CN105891387B - 一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法 - Google Patents

一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法 Download PDF

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Abstract

一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，其属于分析化学检测的技术领域。含亲水性氨基酸样品按一定比例有机溶剂提取或溶解后，然后采用硅胶表面极性基团键合相填料制备；通过优化制备过程中溶剂用量及淋洗配比等参数，实现了对样品中亲水性氨基酸的富集制备。制备后的氨基酸样品能够在一定的色谱质谱条件下，实现一次性同时检测。该方法具有稳定性好、回收率高、操作简便可控等特点。

Description

一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，其属于分析化学检测的前处理技术领域。
技术背景
目前发现的数百种天然氨基酸，按照侧链基团的不同可分为亲水性氨基酸和疏水性氨基酸，通常共同存在于各种样品当中。生物体中液体多以水为载体，鸡蛋、蜂蜜、血浆、马铃薯等样品在提取后会含有大量的极性物质，其中游离氨基酸含量也多以亲水性氨基酸为主。如20种蛋白质氨基酸中，其中12种为亲水性氨基酸，其余8种为疏水性氨基酸。人体中的半必需氨基酸半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸均属于亲水性氨基酸，任何一种的缺失都会造成人体代谢的紊乱。亲水性氨基酸在生物体内代谢可发挥一些特殊的作用，如谷氨酰胺和天冬酰胺是两个影响动物细胞大规模培养过程效率的关键营养物，对细胞生长、抗体表达和氨的生成有显著影响。在常规以液相反相色谱分离为主检测当中，极性物质和亲水性氨基酸往往同时在保留时间一起出峰，给后续亲水性氨基酸的检测造成很大的麻烦。鉴于当前有关亲水性氨基酸的制备方法及标准较少，造成目前多见于各种样品中氨基酸的提取制备存在着亲水性氨基酸回收率低，亲水性氨基酸检测数目较少等现象，迫切需要一种制备方法用于亲水性氨基酸的分离分析检测。
发明内容
本发明涉及一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，原理是依靠硅胶表面极性基团键合相填料表面对样品中亲水性氨基酸的强烈吸附作用。样品中的亲水性氨基酸在填料上先被保留下来，通过优化富集制备过程中溶剂含量及淋洗配比等参数，除去一些生物基质，之后采用特定配比的洗脱液将亲水性氨基酸选择性的洗脱出来，实现样品中亲水性氨基酸的富集制备。
一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，包括以下步骤：
（1）样品提取
将样品置于离心管底部，加入提取液涡旋提取；涡旋混合30秒后，再超声3min，15000g/min离心5min后取全部上清液备用；
所述提取液为有机溶剂与100mM缓冲盐溶液按体积比70-90:10-30混合的混合溶液；
（2）装填固相萃取柱
装填规格为30-100mg/1mL或者100-500mg/5mL的固相萃取柱；填料为硅胶表面极性基团键合相填料，所述极性基团为羟基、羧基、氨基、酰氨基、氰基中的一种或多种；键合相填料的粒径为5-100 um，孔径60-300 nm，比表面积50-800 m2/g；
（3）富集亲水性氨基酸样品
先采用体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水=10:25:65的第一混合液对固相萃取柱进行活化；再加入体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水=90: 5: 5的第二混合液进行平衡；将全部上清液样品上样后，加入第二混合液进行淋洗；最后用体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水：酸=70:5:24:1的第三混合液进行洗脱，并收集全部的洗脱馏分，并将馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中；
所述提取液、第一混合液、第二混合液、第三混合液中有机溶剂及缓冲盐溶液是相对应的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或多种，所述缓冲盐溶液为甲酸铵和/或乙酸铵的甲酸和/或乙酸溶液，缓冲盐溶液的pH为1-4。
所述水性氨基酸为L-脯氨酸、4-羟基-L-脯氨酸、L-O-磷酸丝氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-瓜氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-苏氨酸-3-磷酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-组氨酸、S-磺基-L-半胱氨酸、半胱亚磺酸、肌肽、甘氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、亚磺酸中一种或多种。
所述上清液中样品质量占固相萃取柱中填料质量的0.5%-10%。
富集制备采用的过程方法，具体步骤如下：
