CN116106231A - 一种多维度评价样品与母乳相似度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多维度评价样品与母乳相似度的方法，所述方法按下述步骤进行：（1）建立本地母乳磷脂数据库；（2）采集待评价样品，预处理；（3）测定待评价样品中特征磷脂亚类的含量、特征磷脂分子的含量，并通过激光共聚焦法获得样品中乳脂肪球的微观结构图；（4）计算得到该待测样品的评分G。本发明从特征磷脂亚类组成、特征磷脂分子组成以及形态学相似度评价三个方面入手，多维度评价样品与母乳磷脂的相似性，使该方案可以更好的评价婴幼儿配方乳粉及其原辅料磷脂对于母乳的模拟质量。

Description

一种多维度评价样品与母乳相似度的方法
技术领域
本发明涉及乳制品评价领域，特别涉及一种多维度评价样品与母乳相似度的方法。
背景技术
母乳富含婴儿生长发育所必需的脂类、必需蛋白质、低聚糖以及免疫调节和代谢因子，也自然地反映了新生儿在营养方面的发育需求，对婴儿的短期和长期发育至关重要。鉴于此，母乳被认为是婴幼儿配方粉开发的金标准。此外，由于越来越多的研究证据表明，早期饮食摄入对婴儿的短期和长期健康有重大影响，因此婴儿配方奶粉在现代社会受到越来越多的关注。磷脂是乳脂肪球膜（MFGM）营养特性的主要支撑，约占MFGM成分的25%。磷脂是一个庞大的家族，根据不同的头基和骨架可分为甘油磷脂和鞘脂，其中甘油磷脂包括磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰甘油（phosphatidylglyCerol，PG）和磷脂酸（phosphatidic acid，PA），鞘脂包括鞘磷脂（sphingomyelin，SM）和神经酰胺（Ceramides，Cer）；根据脂肪酰链的差异又可分为不同的分子种。
磷脂对婴幼儿健康成长有诸多益处，如促进婴幼儿的神经系统和认知发育、调节胃肠道脂代谢、调节细胞间信号传递、构建更有效的脂肪球结构、同时保证乳浊液的稳定性等。这些特征与磷脂头基、骨架和脂肪酰链组成及磷脂含量密切相关。母乳中磷脂组成及含量受膳食、哺乳期、基因和区域影响，而婴幼儿配方奶粉磷脂组成及含量主要受磷脂相关补充剂及加工工艺影响。
纵观婴幼儿配方粉脂质发展史，婴幼儿配方粉在模拟母乳脂质时主要围绕植物油的应用、结构脂类的模拟和功能性脂肪酸的补充，即在甘油酸的组成、含量和结构上实现更紧密的匹配。然而，随着母乳脂肪球膜结构的详细特征被逐步推断出来和磷脂的重要功效价值得到验证，关于母乳磷脂的模拟才逐渐被重视。然而，针对婴幼儿配方粉中磷脂模拟相似度的评估方法却鲜有报道。在中国，绝大多数婴儿配方奶粉都是以鲜奶或乳粉为基础，而脂质部分是由乳汁或者乳粉中的脂肪、植物油和母乳替代酯结合来模拟母乳脂质。配方粉加工所用原、辅料直接决定了配方粉中磷脂的组成和含量，然而针对原辅料脂质与母乳相似度评估方法未见报道。
目前，针对婴幼儿配方粉及其原辅料脂质的评估多数采用色谱、质谱等检测其数据，比较分析，说明婴幼儿配方粉、原辅料以及母乳替代酯与母乳脂质的差距。先前评价技术多在脂肪酸水平或脂质亚类水平亦或某种甘油酯水平上进行评估比较，未考虑磷脂的组成、含量和存在形式对婴幼儿配方乳粉的影响，且未考虑不同种类磷脂权重问题。
因鉴于此，特提出此发明。
发明内容
本发明旨在提供一种以母乳为金标准，全面细化且多维度评价乳制品类样品或脂类样品与母乳相似度的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种多维度评价样品与母乳相似度的方法，所述方法按下述步骤进行：
（1）建立本地母乳磷脂数据库；
（2）采集待评价样品，预处理；
（3）测定待评价样品中特征磷脂亚类的含量、特征磷脂分子的含量，并通过激光共聚焦法获得样品中乳脂肪球的微观结构图；
（4）按下述公式计算该待测样品的评分G：
G=Gs+Gm+Gp；
其中Gs=100-Σ（100××）；
式中，Hih/l=；
Hi为母乳中特征磷脂亚类i的含量，Ht为母乳的磷脂总含量，Ai为样品中特征磷脂亚类i的含量；
Gm=Ri×{100-Σ（100××）}；
式中，Hnh/l=；
Ri为磷脂的校正系数，即样品中与母乳中共同种类的特征磷脂分子含量占比之和，Hn为母乳中特征磷脂分子n的含量，Ht为母乳的磷脂总含量，An为样品中特征磷脂分子n的含量；
