CN103183720A

CN103183720A - 一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法

Info

Publication number: CN103183720A
Application number: CN2012102927770A
Authority: CN
Inventors: 肖海龙; 屠海云; 林赛君; 王红青
Original assignee: HANGZHOU QUALITY TECHNOLOGY SUPERVISION INSPECTION INSTITUTE
Current assignee: HANGZHOU QUALITY TECHNOLOGY SUPERVISION INSPECTION INSTITUTE
Priority date: 2012-08-16
Filing date: 2012-08-16
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2032-08-16
Also published as: CN103183720B

Abstract

本发明涉及一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法。目的是提供的方法具有提取效果好、净化性能佳的优点。技术方案是：1）初提：用缓冲液将生鲜乳或乳粉稀释稀释1～5倍，去除脂类和乳与乳制品中的高分子蛋白和其他颗粒物，得到低分子肽初提取液；2）初净化：将初提取液经过萃取和去杂质；然后将萃取柱上的低分子肽洗脱下来，收集洗脱溶液，最后旋转蒸发掉洗脱溶液中的甲醇或乙腈，得到低分子肽初净化液；3）再净化：将获得的初净化液pH值调到2～4以内，接着将低分子肽吸附并富集在该固相树脂上，随后将不带电荷的有机小分子物质和杂质洗涤掉，再用氨水甲醇溶液洗脱固相树脂，收集洗脱液。4）蒸发：得到高纯度的低分子肽混合物。

Description

一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法

技术领域

本发明涉及一种基于分子筛提取、固相萃取净化乳及乳制品中小肽、寡肽和多肽（50个氨基酸以下）的方法，可应用于人乳、牛乳、羊乳及其乳制品中低分子肽的提取、净化、和检测领域，在含肽类产品肽的检测、活性肽功能性产品的研发等方面也具有良好的应用价值。

背景技术

源于蛋白质的低分子肽是一种多功能因子，组成结构包括几个氨基酸残基的短肽链的小肽以及寡肽（5～10个氨基酸）和多肽（11～50个氨基酸）；这类肽能直接被机体吸收利用，具有吸收效率高、免疫原性低等特点。此外，它们还在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用，这些调节作用几乎涉及到人体所有的生理活动，如神经系统、消化系统、循环系统、内分泌系统等。不仅如此，其中许多肽还具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能。特别是以数个氨基酸结合生成的低肽不仅有比蛋白质更好化吸收性能，还具有促进免疫、调节激素、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等生理机能‘迄今短肽的发现已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂的开发热点，而且也是当前食品科技界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。

在乳及乳制品中肽的研究主要集中在两个方面，一是人乳中活性肽的研究，人乳经过自然进化与适应，成为婴幼儿最佳的食品，除了蛋白、脂肪和乳糖外，人乳中还含有丰富的肽，这些肽对消化、吸收、神经、免疫等各个系统均不完善的婴幼儿至关重要。随着婴幼儿配方食品带来如过敏、上火、结石、腹泻等诸多问题，以牛乳为原料的配方奶粉母乳化程度需进一步提高，对人乳中生物功能肽的深入研究更是显得迫切。二是乳源活性肽功能性食品的开发，研究者对乳及乳制品中的生物活性肽研究的日益深入，越来越多的乳源性生物活性肽被发现，鉴于生物活性肽在心血管系统，免疫系统，消化系统及神经系统等均有诸多作用，人们逐渐利用这些乳源性的生物活性多肽所具有的生物活性作用来制造健康食品或功能性食品，以期提升人类健康水平。

提取、净化技术是低分子肽的定性、定量、结构和功能研究的基础；传统的肽的提取方法是采用缓冲盐浸取、超声提取，或蛋白经过酶切后，将未消化的蛋白采用盐、有机溶剂或其他试剂沉淀，离心后直接取上清浓缩。这些提取方法所得到的是粗提物，提取效果差，杂质多；并且对仿母乳婴幼儿配方奶粉的研制和乳品中生物活性肽的研究不利。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种乳及乳制品中天然低分子肽的提取方法，该方法应具有提取效果好、净化性能佳的优点。

