸쳐 식별된 숙주 세포 단백질의 상대 존재비를 보여준다.
도 2는 6개의 농도 점에 걸친 3개의 펩티드 생성물의 중위 세트(중위-3; 사각형) 및 3개의 펩티드 생성물의 상위 세트(상위-3; 다이아몬드)의 피크 면적 합산을 보여준다. 중위-3 펩티드 생성물의 선형 회귀에 대한 R2은 0.98이고, 상위-3 펩티드 생성물의 선형 회귀에 대한 R2은 0.87이다.
도 3a와 도 3b는 4가지의 상이한 분석 기회(기회 A, 기회 B, 기회 C, 기회 D)에서 4가지 샘플(각 막대 세트에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 로트 1, 로트 2, 로트 3, 로트 4)에 대한 Hi-3(도 3a) 및 Mid-3(도 3b) 정량화 방법의 비교를 보여준다. Hi-3 방법의 경우 상대 표준 편차가 82%였고(도 3a), Mid-3 방법의 경우 상대 표준 편차가 16%였다(도 3b).
도 4는 다양한 치료적 단백질 생산 로트에 걸쳐 상위 8개의 식별된 숙주 세포 단백질의 상대 존재비를 보여준다.
도 5는 치료적 단백질의 정제 공정의 단계에 걸쳐 식별된 숙주 세포 단백질의 상대 존재비를 보여준다.
본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화 방법을 제공하며, 방법은 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 기반으로 하여 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계를 포함하며, 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산된다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 샘플에서 제2 폴리펩티드보다 덜 풍부하다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 절대량은 다음 식에 의해 결정된다:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)].
본 발명의 방법은 본 명세서에서 Mid-3으로도 지칭된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이온과 관련하여 사용되는 "적격"은 본 명세서에 기술된 정량화 방법에 적합한 펩티드 생성물 이온을 지칭한다. 일부 구현예에서, 적격 펩티드 생성물 이온은 트립신 비분해 펩티드 생성물 이온 또는 번역 후 변형이 있는 펩티드 생성물 이온을 제외한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 방법은 예를 들어, 당해 분야에 공지된 무라벨 절대 정량화 방법(예컨대, Hi-3; J. C. Silva 등, 위의 문헌)과 비교하여, 샘플에서 더 큰 동적 범위의 폴리펩티드 농도에 걸친 폴리펩티드 정량화의 개선된 정확도와 재현성을 제공한다. 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 무라벨 절대 정량화 방법은, 샘플에서 복수의 폴리펩티드 각각의 등몰량을 가정할 때, 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 상위 n개의 가장 풍부한 이온으로부터의 평균 MS 검출기 반응이 복수의 폴리펩티드 각각에 걸쳐 유사하다(즉, 펩티드 생성물 농도가 검출기 반응과 상관 관계가 있다)는 결과를 기반으로 한다. 따라서, 미지의 농도의 폴리펩티드의 양은 기지의 농도의 표준 폴리펩티드와의 비교에 의해 결정될 수 있다. 그러나 절대 정량화를 위하여 폴리펩티드 표준의 펩티드 생성물의 가장 풍부한 이온을 사용하면 정확도와 재현성이 떨어질 수 있다. 예를 들어, MS 검출기 포화로 인한 상위 이온화 펩티드 생성물에 대한 비선형 거동의 관찰로 인해 정량화 오류가 발생할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 기지의 양의 표준 폴리펩티드 스파이킹 또는, 미지의 농도의 폴리펩티드를 함유하는 샘플과 독립된 LC/MS 분석에서 기지의 양의 표준 단백질 샘플 분석에 의존할 수 있다. 두 접근법 모두 정량화 정확도 감소 및 변동성 증가를 초래할 수 있다. 예를 들어, 기지의 양의 표준 폴리펩티드를 임의의 수의 샘플에 재현성 있게 분취하는 것이 어려울 수 있으며, 미지의 폴리펩티드를 함유하는 샘플과 별도의 효소 반응에서 소화되는 표준 폴리펩티드를 기반으로 한 정량화 계산을 보정하는 것은 소화 완료 정도를 기반으로 한 추가의 변동을 생성할 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드 정량화의 개선된 정확도 및 재현성을 달성하기 위하여 요소를 통합하는 정량화 방법을 제공한다. 첫째, 본 발명의 절대 정량화 방법은 기지의 농도를 가지며 샘플의 다른 폴리펩티드(예컨대, 제조 샘플 내의 치료적 단백질 또는 혈청 샘플 내의 알부민)에 비해 다량인 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 샘플 시스템을 이용하며, 스파이킹된 또는 별도로 분석된 표준 폴리펩티드와 비교할 필요가 없다. 둘째, 본 발명의 절대 정량화 방법은 다량의 폴리펩티드의 상위 n개의 펩티드 생성물 이온의 MS 검출기 포화를 피하기 위하여 2가지 농도에서의 MS 측정을 사용한다. 셋째, 본 발명의 절대 정량화 방법은 전체 정량화 오차를 감소시키기 위하여 상위 펩티드와 비교하여 감소된 정량화 오차를 나타내는 펩티드 생성물 이온의 중위 세트를 추가로 사용한다. 본 발명의 방법의 장점은 당해 분야에 공지된 무라벨 절대 정량화 방법(즉, Hi-3)과 직접 비교하여 증명되었다. 예를 들어, 실시예 2에 나타난 바와 같이, 일련의 분석 및 샘플에 걸쳐 본 발명에 개시된 방법은 16% 상대 표준 편차를 달성한 반면, Hi-3 방법은 82% 상대 표준 편차를 나타냈다.
아래에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명은 기지의 농도를 가지며 소량 폴리펩티드(예컨대, 제1 폴리펩티드)보다 상대 존재비가 더 큰 또 다른 폴리펩티드(예컨대, 제2 폴리펩티드)로부터의 정보를 사용하는, 소량 폴리펩티드의 MS 기반의 무라벨 절대 정량화에 유용한 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계 중 임의의 하나 이상을 포함한다: (a) 로딩 연구를 수행하여, 소량 폴리펩티드의 정량화를 위한 데이터가 획득 및/또는 분석되는 두 가지의 샘플 로딩 농도(예컨대, 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양)를 결정하는 단계; (b) 폴리펩티드 정량화를 위한 적격 펩티드 생성물 이온(예컨대, 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트, 및 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트)을 선택하는 단계; 및 (c) MS 신호(예컨대, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물로부터의 MS 신호)를 사용하여 소량 폴리펩티드의 절대 폴리펩티드 양을 결정하는 단계.
로딩 연구를 수행하여 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 결정하는 단계
본 발명은 원하는 동적 범위의 분석에 걸쳐 샘플의 로딩 연구를 수행하는 방법을 제공한다. 로딩 연구로부터 획득된 MS 신호 정보는 예를 들어, 제1 샘플 로딩 양의 선택(이때, 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물은 검출 가능함)(제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 비해 소량임), 제2 샘플 로딩 양의 선택(이때, 제2 폴리펩티드의 상위 n개의 최대량의 적격 펩티드 생성물 이온은 MS 검출기를 포화시키지 않음), 및 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양의 선택(이때, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트는 감소된 정량화 오차(즉, 가장 풍부한 펩티드 생성물 이온과 비교하여 증가된 선형 거동)를 나타냄)을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 방법은 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술을 이용하여 복수의 샘플 로딩 양에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 분석하여 복수의 샘플 로딩 양 각각에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 MS 신호를 획득하는 단계를 포함하며, 이때, 복수의 샘플 로딩 양은 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하고, 제1 샘플 로딩 양은 제2 샘플 로딩 양보다 더 많다. 일부 구현예에서, MS 신호는 이온화 강도이다. 일부 구현예에서, MS 신호는 피크 높이이다. 일부 구현예에서, MS 신호는 피크 면적이다. 일부 구현예에서, MS 신호는 피크 부피이다.