1) 配置样品提取试剂。提取液为有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液，其中有机溶剂和盐两者体积比介于70∶30—90∶10之间。有机溶剂为甲醇，乙醇，乙腈，丙酮中的任意一种或多种组合；所采用的缓冲液为甲酸铵或乙酸铵中的一种或两者组合，调剂缓冲盐用的酸为甲酸或乙酸中的一种或两者组合；PH介于1-4之间；
2) 样品提取。
A，液体样品处理：移取100uL样品到1.5mLEP管底部，加入900uL提取液涡旋提取。涡旋混合30秒后，再超声3min，15000g/min离心5min后取全部上清液备用；
B，固体样品处理：称取1g样品于1.5mLEP管底部，加入1mL提取液涡旋提取。涡旋混合30秒后，再超声3min，15000g/min离心5min后取全部上清液备用；
3）装填固相萃取柱。装填规格为30-100mg/1mL或者100-500mg/5mL，优选100mg/1mL；填料为硅胶表面极性基团键合相填料，基团包括：羟基，羧基，氨基，酰氨基，氰基等中的一种或多种；键合相填料粒径为5~100 um，孔径60~300 nm，比表面积50~800 m2/g；
4）样品处理。采用填料处理过程分为活化、平衡、上样、淋洗和洗脱。先采用3mL有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水（10:25:65，v/v/v）进行活化；再加入3mL有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水（90: 5: 5，v/v/v）平衡；将全部上清液样品上样后，加入1mL有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水（90: 5: 5，v/v/v）进行淋洗；最后用1mL有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水：酸（70:5:24:1，v/v/v）进行洗脱，并收集全部的洗脱馏分，并将馏分浓缩至干后重溶于100uL0.1moL/L的盐酸中。整个过程中，平衡、活化、上样、淋洗、洗脱所使用的有机溶剂、缓冲盐溶液和酸需一一对应。
本发明具有的有益效果是：高选择性-针对当前亲水性氨基酸样品在前处理过程中的富集制备方法，本发明提出使用极性基团键合相填料，选择性的制备样品中亲水性氨基酸，有效解决样品中亲水性氨基酸检测前处理存在其它物质干扰的问题。方法简单，所采用的固体吸附剂易于制成96孔SPE板，实现批量化。重复性好，操作简单可控，易实现自动化，过程稳定。净化后的氨基酸样品衍生化后用串联质谱检测，能同时检测各种样品中亲水性的氨基酸。
附图说明
图1是实施例中方法的操作流程图。
图2是实施例中随机样品中20种亲水性氨基酸超高效液相串联质谱检测总离子流图。
具体实施方式
现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。实例所用到血浆样品均由辽宁锦州医科大学附属第一医院提供，其它样品购买于市场。在实施方式中，以下实施例中所有净化的样品取10uL样品用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯衍生后，用液质联用的方法进行检测。其中液相色谱流动相条件包括A和B：A为含20 mM甲酸铵、0.5%甲酸、1%乙腈的水溶液，流动相B为含1.6%甲酸的乙腈溶液。流速为0.45mL/min，柱温45℃，色谱柱：Xselect HSS T3 2.1×100 mm 2.5um粒径色谱柱。梯度条件如下：
时间（min） 流速（mL/min) 流动相A（%） 流动相B（%）
0 0.45 98 2
0.5 0.45 98 2
10 0.45 70 30
16 0.45 5 95
17 0.45 5 95
17.5 0.45 98 2
20 0.45 98 2
质谱条件为正离子模式下采用多反应监测检测，参数为离子源温度150℃，毛细管电压3.0kv，源温度150℃，去溶剂温度500℃，去溶剂气流量800L/h，锥孔气流量150L/h。
建立亲水性氨基酸标准品的标准曲线：
选取常见的20种亲水性氨基酸标准品情况见下表：
氨基酸标准品的保留时间、MRM条件及相关参数如下表：
根据液相色谱和质谱条件对亲水氨基酸进行标准曲线测定。并根据保留时间以及质谱离子对区别鉴定所有的氨基酸。本实施例中配置20个氨基酸标准品的浓度如下：0.0001ug/mL, 0.0005ug/mL, 0.001ug/mL, 0.005ug/mL, 0.01ug/mL, 0.05 ug/mL,0.1ug/mL, 0.5ug/mL。以检测限10倍含量配置标准品混标，进行方法回收率考察，平行测定3次。标准品氨基酸经衍生后，经液质联用检测数据处理，氨基酸标准品的出峰面积（y）与浓度（x）之间的回归方程及方法检测限如下表：
根据色谱质谱条件进行分析和数据处理，根据外标法计算实例中每种氨基酸的浓度，实现样品中亲水氨基酸的检测。
实施例1
蜂蜜样品检测。称取1g蜂蜜于1.5mL EP管中，再加入300μL NH4FA(100mM，PH=3.2)涡旋混合，然后加入700μL 甲醇，涡旋混合30秒，超声3min，15000g/min离心3min后取全部上清液备用；
硅胶表面氨基基团键合相填料500mg装填与5mL固相小柱中，加入3mL MeOH∶NH4FA∶H2O（10∶25∶65，v/v/v）活化后，再加入3mL MeOH∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）淋洗。最后加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O∶FA（70:5:24:1，v/v/v）洗脱，并收集所有的洗脱馏分。洗脱馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中，衍生经液质联用检测，可对蜂蜜中亲水性氨基酸进行检测。
