CN116850213B - 一种益生菌组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种益生菌组合物及其应用，属于微生态制剂领域。所述益生菌组合物包括以下重量份的组分：动物双歧杆菌0.2‑2.5份、鼠李糖乳杆菌0.2‑5份、水苏糖5‑15份、低聚果糖10‑40份、凝结芽孢杆菌1‑5份、乙酰化双淀粉己二酸酯10‑25份和聚葡萄糖10‑40份。本发明提供的益生菌组合物，通过实验筛选确定了效果最佳的益生菌组合物配方，该益生菌组合物的原料天然健康，无副作用，通过调控肠道菌群平衡，作用于“脑肠轴”进而改善妊娠母代和子代的自闭抑郁等行为障碍问题，这为临床预防和改善抑郁症提供了理论及技术支持。

Description

一种益生菌组合物及其应用

技术领域

本发明涉及微生态制剂领域，特别是涉及一种益生菌组合物及其应用。

背景技术

孤独症谱系障碍(ASD)也称自闭症或广泛性发育障碍，是一组以沟通障碍及社会交往障碍、兴趣狭隘及重复刻板动作等为主要特征的严重神经发育障碍性疾病。ASD是一种多因素疾病，由环境、免疫、遗传和表观遗传因素等相互作用引起，患者常伴发多系统共患疾病，最常见的是胃肠功能紊乱、睡眠问题、癫痫及免疫失调。近年来，ASD的患病率不断增加，2014-2016年美国儿童和青少年ASD患病率估计为2.47％，韩国儿童患病率高达2.64％，保守估计我国目前ASD的患病率为1％，14岁以下患儿约为200万，ASD目前尚无可治愈的方法，给社会、家庭、个人均带来了沉重的负担。

儿童出生前期，神经系统的发育主要受到遗传基因的控制，环境因素也会起到一定的作用，在生命早期，大脑的发育速度惊人，孕期的最后三个月和婴儿出生后的前两年被称为“大脑发育的加速期”，成人大脑一半以上的重量是在这段时间获得的。

压力是以非特异性方式损害人们健康尤其是孕妇健康的重要因素，如果女性在怀孕期间难以平衡个人、家庭和就业相关问题，怀孕可能会是一个压力很大的时期，这会导致孕妇出现自闭抑郁、焦虑、愤怒等。而研究发现，孕期母亲的焦虑会对后代的情绪和认知发展产生不利影响。妊娠期间母亲处于长时间的压力刺激会导致后代自闭抑郁行为。妊娠期接触应激不良(如)对母亲及其后代的上述负面影响可能与HPA轴介导的神经内分泌有关。长期慢性应激引起的肾上腺皮质类固醇过量可通过与大脑中的各种受体结合起作用，例如影响海马体的结构和功能。海马体是大脑边缘系统的组成部分，与认知功能密切相关。它表现出多种生理功能，可控制血压、免疫力、情绪、生殖和应激反应。微生物群-肠-脑轴(MGBA)是体内的双向交流神经内分泌系统，肠道微生物可通过其代谢产物、免疫功能、神经内分泌调节、迷走神经等途径影响神经发育，从而影响ASD患者的行为症状，同时，来自大脑的神经通信信号可以影响胃肠道运动、感觉和分泌，进而影响微生物稳态。一些研究表明，母体肠道菌群可以从母亲垂直传播给后代，这对后代肠道菌群的进化有直接影响。研究还表明，产前压力可以引起母亲和后代肠道微生物群的变化。ASD发生的时间节点与肠道微生物的发育点具有时间相似性，如果在该阶段发生肠道微生物的紊乱，会直接改变肠脑轴的信号传递，从而影响大脑的正常发育，同时增加了后期精神类疾病的易感性，目前的研究观点支持肠道微生物群在生命早期发育异常可能是ASD发病的危险因素。因此，在生命早期对肠道微生物群的干预是预防ASD的重要措施，可在一定程度上减少自闭抑郁儿童的出现。