일부 구현예에서, 로딩 연구로부터 획득된 정보는 폴리펩티드의 정량화를 위한 후속 샘플 분석(예컨대, LC/MS 기술을 통한 추가 샘플 분석을 위한 2가지의 샘플 로딩 양 선택)에 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양은 적어도 2가지의 샘플 로딩 양을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15가지의 샘플 로딩 양을 포함한다.
샘플 로딩 양은 사용된 LC/MS 기기에 따라(예컨대, 크로마토그래피 컬럼의 로딩 용량에 기반하여) 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양은 약 0.1 μg 내지 약 100 μg, 약 0.1 μg 내지 약 75 μg, 약 0.1 μg 내지 약 50 μg, 약 0.1 μg 내지 약 40 μg, 약 0.1 μg 내지 약 30 μg, 약 0.1 μg 내지 약 20 μg, 약 0.1 μg 내지 약 15 μg, 약 0.1 μg 내지 약 10 μg, 약 1 μg 내지 약 30 μg, 약 1 μg 내지 약 20 μg, 약 1 μg 내지 약 15 μg, 또는 약 1 μg 내지 약 10 μg 범위의 샘플 로딩 양을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플 로딩 양은 약 0.5 μg, 약 1 μg, 약 1.5 μg, 약 2 μg, 약 2.5 μg, 약 3 μg, 약 3.5 μg, 약 4 μg, 약 4.5 μg, 약 5 μg, 약 5.5 μg, 약 6 μg, 약 6.5 μg, 약 7 μg, 약 7.5 μg, 약 8 μg, 약 8.5 μg, 약 9 μg, 약 9.5 μg, 약 10 μg, 약 10.5 μg, 약 11 μg, 약 11.5 μg, 약 12 μg, 약 12.5 μg, 약 13 μg, 약 13.5 μg, 약 14 μg, 약 14.5 μg, 약 15 μg, 약 16 μg, 약 17 μg, 약 18 μg, 약 19 μg, 약 20 μg, 약 21 μg, 약 22 μg, 약 23 μg, 약 24 μg, 약 25 μg, 약 26 μg, 약 27 μg, 약 28 μg, 약 29 μg, 또는 약 30 μg이다.
일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양은 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하며, 이때, 제1 샘플 로딩 양은 약 10 μg이고, 제2 샘플 로딩 양은 약 0.5 μg 내지 10 μg, 또는 3 μg 내지 6 μg, 또는 1 μg, 2 μg, 3 μg, 4 μg, 5 μg, 또는 6 μg이다.
일부 구현예에서, 제1 샘플 로딩 양은 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 MS 신호를 기반으로 하여 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 샘플 로딩 양은 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 MS 신호를 기반으로 하여 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 샘플 로딩 양은 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 MS 신호와 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 MS 신호를 기반으로 하여 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 샘플 로딩 양은 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 MS 신호를 기반으로 하여 선택된다.
일부 구현예에서, 로딩 연구에서 분석된 후속 샘플 로딩 양은 이전에 분석된 샘플 로딩 양으로부터의 데이터에 기반한다.
각 샘플 로딩 양의 부피는 사용된 LC/MS 기기에 따라(예컨대, 샘플 루프의 크기에 기반하여) 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양 각각은 동일한 총 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양 각각의 부피는 약 1 μL 내지 약 60 μL, 약 10 μL 내지 약 60 μL, 약 20 μL 내지 약 50 μL, 또는 약 30 μL 내지 약 50 μL이다. 일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양 각각의 부피는 동일하며, 약 1 μL 내지 약 60 μL, 약 10 μL 내지 약 60 μL, 약 20 μL 내지 약 50 μL, 또는 약 30 μL 내지 약 50 μL이다. 일부 구현예에서, 복수의 샘플 로딩 양 각각의 부피는 약 5 μL, 10 μL, 15 μL, 20 μL, 25 μL, 30 μL, 35 μL, 40 μL, 45 μL, 50 μL, 55 μL, 또는 60 μL이다.
제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드의 적격 펩티드 생성물 이온을 선택하는 단계
본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화를 위한 펩티드 생성물의 적격 이온의 세트를 선택하는 방법을 제공하며, 이때, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 비해 더 소량이다. 예를 들어, 본 발명은 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트, 및 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 중 임의의 하나의 선택 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트를 선택하는 단계를 포함한다.
폴리펩티드의 MS 식별 가능한 펩티드 생성물의 개수는 폴리펩티드의 농도와 특성에 따라 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 농도와 특성은 제1 샘플 로딩 양에서 한정된 수의 펩티드 생성물의 식별을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, n은 1 이상이며, 이때, n은 정수이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
일부 구현예에서, 가장 높은 MS 신호를 나타내는 펩티드 생성물의 적격 이온은 예를 들어, 누락된 효소적 절단, 번역 후 변형, 및 중첩 LC 용리 프로파일 및 동위원소 분포를 포함한 특정 특성을 나타내는 펩티드 생성물 이온을 제외할 수 있다. 예를 들어, 샘플을 트립신으로 소화시켜 가장 높은 MS 신호를 나타내는 펩티드 생성물이 트립신 비분해 펩티드 생성물인 경우, 이 펩티드 생성물은 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 또는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트의 선택으로부터 제외될 수 있다. 일부 구현예에서, 가장 높은 MS 신호를 나타내는 펩티드 생성물의 적격 이온은, 출발 폴리펩티드의 일부로서 재현 가능하게 존재하지 않는, 폴리펩티드의 부분들로부터 유래된 펩티드 생성물 이온을 제외할 수 있다(예컨대, 폴리펩티드의 절단 생성물로부터 유래된 펩티드 생성물, 따라서 출발 폴리펩티드와 동일한 농도로 샘플에 존재하지 않을 수 있다).
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트를 선택하는 단계를 포함하며, 이때, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트는 복수의 샘플 로딩 양, 또는 제1 샘플 로딩 양 및/또는 제2 샘플 로딩 양으로부터의 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 정량화 오차를 기반으로 하여 선택된다. 일반적으로, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 각 펩티드 생성물 이온은 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 전체 세트에 비해 가장 낮은 정량화 오차를 나타내는 것을 기반으로 하여 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 각 펩티드 생성물 이온은 제2 폴리펩티드의 가장 풍부한 펩티드 생성물 이온보다 낮은 정량화 오차를 나타낸다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 펩티드 생성물 이온은 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트보다 낮은 정량화 오차를 나타낸다.
일부 구현예에서, 가장 낮은 정량화 오차를 나타내는 펩티드 생성물의 적격 이온은 예를 들어, 누락된 효소적 절단, 번역 후 변형, 및 중첩 LC 용리 프로파일 및 동위원소 분포를 포함한 특정 특성을 나타내는 펩티드 생성물 이온을 제외할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 샘플을 트립신으로 소화시켜 가장 낮은 정량화 오차를 나타내는 펩티드 생성물이 트립신 비분해 펩티드 생성물인 경우, 이 펩티드 생성물은 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 선택으로부터 제외될 수 있다. 일부 구현예에서, 가장 높은 MS 신호를 나타내는 펩티드 생성물의 적격 이온은, 출발 폴리펩티드의 일부로서 재현 가능하게 존재하지 않는, 폴리펩티드의 부분들로부터 유래된 펩티드 생성물 이온을 제외할 수 있다(예컨대, 폴리펩티드의 절단 생성물로부터 유래된 펩티드 생성물, 따라서 출발 폴리펩티드와 동일한 농도로 샘플에 존재하지 않을 수 있다).
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 선택은 로딩 연구로부터 획득된 정량화 오차를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 선택은 복수의 샘플 로딩 양으로부터 획득된 정량화 오차를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 정량화 오차는 복수의 샘플 로딩 양의 평균 오차(%)이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 선택은 제1 샘플 로딩 양으로부터 획득된 정량화 오차를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 선택은 제2 샘플 로딩 양으로부터 획득된 정량화 오차를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트의 선택은 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양으로부터 획득된 정량화 오차를 기반으로 한다.
