KR20190082717A - 모유은행 기증 모유의 다차원 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, (a) 모유 시료를 채집하는 단계; (b) 상기 모유 시료를 이용하여 복수 개의 검출용 시료를 제조하는 단계; (c) 상기 검출용 시료를 융합 실리카 모세 혈관 칼럼(fused-silica capillary column)을 이용한 액체 크로마토그래피법으로 분리하고, 분리된 성분을 질량 분석법으로 분석하여 상기 모유 시료의 성분 정보를 산출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 산출한 성분 정보를 표준화된 모유의 성분 정보와 비교하는 단계;를 포함하는 다차원 모유 분석방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다차원 모유 분석방법은 모유에 포함된 단백질, 지질, 탄수화물 등의 영양 성분을 고감도로 분석할 수 있어, 신뢰성 있는 분석 결과를 산출할 수 있다.
본 발명에 따른 다차원 모유 분석방법은 모유에 포함된 단백질, 지질, 탄수화물 등의 영양 성분을 고감도로 분석할 수 있어, 신뢰성 있는 분석 결과를 산출할 수 있다.
Description
본 발명은 산모의 모유에 포함된 성분을 다차원으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
모유(human breast milk)는 영아에게 필요한 단백질, 지방, 당질(젖당), 무기질 및 각종 비타민 등의 영양소가 균형있게 존재할 뿐만 아니라, 면역글로불린(immunoglobulin), 인터페론(interferon), 인터루킨(interlukin), 락토페린(lactoferrin) 등과 같은 면역성분들도 다량 포함되어 있어 영양학적으로나 면역학적으로 영아에게 유익하다. 또한, 모유 수유는 영아의 지능 발달에도 도움을 주고, 정서안정에도 도움을 주는 것으로 알려져 이와같은, 모유 수유의 중요성이 널리 알려짐에 따라 모유 수유를 희망하는 산모들이 증가하고 있는 추세이다. 또한, 최근 모유 기증 운동이 확산되어 모유 은행에 기증되는 모유의 양이 점점 증가하고 있다.
수유모로부터 모유 수유를 받는 유아는 6개월까지는 모유에 대한 의존도가 높은데, 특히, 모유 수유 3개월까지는 모유의 영양에 완전히 의존하기 때문에 모유 수유를 통해 수유모에게서 유아로 전달되는 모유 내 영양 성분과 양을 확인하는 일은 매우 중요하다. 일반적으로, 모유는 분비시기에 따라 분만 후, 5일 까지는 초유, 12일까지는 이행유, 그 이후로는 성숙유로 분류되고 있는데, 초유에서 이행유를 거쳐 성숙유로 변화하는 기간 동안 모유 내 영양소와 면역성분에 많은 변화가 일어나 영양분의 포함함량이 모유 수유 기간별로 상이하고, 수유모의 식습관에도 영향을 받아 모유가 변화하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 수유모는 자신의 모유에 정확히 어떠한 성분이 포함되어 있고 모유에 포함된 성분의 포함함량이 얼마나 되는지는 알 수가 없고, 모유 수유가 영아에게 어떠한 영향을 미치는지에 관한 궁금증이 유발될 수 있다.
이에 따라, 종래에는 중적외선을 모유 시료에 조사하여 모유에 포함된 지방, 단백질, 탄수화물, 수분 등을 분석할 수 있는 모유분석기에 대한 기술 내용이 개시된 바 있다. 하지만, 상기 모유분석기는 중적외선을 이용하여 모유에 포함된 분자의 작용기를 분석하기 때문에, 모유에 포함된 성분의 완전한 분석이 어렵고, 분석된 정보자료의 정확성이 다소 떨어진다는 단점이 있다.
따라서, 수유모의 모유에 대한 정확한 분석이 가능하고, 분석된 정보를 이용하여 모유의 성분에 대해 올바로 진단할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하고, 분석한 자료를 이용하여 영아에게 유익한 영양분을 공급할 수 있는 방법에 대한 연구 또한 필요하다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 모유에 포함된 각종 성분에 관해 신뢰성있는 정보를 제공할 수 있는 다차원 모유 분석 방법에 관한 기술 내용을 제공하고자 한다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은, (a) 모유 시료를 채집하는 단계; (b) 상기 모유 시료를 이용하여 복수 개의 검출용 시료를 제조하는 단계; (c) 상기 검출용 시료를 융합 실리카 모세 혈관 칼럼(fused-silica capillary column)을 이용한 액체 크로마토그래피법으로 분리하고, 분리된 성분을 질량 분석법으로 분석하여 상기 모유 시료의 성분 정보를 산출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 산출한 성분 정보를 표준화된 모유의 성분 정보와 비교하는 단계;를 포함하는 다차원 모유 분석방법을 제공한다.
또한, 상기 모유 시료는 12 내지 48 시간 동안 수유모가 배출하는 모유를 채집한 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 검출용 시료는 상기 모유 시료에 포함된 성분을 구분할 수 있는 표준 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (b)에서는, 상기 모유 시료에 포함된 총단백질을 분리한 후, 상기 총단백질에 가수분해효소를 처리하여 단백질을 포함하는 검출용 시료를 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (c)에서는, 상기 모유 시료에 포함된 유해물질의 성분 정보를 산출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 유해물질은 파라벤(paraben), 폴리염화비페닐(polychlorinated biphenyl), 과불화화합물(perfluorinated compounds)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (d)에서는, 산출한 성분 정보를 표준화된 모유의 성분 정보와 비교한 후, 비교한 모유 성분 정보로 산모 건강상태를 나타내는 등급을 부여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기에 기재된 방법에 의해 성분 분석된 모유에 단백질, 지질 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 혼합하여 제조한 표준화된 모유를 제공한다.