已有大量文献研究益生菌对预防治疗自闭、抑郁、孤独症的作用，因为菌株不同，功效不同，不同益生菌的干预效果均不同。同时，现有技术中，CN202310341402.7公开了一种五环三萜皂苷类的有机化合物用于慢性束缚应激所致抑郁行为，但因有机化合物制备工艺复杂，且有机化合物对人体的带来的副作用并不可知，因此并不是一个理想的抑郁症预防治疗措施。CN202310112655.7公开了一种中药组合物用于缓解精神障碍问题，但是其中药组合物的制备工序繁琐，需要经过煎煮过滤冷却，还需控制煎煮时长及温度，因此，在患者依从性方面并不理想。CN202211494709.2也公开了四氢苯并噻吩衍生物在抑郁自闭等一系列精神障碍问题中的应用，但是仍存在副作用不可知及制备方法复杂成本高的问题，综合看来，现有技术中公开对于预防治疗自闭抑郁等精神障碍问题的成分中，大部分是中药化合物或者是有机化合物，亦或是抗体类物质，均存在成本高、制备工艺繁琐、副作用不可知的一种或多种缺点；公开益生菌在精神障碍方面应用的现有技术比较少，且能够从备孕期改善母体及子代自闭抑郁等精神障碍的技术，尚未见报道。

而从前述可知，母体应激所致肠道菌群紊乱可以直接垂直传递到子代，导致后代出现精神障碍问题，因此，研发一种能够从备孕或妊娠期即可预防治疗母体自闭抑郁行为同时预防子代自闭抑郁行为出现的组合物产品，是非常有社会价值和意义的，可以为临床中减少自闭抑郁患儿的出现提供一定的技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种益生菌组合物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该益生菌组合物对母体应激抑郁症以及母体应激所致后代的自闭抑郁行为具有明显的改善效果。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括以下重量份的组分：动物双歧杆菌0.2-2.5份、鼠李糖乳杆菌0.2-5份、水苏糖5-15份、低聚果糖10-40份、凝结芽孢杆菌1-5份、乙酰化双淀粉己二酸酯10-25份和聚葡萄糖10-40份。

优选的是，所述益生菌组合物包括以下重量份的组分：动物双歧杆菌0.2-1.5份、鼠李糖乳杆菌0.2-1份、水苏糖5-10份、低聚果糖10-40份、凝结芽孢杆菌1-2.2份、乙酰化双淀粉己二酸酯10-16份和聚葡萄糖10-35份。

优选的是，动物双歧杆菌1份、鼠李糖乳杆菌0.5份、水苏糖5份、低聚果糖40份、凝结芽孢杆菌2.2份、乙酰化双淀粉己二酸酯15份和聚葡萄糖35份。

优选的是，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)DH216，该菌株已于2016年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13232，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)DH-Lr-121，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TBC169。这两株菌也是申请人前期分离鉴定的菌株，并且已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，详见专利号CN202210342926.3，专利名称“一种益生菌组合物及其应用”。

优选的是，所述动物双歧杆菌、所述鼠李糖乳杆菌和所述凝结芽孢杆菌均为冻干粉。

本发明还提供了所述的益生菌组合物在制备预防和/或改善自闭抑郁症的药物中的应用。

优选的是，所述自闭抑郁症包括妊娠期母体应激性抑郁症和由于妊娠期母体压力应激所致后代产生的自闭抑郁症。

本发明还提供一种预防和/或改善自闭抑郁症的药物，包括所述的益生菌组合物。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的益生菌组合物，其由动物双歧杆菌(DH216)、鼠李糖乳杆菌(DH-Lr-121)、水苏糖、低聚果糖、凝结芽孢杆菌(TBC169)、乙酰化双淀粉己二酸酯、聚葡萄糖等原料经特定比例配制而成。通过大量动物实验验证发现，当双歧杆菌乳亚种(DH216)、鼠李糖乳杆菌(DH-Lr-121)、水苏糖、低聚果糖、凝结芽孢杆菌(TBC169)、乙酰化双淀粉己二酸酯、聚葡萄糖的配比不同，其对后代自闭抑郁样行为改善效果不同，当配比为一定比例(配方b)时，所得益生菌组合物对母体应激所致后代的自闭抑郁行为的改善效果最优。

本发明经过实验验证发现：所制备的益生菌组合物可有效改善母体应激压力所致母体及后代的自闭、抑郁行为，并且筛选确定出最优益生菌组合物配方。本发明还通过动物实验探究了益生菌组合物对改善CUMS所致后代自闭、抑郁行为的作用机制，结果显示益生菌组合物可调节母体肠道菌群平衡及子代肠道菌群平衡，通过BDNF信号通路为主导的脑肠轴来改善母体CUMS所致后代自闭、抑郁样行为。本发明提供的益生菌组合物的原料天然健康，无副作用，通过调控肠道菌群平衡，作用于“脑肠轴”进而改善妊娠母代和子代的自闭抑郁等行为障碍问题，解决了现有技术问题中预防和治疗抑郁症所存在的问题，为临床预防和治疗应用提供了理论及技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同配方组的益生菌组合物对CUMS妊娠母鼠血浆皮质酮水平的影响；