일부 구현예에서, m은 1 이상이며, 이때, m은 정수이다. 일부 구현예에서, m은 3이다. 일부 구현예에서, m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
일부 구현예에서, n은 m과 동일하다. 일부 구현예에서, n은 m과 동일하지 않다. 일부 구현예에서, n과 m은 2 이상이며, 이때, n과 m은 정수이다. 일부 구현예에서, n과m은 3이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 상위 세트 각각은 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 각각과 상이하다. 일부 구현예에서, 적격 펩티드 생성물 이온은 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 상위 세트와 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트의 구성원이다.
일부 구현예에서, 적격 펩티드 생성물 이온은 카르바미도메틸화 시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적격 펩티드 생성물 이온은 카르복시메틸화 시스테인을 포함한다.
소량 폴리펩티드의 절대 폴리펩티드 양을 결정하는 단계
본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 폴리펩티드 양을 계산하는 방법을 제공하며, 방법은 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 기반으로 하여 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계를 포함하며, 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산된다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 절대량은 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반하여 결정된다.
일부 구현예에서, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산된다. 일부 구현예에서, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 총합을 이용하여 계산된다.
일부 구현예에서, MS 신호는 이온화 강도이다. 일부 구현예에서, MS 신호는 피크 높이이다. 일부 구현예에서, MS 신호는 피크 면적이다. 일부 구현예에서, MS 신호는 피크 부피이다.
일부 구현예에서, 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트는 사전에 결정된다. 일부 구현예에서, 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트는 사전에 결정된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트는 사전에 결정된다. 일부 구현예에서, 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B)와 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)의 비율은 사전에 결정된다.
일부 구현예에서, 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합은 샘플의 2회의 LC/MS 분석으로부터 결정된다. 일부 구현예에서, 2회의 LC/MS 분석의 추가적인 반복 분석이 수행된다.
일부 구현예에서, 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합은 샘플의 2회의 LC/MS 분석으로부터 결정되는데, 이때, LC/MS 분석은 로딩 연구의 일부가 아니다. 일부 구현예에서, 2회의 LC/MS 분석의 추가적인 반복 분석이 수행된다.
일부 구현예에서, 정량화 방법은 기지의 양의 2종 이상의 폴리펩티드로부터의 MS 신호를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 제2 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계를 더 포함한다. 제2 폴리펩티드의 단백질 양을 결정하는 방법은 예를 들어, ELISA와 웨스턴 블롯을 포함한다.
분석당 미지의 농도의 1종 초과의 폴리펩티드가 본 발명의 방법을 이용하여 식별 및 정량화될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 위에 개시된 식으로부터, 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A)는 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 또 다른 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트로 치환되어 다른 폴리펩티드의 양을 계산할 수 있다.
샘플 및 샘플 제조
본 발명의 방법은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화에 유용하며, 이때, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 비해 더 소량이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 약 10배 더 소량이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 약 100배 더 소량이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 약 1000배 더 소량이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 약 2배 내지 약 1x109배 더 소량이다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드는 1 ppb(십억분율)의 양으로 측정된다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드보다 적어도 약 10배 더 다량이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드보다 적어도 약 100배 더 다량이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드보다 적어도 약 1000배 또는 1x109배 더 다량이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드보다 적어도 약 2배 내지 약 1x109배 더 다량이다.
LC/MS 기술을 통한 분석을 위하여 샘플에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 생성하는 데 필수적인 샘플 제조 기술은 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 샘플의 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물은 LC/MS 기술을 이용한 펩티드 생성물의 분석 전 샘플 소화를 통해 수득된다. 일부 구현예에서, 샘플 소화는 프로테아제를 이용한 효소적 소화를 포함한다. 일부 구현예에서, 효소적 소화는 트립신, Lys-C, IdeS, IdeZ, PNGase F, 서몰리신, 펩신, 엘라스타제, Arg-C, TEV, Glu-C, Asp-N, 및 Xa 인자 중 1종 이상을 이용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 샘플의 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물은 트립신 분해 펩티드 생성물이다.
일부 구현예에서, 샘플 소화는 화학적 소화, 예컨대 산 가수분해를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. LC/MS 분석을 위한 샘플을 수득하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 조직(예컨대, 혈액, 혈장) 수집과 세포 배양을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 정제되었거나 농축되었다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플에서 복수의 폴리펩티드를 처리하여 펩티드 생성물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플에서 복수의 폴리펩티드를 처리하는 단계는 다음 중 하나 이상의 단계를 포함한다: (a) 샘플을 원심분리하여 복수의 폴리펩티드를 단리하는 단계; (b) 샘플의 복수의 폴리펩티드를 정제하는 단계; (c) 샘플로부터 후속 처리 및 LC/MS 분석에 적합하지 않은 성분을 제거하는 단계; (d) 복수의 폴리펩티드를 소화시켜 펩티드 생성물을 생성하는 단계; 및 (e) LC/MS 분석 전에 펩티드 생성물을 정제하는 단계.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드, 예컨대, 항체(예컨대, 재조합 항체), 또는 효소(예컨대, 재조합 효소), 또는 펩티드(예컨대, 인슐린)이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 (예컨대, 유전자요법용과 같은) 바이러스 입자의 캡시드와 같은 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 샘플은 세포 배양 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 약제학적 생성물 또는 이의 중간체이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 바이오마커, 예컨대, 순환 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플이다.
액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술
본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플의 탠덤 질량 스펙트럼 생성을 위한 다양한 종류의 LC/MS 기술을 고려한다.
일부 구현예에서, LC/MS 기술은 액체 크로마토그래피 기술을 통해 펩티드 생성물을 분리하는 것을 포함한다. 본 출원에 의해 고려되는 액체 크로마토그래피 기술은 폴리펩티드 분리 방법 및 질량 분광분석법 기술과 적합한 액체 크로마토그래피 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피 기술은 고성능 액체 크로마토그래피 기술을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피 기술은 초고성능 액체 크로마토그래피 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피 기술은 고유량(high-flow) 액체 크로마토그래피 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피 기술은 저유량 액체 크로마토그래피 기술, 예컨대, 마이크로유량 액체 크로마토그래피 기술 또는 나노유량 액체 크로마토그래피 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피 기술은 질량 분광분석기에 결합된 온라인 액체 크로마토그래피 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 온라인 액체 크로마토그래피 기술은 고성능 액체 크로마토그래피 기술이다. 일부 구현예에서, 온라인 액체 크로마토그래피 기술은 초고성능 액체 크로마토그래피 기술이다.
일부 구현예에서, 모세관 전기영동(CE) 기술, 또는 전자분무 또는 MALDI 기술이 사용되어 샘플을 질량 분광분석기에 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 질량 분광분석법 기술은 이온화 기술을 포함한다. 본 출원에 의해 고려되는 이온화 기술은 폴리펩티드와 펩티드 생성물을 충전할 수 있는 기술을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 이온화 기술은 전자분무 이온화이다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 나노-전자분무 이온화이다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 대기압 화학 이온화이다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 대기압 광이온화이다. 일부 구현예에서, 이온화 기술은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법 기술은 전자분무 이온화, 나노전자분무 이온화, 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 기술을 포함한다.
일부 구현예에서, LC/MS 기술은 질량 분광분석법 기술을 통해 펩티드 생성물을 분석하는 것을 포함한다. 온라인 액체 크로마토그래피 기술이 결합되는, 본 발명에 의해 고려되는 질량 분광분석기는 고해상도 질량 분광분석기와 저해상도 질량 분광분석기를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 비행시간형(time-of-flight, TOF) 질량 분광분석기이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 사중극자 비행시간형(Q-TOF) 질량 분광분석기이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 사중극자 이온 트랩 비행시간형(QIT-TOF) 질량 분광분석기이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 이온 트랩이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 단일 사중극자이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 삼중 사중극자(QQQ)이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 오비트랩(orbitrap)이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 사중극자 오비트랩이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FT) 질량 분광분석기이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석기는 사중극자 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(Q-FT) 질량 분광분석기이다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법 기술은 양이온 모드를 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법 기술은 음이온 모드를 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법 기술은 비행시간형(TOF) 질량 분광분석법 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법 기술은 사중극자 비행시간형(Q-TOF) 질량 분광분석법 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 질량 분광분석법 기술은 이온 이동도 질량 분광분석법 기술을 포함한다. 일부 구현예에서 저해상도 질량 분광분석빕 기술, 예컨대, 이온 트랩ㅂ, 또는 단일 또는 삼중-사중극자 접근법이 적당하다.