본 발명에 따른 다차원 모유 분석방법은, 모유 시료에 포함된 다양한 영양 성분을 효과적으로 검출할 수 있는 최적화된 추출방법(extraction)으로 검출용 시료를 준비한 뒤, 액체 크로마토그래피(liquid chromatography, LC)와 전기분무 이온화 질량 분광분석법(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS/MS) 통해 모유에 포함된 각종 성분을 고감도로 분석할 수 있어, 모유에 포함된 각종 성분에 대한 신뢰성 있는 분석 결과를 산출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 다차원 모유 분석방법의 각 단계를 나타낸 공정도이다.
본 발명은, 수유모로부터 수득한 모유에 포함된 각종 성분을 다차원으로 분석하여 수유모의 건강 및 모유의 상태를 분석하고, 분석한 성분 정보로 모유에 포함된 불충분한 성분을 보충하여 완전체 모유를 제조할 수 있는 모유 분석 방법에 관한 기술 내용을 제공하고자 한다. 본 발명에 따른 모유 분석 방법은 액체크로마토그래피 및 전기분무 이온화 질량 분광분석법을 순차적으로 수행해 산모가 기증한 모유의 신뢰성 있는 모유의 성분 정보를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.
본 발명은, (a) 모유 시료를 채집하는 단계; (b) 상기 모유 시료를 이용하여 복수 개의 검출용 시료를 제조하는 단계; (c) 상기 검출용 시료를 융합 실리카 모세 혈관 칼럼(fused-silica capillary column)을 이용한 액체 크로마토그래피법으로 분리하고, 분리된 성분을 질량 분석법으로 분석하여 상기 모유 시료의 성분 정보를 산출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 산출한 성분 정보를 표준화된 모유의 성분 정보와 비교하는 단계;를 포함하는 다차원 모유 분석방법을 제공한다.
상기 단계 (a)는 모유 시료를 채집하는 단계로서, 상기 모유 시료는 산후 회복 중인 수유모(lactating women)로부터 수득한 초유, 이행유 또는 성숙유 등의 모유라면 제한받지 않고 사용할 수 있다.
상기 모유 시료는 수유모의 산후 회복 기간별로 포함된 성분 조성이 각기 다르고, 모유 시료를 채집하는 시간별로도 성분 조성이 달라질 수 있으며, 수유모의영양, 출산력, 신체조건, 유전, 재태연령 등에 따라 달라질 수 있어, 모유 시료에 포함된 성분 조성의 차이가 크지 않도록, 특정한 시간 간격동안 수유모에서 채집하는 모유를 혼합하여 평균적인 성분 조성을 가지는 모유 시료를 수득할 수 있다. 바람직하게는, 상기 모유 시료는 12 내지 48 시간 동안 수유모가 배출하는 모유를 모두 혼합해 모유 시료로 사용할 수 있고, 수득한 모유 시료는 균질화 장치를 이용하여 균질화 처리할 수 있다.
일례로, 상기 모유 시료는 착유기 또는 손으로 수유 전에 수유모의 임의대로 모유를 착유하고, 멸균한 폴리에틸렌 튜브 등과 같은 용기에 담아 밀봉한 후, 저온에서 보관한 것일 수 있다.
상기 단계 (b)는 상기 모유 시료를 이용하여 복수 개의 검출용 시료를 제조하는 단계이다. 본 단계에서는 모유 시료에 포함된 각종 성분을 고감도로 검출할 수 있도록, 단백질, 탄수화물 또는 지질 등을 성분별로 각각 포함하는 복수 개의 검출용 시료를 제조할 수 있다.
본 단계에서는, 모유 시료에 포함된 단백질 성분을 검출하기 위해, 모유 시료에서 총단백질을 분리 및 정제한 후, 총단백질에 가수분해효소를 처리하여 단백질을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다. 이때, 상기 검출용 시료에 포함된 단백질은 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질 또는 아미노산 등 특정 크기에 제한되는 것은 아니다. 특히, 모유 시료에 포함된 고분자량의 단백질을 후술할 단계에서 질량분석기로 분석하기 위해서는 다양한 단백질 가수분해 효소를 이용하여 보다 저분자량인 펩타이드로 가수 분해하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 단백질을 포함하는 검출용 시료는 단백질 수준에서의 분석이 어려우므로, 단백질을 가수분해시켜 검출용 시료를 제조할 수 있다. 단백질을 분해하기 위한 가수분해효소는, 트립신(trypsin) 또는 키모트립신(chymotrypsin) 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 그리고, 상기 검출용 시료는 일반적으로 알려진 변성(denaturation), 환원(reduction), 시스테인 알킬레이션(cysteine alkylation), 탈인산화(dephosphorylation) 또는 탈당쇄화(deglycosylation) 등과 같은 전처리 과정을 통해 단백질을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다.