实施例2
血浆样品检测。取500uL待测血浆，5000g离心后，取上层100uL血浆于1.5mL EP管中，再加入100μL NH4FA(100mM，PH=3.2)涡旋混合，然后加入900μL ACN沉淀蛋白质，涡旋混合30秒，超声3min，15000g/min离心3min后取全部上清液备用；
硅胶表面羟基基团键合相填料100mg装填与1mL固相小柱中，加入3mL ACN∶NH4FA∶H2O（10∶25∶65，v/v/v）活化后，再加入3mL ACN∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL ACN∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）淋洗。最后加入1mL ACN∶NH4FA∶H2O∶FA（70:5:24:1，v/v/v）洗脱，并收集所有的洗脱馏分。洗脱馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中，衍生经液质联用检测，可对血浆中亲水性氨基酸进行检测。
实施例3
细胞组织样品检测。称取0.05g粉碎后的组织于1.5mL EP管中，再加入100μLNH4FA(100mM，PH=3.2)涡旋混合，然后加入900μL 甲醇，涡旋混合30秒，超声3min，15000g/min离心3min后取全部上清液备用；
硅胶表面酰氨基团键合相填料100mg装填与1mL固相小柱中，加入3mL MeOH∶NH4FA∶H2O（10∶25∶65，v/v/v）活化后，再加入3mL MeOH∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）淋洗。最后加入1mL MeOH∶NH4FA∶H2O∶FA（70:5:24:1，v/v/v）洗脱，并收集所有的洗脱馏分。洗脱馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中，衍生经液质联用检测，可对细胞组织中亲水性氨基酸进行检测。
实施例4
鸡蛋样品检测。生鸡蛋除去蛋壳，充分均匀后，称取1g样品于1.5mL EP管中，再加入200μL NH4FA(100mM，PH=3.2)涡旋混合，然后加入800μL 乙醇，涡旋混合30秒，超声3min，15000g/min离心3min后取全部上清液备用；
硅胶表面羧基基团键合相填料500mg装填与5mL固相小柱中，加入5mL 乙醇∶NH4FA∶H2O（10∶25∶65，v/v/v）活化后，再加入5mL 乙醇∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入3mL 乙醇∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）淋洗。最后加入2mL 乙醇∶NH4FA∶H2O∶FA（70:5:24:1，v/v/v）洗脱，并收集所有的洗脱馏分。洗脱馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中，衍生经液质联用检测，可对鸡蛋中亲水性氨基酸进行检测。
实施例5
血清样品检测。取500uL待测血浆，5000g离心后，取上层100uL血浆于1.5mL EP管中，再加入100μL NH4FA(100mM，PH=3.2)涡旋混合，然后加入900μL 丙酮沉淀蛋白质，涡旋混合30秒，超声3min，15000g/min离心3min后取全部上清液备用；
硅胶表面氰基基团键合相填料100mg装填与1mL固相小柱中，加入3mL 丙酮∶NH4FA∶H2O（10∶25∶65，v/v/v）活化后，再加入3mL 丙酮∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL 丙酮∶NH4FA∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）淋洗。最后加入1mL 丙酮∶NH4FA∶H2O∶FA（70:5:24:1，v/v/v）洗脱，并收集所有的洗脱馏分。洗脱馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中，衍生经液质联用检测，可对血清中亲水性氨基酸进行检测。
实施例6
果汁样品检测。取500uL果汁，5000g离心后，取上层100uL于1.5mL EP管中，再加入100μL 乙酸铵(100mM，PH=3.2)涡旋混合，然后加入900μL ACN沉淀蛋白质，涡旋混合30秒，超声3min，15000g/min离心3min后取全部上清液备用；
硅胶表面羟基基团键合相填料100mg装填与1mL固相小柱中，加入3mL ACN∶乙酸铵∶H2O（10∶25∶65，v/v/v）活化后，再加入3mL ACN∶乙酸铵∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）进行平衡，然后将上样溶液全部上样后，加入1mL ACN∶乙酸铵∶H2O（90∶5∶5，v/v/v）淋洗。最后加入1mL ACN∶NH4FA∶H2O∶FA（70:5:24:1，v/v/v）洗脱，并收集所有的洗脱馏分。洗脱馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中，衍生经液质联用检测，可对果汁中亲水性氨基酸进行检测。