일부 구현예에서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물의 획득된 MS 신호를 처리하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 피크 검출을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물의 이온화 강도를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물의 피크 높이를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물의 피크 면적을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물의 피크 부피를 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 아미노산 서열에 의해 펩티드 생성물을 식별하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물 아미노산 서열 배정을 수동으로 검증하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 단백질 식별자에 의해 제1 폴리펩티드를 식별하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LC/MS 기술은 단백질 식별자에 의해 복수의 폴리펩티드 중 1종 이상을 식별하는 것을 포함하며, 이는 데이터베이스 검색 또는 라이브러리 검색에서 식별될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 식별은 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 달성될 수 있다. 일반적으로, 스펙트럼 라이브러리의 사용은 폴리펩티드 시스템과 관련하여 획득된 지식의 귀속을 허용하며, 데이터 분석 속도 증가와 오차 감소를 초래한다.
절대 정량화 방법의 용도
본 명세서에 개시된 MS 기반의 무라벨 절대 정량화 방법은 소량의 폴리펩티드와 상대적으로 다량의 또 다른 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 소량의 폴리펩티드의 정량화를 포함하는 용도에 특히 적합하다. 본 명세서에 개시된 MS 기반의 무라벨 절대 정량화 방법은 예컨대, 다단계 공정, 예컨대 치료적 단백질의 정제에서 소량의 단백질의 정량화에서 단일 단계를 구성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 치료적 폴리펩티드의 생성에서 오염물질 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 치료적 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; (b) 오염물질 폴리펩티드가 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계로서, 이때, 오염물질 폴리펩티드의 존재는 본 명세서에 개시된 방법을 이용하는, 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기초로 하는 것인, 단계. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 1종 초과의 오염물질 폴리펩티드는 샘플에서 검출된다(예컨대, 그리고 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 총량은 정량화된다). 일 구현예에서, 샘플은 다양한 단계에서 재조합 폴리펩티드의 순도를 분석하기 위하여 재조합 폴리펩티드(예컨대, 치료적 폴리펩티드)의 생성 공정 중 다양한 단계에서 취해진다. 식별되는 오염물질 폴리펩티드(예컨대, 숙주 세포 폴리펩티드)의 양이 적을수록 재조합 폴리펩티드의 순도가 더 높음을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 치료적 폴리펩티드의 생성 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 생성 공정의 단계, 예컨대, 세포 배양물 수확 또는 정제 단계로부터 치료적 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플에서 오염물질 폴리펩티드를 식별하는 단계; (c) 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 수준을 결정하는 단계로서, 오염물질 폴리펩티드의 수준은 본 명세서에 개시된 방법을 사용한, 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기반으로 하는 것인, 단계. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 1종 초과의 오염물질 폴리펩티드는 샘플에서 검출된다(예컨대, 그리고 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 총량은 정량화된다). 일 구현예에서, 샘플은 다양한 단계에서 재조합 폴리펩티드의 순도를 분석하기 위하여 재조합 폴리펩티드(예컨대, 치료적 폴리펩티드)의 생성 공정 중 다양한 단계에서 취해진다. 식별되는 오염물질 폴리펩티드(예컨대, 숙주 세포 폴리펩티드)의 양이 적을수록 재조합 폴리펩티드의 순도가 더 높음을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 치료적 폴리펩티드의 정제 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 정제 공정의 1개 이상의 단계, 예컨대, 세포 배양물 수확 또는 정제 단계로부터 치료적 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플에서 오염물질 폴리펩티드를 식별하는 단계; (c) 정제 공정의 1개 이상의 단계에서 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 수준을 결정하는 단계로서, 오염물질 폴리펩티드의 수준은 본 명세서에 개시된 방법을 사용한, 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기반으로 하는 것인, 단계. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 1종 초과의 오염물질 폴리펩티드는 샘플에서 검출된다(예컨대, 그리고 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 총량은 정량화된다). 일 구현예에서, 샘플은 다양한 단계에서 재조합 폴리펩티드의 순도를 분석하기 위하여 재조합 폴리펩티드(예컨대, 치료적 폴리펩티드)의 생성 공정 중 다양한 단계에서 취해진다. 식별되는 오염물질 폴리펩티드(예컨대, 숙주 세포 폴리펩티드)의 양이 적을수록 재조합 폴리펩티드의 순도가 더 높음을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자요법 생성물에서 오염물질 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 예를 들어, (a) 정제 공정의 1개 이상의 단계, 예컨대, 세포 배양물 수확 또는 정제 단계로부터 유전자요법 벡터를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플에서 오염물질 폴리펩티드를 식별하는 단계; (c) 정제 공정의 1개 이상의 단계에서 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 이때, 오염물질 폴리펩티드의 수준은 본 명세서에 개시된 방법을 사용한, 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 유전자요법 생성물은 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 유전자요법 생성물은 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자요법 벡터는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 유전자요법 벡터는 캡시드와 같은 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 입자의 일부이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 유전자요법 생성물과 관련이 없는 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 유전자요법의 일부가 아닌 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 헬퍼 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 1종 초과의 오염물질 폴리펩티드는 샘플에서 검출된다(예컨대, 그리고 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 총량은 정량화된다). 일 구현예에서, 샘플은 다양한 단계에서 유전자요법 생성물의 순도를 분석하기 위하여 유전자요법 생성물의 생성 공정 중 다양한 단계에서 취해진다. 식별되는 오염물질 폴리펩티드(예컨대, 숙주 세포 폴리펩티드)의 양이 적을수록 유전자요법 생성물의 순도가 더 높음을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자요법 생성물의 생성 방법을 제공한다. 이 방법은 예를 들어, (a) 정제 공정의 1개 이상의 단계, 예컨대, 세포 배양물 수확 또는 정제 단계로부터 유전자요법 벡터를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플에서 오염물질 폴리펩티드를 식별하는 단계; (c) 정제 공정의 1개 이상의 단계에서 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 이때, 오염물질 폴리펩티드의 수준은 본 명세서에 개시된 방법을 사용한, 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 유전자요법 생성물은 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 유전자요법 생성물은 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자요법 벡터는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 유전자요법 벡터는 캡시드와 같은 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 입자의 일부이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 유전자요법 생성물과 관련이 없는 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 유전자요법의 일부가 아닌 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 헬퍼 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 1종 초과의 오염물질 폴리펩티드는 샘플에서 검출된다(예컨대, 그리고 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 총량은 정량화된다). 일 구현예에서, 샘플은 다양한 단계에서 유전자요법 생성물의 순도를 분석하기 위하여 유전자요법 생성물의 생성 공정 중 다양한 단계에서 취해진다. 식별되는 오염물질 폴리펩티드(예컨대, 숙주 세포 폴리펩티드)의 양이 적을수록 유전자요법 생성물의 순도가 더 높음을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유전자요법 생성물의 정제 방법을 제공한다. 이 방법은 예를 들어, (a) 정제 공정의 1개 이상의 단계, 예컨대, 세포 배양물 수확 또는 정제 단계로부터 유전자요법 벡터를 포함하는 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플에서 오염물질 폴리펩티드를 식별하는 단계; (c) 정제 공정의 1개 이상의 단계에서 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 이때, 오염물질 폴리펩티드의 수준은 본 명세서에 개시된 방법을 사용한, 샘플에서 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 유전자요법 생성물은 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 유전자요법 생성물은 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자요법 벡터는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 유전자요법 벡터는 캡시드와 같은 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 입자의 일부이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 유전자요법 생성물과 관련이 없는 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 유전자요법의 일부가 아닌 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 오염물질 폴리펩티드는 헬퍼 바이러스 단백질이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 바이러스 단백질, 예컨대, 캡시드 단백질이다. 일부 구현예에서, 1종 초과의 오염물질 폴리펩티드는 샘플에서 검출된다(예컨대, 그리고 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 총량은 정량화된다). 일 구현예에서, 샘플은 다양한 단계에서 유전자요법 생성물의 순도를 분석하기 위하여 유전자요법 생성물의 생성 공정 중 다양한 단계에서 취해진다. 식별되는 오염물질 폴리펩티드(예컨대, 숙주 세포 폴리펩티드)의 양이 적을수록 유전자요법 생성물의 순도가 더 높음을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 오염물질 폴리펩티드의 존재를 기반으로 한 프로토콜을 조정하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 정제 공정은 식별되고 정량화된 오염물질 폴리펩티드의 존재를 기반으로 하여 조정될 수 있다. 이러한 조정은 표적 폴리펩티드, 예컨대, 치료적 폴리펩티드의 순도를 개선하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 개체의 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 이때, 개체는 개체의 바이오마커량을 기반으로 한 치료를 위하여 선택된다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 혈청 샘플에서 정량화된다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 혈청 알부민이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 개체의 질환을 평가하는 방법을 제공하는데, 이때, 개체는 개체의 바이오마커량을 기반으로 하여 평가된다. 일부 구현예에서, 바이오마커의 양은 혈청 샘플에서 정량화된다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 혈청 알부민이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 개체의 질환을 진단하는 방법을 제공하는데, 이때, 개체는 개체의 바이오마커량을 기반으로 하여 이 질환으로 진단된다. 일부 구현예에서, 바이오마커의 양은 혈청 샘플에서 정량화된다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 혈청 알부민이다.