일례로, 상기 단백질을 포함하는 검출용 시료를 제조하기 위해서는, 먼저, 모유 시료를 원심분리하여 상등액을 취하고, 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)으로 첨가 반응시켜 모유 단백체를 수득한다. 수득한 모유 단백체를 아세톤 침전(acetone precipitation)시켜 단백질을 정제하고, 정제된 단백질은 트리스 버퍼(Tris-HCl buffer) 및 우레아(urea)에 용해시켜 총단백질을 수득할 수 있다. 수득한 총단백질 시료에 TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)를 첨가한 후, 반응시켜 환원시키고, 알킬화 시약인 요오드아세트아미드(iodoacetamide)를 첨가하여 카바미도메틸화(carbamidomethylation), 즉, 시스테인 알킬레이션를 유도해 시스테인 자리가 보호된 단백질을 제조하고, 트리스 버퍼 및 염화칼슘을 첨가한 후, 트립신을 첨가해 가수분해시켜 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질 또는 아미노산 등의 형태로 단백질을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다.
또한, 본 단계에서는, 모유 시료에 포함된 지질 성분을 검출하기 위해서 통상적으로 사용되는 지질 추출 방법을 이용하여, 지질을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다. 바람직하게는 모유 시료를 용매 추출법(solvent extraction)의 일종인 폴츠 분배법(Folch method)으로 처리하여 지질을 포함하는 상기 검출용 시료를 제조할 수 있으며, 해당 검출용 시료를 이용하여 지질 및 지방산을 동시분석 가능하다.
이때, 상기 검출용 시료에 포함된 지질은 중성지방, 인지질, 유리지방산 등 특정 크기에 제한되는 것은 아니다.
일례로, 채집한 모유 시료를 액체 질소(N2)를 이용하여 급속 냉각한 후, 건조하여 모유 분말을 제조하고, 물에 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)이 2:1의 비율로 섞인 용매를 모유 분말에 첨가하여 혼합한 후, 증류수를 재첨가하여 혼합 모유 시료를 제조할 수 있다. 제조한 혼합 모유 시료를 원심분리하여 유기용매 층과 수용액 층을 분리하고, 유기용매 층을 취해 건조하여 분말을 제조하고, 분말과 클로로포름과 메탄올 용매를 1:1의 비율로 섞어 지질을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다. 또는, 상기 유기용매 층에 n-헥산을 첨가하여 지질을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다. 상기와 같이 제조된 지질을 포함하는 검출용 시료는 지질에 포함된 과불화화합물, 폴리염화비페닐 또는 페놀 등의 잔류오염 물질을 검출하기 위해서도 사용가능하다.
또한, 본 단계에서는, 모유 시료에 포함된 탄수화물 성분을 검출하기 위해, 상기 검출용 시료는 모유 시료를 10,000 Mw 이상의 분자량을 초과하는 물질을 차단하는 여과막으로 여과하여 분획분자량(molecular weight cut-off, MWCO)의 탄수화물을 포함하는 상기 검출용 시료를 제조할 수 있다. 이때, 상기 여과막은 초미세 여과막을 사용할 수 있다.
이때, 상기 검출용 시료에 포함된 탄수화물은 다당(polysaccharide), 올리고당(oligosaccharide), 단당(monosaccharide) 등 특정 크기에 제한되는 것은 아니다.
일례로, 탄수화물을 포함하는 상기 검출용 시료는 모유 시료에 클로로포름 또는 아세톤을 첨가하여 원심분리하면 단백질 및 지질을 포함하는 침전물과 상등액으로 분리시키고, 상등액을 취한 후, 분자량 10,000 Mw 이상의 물질을 차단하는 여과막으로 여과하여 탄수화물 검출용 시료를 제조할 수 있다.
또는, 지질을 포함하는 검출용 시료의 제조과정 중에 발생되는 수용액 층을 취하는 것으로 지질이 제거된 모유 시료를 제조하고, 여과막으로 여과하여 탄수화물을 포함하는 상기 검출용 시료를 제조할 수 있으며, 모유 시료에 아세톤 및 클로로포름을 포함하는 혼합용액을 공급한 후, 원심분리하여 단백질을 침전시키고, 상등액을 취해 단백질이 제거된 시료를 제조하고, 상기 시료를 여과막으로 여과하여 탄수화물을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다.
아울러, 본 단계에서는, 후술할 단계에서 모유 시료에 포함된 구리, 철, 아연 등의 미량 금속 성분을 분석할 수 있도록, 상기 모유 시료에 질산(HNO3)을 첨가하여 원심분리 후 형성되는 침전물을 수득해 상기 모유 시료에 포함된 마그네슘, 구리, 철, 아연 등의 미량 금속 성분을 포함하는 미네랄 검출용 시료를 제조할 수 있으며, 미네랄을 포함하는 검출용 시료는 원자흡수분광광도법으로 분석하여 모유 시료에 포함된 미네랄 성분을 분석할 수 있다.
나아가, 본 발명에서는 상기 모유 시료에 단백질 분해효소(protease) 및 지방 분해효소(lipase)를 첨가하여 단백질과 지질을 분해시키고, 글루쿠로니다아제(glucuronidase) 및 황산을 시간간격별로 첨가한 후, 원심분리를 통해 얻어지는 상등액을 수득하는 방법으로 페놀, 파라벤류 등의 잔류 오염물질을 포함하는 검출용 시료를 제조할 수 있다.