图2为不同配方组的益生菌组合物对CUMS妊娠母鼠SPT行为变化(A)和糖水偏好(B)的影响；

图3为不同配方组益生菌组合物对CUMS妊娠大鼠OFT行为变化的影响；A：水平运动；B：垂直运动；

图4为不同配方组益生菌组合物对CUMS妊娠母鼠肠道微生物群变化的影响；A：Ace指数；B：Chao指数；C：Simpson指数；D：Shannon指数；

图5为产前母体应激及不同配方组组合物饲喂治疗后对后代体重变化及糖水偏好行为变化的影响；A：体重；B：糖水摄入量；C：对糖水的偏好；

图6为产前母体应激及不同配方组组合物饲喂治疗后对后代子鼠血浆皮质酮水平变化的影响；

图7为产前母体应激及不同配方组组合物饲喂治疗后对后代血清代谢物水平变化的影响；A：5-羟色胺(5-HT)；B：γ-氨基丁酸(GABA)；C：胆囊收缩素(CCK)；D：短链脂肪酸(SCFA)；

图8为益生菌组合物对后代肠道菌群的影响；A：Ace指数；B：Chao指数；C：Simpson指数；D：Shannon指数；

图9为益生菌组合物对后代抑郁行为影响的信号通路机制探究结果；A和D分别为BDNF的含量以及其mRNA表达量；B和E分别为CREB的含量以及其mRNA表达量；C和F分别为TRKB的含量以及其mRNA表达量；

上述图中，##：表示与对照组(C组)相比，有极显著性差异(P＜0.01)，#：表示与模型组(M组)相比有显著性差异(P＜0.05)；**表示与模型组(M组)相比，有极显著性差异(P＜0.01)；*：表示与模型组(M组)相比有显著性差异性(P＜0.05)。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例所用的菌株：

1、鼠李糖乳杆菌DH-Lr-121，凝结芽孢杆菌TBC169为申请人前期已经分离鉴定并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，详见专利号CN202210342926.3，专利名称“一种益生菌组合物及其应用”，在此不再赘述。

2、动物双歧杆菌DH216分离与鉴定：

2.1菌粉的制备和菌种的鉴定

用无菌容器收集饲养的家兔自然排出的新鲜粪便5-10g，迅速放入厌氧罐中，带回实验室进行菌种分离。取粪便样品1.5g，用15mL PBS缓冲液悬浮混匀，400g离心5min收集上清浊液，再加入适量PBS缓冲液8000g离心10min，收集上清浊液，即得到供试样品。吸取1ml上浊液加入一支装有9mL PBS稀释液(含有5‰L-半胱氨酸)的试管中涡旋混匀，作为10^-2稀释液，用同样方法稀释至10^-3，分别取粪便原液、10^-2稀释液、10^-3稀释液各0.1mL涂布于MRS平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时后，选择培养基上菌落形态较为粗糙的菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后，将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×10⁹CFU/g以上。同时对菌株展开生理生化特征鉴定。通过对分离获得的菌株分别进行接触酶实验及凝乳实验，去除接触酶阳性及无凝乳现象之菌株，排除非目的菌株后，对其余的菌株继续通过BIOLOG及API 50CH进行生理生化特征鉴定。最后通过提取DNA测序，进一步明确菌株的分类地位。经鉴定确定该分离菌株属于动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，命名为DH216，并于2016年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13232，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.2毒性试验

(1)动物及分组

取50只SPF级别小鼠，6～8周龄，体重15～19g，随机分为4个动物双歧杆菌DH216组和未给药组，每组10只。

(2)制备菌液

将上述动物双歧杆菌DH216菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×10⁹CFU/mL的菌液。

(3)方法

动物双歧杆菌DH216组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，动物双歧杆菌DH216组每天灌服动物双歧杆菌DH216菌液0.5mL，未给药组每天灌服纯化水0.5mL，饲喂6个月，观察毒性反应。