本发明提供的技术方案是：

一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，按以下步骤进行：

1）初提

用缓冲液将生鲜乳稀释1～5倍，或用缓冲液将乳粉稀释5～15倍，用正己烷或乙醚—石油醚混合溶液去除脂类；接着采用超滤膜以及离心或抽滤的方式去除乳与乳制品中的高分子蛋白和其他颗粒物，得到低分子肽初提取液；乙醚—石油醚混合溶液中，乙醚的体积比例为30%～70%，其余是石油醚；

2）初净化

将上述初提取液经过C18反相固相萃取柱的萃取；接着先用1%—5%的甲醇溶液或乙腈溶液洗去前述萃取柱上的强极性的杂质，然后用40%—70%的甲醇洗脱溶液或乙腈洗脱溶液将前述萃取柱上的低分子肽洗脱下来，收集洗脱溶液；最后旋转蒸发掉洗脱溶液中的甲醇或乙腈，剩下的溶液即为低分子肽初净化液；

3）再净化

用盐酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液将获得的初净化液pH值调到2～4以内，以使低分子肽上的氨基“—NH₂”带上H⁺变为“—NH₃ ⁺”；接着将前述溶液通过带有负电荷基团的阳离子交换固相萃取小柱，以将低分子肽吸附并富集在该固相树脂上；随后，依次用酸性、中性洗涤液将不带电荷的有机小分子物质和杂质洗涤掉，再用氨水甲醇溶液洗脱固相树脂，使低分子肽上的“—NH₃ ⁺”重新成为不带电荷的“—NH₂”状态，并随氨水甲醇溶液洗脱下来，收集洗脱液；

4）蒸发

洗脱液经过低温氮吹至净干，得到高纯度的低分子肽混合物。

所述步骤1）中的缓冲液是磷酸盐缓冲液（PBS），或者是柠檬酸缓冲液，或者是NaCl溶液。

所述超滤膜是截留分子量为5K的超滤膜。

所述步骤2）中的甲醇洗脱溶液的成分为甲醇和水，其中甲醇的体积含量为40%～70%。

所述步骤2）中的乙腈洗脱溶液的成分为乙腈和水，其中乙腈的体积含量为40%～70%。

所述步骤3）中的氨水甲醇溶液的成分为甲醇和氨水，其中氨水的体积含量为2%～5%。

所述步骤3）中的酸性洗涤液为磷酸盐缓冲液（PBS），或者是柠檬酸盐缓冲液，或者是NaCl溶液，用盐酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液将其pH值调至2～4以内；

所述步骤3）中的中性洗涤液为磷酸盐缓冲液（PBS），或者是柠檬酸盐缓冲液，或者是NaCl溶液，pH在6.5～7.5以内。

所述1%—5%的甲醇溶液的成分为甲醇和水，其中甲醇的体积含量为1%～5%。

所述1%—5%的乙腈溶液的成分为乙腈和水，其中乙腈的体积含量为1%～5%。

本发明的有益效果是：所采用的方法提取和净化效果好，杂质少，获得的低分子肽纯度高（可达90%以上），前处理简便易操作；可应用于人乳、牛乳、羊乳及其乳制品中低分子肽的提取、净化、和检测。在含肽类产品肽的检测、活性肽功能性产品的研发等方面也具有良好的应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例之一获得的低分子肽总离子流图（TIC）；图中显示不同的肽在色谱柱上得到分离，每一个峰包含一个到多个低分子肽。

图2是本发明实施例之一的低分子肽质谱图（5min—9min）。

图3是本发明实施例之一的低分子肽质谱图（11min—15min）。

图4是本发明实施例之一的低分子肽质谱图（17min—24min）。

图5是本发明实施例之一的低分子肽质谱图（17min—24min）。

具体实施方式

为了有效提取和净化乳及乳制品中小肽、寡肽和低分子多肽，本发明人进行了广泛深入的研究；采用截留分子量为5K的超滤膜将低分子肽与高分子蛋白和其他颗粒物分开，然后根据不同物质具有的非极性强弱不同的原理，采用反相固相萃取柱对低分子肽进行初步净化，接着根据正负离子电荷作用力的原理，选择阳离子交换固相萃取柱对低分子肽进一步净化，最后采用氮吹方式进行了浓缩，得到高纯度的低分子肽混合物。通过以上处理，完成了本发明。

本发明的有关细节描述如下：

1、试剂与材料

水为GB/T 6682规定的三级水。

甲醇，色谱纯。

乙腈，色谱纯。

正己烷，分析纯。

甲酸，分析纯。

盐酸，分析纯。

磷酸盐缓冲液（PBS）：在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄,用HCl调节溶液的pH值至7.4加水定容至1L。