또한, 상기와 같이 제조한 각각의 검출용 시료는 단백질, 탄수화물, 지질 또는 잔류 오염물질 등을 질량분석법으로 분석하여 모유 시료에 포함된 함량을 산출할 수 있도록, 각종 성분의 전하량(charge)을 미리 알고 있는 표준 물질을 각각 첨가하도록 구성하여, 후술할 단계에서 질량 분석법에 의해 각각의 성분을 전하량도 별로 분석하도록 구성할 수 있다.
또는, 상기와 같이 제조한 각각의 검출용 시료는 단백질, 탄수화물, 지질 또는 잔류 오염물질 등을 분자량별로 구분한 후, 질량분석법으로 분석하여 모유 시료에 포함된 함량을 산출할 수 있도록, 분자량을 미리 알고 있는 표준 물질을 각각 첨가하도록 구성하여, 후술할 단계에서 질량 분석법에 의해 각각의 성분을 분자량 또는 이온화도 별로 분석하도록 구성할 수 있다.
상기 표준 물질은 모유 시료에서 검출되지 않는 성분을 내부 표준 물질로 사용할 수 있고, 질량분석에서 항상검출되는 성분을 사용할 수도 있으며, HPLC 등급의 표준 물질을 사용할 수도 있다.
상기 단계 (c)에서는 융합 실리카 모세 혈관 칼럼(fused-silica capillary column)을 이용한 액체 크로마토그래피법으로 상기 검출용 시료에서 단백질, 탄수화물, 지질 및 미네랄을 각각 분리하고, 상기 단백질, 탄수화물 및 지질을 질량 분석법으로 분석하여 상기 모유 시료의 성분 정보를 산출하는 단계이다.
상기 액체 크로마토그래피법(liquid chromatogrphy, LC)은 모유 시료를 보다 효과적인 분석이 가능하도록 검출용 시료에 포함된 단백질, 지질, 탄수화물 등의 성분을 분자량별 또는 전하량별로 분리하는 역할을 한다.
상기 액체 크로마토그래피를 수행하기 위해서, 상기 검출용 시료는 포름산(formic acid) 또는 아세트산(acetate) 등의 산과 아세토니트릴(acetonitrile, ACN) 포름산 암모늄(ammonium formate) 또는 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF) 등의 극성이 낮은 유기용매를 첨가하여 이동상을 제조해 액체 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
이때, 상기 포름산은 0.1 내지 200 mM의 포름산을 0.01 내지 0.1 부피%를 첨가하여 액체 크로마토그래피를 수행할 수 있으며, 분리를 촉진시키기 위해서 농도가 높은 포름산을 사용할 수 있으며, 농도가 높은 아세토니트릴과 혼합된 검출용 시료를 공급함으로써, 기울기를 형성시켜 액체 크로마토그래피로부터 분리되는 성분을 조절하고, 분석시간을 단축하도록 구성할 수 있으며, 아세토니트릴의 농도를 5 내지 80%의 범위로 조절할 수 있다.
또한, 질량 분석법은 전자분무 이온화법(ESI-MS/MS)을 사용하는 것이 바람직하며, 전자분무 이온화법은 액체 크로마토그래피법에 의해 분리된 성분이 용액 상에서 이온화 시켜 분무하기 때문에 분자 그대로의 정보를 얻음과 동시에 조각 이온들이 많이 생성되지 않고, 열에 불안정한 물질이나 분자량이 큰 물질들도 이온화가 가능하여 안정적으로 사용될 수 있다. 상기 질량 분석법은 액체 크로마토그래피법에 의해 분리된 성분을 각각의 성분을 전자분무하고 이온화시킨 후, 질량-대-전하 비율(m/z)과 표준 물질과의 조합을 통해 첫 번째 스캐닝에서 어미이온을 검출하고, 충돌유도해리(collision induced dissociation) 등과 같은 단편화(fragmentation)를 통해 두 번째 스캐닝에서 상기 어미이온의 딸이온(product ion or fragment ion)을 검출하는 분자 계산(spectral counting)이나 신호 세기(signal intensity)를 이용한 비표지 정량 분석방법(label free method)으로 모유 시료에 포함된 단백질, 지질, 탄수화물 등 각종 성분의 분자량 및 구조를 순차적으로 산출할 수 있다.
이때, LC-ESI-MS/MS로 분석되어 정성되어진 결과를 비동위원소(label-free)정량분석법으로 정량분석하기 위해서는 검출용 시료에 포함된 각종 성분의 정확한 분자량과 액체크로마토그래피를 통해 각종 성분들이 분리되어 나오는 시간의 재현성이 중요하며, 이를 산출하기 위해, 질량분석기에 잠김 분무(lock spray) 방식을 장착하여 액체 크로마토그래피에서 분리되어 질량분석기로 들어가는 전자 분무된 이온들을 주기적으로 막고 분자량을 정확하게 알고 있는 표준 물질이 분무되도록 하여 분석이 끝난 후, 각종 성분의 분자량 값을 보다 정확하게 보정하여 각종 성분에 대한 신뢰도를 높여주어 재현성있는 결과를 얻도록 구성할 수 있다.
나아가, 보다 재현성 있는 결과를 바탕으로 모유 시료를 정량분석하기 위해 복수 개의 검출용 시료를 이용한 각종 성분의 ESI-MS/MS 분석은 모두 1회 이상 수행하는 것이 바람직하다.