Gp为样品乳脂肪球的微观结构图与母乳乳脂肪球的微观结构图的相似度模糊评价得分。
优选或可选地，步骤（2）中，所述预处理按下述步骤进行：
将内标用复溶液稀释至与母乳浓度一致，向样品中添加内标，后加入超纯水，甲醇和二氯甲烷混合后，再添加超纯水和二氯甲烷，离心，分离有机相和水相，向有机相中加入超纯水、甲醇和二氯甲烷，混匀后离心，分离有机相和水相，合并两次的水相，添加二氯甲烷，混合离心，分离有机相和水相；合并后两次离心的有机相，氮吹吹干，吹干后用复溶液复溶，得到待萃取样品，并过固相萃取柱得到极性脂质分离液。
优选或可选地，预处理中使用的复溶液为含5-20mM醋酸铵的甲醇-二氯甲烷溶液，且复溶液中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:1-2。
优选或可选地，复溶液为含10mM醋酸铵的甲醇-二氯甲烷溶液，且复溶液中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:1。
优选或可选地，所述内标为PC17:0-14:1、PE17:0-14:1、SM d18:1-17:0、PI17:0-14:1、PG17:0-14:1、Cer d18:2-24:0的标准品，所述内标在添加后的终浓度为0.1-0.8mg/L。
优选或可选地，所述过固相萃取柱的操作为，将待萃取样品加入到经正己烷活化的硅胶柱中，静置吸附，然后先加入以8:2体积比配置的正己烷/二乙醚混合液洗脱，后加入以1:1体积比配置的正己烷/二乙醚混合液洗脱，合并并弃去洗脱液，然后依次加入甲醇和以3:5:2体积比配置的二氯甲烷/甲醇/水混合液，收集洗脱液，氮吹吹干并用复溶液溶解即得极性脂质分离液。
优选或可选地，步骤（3）中，测定特征磷脂亚类和特征磷脂分子含量的方法为超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱。
优选或可选地，所述超高效液相色谱的方法为：进样量为2μL，流速0.8mL/min，柱温30℃；流动相A为5mM乙酸铵的水/甲醇/乙腈(1:1:1,v/v/v)溶液，流动相B为5mM乙醇铵的异丙醇溶液；洗脱梯度为：
磷脂(Time,min) 0.0 1.0 10.0 15.0 20.0
A 50% 2% 2% 50% 50%
B 50% 98% 98% 50% 50%
。
优选或可选地，所述四极杆飞行时间质谱的条件为：在正、负极条件下，离子源喷雾电压为5500V和-4500V，离子源气体压力60psi，离子源温度650℃，气帘气压强35psi，去簇电压80V和-80V，碰撞能量10V和-10V，扫描范围50-1300Da。
优选或可选地，步骤（3）中，所述特征磷脂亚类包括PE、PC、PI、PS、PA、PG、SM、CER。
优选或可选地，步骤（3）中，所述特征磷脂分子包括SM42:2:2、PE36:2、SM40:1;2、PC36:2、PE36:1、SM38:1;2、SM36:1;2、SM34:1;2、SM42:1;2、PC34:1、PC34:2、PE34:1、PI36:2、PE38:4、PS36:2、PE36:3、PC34:0、LPE18:0、PE38:1、PI38:4、PE34:2、Cer42:2;2、SM40:2;2、PC36:3、PE34:0、PE38:3、PE40:6、PS36:1、PE38:2、PE40:4、PE32:1、SM40:0;2、PC36:1、PC38:4、PS36:0、PE40:5、Cer40:2;2、PC32:0、PE32:0、SM36:0;2、SM32:1;2、PI36:1、SM38:0;2、PI38:3、PI34:1、PC36:4、SM42:1;3、LPE16:0、PE40:1、LPE18:2、PE40:2、PE38:5、PE36:4、PE34:3、PE36:0、PI34:0、SM42:0;3、LPE18:1、LPI18:0、SM42:0;2、Cer38:0;3、SM38:2;2、PI36:3。
优选或可选地，步骤（3）中微观结构图包括尼罗红染色图和Rd-DOPE染色图。
本发明从特征磷脂亚类组成、特征磷脂分子组成以及形态学相似度评价三个方面入手，多维度评价样品与母乳磷脂的相似性，使该方案可以更好的评价婴幼儿配方乳粉及其原辅料磷脂对于母乳的模拟质量。