(4)结果

各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，表明动物双歧杆菌DH216不存在毒性。

将上述分离得到的动物双歧杆菌经冷冻干燥后，制成冻干粉，待用。

利用上述菌株配制组合物并进行实验验证，下面以具体的实施例进一步说明。

实施例1组合物的配方及制备工序。

按照表1所示的配比配制不同的组合物，表中原辅料均是按照重量份计。

表1不同的组合物配方

本发明的组合物是经称量、粉碎(或不粉碎)、过筛(或不过筛)、混料、制粒(或不制粒)、内包等工序制备而得。具体可采用如下制备工序：

称量、混料：按照上述配方称取原辅料；将检查无误的物料按照由多到少的顺序逐一投入混合机(HDA-800型多向运动混合机)，设定电机转速为27转/分钟(主轴转速6转/分钟)，混合20分钟，混合过程中严格控制混合时间。

内包：对SK系列条状包装机进行安装复合膜、色带，开机预热，进行空载调机后，向料斗内加入混合粉，内包过程中控制装量稳定。

外包：将内包完成后的产品进行外包工序。

实施例2慢性应激性抑郁症(CUMS)动物模型构建、治疗实验方案

1、实验动物

Wister SPF级大鼠(平均体重量200±12g)，包括28只雄性大鼠和56只雌性大鼠。

2、饲养条件

环境温度为25±2℃，相对湿度为43±3％，光照和黑暗交替循环(早7:00-晚7:00为照明时间)，正常饮食和饮水，在建立模型前，将大鼠饲养2周以适应环境。实验中所涉及的动物的使用和实验方案均符合国际实验动物评估和评审委员会的动物使用标准。

3、动物分组

将雌性大鼠鼠随机分为对照组(C组)、产前应激组(M组)和5个益生菌组合物治疗组(Da-De组)，共7组，每组8只。C组和Da-De组这6组的大鼠饲养在单笼中，将28只雄性大鼠随机分为对照交配组(各4只)、应激交配组(各4只)，益生菌干预交配组(5组，每组4只，共20只)，每只雄性大鼠在每笼中喂食。

4、慢性应激抑郁症(CUMS)动物模型的构建

4.1刺激方案

对M组和Da-De组的雌性大鼠进行慢性不可预测的轻度应激(CUMS)以建立动物模型。根据实验室条件进行一些调整，具体应激方法包括：(1)食物剥夺24h；(2)禁水24h；(3)拥挤的环境(7小时，笼子倾斜45°)；(4)潮湿环境，湿度1-30％，持续30小时；(5)冷水在5℃下游泳1h；(6)摇晃5min，200rpm；(7)黑白颠倒24h；(8)100℃热应激12分钟；(9)夹尾(距鼠尾尖2厘米，夹尾1分钟)；(10)不同噪声6h；(11)不给任何刺激24h；(12)放异物12h。

将上述12种刺激方法随机排列到21d，同种刺激模式不能连续出现。

在应激的第8天，使用各配方组合物(配方a-e)通过管饲进行干预。雌性大鼠在应激的第7、14天进行开放场试验(OFT)、蔗糖偏好试验(SPT)和眼内眦静脉血液采样。压力完成后，从母鼠中收集新鲜粪便。

4.2交配

在CUMS模型构建的第2天下午17:00，将M组、Da-De各配方组雌性大鼠与应激交配组雄性大鼠在笼中自然交配。第二天早上，一起检查阴道塞和阴道涂片，以确定怀孕是否成功。确认怀孕后，将雄性和雌性大鼠分开，并将怀孕的母鼠关在一个笼子里。当大鼠交配时，应激因子的应用没有暂停。C组的雌性大鼠和对照交配组的雄性以2：1的比例饲养在一起并自然交配。确认怀孕后，将C组的怀孕母鼠每两个关在一个笼子里，从怀孕第18天开始单独饲养。

4.3不同配方组益生菌组合物的治疗

配制浓度为0.1mg/mL的各配方组的益生菌组合物溶液，在CUMS模型的第7天，对Da-De这5组母鼠分别进行不同配方组溶液的灌胃处理，每只母鼠灌胃量为5mL。对照C组给予相应剂量的生理盐水14天，直到应激结束。

4.4分割后代

后代出生的那一天被指定为出生后第0天(PND0)。后代在PND21断奶，雄性和雌性分开饲养。正常对照组后代为GC组，应激母鼠所产子代鼠为GM组，各配方组益生菌组合物治疗后的母鼠所产子鼠为Ga-Ge共5组。所有后代均在稳定温度(20-22℃)下以8小时/8小时光照/黑暗循环情况下饲养，每个笼子4个，并自由获得标准化饮食和供水。从髂静脉采集血液，出生后28天(PND28)称重。

4.5确定后代的情绪表现

在子代鼠出生后20天(PND20)收集后代新鲜粪便进行检测，在PND21断奶，在PND42处采用OFT、SPT和尾部悬架试验(TST)测定情绪功能，具体操作方法如上所述，测试持续4天，每天一次。