Claims (4)

1.一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品提取
将样品置于离心管底部，加入提取液涡旋提取；涡旋混合30秒后，再超声3min，15000g离心5min后取全部上清液备用；
所述提取液为有机溶剂与100mM缓冲盐溶液按体积比70-90:10-30混合的混合溶液；
（2）装填固相萃取柱
装填规格为30-100mg/1mL或者100-500mg/5mL的固相萃取柱；填料为硅胶表面极性基团键合相填料，所述极性基团为羟基、羧基、氨基、酰氨基、氰基中的一种或多种；键合相填料的粒径为5-100 um，孔径60-300 nm，比表面积50-800 m2/g；
（3）富集亲水性氨基酸样品
先采用体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水=10:25:65的第一混合液对固相萃取柱进行活化；再加入体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水=90: 5: 5的第二混合液进行平衡；将全部上清液样品上样后，加入第二混合液进行淋洗；最后用体积比有机溶剂∶100mM缓冲盐溶液：水：酸=70:5:24:1的第三混合液进行洗脱，并收集全部的洗脱馏分，并将馏分浓缩至干后重溶于100uL 0.1moL/L的盐酸中；
所述提取液、第一混合液、第二混合液、第三混合液中有机溶剂及缓冲盐溶液是相对应的，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或多种，所述缓冲盐溶液为甲酸铵和/或乙酸铵的甲酸和/或乙酸溶液，缓冲盐溶液的pH为1-4。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，其特征在于：所述亲水性氨基酸为L-脯氨酸、4-羟基-L-脯氨酸、L-O-磷酸丝氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-苏氨酸-3-磷酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-组氨酸、S-磺基-L-半胱氨酸、半胱亚磺酸、甘氨酸、牛磺酸中一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，其特征在于：所述固相萃取柱的规格为100mg/1mL。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测亲水性氨基酸的富集方法，其特征在于：所述上清液中样品质量占固相萃取柱中填料质量的0.5%-10%。
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