附图说明
图1为实施例2中母乳标准品BF组以及普通型配方粉FF1组和添加磷脂的改进型配方粉FF2组的尼罗红染色图和Rd-DOPE染色图；
图2为实施例3中不同喂养方式仔猪肠道形态学组织切片；
图3为实施例3中不同喂养方式仔猪肠道形态学指标图；
图4为实施例3中不同喂养方式仔猪肠道形态学指标图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供了一种本地母乳数据库的建立方法。
选取来自北京、唐山、浏阳、洛阳的61位健康产妇，各产妇的相关身体指标均正常，且婴儿均为足月生产。
从上述的61位健康产妇中跟踪收集0-6个月的母乳样品共233份，并同时记录各母乳样品对应婴儿发育状况。
样品在进入色谱和质谱前需先进行预处理，预处理的具体方法为：用复溶液将标准品稀释至与母乳相似浓度，复溶液为含10mM醋酸铵的甲醇:二氯甲烷(1:1,v/v)溶液。将20μL 9.64mg/L PE14:1-17:0、20μL 10.38mg/L PC14:1-17:0、20μL 10.00 mg/L SM d18:1-17:0、8μL10.22 mg/L PI14:1-17:0、4μL 9.81 mg/L PG14:1-17:0和4μL 10.00 mg/LCer d18:2-24:0标准品作为内标加入到200μL待评价样品中，先加入200μL超纯水、2mL甲醇、900μL二氯甲烷，混匀，然后加入200μL超纯水、900μL二氯甲烷，混匀并在6000rpm下离心15min，分离有机相和水相。有机相中加入1mL超纯水、2.2mL甲醇和600μL二氯甲烷，混合液3000×g离心10min，分离有机相和水相。合并水相与1.8mL二氯甲烷混合，6000rpm离心15分钟，分离并合并有机相。氮气吹干有机相，用1mL复溶液复溶，得到待萃取样品。
将1mL待萃取样品倒入到已通过3mL正己烷活化并弃去洗脱液的硅胶柱（ProElutSilica (1g/6mL CAT NO:63006)）中，静置5min进行吸附，吸附完成后，先依次加入3mL正己烷/二乙醚(8:2,v/v)和3mL正己烷/二乙醚(1:1,v/v)混合液，并弃去洗脱液，然后再依次加入4mL甲醇、2mL甲醇和2mL二氯甲烷/甲醇/水(3:5:2,v/v/v)混合液，收集合并洗脱液，氮气吹干后，用200μL复溶液复溶，得到用于后续分析的极性脂质分离液。
采用超高效液相色谱/四极杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)法及配备ESI电喷雾离子源和Pearkview2.2和MSDIAL3.20数据处理系统对上述的母乳样品中的甘油酯种类及含量进行测定。
具体的色谱条件为：色谱柱采用Kinetex公司的Phenomenex2.6μm C18 100Å150×4.6mm，进样量为2μL，流速0.8mL/min，柱温30℃；
流动相A为5mM乙酸铵的水/甲醇/乙腈(1:1:1,v/v/v)溶液，流动相B为5mM乙醇铵的异丙醇溶液；
洗脱梯度如表1所示：表1色谱洗脱梯度表
时间（分钟） 0.0 1.0 10.0 15.0 20.0
A 50% 2% 2% 50% 50%
B 50% 98% 98% 50% 50%
。
所述四极杆飞行时间质谱的条件为：在正、负极条件下，离子源喷雾电压5500和-4500V，离子源气体压力60psi，离子源温度650℃，气帘气压强35psi，去簇电压80和-80V，碰撞能量10和-10V，扫描范围50-1300Da。
以上述的233份母乳样品取等体积混合后制备的样品作为母乳标准品，采用上述的色谱和质谱方法进行分析，共测得8个特征磷脂亚类和63种主要特征磷脂分子，结果如表2和表3所示。
表2实施例1中母乳样品8个特征磷脂亚类含量结果表：
特征磷脂亚类 权重（%）
PE 31.61
PC 17.28
PI 4.49
PS 3.10
PA 0.45
PG 0.19
SM 40.91
CER 1.98
。
表3实施例1中母乳样品中特征磷脂分子含量结果表：
特征磷脂分子 权重（%）
SM42:2;2 10.31
PE36:2 9.83
SM40:1;2 9.73
PC36:2 7.91