4.6确定后代血浆微生物代谢物及微生物群的变化

在PND50收集后代血浆，采用ELISA测定血浆微生物代谢物的表达水平，得出后代5-羟色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、胆囊收缩素(CCK)和短链脂肪酸(SCFA)的表达水平。采用Illumina MiSeqPE16测序技术测定母体和后代粪便中的微生物。应激完成后，将大鼠恢复到原来的繁殖环境。

5、统计分析

所有数据均表示为平均值±标准偏差，使用社会科学统计包(SPSS)23.0进行分析，所有图形均在GraphPad Prism中构建。采用重复测量方差分析分析母体数据均值，P＜0.05被认为具有统计学意义。

实施例3探究不同配方组的益生菌组合物对CUMS妊娠母鼠血浆皮质酮水平的影响。

对不同配方组合物饲喂的CUMS妊娠母鼠的血浆皮质酮浓度进行了测定，评估不同配方组对CUMS妊娠大鼠的干预效果。

实验方法：在雌性大鼠应激的第7天、第15天分别从静脉收集血液，将血液样品离心(20rpm，4min)，并将获得的血浆储存在-80℃的冰箱中。血浆皮质酮水平由测定的皮质醇值得出，使用以下转换公式：皮质酮浓度＝皮质醇浓度×50。

从图1中可以看到，在第7天(7d)，模型组CUMS妊娠母鼠(M组)的血浆皮质酮水平相比正常对照组大鼠(C组)有明显升高，有显著性差异(P＜0.05)，在第14d时，模型组CUMS妊娠母鼠(M组)的血浆皮质酮水平相比正常对照组大鼠(C组)有显著性的升高，组间有极显著性差异(P＜0.01)；而经不同配方组的益生菌组合物饲喂后，在干预的第7天(7d)和第14天(14d)，CUMS妊娠母鼠血浆皮质酮水平有不同程度的降低。从图中可进一步看出，在干预治疗的第7天(7d)，配方b组和配方c组的CUMS妊娠母鼠(Db组、Dc组)血浆皮质酮水平相比模型组(M组)均有较大程度的降低，Db、Dc这两组母鼠的皮质酮水平相比对照组均有显著性差异(P＜0.05)。在干预治疗的第14天(14d)，配方b组的CUMS妊娠母鼠(Db组)血浆皮质酮水平降低水平相比模型组有极显著性差异(P＜0.01)；配方c组的CUMS妊娠母鼠(Dc组)血浆皮质酮水平降低水平相比模型组也有显著性差异(P＜0.05)。其余各配方组的血浆皮质酮水平变化相比模型组有一定降低，但是统计学差异不显著。

实施例4探究不同配方组的益生菌组合物对CUMS妊娠母鼠SPT行为变化的影响

对不同配方组益生菌组合物饲喂的CUMS妊娠母鼠的SpT行为变化进行了测定，评估不同配方组对CUMS妊娠母鼠的SPT抑郁行为的干预效果。

实验方法：首先在测试前训练大鼠适应蔗糖饮用水，将两个含有1％蔗糖水的水瓶放置在每个笼子中24小时，以便自由饮用。之后，正常进水饮食24小时。然后，在第二天早上10：00，给每只雌性大鼠2瓶称取水(1瓶1％蔗糖水，1瓶纯净水)，自由饮用1h后，取出2瓶进行测量。在压力的第7天和第14天测试糖水摄入量及糖水偏好情况。

从图2中A(SPT行为)可以看出，模型组(CUMS妊娠母鼠，即M组)相比对照组的妊娠母鼠(C组)，对蔗糖水的消耗明显减少，而经不同配方组益生菌组合物饲喂治疗后的CUMS妊娠母鼠对于糖水的消耗有所增加，说明压力应激降低了妊娠母鼠对快乐事件的反应能力，而本发明的益生菌组合物产品能够从一定程度上改善这种自闭抑郁行为。此外，从图2B也可以看出，压力应激的母鼠(M组)对糖水的偏好百分比相比对照组(C组)有较为明显的降低，尤其在干预的第14天(14d)两组间显著性差异性(P＜0.05)；而经不同配方组的益生菌组合物饲喂治疗治疗后，对糖水偏好百分比有不同程度的增加，从图2中B明显看出，在干预治疗的第7天(7d)，配方c、配方d对母鼠的这种自闭抑郁行为改善效果相比CUMS模型组母鼠(M组)有显著性差异性(P＜0.05)，在干预治疗的第14天(14d)，配方b对母鼠(Db组)的这种自闭抑郁行为改善效果相比CUMS模型组母鼠(M组)有极显著的差异性(P＜0.01)，配方c对母鼠(Dc组)的这种自闭抑郁行为改善效果相比CUMS模型组母鼠(M组)有显著性差异性(P＜0.05)，其余各配方组母鼠对糖水偏好行为相比模型组均有不同程度的改善，但是没有做出明显的差异性。