이를 위해, 본 단계에서는 상기 질량분석법은 검출용 시료에 포함된 단백질, 지질, 탄수화물을 액체 크로마토그래피를 통해 분자량 또는 전하별로 별도로 분리하여 공급하는 시료주입부(inlet system), 레이저, 고속원자 충격 또는 플라즈마 등으로 검출용 시료에 포함된 성분을 이온화시키는 이온화부(ion source), 물질을 비전하에 값에 따라 분리시키는 질량분리부(mass analyzer or mass filter), 이온을 검출하는 검출부(detector) 및 검출된 이온들의 질량값을 계산하는 모유 성분 분석부 등을 포함하는 질량분석 시스템(mass spectrometer)을 이용하여 검출용 시료에 포함된 단백질, 지질, 탄수화물 등의 각종 모유 성분의 전하량/질량 비(e/m, 비전하, specific charge)를 측정하여 물질의 질량을 분석할 수 있다.
이때, 상기 시료주입부의 액체 크로마토그래피는 고분해능을 나타내는 역상의 컬럼을 사용할 수 있으며, 빠른 분리속도와 높은 분리 분해능을 가지는 융합 실리카 모세 혈관 컬럼(fused-silica capillary column)을 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 상기 단계 (c)에서는, 지질을 포함하는 상기 검출용 시료를 이용하여 지질 성분을 측정한 후, 상기 모유 시료에 포함된 유해물질을 측정하는 단계를 추가로 포함하도록 구성할 수 있다.
이때, 상기 유해물질은 파라벤(paraben), 폴리염화비페닐(polychlorinated biphenyl), 과불화화합물(perfluorinated compounds) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 것일 수 있으며, 체내 잔류하는 오염물질로 알려진 다양한 성분을 추가로 분석할 수 있다.
일반적으로, 상기한 체내 잔류 오염물질은 지질에 부착하여 체내 존재하며, 본 발명에서는, 상기 체내 잔류 오염물질을 정성 정량분석하기 위해서, 상기 지질시료에 오염물질을 검출할 수 있는 표준 물질을 첨가하고, 상기 검출용 시료를 분석함으로써, 모유 시료에 포함된 각종 오염물질을 정량하여 산모의 건강상태 및 영양 성분을 분석하여, 산모의 건강 증진에 이용할 수 있고, 모유 영양아(breastfed infant)에게 공급되는 모유 수유를 제한시킴으로써, 영아에게 전달되는 오염물질의 량을 최소화할 수 있다.
상기와 같은 방법을 이용하면, 종래에 중적외선을 이용한 모유분석기와 비교할 때, 모유 시료에 포함된 각종 단백질, 지질 또는 탄수화물 등의 영양성분을 다차원으로 고감도의 분석을 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 모유 시료에 포함된 각종 잔류 오염물질을 검출가능하여 모유에 포함된 성분에 관한 신뢰성있는 성분 정보를 제공할 수 있다. 나아가, 상기 방법을 통해, 모유의 단백체(proteomics), 지질체(lipidomics), 오믹스(omics) 등의 분석에 효과적으로 활용이 가능하다.
상기 단계 (d)는 상기 단계 (c)에서 산출한 성분 정보를 표준화된 모유의 성분 정보와 비교하는 단계이다.
상기한 바와 같이 하여, 분석된 모유 시료의 성분 정보는 다양한 검색 엔진을 통해 정성할 수 있으며, 분석에 사용된 모든 성보의 리스트를 취합하여 포커스 데이터베이스(focused database)를 만들고, 만들어진 포커스 데이타베이스를 바탕으로 단백질, 지질, 탄수화물 또는 미네랄 등의 성분을 정성 및 정량 분석처리할 수 있다. 정성 및 정량 분석된 결과들을 엑셀로 익스포트(export)한 후, 익스포트한 결과를 정리하고, 표준화된 모유의 성분 정보 자료와 분석한 모유 시료의 성분 정보를 비교하여, 수유모의 영양 상태, 건강 상태 등을 등급별로 진단할 수 있다. 또한, 얻어진 성분 정보를 이용하여 수유모의 모유에 필요한 성분을 확인함으로써, 부족한 성분을 모유에 추가로 첨가하여 모유 영양아에 공급되는 모유의 성분을 최적화시킬 수 있으며, 수유모에게 식이 조절, 영양제 섭취 권장 등의 정보를 제공하여, 모유에 불충분한 성분으로 판별된 영양 성분을 보충하도록 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기에 기재된 방법에 의해 성분 분석된 모유의 성분 분석 정보를 이용하여 단백질, 지질 또는 탄수화물 등의 모유에 포함된 불충분한 성분을 보충하여 표준화된 완전체 모유를 제공한다.
상기한 완전체 모유는 모유 영양아에게 공급하기 위한, 필수 영양 성분이 적절한 농도로 포함되어 있어, 모유 영양아의 생육을 효과적으로 촉진시킬 수 있으며, 친모로부터 수득한 모유가 아니어도, 대리 수유모에 의해 공급되는 모유를 효과적으로 섭취가 가능해 모유 영양아의 생육을 효과적으로 촉진시킬 수 있다.
또한, 모유 영양아의 건강, 면역, 체중 등의 인자를 고려하여, 이를 보완할 수 있는 성분을 추가적으로 첨가한 완전체 모유를 제조할 수 있으며, 이를 모유 영양아에게 급여함으로써, 모유 영양아의 발육 및 건강 개선에 기여할 수 있다.