PE36:1 6.13
SM38:1;2 5.49
SM36:1;2 4.41
SM34:1;2 4.19
SM42:1;2 3.67
PC34:1 3.17
PC34:2 2.49
PE34:1 2.13
PI36:2 2.05
PE38:4 1.89
PS36:2 1.73
PE36:3 1.61
PC34:0 1.41
LPE18:0 1.24
PE38:1 1.18
PI38:4 1.11
PE34:2 1.08
Cer42:2;2 0.99
SM40:2;2 0.83
PC36:3 0.79
PE34:0 0.71
PE38:3 0.66
PE40:6 0.65
PS36:1 0.64
PE38:2 0.58
PE40:4 0.52
PE32:1 0.49
SM40:0;2 0.44
PC36:1 0.44
PC38:4 0.39
PS36:0 0.38
PE40:5 0.38
Cer40:2;2 0.35
PC32:0 0.34
PE32:0 0.32
SM36:0;2 0.31
SM32:1;2 0.30
PI36:1 0.30
SM38:0;2 0.27
PI38:3 0.26
PI34:1 0.23
PC36:4 0.22
SM42:1;3 0.22
LPE16:0 0.21
PE40:1 0.21
LPE18:2 0.20
PE40:2 0.19
PE38:5 0.19
PE36:4 0.17
PE34:3 0.16
PE36:0 0.15
PI34:0 0.14
SM42:0;3 0.13
LPE18:1 0.13
LPI18:0 0.11
SM42:0;2 0.11
Cer38:0;3 0.11
SM38:2;2 0.11
PI36:3 0.10
其他 2.79
。
需要注意的是，表3中其他项为除上述的63种特征磷脂分子外的其他磷脂分子的含量总和，如PC36:4、PE40:3、PG36:2、PS38:5，本实施例中不完全列出。
即后续的对其他乳类样品的分析均以上述的母乳标准品的特征磷脂亚类和特征磷脂分子含量作为评价基准。
但是应当注意的是，由于各地饮食习惯和生活习惯的差异，不同地域的健康产妇的母乳中的磷脂成分和含量是不同的，因此，对于本领域技术人员而言，母乳样品的来源可根据实际需要进行选择，对应的，以母乳样品制备的母乳标准品的特征磷脂亚类和特征磷脂分子的测定结果也会随之变化。
而对于获得样品中乳脂肪球的微观结构图的方法，本实施例中使用的是激光共聚焦法（CLSM）。具体方法为，将尼罗红（NR）用乙醇溶解，配置成浓度为42mg/L的NR染液；将N-(lissamine rhodamine B sulfonyl)dioleoyl-phosphatidyl-ethanolamine(Rd-DOPE)用氯仿溶解，配置成浓度为1g/L的Rd-DOPE染液。其中，NR染液用于标记样品中的中性脂质，Rd-DOPE染液用于标记样品中的磷脂。
取100μL未经预处理的样品，分别向其中加入10μL NR染液或2μL Rd-DOPE染液，在室温下孵育30min，取10μL混合物移于载玻片，使用共聚焦显微镜进行观察，获得样品中乳脂肪球的微观结构图。
实施例2
以实施例1中所述的母乳标准品的特征磷脂亚类含量、特征磷脂分子含量以及样品中乳脂肪球的微观结构图作为评价基准评价各样品的得分。
评分G按照下述的公式进行计算：
G=Gs+Gm+Gp；
其中Gs=100-Σ（100××）；
式中，Hih/l=；
Hi为母乳中特征磷脂亚类i的含量，Ht为母乳的磷脂总含量，Ai为样品中特征磷脂亚类i的含量；
Gm=Ri×{100-Σ（100××）}；
式中，Hnh/l=；
Ri为磷脂的校正系数，即样品中与母乳中共同种类的特征磷脂分子含量占比之和，Hn为母乳中特征磷脂分子n的含量，Ht为母乳的磷脂总含量，An为样品中特征磷脂分子n的含量；
Gp为样品乳脂肪球的微观结构图与母乳乳脂肪球的微观结构图的相似度模糊评价得分。
其中，Ai和An均采用实施例1中与母乳样品相同的方法进行测定。
而相似度模糊评价得分Gp的具体方法为：
分别取在相同分辨率（10μm）下的母乳标准品乳脂肪球被尼罗红和Rd-DOPE染色的照片以及样品的对应照片（如图1所示）。选择10名人员进行相似度评定，对样品照片与作为标准的母乳标准品照片进行形态相似度评价。