柠檬酸盐缓冲液：5.88g二水柠檬酸钠溶于800ml蒸馏水中，用柠檬酸调pH值至7.0，加水定容至1L。

NaCl缓冲液：9g NaCl溶于800ml蒸馏水中，加水定容至1L。

甲醇洗脱溶液：成分为甲醇和水，其中甲醇的体积含量为40%～70%。

乙腈洗脱溶液：成分为乙腈和水，其中乙腈的体积含量为40%～70%。

氨水甲醇溶液的体积比例是：甲醇:氨水=95:5：取5mL氨水，用甲醇定容至100mL。

1%—5%的甲醇溶液的成分为甲醇和水，其中甲醇的体积含量为1%～5%。

超滤膜，截留分子量大小为5K，如美国的Milipore超滤管等产品。

C18反相固相萃取柱，如Waters公司的HLP柱等。

强阳离子交换SPE柱，其中键合相为苯磺酸型，如Varian公司的PCX小柱、Waters公司的MCX柱等。

2、仪器与设备

冷冻高速离心机，

真空泵，

旋转蒸发仪，

氮吹仪。

以上试剂、材料、仪器及设备全都外购获得。

3、操作步骤

3.1试样制备

生鲜乳（人乳）和液体乳（人乳）样品：准确称取10g样品，置于100mL玻璃器皿中，加20mL磷酸盐缓冲液，充分震荡混匀。

乳粉和粉状乳制品：准确称取3g样品，置于50mL玻璃具塞试管中。加入30mL柠檬酸缓冲液，溶解并充分震荡混匀。

3.2提取

实施例1

在生鲜乳和液体乳样品溶液中加入20mL正己烷，充分震荡混匀，6000rpm/min离心15分钟，上层为正己烷-脂类溶液，中间层为磷酸盐缓冲溶液，最低层为蛋白沉淀-颗粒杂物层，取中间层溶液，过截留分子量为5K的超滤膜，滤液即为初提取液。

活化（常规处理工序）：取反相固相萃取柱（HLP柱），依次用10mL甲醇，10mL水进行活化。

上样及洗涤：将初提取液加入到已活化的HLP柱中，依次用10mL PBS和20mL5%的甲醇溶液洗涤。

洗脱：用10mL60%的甲醇洗脱溶液洗脱，收集洗脱溶液。

旋转蒸发：洗脱溶液用旋转蒸发仪浓缩至大约4mL，即为初净化液。

活化（常规处理工序）：取MCX柱依次用10mL甲醇，10mLpH=3的稀盐酸或甲酸溶液活化。

上样及洗涤：初净化液加入等体积pH=3的稀盐酸或甲酸溶液，加入已活化完成的MCX柱中，依次加入10mL稀盐酸或甲酸溶液和10mL水洗涤，并用真空泵将MCX柱抽干。

洗脱：用10mL的氨水甲醇溶液淋洗小柱，收集洗脱液。

洗脱液用氮吹仪浓缩至净干，即获得高纯度的低分子肽混合物。

实施例2

在乳粉和粉状乳制品溶液中加入20mL正己烷，充分震荡混匀，6000rpm/min离心15分钟，上层为正己烷-脂类溶液，中间层为柠檬酸缓冲溶液萃取层，最低层为蛋白沉淀—颗粒杂物层，取中间层溶液，过截留分子量为5K的超滤膜，滤液即为初提取液。

上样及洗涤：将初提取液加入到已活化的HLP柱中，依次用10mL PBS和20mL 5%的甲醇溶液洗涤。

洗脱：用10mL 60%的甲醇洗脱溶液洗脱，收集洗脱溶液。

上样及洗涤：初净化液加入等体积pH=3的稀硫酸或乙酸溶液，加入已活化完成的MCX柱中，依次加入10mL稀盐酸或甲酸溶液和10mL水洗涤，并用真空泵将MCX柱抽干。

洗脱：用10mL的氨水甲醇溶液淋洗小柱，收集洗脱液。

4、提取物测定

提取、净化后的低分子肽测试-飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF）

4.1分析参数设置

4.1.1液相色谱参数设置（waters公司UPLC）

色谱柱：BEH300 C18（2.1mm×100mm×1.7μm）

进样量：5.0uL

柱温：30度

流速：0.4mL/min

流动相A：0.1%甲酸水溶液

流动相B：乙腈

流动相梯度按表1.