바람직하게는, 상기와 같은 표준화된 모유는 10 내지 22 g/L의 단백질, 15 내지 52 g/L의 지질, 55 내지 80 g/L의 탄수화물을 포함할 뿐만 아니라, 이외에도, 4.0 내지 5.5 mg/mL의 칼슘(Ca), 0.0005 내지 0.0021 mg/mL의 구리(Cu), 0.001 내지 0.007 mg/mL의 철(Fe), 0.18 내지 0.3 mg/mL의 마그네슘(Mg), 0.01 내지 0.1 mg/mL의 망간(Mn), 2 내지 3 mg/mL의 인(P), 1 내지 2 mg/mL의 칼륨(K), 0.5 내지 1 mg/mL의 나트륨(Na) 및 0.3 내지 0.7 mg/mL의 아연(Zn)을 포함하여 모유 영양아에 급여시 모유 영양아의 생육에 올바른 영양분을 공급할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하도록 한다.
제시된 실시예는 본 발명의 구체적인 예시일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
<실시예>
(1) 모유 시료의 채집
수유모는 18세 이상의 직장인 여성으로, 특별한 감염성, 선천성, 유전적 질환이 없었으며, 고위험 임신이 아닌 산모를 대상으로 산부인과 의사의 판단으로 적합한 대상자를 선정하였고, 출산후 45일 경과한 시점의 성숙유를 채유하였다. 모유의 채유는 수유모의 동의을 얻은 후 산부인과 의사가 직접 채유하였으며, 24시간 동안 시간대별로 모유를 4회 착유하고, 착유한 모유 10 mL씩을 혼합하여 저온 보관된 혼합 모유를 균질화처리기(Sonicator)로 균질화처리하였다.
(2) 검출용 시료의 제조
1) 시약 및 분석 장치
본 실시예에서는, 물, 메탄올, 아세토니트릴, 헥세인, 디클로로메탄 등의 용매는 J. T. Baker사(NJ, USA)의 HPLC 등급 시약을 사용하였으며, 클로로포름 및 포름산(formic acids)은 Fluka사(Seelze, Germany)의 시약을 사용하였다. 또한, 모세관 펌프 시스템(1200 series capillary pump system)(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)과 나노-전자분무이온화 소스(nano-electrospray ionization source)를 갖춘 텐뎀질량분석기(Agilent사, Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다. 또한, 검출용 시료의 제조시간을 단축하기 위해서, 시료에 초음파를 조사하여 균질한 혼합 시료를 제조할 수 있도록 초음파발생기(Ultrasonicator VCX-750, Sonics Inc.)를 검출용 시료 제조에 사용하였다.
나노유속 액체크로마토그래피를 위하여 외경(o.d.)이 360 μm이고, 내경(i.d.)이 각각 20, 50, 75 μm인 역상 실리카 모세관[silica capillary tubes, (Polymicro Technology LLC, Phoenix, AZ, USA)]을 사용하였다. 또한, 모세관(capillary tube)의 한쪽 끝을 불꽃으로 달군 후 늘어뜨려 이미터(emitter)를 만든 후, 모세 컬럼(100 μm i.d. × 500 μm o.d., 100 μm i.d. × 365 μm o.d. 또는 250 μm i.d. × 365 μm o.d.)에 C18, 3 μm-100Å(SPEC PLUS PT C18)를 충진하여 복수 개의 분석컬럼을 제작하였고, 검출용 시료에 포함된 각종 성분을 전하(charge) 별로 분획화하는 강한 양이온 교환(strong cation exchange, SCX)과 역상 컬럼을 이용한 방법을 통해 각각의 검출용 시료를 분석하였다. 그리고, 컬럼 패킹을 위한 구성 및 기울기 용리(gradient elution)를 위해 아세토니트릴의 농도가 낮은 검출용 시료와 높은 농도의 검출용 시료를 제조하여 기울기 용리(gradient elution)에 사용하였다.
2) 단백질 검출용 시료의 제조
균질화처리된 모유 시료 5 mL을 튜브에 주입하고, 10,000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액에 TCA(trichloroacetic acid)를 20 부피%가 되도록 첨가하여 TCA-모유 반응물을 제조하고 4 ℃의 온도 조건에서 초음파를 조사하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 TCA-모유 반응물을 20,000 rpm의 속도로 30분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하였으며, 수득한 상등액에 8M의 우레아(urea) 및 트리스-염산(Tris-HCl buffer, pH 8.5)을 첨가하여 단백질 추출물을 제조하였다.
단백질 추출물에 5mM의 TCEP[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 반응시켜 단백질 추출물을 환원시키고, 환원이 완료된 단백질 추출물에 10mM의 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 반응시켜 카바미도메틸화를 유도하였다. 카바미도메틸화 유도가 완료된 단백질 추출물에 2 내지 8M의 우레아와 1M 트리스 버퍼 및 2mM의 염화칼슘을 첨가한 후, 5 μg의 트립신을 첨가하여 단백질을 가수분해하고 질소농축기를 이용하여 농축하여 단백질 검출용 시료를 농축하였다.