评定论域为U=（U1，U2，U3）=（形态，数量，面积）、评语论域V=（V1、V2、V3、V4）=（基本一致，比较近似，有一定区别，区别较大）=（100，80，60，40）、权重向量X=（0.4，0.3，0.3）。根据上述的论域建立评判矩阵，并分别计算各样品的尼罗红和Rd-DOPE染色的照片的对应分数，在加和后乘以加权系数，得到形态相似度部分分数，并入到方案中计算总分。
本发明中模糊数学感官评价分为三步：
（1）统计评定论域的感官评价结果并建立评定关系矩阵Ci=(Ci1 Ci2 Ci3 Ci4)和模糊评判矩阵。根据照片，10名人员进行相似度评定，并统计对乳脂肪球形态、数量和面积的评价统计结果，以添加磷脂的改进型配方粉为例：
C形态=(0.1 0.2 0.5 0.2)，
式中：i表示形态，数量，面积
（2）评定结果向量Bk=(Bk1 Bk2 Bk3 Bk4)= X×C = (X1 X2 X3)C，即
；
（3）综合评分Gp=V×Bk T=(V1 V2 V3 V4)(Bk1 Bk2 Bk3 Bk4)T，即
；
其中乳脂肪球形态、数量和面积的权重是选取强制评分法、环比评分法和统计学评分法三种方法评分结果的平均数作为最终的权重。
根据上述方法计算作为示例的添加磷脂的改进型配方粉和普通婴幼儿配方粉的评分如下表所示。
其中，添加磷脂的改进型配方粉来源于市售某品牌添加MFGM的1段奶粉，普通婴幼儿配方粉来源于市售某品牌未添加MFGM的1段奶粉。
表4各样品评价得分表：
乳类样品 得分（G）
添加磷脂的改进型配方粉 149.93
普通婴幼儿配方粉 121.34
。
但是应当注意的是，本实施例中虽然仅以上述的两种配方粉作为示例进行了相关评价，但是本发明所述的方法不仅适用于配方粉的评价，也适用于作为原辅料的脂类原料、以及各种乳类产品及制品的评价。
实施例3
本实施例针对实际的样品采用实施例2中所述的方法进行评分，并从营养学角度对该评分进行验证。
本实施例中的乳类样品选择为实施例2中涉及的普通婴幼儿配方粉（FF1）和添加磷脂的改进型配方粉（FF2）。
采用实施例2中计算得到的FF1和FF2的得分分别为121.34和149.93。
采用动物实验进行营养学验证。选用产龄相似的5头怀孕英系大白二元杂交母猪进行。顺产SPF仔猪（n=20）为SPF母猪自然分娩。选取体重、身长相似的健康仔猪，出生后3天内统一母乳喂养，让仔猪获得足够的母体免疫和营养。实验开始前3天为母乳喂养，然后正式进行喂养实验直至31天。正式实验开始后，将随机分为3组，分别为母乳组（BF组）、FF1组和FF2组。母乳喂养组的仔猪和母猪在同一猪舍中管理，继续进行母乳喂养直至31天断奶；奶粉组饲喂由奶粉和水制成的复原乳，由奶瓶（后期用食槽）饲喂直至31天，期间仔猪同母猪隔离开，用笼具单独进行饲养管理。样本的采集时间为分娩后第31天。
粪便样本的采集方法为：在饲喂的第7天、14天和21天分别收集仔猪的粪便10g左右，迅速冻于液氮，干冰运输，后转入-80℃冰箱低温保存备用。
肠道菌群16S rRNA基因高通量测序。根据试剂盒操作说明，使用QIAamp快速粪便DNA Mini试剂盒（Qiagen，GmbH，Hilden，德国），从100mg粪便样品中提取基因组DNA。然后以10ng DNA为模板，进行PCR扩增V3-V4区域的16S rRNA基因，30μL总反应体系为：15μL高保真PCR反应混合液（New England Biolabs），0.2μM正向和反向引物（314F-805R）。PCR条件包括95℃，3min；30s循环25次：95℃，30秒；30s，55℃，30s，72℃。根据操作说明，使用NEB UltraDNA文库制备试剂盒（NEB，美国）生成测序文库。扩增子测序用PE 2×250bp HiSeq 2500（Illumina，美国）进行。
使用QIIME 1.9.0合并、质量筛选和demultiplex原始下机测序数据。序列进行聚类，并将具有97%的相似性的序列归为操作分类单元(OTU)，然后将OTU序列根据Greengenes16S rRNA基因数据库(Version 13.5)进行物种注释，分类为从门到属的分类级别。下游数据分析使用R语言进行，包括α-多样性，使用Bray-Curtis距离或UniFrac距离进行β-多样性等分析，结果如表5所示。