시스템
본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 폴리펩티드 양을 결정하는 데 유용한 시스템 및 비임시적 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화를 위한 시스템을 제공하며, 이 시스템은 다음을 포함한다: (a) 질량 분광분석기; (b) (c)를 포함하는 컴퓨터; (c) 실행 시 다음 단계를 포함하는 처리를 수행하는 비임시적 컴퓨터 판독 가능한 매체(이에 저장된 설명 포함): (i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); (ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); (iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 (iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계로서, 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 시스템은 액체 크로마토그래프를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 실행 시 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화를 위한 처리를 수행하는 비임시적 컴퓨터 판독 가능한 매체(이에 저장된 설명 포함)를 제공하며, 처리는 다음 단계를 포함한다: (i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A); (ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B); (iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및 (iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D)에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계로서, 이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계.
당업자는 여러 구현예가 본 발명의 범위 및 사상 내에서 가능함을 인식할 것이다. 이제 본 발명을 다음 비제한적인 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 기술한다. 다음 실시예는 본 발명을 추가로 설명하나, 물론 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결되는 아미노산을 포함하는 중합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 단백질이다. 일부 예에서, 단백질은 2종 이상의 폴리펩티드(예컨대, 다량체 단백질, 동종체(homomeric) 단백질, 다중단백질 복합체)를 포함한다. 폴리펩티드는 비아미노산 모이어티로 더 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 효소 매개성 변형 및/또는 화학적 변형(예컨대, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, 포르밀화, 글리코실화, 산화)를 더 포함할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 세포 기반의 환경에서 또는 샘플 처리 및/또는 분석 기술의 결과로서 일어날 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "펩티드 생성물"은 폴리펩티드의 분해 처리 후에 수득된 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결된 2종 이상의 아미노산을 포함하는 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 펩티드 생성물은 화학적 소화(예컨대, 산 가수분해) 또는 효소적 소화(예컨대, 트립신 소화)를 포함하는 폴리펩티드의 분해 처리 후에 수득된다. 일부 구현예에서, 펩티드 생성물은 트립신 분해 펩티드이다. 일부 구현예에서, 펩티드 생성물은 더 큰 폴리펩티드의 말단 단편이다. 일부 구현예에서, 펩티드 생성물은 폴리펩티드의 내부 단편이다.
용어 "포함한다"는 본 명세서에서 다른 구성요소, 성분, 단계 등이 선택적으로 존재함을 의미하고자 사용된다. 예를 들어, 구성요소 A, B, 및 C를 "포함하는" 물품은 구성요소 A, B, 및 C를 구성(즉, 구성요소 A, B, 및 C만을 함유)할 수 있거나, 구성요소 A, B, 및 C뿐만 아니라 1종 이상의 다른 구성요소도 함유할 수 있다. "포함한다" 및 이의 문법적 등가물은 "~로 구성된" 또는 "필수적으로 ~로 구성된"을 포함하는 것으로 이해된다.
일정 범위의 값이 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한, 그리고 그 언급된 범위 내의 임의의 기타 언급된 값 또는 개재 값의 사이에 있는 각각의 값은 하한 단위의 소수점 첫째 자리까지, 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 제외된 한계치를 조건으로, 본 개시에 포함된다고 이해된다. 언급된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그렇게 포함되는 한계치 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위들 또한 본 개시에 포함된다.
본 명세서에서 값 또는 매개변수의 "약(about)"에 대한 언급은 그 값 또는 매개변수 자체에 대한 변이형을 포함(및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"로 언급된 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다.
실시예
실시예 1
ASM의 펩티드 생성물 이온의 중위 세트의 개선된 선형 MS 신호 반응을 증명하는 ASM의 로딩 연구
이 실시예는 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양 선택을 위한 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(ASM)를 포함하는 샘플을 이용한 로딩 연구를 보여준다. 나아가, 이 실시예는 ASM의 가장 풍부한 펩티드 생성물 이온의 상위 세트와 비교하여 ASM의 펩티드 생성물 이온의 중위 세트의 개선된 선형 MS 신호 반응을 증명한다.
3회 반복하여, LysC 및 트립신으로의 소화 전에 ASM 샘플을 변성시키고, 환원시키고, 알킬화시켰다. 1 μg, 2.5 μg, 5 μg, 7.5 μg, 10 μg, 12.5 μg, 15 μg, 18 μg, 및 20 μg에서 소화시킨 샘플에 대해 LC/MS 분석을 수행하였다. CSH130 C18 1.7 μm 물질이 패킹된 2.1 x 150 mm 컬럼을 이용하여 ACQUITY UPLC로 크로마토그래피를 수행하였다. Xevo Q-Tof G2-XS 상에서 저충돌에너지와 상승된 충돌에너지의 교대성 스캔을 이용하여 데이터를 획득하여 전구체 및 단편 이온 정보를 생성하였다. ASM의 상위 40개의 가장 풍부한 펩티드 생성물 이온의 샘플량 범위에 걸친 각각의 펩티드 생성물 이온에 대한 MS 피크 면적과 평균 오차(%)를 계산하였다.
도 1은 상이한 샘플 로딩 양에서 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(ASM)를 포함하는 샘플의 LC/MS 분석으로부터 관찰된 40개의 가장 풍부한 펩티드 생성물 이온에 대한 MS 피크 면적의 막대그래프를 보여준다(LC/MS 분석당 샘플 로딩 양은 각 펩티드 막대 세트에 대해 왼쪽으로부터 오른쪽으로 1 μg, 2.5 μg, 5 μg, 7.5 μg, 10 μg, 12.5 μg, 15 μg, 18 μg, 및 20 μg으로 배열된다). 샘플 로딩 양에 걸친 각 펩티드 생성물 이온에 대한 평균 오차(%)는 펩티드 막대 세트 위에 제시하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, ASM의 가장 강한 펩티드 생성물은 모든 펩티드 생성물 이온에 비해, 특히 총 샘플 양이 증가함에 따라, 더 큰 오차를 나타낸다. 펩티드 생성물 이온 분포의 중간에 있는 펩티드는 심지어 총 샘플 로딩 양 20 μg까지 모든 펩티드 생성물 이온에 비해 더욱 선형적으로 거동하며 더 작은 오차를 나타낸다.