3) 지질 검출용 시료의 제조
균질화처리된 모유 시료 5 mL을 튜브에 주입하고, 동결건조하여 침전물을 제조하였다. 제조한 침전물에 클로로포름 및 메탄올이 2:1의 비율로 혼합한 용매를 5mL을 첨가한 후, 20분 동안 와류교반하였으며, 교반이 완료된 후, 멸균수를 첨가한 후 와류교반을 수행하였다. 10,000 rpm의 속도로 10분 동안 원심분리하여 유기용매 층과 수용액 층으로 각각 분리하고, 유기용매층을 취한 후에 원심건조기에서 건조하였다. 건조가 완료된 분말에 클로로포름 및 메탄올을 1:1의 중량비로 혼합하고, HPLC 등급의 표준물질을 첨가하여 지질 검출용 시료를 제조하였다.
4) 탄수화물 검출용 시료의 제조
균질화처리된 모유 시료 5 mL을 튜브에 주입하고, 모유 시료에 차가운 아세톤 및 클로로포름을 9:4의 중량비로 포함하는 혼합용액과 1M의 질산을 순차적으로 첨가한 후, 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 단백질 및 지질을 침전시키고, 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액을 10,000 Mw 분자량을 배제하는 폴리설폰 나노여과막을 이용하여 상등액을 여과하고, 여과한 상등액에 방사선 동위원소인 세슘(Cs)을 첨가하여 탄수화물을 포함하는 검출용 시료를 제조하였다.
(3) 검출용 시료를 이용한 모유의 성분 분석
검출용 시료의 성분 분석을 위해서, 검출용 시료의 이동상으로는 0.1% 포름산이 포함된 물(A), 아세토니트릴(B) 및 포름산 암모늄과 아세토니트릴의 혼합용매(C)를 혼합하여 사용하였다. 아세토니트릴의 농도를 5 내지 50%로 선형적으로 변화시킨 기울기 용매로 검출용 시료를 제조하고, 이와 같은 복수 개의 검출용 시료를 별도로 구비된 컬럼에 공급하여 액체 크로마토그래피 분리를 수행하였고, 단백질, 지질, 탄수화물의 분석을 위해 각기 다른 크기의 실리카 충진체가 충진된 별도의 컬럼을 각각 이용하여 액체 크로마토그래피를 수행하였다. 액체 크로마토그래피는, 먼저, 50% 농도의 아세토니트릴을 포함하는 용매를 컬럼에 공급하여 컬럼을 활성화시킨 후, 5% 농도의 아세토니트릴을 포함하는 용매를 공급하여 평형을 유지시켰다. 이후, 5% 농도의 아세토니트릴을 포함하는 검출용 시료를 복수 개의 컬럼에 공급하여 복수개의 검출용 시료에 포함된 각종 성분을 분리하였으며, 5 내지 50%의 농도 범위로 아세토니트릴의 농도가 높은 검출용 시료를 공급하였다. 이때, 이동상의 유속은 0.1 mL/분이었으며 각각의 검출용 시료의 주입량은 10 μL이었다.
분리가 완료된 컬럼을 5% 농도의 아세토니트릴을 포함하는 용매로 세척한 후, 95% 농도의 아세토니트릴 및 0.5% 농도의 아세트산을 포함하는 혼합용매로 탈염처리하여 MS/MS 질량 분석을 수행하였다.
모유의 성분 검출을 위한 MS/MS 분석조건은, 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI) 방식을 통한 양이온(+) 모드에서 MRM(multiple reaction monitoring) 방법을 사용하였다. 모세관 전압(Capillary voltage)은 1 내지 10 kV, 분무기체(질소)의 온도는 350 ℃, 유량은 0.1 mL/분으로 설정하였다.
또한, 검출한계, 정량한계, 회수율 및 검정곡선 실험방법 분석 방법에 대한 유효성 검증을 위해서 검출한계, 정량한계 및 회수율을 결정하고, 검정곡선을 작성하였다. 검출한계(Limit of Detection, LOD)와 정량한계(Limit of Quantitation, LOQ)는 확립된 분석방법으로 시료를 추출하여 LC/ESI-MS/MS로 분석하였다. 분석과정에서 신호대 잡음비(S/N ratio)가 3일 때의 대략적인 농도를 추정한 후, 농도가 검출한계의 1 내지 5배 사이에 드는 검출용 시료(n≥7)를 준비하여 측정한 결과로 표준편차 값(σ)를 계산하고, 선형검정곡선을 작성하여 기울기(m)값을 측정한 후 검출한계(LOD)는 3σ/m, 정량한계(LOQ)는 10σ/m로 설정하였다. 검정곡선(calibration curve)은 미지 양에 대한 감응을 해석할 수 있도록 표준물질에 대한 감응으로 평가하였으며, 피크 면적비로 검정곡선을 작성하고, 직선식과 상관계수(r2)를 산출하였다.
상기와 같이 제조된 각각의 검출용 시료를 이용하여 모유 시료에 포함된 단백질, 지질, 탄수화물 등의 성분 정보를 분석하였으며, 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타난 바와 같이, 모유 시료에 포함된 단백질, 탄수화물, 지질의 함량은 적정수준을 유지하는 것을 확인할 수 있었으나, 페놀 화합물인 비스페놀 A(BPA)의 함량이 다소 높은 것으로 확인되었으나, 모유 시료에는 페놀 화합물을 고농도로 함유하지는 않아, 모유 영양아에 제공시에도 무방할 것으로 예측되었다.