表5肠道菌群丰度结果表：
表5肠道菌群丰度结果表：
。
由表5可以看出，在门水平，放线杆菌和变形杆菌在母乳喂养仔猪中表现出较高的丰度，其次是添加磷脂的婴幼儿配方粉喂养仔猪，然后是标准配方饲料仔猪（kw.ep<0.05）。但7日间，三组间的菌群无明显差异。属水平7日龄时，两个奶粉组拟杆菌属、嗜胆菌属和乳杆菌属均高于母乳组，梭菌属奶粉组较高，和真杆菌属均为奶粉组高于母乳组；14天，多尔氏菌属、拟杆菌属，梭菌属，脱硫弧菌属，丁酸弧菌属和肠杆菌科未分类属母乳组中较高；链型杆菌属，厌氧弧菌属，柯林斯氏菌属，布雷德菌属和拟杆菌属均在FF2组中较高；两个奶粉组中的粪便杆菌较高，仅粪芽孢杆菌在FF1高；在21天，梭菌，多尔氏菌属、莫氏菌科未分类属、肠球菌属、假支杆菌属、肠杆菌科未分类属在母乳组中显示较高的丰度，添加磷脂的婴幼儿配方粉喂养组仔猪的嗜胆菌属，草酸杆菌属，普氏菌属，脱硫弧菌属较高，而普通婴幼儿配方粉喂养仔猪的粪球菌属和链型杆菌属较高。
在31日饲养完成后，取31日龄仔猪的小肠（十二指肠、空肠和回肠）和大肠（结肠）的组织形态进行测定，测定指标包括肠道组织绒毛高度、绒毛底宽、绒毛中宽、绒毛顶宽、绒毛表面积和隐窝深度，并进行Kruskal-Wallis差异检验。组织切片如图2所示，形态学指标结果如图3-4所示。
由图2-4可知，FF2组的空肠绒毛组织形态和母乳喂养组类似，具体来说，空肠的绒毛高度、绒毛底宽和绒毛表面积均在母乳组显著高于FF1组，同时，在结肠中，FF2组的隐窝深度也和母乳喂养组类似，并显著高于FF1组。
综上所述，经过上述的实验验证，得分较高的FF2组在喂养显著增加了仔猪嗜胆菌，草酸杆菌，普氏菌属，脱硫弧菌属的丰度、以及血清甜菜碱的含量方面均优于得分较低的FF1组，且肠道的发育情况也显著优于FF1组，与母乳组更加接近。
上述结果说明通过在配方粉中添加磷脂类原料，可以使其磷脂的组成与母乳更为接近，使制得的配方粉更有助于新生儿免疫力的提高，可以改善肠道微生物的组成和机体的氨基酸代谢。即本发明提供的多维度评价样品与母乳相似度的方法的结果是可靠而有效的，该方法对于乳制品行业进一步的提供与母乳具备更高相似度的产品有着指导意义。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (12)

1.一种多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，所述方法按下述步骤进行：
（1）建立本地母乳磷脂数据库；
（2）采集待评价样品，预处理；
（3）测定待评价样品中特征磷脂亚类的含量、特征磷脂分子的含量，并通过激光共聚焦法获得样品中乳脂肪球的微观结构图；
（4）按下述公式计算该待测样品的评分G：
G=Gs+Gm+Gp；
其中Gs=100-Σ（100××）；
式中，Hih/l=；
Hi为母乳中特征磷脂亚类i的含量，Ht为母乳的磷脂总含量，Ai为样品中特征磷脂亚类i的含量；
Gm=Ri×{100-Σ（100××）}；
式中，Hnh/l=；
Ri为磷脂的校正系数，即样品中与母乳中共同种类的特征磷脂分子含量占比之和，Hn为母乳中特征磷脂分子n的含量，Ht为母乳的磷脂总含量，An为样品中特征磷脂分子n的含量；
Gp为样品乳脂肪球的微观结构图与母乳乳脂肪球的微观结构图的相似度模糊评价得分。
2.根据权利要求1所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述预处理按下述步骤进行：
将内标用复溶液稀释至与母乳浓度一致，向样品中添加内标，后加入超纯水，甲醇和二氯甲烷混合后，再添加超纯水和二氯甲烷，离心，分离有机相和水相，向有机相中加入超纯水、甲醇和二氯甲烷，混匀后离心，分离有机相和水相，合并两次的水相，添加二氯甲烷，混合离心，分离有机相和水相；合并后两次离心的有机相，氮吹吹干，吹干后用复溶液复溶，得到待萃取样品，并过固相萃取柱得到极性脂质分离液。
3.根据权利要求2所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，预处理中使用的复溶液为含5-20mM醋酸铵的甲醇-二氯甲烷溶液，且复溶液中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:1-2。