로딩 연구의 데이터를 이용하여, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트와 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트가 선택될 수 있다. 예를 들어, ASM의 펩티드 생성물의 n개, 예를 들어, 3개의 적격 이온의 상위 세트는 펩티드 A(z=4), 펩티드 B(z=3), 및 펩티드 C(z=4)로부터 선택되는 펩티드 생성물 이온을 포함할 수 있다. ASM의 펩티드 생성물의 m개, 예를 들어, 3개의 적격 이온의 중위 세트는 펩티드 D(z=2), 펩티드 M(z=4), 펩티드 O(z=1), 펩티드 M(z=3), 펩티드 B(z=2), 펩티드 L(z=2), 펩티드 P(z=1), 및 펩티드 Q(z=1)로부터 선택되는 펩티드 생성물 이온을 포함할 수 있다.
나아가, ASM 로딩 연구로부터 수집된 데이터를 이용하여, 컬럼에 로딩된 샘플(μg)에 대한 피크 면적 합산을 3개의 가장 풍부한 펩티드 생성물 이온의 상위 세트(상위-3)와 3개의 펩티드 생성물 이온의 중위 세트(중위-3)를 이용하여 각각의 샘플 로딩 양에 대해 플로팅하였다(도 2). 상위-3 펩티드 생성물 세트의 비선형 거동은 최적 샘플 로딩 양(10 μg) 미만에서 잘 볼 수 있다. 중위-3 펩티드 생성물 세트는 로딩 연구의 샘플 로딩 양에 걸쳐 선형적으로 거동하였으며, 따라서 중위-3 펩티드 생성물 이온이 본 발명의 정량화 기술에 적합함을 증명하였다. 또한, 선형 회귀에 대한 R2은 중위-3 펩티드 생성물 세트를 이용하여 개선된다(상위-3 펩티드 생성물 세트에 대한 0.87과 비교하여, 중위-3 펩티드 생성물 세트의 경우 0.98).
2.5 μg 로드에 대한 각 농도에서의 각각의 펩티드 생성물 세트에 대한 오차(%)를 표 1에 제공하였다. 중위-3 펩티드 생성물 세트에 대해 예상했던 비율과 관찰된 비율 사이의 오차(%)는 모든 샘플 로딩 양에 대한 상위-3 펩티드 생성물 세트보다 작았다.
실시예 2
폴리펩티드의 양 결정 방법
이 실시예는 4가지의 상이한 분석 기회에서 분석된 치료적 단백질 생성물의 4개의 단백질 생산 로트를 이용하는 Hi-3 방법과 비교한 Mid-3 방법의 정량화 재현성의 개선을 보여준다.
단백질 X의 4개의 단백질 생산 로트(로트 1, 로트 2, 로트 3, 로트 4)를 준비하고, 실시예 1에 개시된 바와 같이 분석하였다. Hi-3 방법의 경우, 200 fmol의 ClpB 표준(E. 콜라이 샤페론 CIpB) 펩티드 생성물을 내부 표준물질로서 각 샘플에 스파이킹하였다.
Hi-3 방법에 의해 측정된 바와 같이, 스파이킹된 CIpB 펩티드 생성물에 대한 숙주 세포 단백질의 총 ppm을 각 단백질 생산 로트에 대해 플로팅하였다(도 3a). Hi-3 방법의 정량화 측정은 82%의 상대 표준 편차를 나타낸다.
Mid-3 방법에 의해 측정된 바와 같이, 숙주 세포 단백질(HCP)의 총 ppm을 각 단백질 생산 로트에 대해 플로팅하였다(도 3b). Mid-3 방법의 정량화 측정은 16%의 상대 표준 편차를 나타낸다.
Mid-3 방법에 대한 폴리펩티드의 양을 계산하는 데 사용된 식은 다음과 같다:
[(높은 샘플 양 로드에서 HCP의 상위 3개 펩티드 생성물 이온의 피크 면적의 총합)/(높은 샘플 양 로드에서 치료적 단백질 생성물의 중위 3개 펩티드 생성물 이온의 피크 면적의 총합)] * (높은 샘플 양 로드에서 치료적 단백질 생성물의 fmol) * [(낮은 샘플 양 로드에서 치료적 단백질 생성물의 중위 3개 펩티드 생성물 이온의 피크 면적의 총합)/(낮은 샘플 양 로드에서 치료적 단백질 생성물의 상위 3개 펩티드 생성물 이온의 피크 면적의 총합)].
내부 표준물질로서 CIpB 펩티드 200 fmol을 이용한 Hi-3 방법 이용 시, Mid-3 방법과 비교하여 더 큰 오차가 발생하였다. Mid-3 방법을 이용하는 절대 정량화가 훨씬 더 재현성이 컸다. 가장 큰 변동성은 스파이킹한 내부 표준물질로 인한 것이었으나, 효소적 분해의 차이도 발생했을 수 있다. 10 μg 온-컬럼(on-column)에서, 펩티드 생성물의 중위 세트는, 이들이 선형적으로 거동하였으므로, 정량화에 사용하기에 더 적합하였다.
실시예 3
치료적 단백질의 정제 중 숙주 세포 단백질의 검출 및 추적을 위한 Mid-3 정량화 방법의 적용
이 실시예는 세포 배양물 수확에서 수집된 샘플 내지 최종 탈염 프로토콜 후에 수집된 샘플을 포함한, 치료적 단백질의 정제 공정 중 여러 단계에서의 오염물질 숙주 세포 단백질(HCP)의 고처리량 검출 및 추적을 위한 본 명세서에 개시된 Mid-3 정량화 방법의 적용을 보여준다. 또한, 이 실시예는 후기 단계 정제 샘플에서 HCP의 무라벨 정량화를 위한 체류 시간과 m/z에 의한 HCP의 펩티드 추적을 위한 소프트웨어의 사용 및 처리량을 더 개선하고 절대 정량화를 최적화하기 위한 스펙트럼 라이브러리 기반 검색의 사용을 보여준다.
방법:
치료적 단백질(단백질 X)의 세포 배양 기반 생산 후, 세포 배양물 수확 및 단백질 정제 공정의 5개 단계에서 최종 약물 물질 샘플을 포함하는 샘플을 수집하였다. 3회 반복을 이용하여 재현성 및 수율 데이터를 포함하는 하류 측정의 통계적 검증력을 제공하였다. 샘플을 수집한 후, 수확 샘플을 제조사의 지침에 따라 3k MWCO Amicon Ultra-15 필터(EMD Millipore)로 여과하여 농축하고 질량 분광분석을 방해하는 첨가제를 제거한 후, 나머지 샘플로 변성시키고 소화시켰다. 간략히 설명하면, Amicon 장치를 물로 헹구는 단계를 완료한 다음, 샘플당 400 μg의 총 단백질 또는 치료적 단백질을, 총 부피 15 mL까지 상부에 첨가된 50 mM 중탄산암모늄(Ambic)과 함께 첨가하였다. 그 후, 최종 원심분리 단계 전에 15 mL의 50 mM Ambic으로의 세척을 완료하였다. 최종 농도를 1.4 내지 1.7 mg/mL 총 단백질 또는 치료적 단백질로서 측정하였다. 각 샘플(Amicon 여과된 수확물부터 약물 물질(DS)까지뿐만 아니라 블랭크 소화물도 포함)로부터의 3반복 분취물을 50 mM Ambic에 1 mg/mL까지 희석시키고, Rapigest(Waters, 50 mM Ambic으로 0.1%의 농도까지 재구성됨)와 1:1로 혼합하여 0.05% Rapigest, 50 mM Ambic 중 0.5 mg/mL 단백질의 최종 용액을 생성하였다. 단백질의 변성을 확실히 하기 위하여 15분 동안 60℃에서 샘플을 인큐베이션하였다. 1시간 동안 60℃에서 50 mM Ambic 중 10 mM 1,4-디티오트레이톨(DTT)(Pierce)로 이황화물의 환원을 수행하였다. 50 mM의 Ambic 중 20 mM의 2-요오도아세트아미드(IAA)(Pierce)로의 알킬화 전에 샘플을 실온까지 냉각시키고, 30분 동안 암소에서 실온에서 인큐베이션하였다. Lys-C(Promega, 15 μg/바이알)를 50 mM의 Ambic 중에 0.125 μg/μL의 농도로 재구성하고, 1:50의 효소:기질 비율로 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 트립신(Promega, 100 μg/바이알) 용액을 50 mM의 Ambic 중에 0.4 μg/μL로 제조하고, 1:25 비율로 샘플에 첨가하고, 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 2.05% 포름산(EMD Millipore) 첨가를 이용한 산 절단에 의해 Rapigest를 제거하였다. 절단된 Rapigest와 임의의 소화되지 않은 단백질을 펠릿화하기 위하여 15분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하기 전에 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 오토샘플러 바이알을 20 μg의 소화된 샘플, 400 fmol의 Hi3 E. 콜라이 표준물질(Waters)로 제조하고, LC-MS에 주입하기 위하여 0.1% 포름산으로 최종 부피 60 μL까지 희석하였다.