상기한 바와 같은 본 발명에 따른 다차원 모유 분석방법은, 모유 시료에 포함된 단백질, 탄수화물 또는 지질 등의 영양 성분을 검출할 수 있는 복수 개의 검출용 시료를 준비하고, 액체 크로마토그래피와 전기분무 이온화 질량 분광분석을 연속적으로 진행함으로써, 모유에 포함된 각종 성분을 고감도로 분석할 수 있어, 모유에 포함된 각종 성분에 대한 신뢰성 있는 분석 결과를 산출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
Claims (7)
- (a) 18세 이상 여성의 출산 후 45일 이후의 성숙유인 모유 시료를 채집하는 단계;
(b) 상기 모유 시료를 이용하여 단백질 검출용 시료, 지질 검출용 시료, 및 탄수화물 검출용 시료를 제조하는 단계로서,
상기 단백질 검출용 시료는 모유 시료를 원심분리하여 얻은 상등액에 TCA(trichloroacetic acid)를 첨가하여 TCA-모유 반응물을 제조하고, 4 ℃의 온도 조건에서 초음파를 조사하여 1시간 동안 반응시킨 후 원심분리하여 상등액을 수득하고, 수득한 상등액에 우레아(urea) 및 트리스-염산(Tris-HCl buffer, pH 8.5)을 첨가하여 단백질 추출물을 얻고, 얻어진 단백질 추출물에 5 mM의 TCEP[Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]를 첨가하여 실온에서 반응시켜 단백질 추출물을 환원시키고, 환원이 완료된 단백질 추출물에 10 mM의 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 첨가한 후 실온에서 반응시켜 카바미도메틸화를 유도하고, 카바미도메틸화 유도가 완료된 단백질 추출물에 2 내지 8 M의 우레아와 1 M 트리스 버퍼 및 2 mM의 염화칼슘을 첨가한 후, 트립신을 첨가하여 단백질을 가수분해하고 질소농축기를 이용하여 농축하여 얻은 것이고,
상기 지질 검출용 시료는 모유 시료를 동결건조하여 침전물을 제조하고, 제조한 침전물에 클로로포름 및 메탄올이 2:1의 비율로 혼합된 용매를 첨가한 후, 20분 동안 와류교반하고 멸균수를 첨가한 후 추가로 와류교반을 수행한 다음, 원심분리하여 유기용매 층과 수용액 층으로 분리하고, 유기용매층을 취하여 원심건조기에서 건조한 후, 건조가 완료된 분말에 클로로포름 및 메탄올의 혼합물(1:1 중량비)을 추가하여 얻은 것이고,
상기 탄수화물 검출용 시료는 모유 시료에 아세톤 및 클로로포름을 9:4의 중량비로 포함하는 혼합용액과 1M의 질산을 순차적으로 첨가한 후, 원심분리하여 단백질 및 지질을 침전시키고 상등액을 수득한 다음, 수득한 상등액을 10,000 Mw 분자량을 배제하는 폴리설폰 나노여과막을 이용하여 상등액을 여과하고, 여과한 상등액에 방사선 동위원소인 세슘(Cs)을 첨가하여 얻은 것을 특징으로 하는 단계;
(c) 상기 검출용 시료를 융합 실리카 모세 혈관 칼럼(fused-silica capillary column)을 이용한 액체 크로마토그래피법으로 분리하고, 분리된 성분을 질량 분석법으로 분석하여 상기 모유 시료의 단백질, 면역글로불린, 지질 및 탄수화물을 포함하는 성분 정보를 산출하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)에서 산출한 성분 정보를 표준화된 모유의 성분 정보와 비교하는 단계;를 포함하고,
산출한 성분 정보 중 부족분을 보충하여 10 내지 22 g/L의 단백질, 15 내지 52 g/L의 지질, 55 내지 80 g/L의 탄수화물, 4.0 내지 5.5 mg/mL의 칼슘(Ca), 0.0005 내지 0.0021 mg/mL의 구리(Cu), 0.001 내지 0.007 mg/mL의 철(Fe), 0.18 내지 0.3 mg/mL의 마그네슘(Mg), 0.01 내지 0.1 mg/mL의 망간(Mn), 2 내지 3 mg/mL의 인(P), 1 내지 2 mg/mL의 칼륨(K), 0.5 내지 1 mg/mL의 나트륨(Na) 및 0.3 내지 0.7 mg/mL의 아연(Zn)을 포함하는 표준화된 모유를 제공하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다차원 모유 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 모유 시료는 12 내지 48 시간 동안 수유모가 배출하는 모유를 채집한 것을 특징으로 하는 다차원 모유 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 단백질 검출용 시료, 지질 검출용 시료, 및 탄수화물 검출용 시료는 상기 모유 시료에 포함된 성분을 구분할 수 있는 표준 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다차원 모유 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (c)에서는, 상기 모유 시료에 포함된 유해물질의 성분 정보를 산출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다차원 모유 분석 방법. - 제4항에 있어서,
상기 유해물질은 파라벤(paraben), 폴리염화비페닐(polychlorinated biphenyl), 과불화화합물(perfluorinated compounds)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 다차원 모유 분석 방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (d)에서는, 산출한 성분 정보를 표준화된 모유의 성분 정보와 비교한 후, 비교한 모유 성분 정보로 산모 건강상태를 나타내는 등급을 부여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 다차원 모유 분석 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 성분 분석된 모유에 산출한 성분 정보 중 부족분을 혼합하여 제조한 표준화된 모유.
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