4.根据权利要求3所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，复溶液为含10mM醋酸铵的甲醇-二氯甲烷溶液，且复溶液中甲醇与二氯甲烷的体积比为1:1。
5.根据权利要求2所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，所述内标为PC 17:0-14:1、PE 17:0-14:1、SM d18:1-17:0、PI17:0-14:1、PG17:0-14:1、Cer d18:2-24:0的标准品，所述内标在添加后的终浓度为0.1-0.8 mg/L。
6.根据权利要求2所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，所述过固相萃取柱的操作为，将待萃取样品加入到经正己烷活化的硅胶柱中，静置吸附，然后先加入以8:2体积比配置的正己烷/二乙醚混合液洗脱，后加入以1:1体积比配置的正己烷/二乙醚混合液洗脱，合并并弃去洗脱液，然后依次加入甲醇和以3:5:2体积比配置的二氯甲烷/甲醇/水混合液，收集洗脱液，氮吹吹干并用复溶液溶解即得极性脂质分离液。
7.根据权利要求1所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，步骤（3）中，测定特征磷脂亚类和特征磷脂分子含量的方法为超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱。
8.根据权利要求7所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的方法为：进样量为2μL，流速0.8mL/min，柱温30℃；流动相A为5mM乙酸铵的水/甲醇/乙腈(1:1:1, v/v/v)溶液，流动相B为5mM乙醇铵的异丙醇溶液；洗脱梯度为
。
9.根据权利要求7所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，所述四极杆飞行时间质谱的条件为：在正、负极条件下，离子源喷雾电压为5500V和-4500V，离子源气体压力60psi，离子源温度650℃，气帘气压强35psi，去簇电压80V和-80V，碰撞能量10V和-10V，扫描范围50-1300Da。
10.根据权利要求1所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述特征磷脂亚类包括PE、PC、PI、PS、PA、PG、SM、Cer。
11.根据权利要求1所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述特征磷脂分子包括SM42:2;2、PE36:2、SM40:1;2、PC36:2、PE36:1、SM38:1;2、SM36:1;2、SM34:1;2、SM42:1;2、PC34:1、PC34:2、PE34:1、PI36:2、PE38:4、PS36:2、PE36:3、PC34:0、LPE18:0、PE38:1、PI38:4、PE34:2、Cer42:2;2、SM40:2;2、PC36:3、PE34:0、PE38:3、PE40:6、PS36:1、PE38:2、PE40:4、PE32:1、SM40:0;2、PC36:1、PC38:4、PS36:0、PE40:5、Cer40:2;2、PC32:0、PE32:0、SM36:0;2、SM32:1;2、PI36:1、SM38:0;2、PI38:3、PI34:1、PC36:4、SM42:1;3、LPE16:0、PE40:1、LPE18:2、PE40:2、PE38:5、PE36:4、PE34:3、PE36:0、PI34:0、SM42:0;3、LPE18:1、LPI18:0、SM42:0;2、Cer38:0;3、SM38:2;2、PI36:3。
12.根据权利要求1所述的多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，步骤（3）中微观结构图包括尼罗红染色图和Rd-DOPE染色图。
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