소화된 샘플(30 μL 또는 10 μg 온 컬럼)을 1.7 μm CSH C18 컬럼(2.1 mm X 150 mm, Waters)을 이용하는 LC-MS 분석을 위하여 Waters XEVO G2-XS QTof 질량 분광분석기에 부착된 Waters ACQUITY H-Class UPLC 시스템에 주입하였다. 질량 분광분석기는 민감도 모드에서 0.3초 스캔으로 50 내지 2000의 질량 범위에 걸쳐 MSE 데이터를 수집하도록 설정하였다. 모든 샘플은 청결 단계 내에서 무작위 순서로 실행되었다(즉, 블랭크와 약물 물질이 함께 무작위화되어 먼저 실행됨; 중간 공정 컬럼 용출액 샘플이 무작위화되어 다음에 실행됨; 세포 배양 수확물이 무작위화되고 마지막으로 실행됨). UPLC는 첨가제로 0.1% 포름산이 함유된 물과 아세토니트릴(ACN)을 사용하였으며, 250 μL/분의 유속과 45분의 총 구배 시간으로, 30분에 걸쳐 5에서 40% ACN까지, 5분에 걸쳐 85% ACN까지 증가, 2분 동안 유지, 3분에 걸쳐 초기 조건으로 복귀, 5분 동안 유지의 구배를 사용하였다.
MSE 검색 알고리즘(Waters)을 이용하여 서열 데이터베이스에 대해 검색하기 전에, 피크 선택 및 전구체/생성물 이온 정렬을 위하여 Progenesis Qi for Proteomics 소프트웨어(Nonlinear Dynamics)로 MS 데이터 파일을 가져왔다. 데이터베이스는 치료적 단백질 생성물 서열, 공통 오염물질 단백질, 중국 햄스터 Uniprot 데이터베이스, 및 각각의 역전된 버전을 조합하였다(총 69,916개의 서열). 4% 이하의 FDR로, 펩티드당 3개의 단편, 단백질당 7개의 단편, 및 단백질당 적어도 2개의 펩티드를 요건으로 식별을 수행하였다. 펩티드 스코어 >5 및 펩티드 질량 오차 <10 ppm을 사용하여 추가 여과를 이용하여 <1% FDR을 획득하였다. 일반적으로, 펩티드 식별은 가장 상류 공정 샘플, 예를 들어 수확물 샘플에서 이루어졌지만, 항상 그런 것은 아니다. 단백질의 경향과 일치하지 않는 펩티드는 정량화에 포함시키지 않았다. ClpB에 대한 상위 3개의 펩티드(Hi-3) 또는 생성물에 대해 선형으로 거동하는 펩티드(Mid-3)와 비교하여 (모든 3회 주입에 걸친) 단백질당 상위 3개의 펩티드의 풍부도에 기반하여 단백질을 정량화하여 각 샘플에 존재하는 단백질의 상대적인 양을 결정하였다.
결과 및 고찰:
치료적 단백질 생산 혼합물에서 상대적으로 소량인 HCP의 분석을 위한 단백질 유전정보학 발견 소프트웨어 툴을 이용하는 것의 한 가지 위험은 치료적 단백질로부터의 풍부한 이온이 HCP로 잘못 식별될 수 있다는 점이다. 최근 풍부한 단백질에 대한 인공물이 디코이 비율(decoy rate)보다 훨씬 높은 비율로 다른 단백질로 잘못 식별될 수 있음이 밝혀졌다(Kong et al. Nature methods. 2017;14(5):513-520). 또한, HCP가 단백질 수준에서 정확하게 식별될 수도 있지만, 이러한 HCP에 대한 일부 펩티드가 부정확할 수 있거나 다른 이온에 의해 방해 받을 가능성이 있으므로, 이들은 정량화에 사용되어서는 안 된다.
본 명세서에 개시된 방법은 정제 공정 전반에 걸쳐 강도 패턴의 직교식 물리화학적 성질을 이용하여 그러한 거짓 양성 식별뿐만 아니라 방해가 있는 펩티드도 여과하여 제거한다. Progenesis Qi for Proteomics 내에서, 각각의 펩티드를 식별 스코어 및 질량 정확도뿐만 아니라, 전체 실험에서 펩티드 경향의 시각화와 함께 열거하였다. 다른 방해하는 이온이 관찰될 수 있도록, 각 펩티드의 검출을 m/z와 체류 시간으로 보여주는 이미지도 나타내었다. 예컨대, 관찰된 방해가 있는 펩티드는 정량화에 사용되지 않았다.
전체 정제 공정으로부터의 샘플 분석을 위한 LC-MS 분석 시간은 약 2일 이내에 완료되었다(단일 샘플에 대한 LC-MS 분석 시간은 약 45분이었다). HCP로부터의 펩티드를 포함하는 모든 펩티드의 식별을 수동으로 검증하는 것은 대략 2주일이 소요되었다. 검증 후, 치료적 단백질 생산 샘플로부터 식별된 HCP의 최종 목록을 정량화하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 7개의 생산 로트 사이에서 공통 HCP가 식별되었다. 정제 공정, 예컨대, 정제 공정의 각 단계 중 HCP의 제거에 대한 설명을 제공한 주성분 분석(Principal Components Analysis, PCA)을 이해하기 위하여 통계 분석을 수행하였다. HCP의 추가 분석은 계층별 클러스터링을 포함하였는데, 이는 정제 공정 중 비슷하게 거동하는 단백질을 그룹화한다. 계층별 클러스터링은 교점 조사를 통해 정제 공정의 각 단계 중에 어떠한 단백질이 제거되는지를 발견할 수 있게 하였다. 특정 HCP가 최종 치료적 단백질 생성물로부터 제거되었음을 확실히 하기 위하여 이러한 데이터를 이용하여 정제 공정을 이해하고 최적화하였다. 치료적 단백질로부터 적절히 정제되지 않은 HCP는 예컨대, pI, 분자량, 소수성, 활성, 및 면역원성을 포함하는, HCP의 물리화학적 성질에 기반한 정제 공정을 최적화하여 제거되었다. 또한, 소프트웨어를 사용하여 정제 공정 과정에 걸쳐 HCP의 존재를 자동으로 모니터링하였다.