表1低分子肽色谱分离流动相梯度

时间（min）	流动相A(%)	流动相B(%)
			0	95	5
3	95	5
			5	85	15
40	60	40
			40.1	10	90
46	10	90
			46.1	95	5

4.1.2Q—TOF参数设置（waters公司Xevo QTof MS）

扫描模式：ESI+

扫描范围（质核比）：100—2000

扫描时间：1.0

毛细管电压：3.0Kv

样品锥孔电压40

提取电压：4.0

离子源温度：100度

脱气温度：350度。

氮气脱气流速：800L/h

低碰撞能量：6V

高碰撞能量范围：15V-35V

4.2低分子肽测试结果

图1是总离子流图。

图2至图5是低分子肽质谱图；图中可见：大部分肽因含赖氨酸、精氨酸等，因此带2到多个电荷，在质谱图中同位素峰之间的质核比差表现为0.5、0.33等0.25、0.2差别。

部分低分子肽序列测定结果见表1

表1人乳中部分肽初步鉴定检索结果

5、结论

5.1经过液相色谱-四级杆-飞行时间质谱检测，总离子流图显示所获得的样品出峰情况良好；质谱图反应出这些峰均为带2-5个电荷的肽，不同质荷比说明一个峰包含一个或多个的肽，且分子量在200Da～5000Da之间，即低分子肽（2肽～50个AA以内的多肽）。以上表明，采用本发明所述的提取方法，所获得的提取物主要为低分子肽，且基本上无杂质。

5.2本发明所述的提取方法主要采用分子筛、反相固相萃取和阳离子固相萃取这三个步骤，具有操作简便的特点，提取效果好、提取的低分子肽纯度高。可应用于人乳、牛乳、羊乳及其乳制品中低分子肽的提取、净化、和检测领域，在含肽类产品肽的检测、活性肽功能性产品的研发等方面也具有良好的应用价值。

Claims

1.一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，按以下步骤进行：

1）初提

2）初净化

将上述初提取液经过C18反相固相萃取柱的萃取；接着先用1%—5%的甲醇溶液或乙腈溶液洗去前述萃取柱上的强极性的杂质，然后用40%—70%的甲醇洗脱溶液或乙腈洗脱溶液将前述萃取柱上的低分子肽洗脱下来，收集洗脱溶液；最后蒸发掉洗脱溶液中的甲醇或乙腈，剩下的溶液即为低分子肽初净化液；

3）再净化

用盐酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液将获得的初净化液pH值调到2～4以内，以使低分子肽上的氨基“—NH₂”带上H⁺变为“—NH₃ ⁺”；接着将前述溶液通过带有负电荷基团的阳离子交换固相萃取小柱，以将低分子肽吸附并富集在该固相树脂上；随后，依次用酸性、中性洗涤液将不带电荷的有机小分子物质和杂质洗涤掉，再用氨水甲醇溶液洗脱固相树脂，使低分子肽上的“-NH₃ ⁺”重新成为不带电荷的“-NH₂”状态，并随氨水甲醇溶液洗脱下来，收集洗脱液；

4）蒸发

2.根据权利要求1所述的一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于：所述步骤1）中的缓冲液是磷酸盐缓冲液（PBS），或者是柠檬酸缓冲液，或者是NaCl溶液。

3.根据权利要求2所述的一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于：所述超滤膜是截留分子量为5K的超滤膜。

4.根据权利要求3所述的一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于：所述步骤2）中的甲醇洗脱溶液的成分为甲醇和水，其中甲醇的体积含量为40%～70%。

5.根据权利要求4所述的一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于：所述步骤2）中的乙腈洗脱溶液的成分为乙腈和水，其中乙腈的体积含量为40%～70%。

6.根据权利要求5所述的一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于：所述步骤3）中的酸性洗涤液为磷酸盐缓冲液（PBS），或者是柠檬酸盐缓冲液，或者是NaCl溶液，用盐酸或硫酸或甲酸或乙酸溶液将其pH值调至2～4以内；

7.根据权利要求6所述的一种乳及乳制品中低分子肽的提取方法，其特征在于：所述步骤3）中的氨水甲醇溶液的成分为甲醇和氨水，其中氨水的体积含量为2%～5%。