분석 기회간 HCP의 절대 정량화에서 가장 큰 변동성의 원천은 스파이킹된 내부 표준물질의 양 또는 소화된 단백질인 HCP에 대한 펩티드 수준의 내부 표준물질의 양이었다. 스파이킹된 내부 표준물질은 일반적으로 절대 정량화에 사용되는 Hi-3 ClpB 펩티드였다. 표준물질을 가용화, 분취, 및 저장하고자 세심한 주의를 기울였으나, 예컨대, 조작자 사이의 피펫팅 차이 또는 분석 기회간 효소적 소화의 변화로 인해 변동성이 발생했을 수 있다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, 스파이킹된 내부 표준물질을 사용하는 대신, 치료적 단백질의 펩티드가 사용될 수 있으나, 치료적 단백질로부터의 가장 풍부한 펩티드는 종종 질량 분광분석기의 동적 범위를 넘어 풍부하게 존재한다. 즉, 치료적 단백질의 가장 풍부한 펩티드는 질량 분광분석기의 검출기를 과포화시킬 수 있다. 가장 풍부한 펩티드 방법(Hi-3 방법) 사용 시, 가장 풍부한 펩티드는 예컨대, 검출기 포화로 인해 비선형 거동을 나타내는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, Mid-3 펩티드라 지칭되는, 이온화 분포의 중간에 있는 펩티드는 존재도에 기반하여 선형의 신호 거동을 나타내는 것으로 관찰되었다. 본 명세서에 나타난 바와 같이, Mid-3 펩티드로부터의 데이터를 포함하는 Mid-3 펩티드 방법은 더 작은 오차를 생성하였고, 18 μg 온-컬럼까지 선형 거동을 나타내었다.
Claims (44)
- 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화 방법으로,
제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 10배 더 소량이고,
다음 단계:
(a) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술을 이용하여 복수의 샘플 로딩 양에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 분석하여 복수의 샘플 로딩 양 각각에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 MS 신호를 획득하는 단계로서,
복수의 샘플 로딩 양은 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하고,
제1 샘플 로딩 양은 제2 샘플 로딩 양보다 더 많은 것인, 단계;
(b) 다음에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계:
(i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A);
(ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B);
(iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및
(iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D),
이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및
(c) 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화 방법으로,
제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 10배 더 소량이고,
다음 단계:
(a) 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 MS 신호를 획득하는 단계로서,
이때, 펩티드 생성물의 이온의 상기 MS 신호는 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술을 이용하여 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 분석함으로써 획득되고,
펩티드 생성물의 MS 신호는 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하는 복수의 샘플 로딩 양 각각에 대해 획득되고,
제1 샘플 로딩 양은 제2 샘플 로딩 양보다 더 많은 것인, 단계;
(b) 다음에 대한 MS 신호의 평균 또는 총합을 계산하는 단계:
(i) 제1 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제1 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (A);
(ii) 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트 (B);
(iii) 제1 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트 (C); 및
(iv) 제2 샘플 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트 (D),
이때, A, B, C, 및 D는 모두 MS 신호의 평균을 이용하여 계산되거나 모두 총합을 이용하여 계산되는 것인, 단계; 및
(c) 다음 식:
[(A)/(C)] * (제1 로딩 양에서 제2 폴리펩티드의 몰) * [(D)/(B)],
또는 이의 수학적 등가에 기반한, 제1 샘플 로딩 양에서 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, MS 신호의 평균은 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 데 사용되는 것인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, MS 신호의 총합은 제1 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 데 사용되는 것인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트는 복수의 샘플 로딩 양, 또는 제1 샘플 로딩 양 및 제2 샘플 로딩 양 중 적어도 하나로부터의 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 정량화 오차를 기반으로 하여 선택되는 것인, 방법.
- 제5항에 있어서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트를 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 포함하는 복수의 폴리펩티드를 포함하는 샘플에서 제1 폴리펩티드의 절대 정량화를 위한 펩티드 생성물의 적격 이온의 세트를 선택하는 방법으로,
제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 10배 더 소량이고,
다음 단계:
(a) 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법(LC/MS) 기술을 이용하여 복수의 샘플 로딩 양에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물을 분석하여 복수의 샘플 로딩 양 각각에서 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 이온의 MS 신호를 획득하는 단계로서,
복수의 샘플 로딩 양은 제1 샘플 로딩 양과 제2 샘플 로딩 양을 포함하고,
제1 샘플 로딩 양은 제2 샘플 로딩 양보다 더 많은 것인, 단계; 및
(b) 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 m개의 적격 이온의 중위 세트를 선택하는 단계로서,
제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트는 복수의 샘플 로딩 양, 또는 제1 샘플 로딩 양 및 제2 샘플 로딩 양 중 적어도 하나로부터의 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 정량화 오차를 기반으로 하여 선택되는 것인, 단계를 포함하는, 방법. - 제7항에 있어서, 제2 샘플 로딩 양에서 가장 높은 MS 신호를 나타내는 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 n개의 적격 이온의 상위 세트를 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항, 제2항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물의 적격 이온의 상위 세트 각각은 적격 이온의 중위 세트 각각과 상이한 것인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MS 신호는 이온화 강도인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MS 신호는 피크 높이인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MS 신호는 피크 면적인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MS 신호는 피크 부피인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플의 복수의 폴리펩티드의 펩티드 생성물은 LC/MS 기술을 이용한 펩티드 생성물의 분석 전 샘플 소화를 통해 수득되는 것인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 수득하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 복수의 폴리펩티드를 처리하여 펩티드 생성물을 생성하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 샘플을 처리하는 단계는 다음 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법:
(a) 샘플을 원심분리하여 복수의 폴리펩티드를 단리하는 단계;
(b) 샘플의 복수의 폴리펩티드를 정제하는 단계;
(c) 샘플로부터 후속 처리 및 질량 분광분석법 분석에 적합하지 않은 성분을 제거하는 단계;
(d) 복수의 폴리펩티드를 소화시켜 펩티드 생성물을 생성하는 단계; 및
(e) 펩티드 생성물을 정제하는 단계. - 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, LC/MS 기술은 액체 크로마토그래피 기술을 통해 펩티드 생성물을 분리하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, LC/MS 기술은 펩티드 생성물의 획득된 MS 신호를 처리하는 것을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, LC/MS 기술은 다음 중 하나 이상을 더 포함하는 것인, 방법:
(a) 아미노산 서열에 의해 펩티드 생성물을 식별하는 것;
(b) 단백질 식별자에 의해 제1 폴리펩티드를 식별하는 것; 및
(c) 단백질 식별자에 의해 복수의 폴리펩티드 중 1종 이상을 식별하는 것. - 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드의 절대량을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질인 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 바이오마커인 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드보다 적어도 100배 더 소량인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 폴리펩티드인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 세포 배양 샘플인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액 또는 혈청 샘플인, 방법.
- 제28항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 혈청 알부민인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 약제학적 생성물 또는 이의 중간체인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 정제되었거나 농축된 것인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물은 복수의 폴리펩티드의 트립신 분해 펩티드 생성물인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 샘플 로딩 양은 0.1 내지 25 μg 총 단백질 범위의 샘플 로딩 양을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 샘플 로딩 양은 10 μg 총 단백질인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 샘플 로딩 양은 1 μg 총 단백질인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물의 제2 세트의 MS 신호를 기반으로 한 제2 샘플 로딩 양을 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 생성물의 제1 세트의 MS 신호를 기반으로 한 제1 샘플 로딩 양을 선택하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 샘플 로딩 양 각각은 동일한 총 부피를 갖는 것인, 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, n은 1 이상인 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, n은 3인 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1 이상인 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, m은 3인 방법.
- 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드의 펩티드 생성물의 적격 이온의 중위 세트는 펩티드 생성물 각각의 서열을 기반으로 하여 선택되는 것인, 방법.
- 치료적 폴리펩티드의 생성에서 오염물질 폴리펩티드를 검출하는 방법으로,
(a) 치료적 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 오염물질 폴리펩티드가 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계로서,
이때, 오염물질 폴리펩티드의 존재는 제1항, 제2항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항의 방법을 이용하는, 샘플의 오염물질 폴리펩티드의 절대 정량화를 기초로 하는 것인, 단계;를 포함하는 방법.
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