实施例5探究不同配方组益生菌组合物对CUMS妊娠大鼠OFT行为变化的影响

对不同配方饲喂的CUMS妊娠母鼠的OFT行为变化进行了测定，评估不同配方组对CUMS妊娠母鼠的垂直和水平运动行为的干预效果。

实验方法：该测试与蔗糖偏好测试同时进行。开放式装置由不透明材料制成，底部有一个80厘米×80厘米见方，平均分为25个等边正方形。具体操作如下：将大鼠放在中央正方形中，并记录大鼠在3分钟内穿过的正方形数。以箱体底面的方块数作为水平移动得分，当3个及以上爪子踏入箱体计数1分时；直立数(2只前爪在空中或爬墙)记录为垂直运动得分，鼠爪离开底部作为标记1分。测试一只大鼠，并在观察下只大鼠之前彻底清洁打开的盒子。

如图3所示，从图中可以看出，模型组(CUMS妊娠母鼠)相比对照组的妊娠母鼠，水平运动和垂直运动都有所减少，说明压力应激导致妊娠母鼠的运动能力下降，而经不同配方组益生菌组合物饲喂治疗后的CUMS妊娠母鼠的水平和垂直运动都有所增加，说明本发明的益生菌组合物产品能够从一定程度上改善CUMS妊娠母鼠的自闭抑郁行为。同时，也可以发现，配方组b和配方组c对这种运动行为改善效果更优(相比模型组有显著性差异P＜0.05)。

实施例6探究不同配方组益生菌组合物对CUMS妊娠母鼠肠道微生物群变化的影响

因为肠道微生物可通过肠-脑轴影响免疫功能、神经内分泌调节等进而影响神经发育，最终导致自闭抑郁样行为。正常生物体内的微生物群处于平衡状态，当受到外界刺激后，它会改变肠道微生物群的结构组成，导致肠道微生物群失衡，进而通过肠脑轴引发自闭抑郁行为。因此，对CUMS妊娠母鼠的肠道微生物群的丰富度和多样性指数进行了分析，确定益生菌组合物是否通过影响肠道微生物进而干预自闭抑郁性为。具体实验方法如下：

(1)样本收集

在模型建立后的第二天从每组大鼠中收集新鲜粪便，在PND20收集后代的粪便，总共36个粪便样品无菌并在-80℃的冰箱中冷冻保存。

(2)DNA提取和PCR扩增

根据制造商的说明，使用E.Z.N.A.Stool DNA试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，美国)从粪便样品中提取微生物群落基因组DNA。在1％琼脂糖凝胶上检查DNA提取物，并使用NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(美国威尔明顿赛默飞世尔科技)测定DNA浓度和纯度。细菌16S rRNA基因的高变区V3-V4通过ABI 338PCR热循环仪(美国加利福尼亚州阿比)用引物对515F(3′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-5′)和806R(3′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′)扩增。16S rRNA基因的PCR扩增如下：首先，95℃3分钟，然后95℃持续30秒，55℃持续30秒，72℃持续45秒，27个循环，最后一步在72℃下扩增延伸10分钟。通过2％琼脂糖凝胶电泳证实扩增。

(3)Illumina MiSeq测序

纯化的扩增子在Illumina MiSeq平台(美国圣地亚哥Illumina)上以等摩尔和配对末端测序(2×300)根据Majorbio生物制药科技有限公司(中国上海)的标准方案进行。原始读取被存入NCBI序列读取存档(SRA)数据库(入藏号：SRPPRJNA721070)。

(4)测序数据的处理

大测序深度是为了保证微生物群落分辨率的高测序质量，在16S rRNA基因序列分析中采用高通量测序。每个测序文库的覆盖率达到97％，当测序深度达到40，000-50，000时，V3-V4测序获得的数据是可重复的。在本发明的研究中，使用UPARSE(版本97.7，http://drive1.com/uparse/)对具有5％相似性截止值的操作分类单元(OTU)进行聚类，并识别并删除嵌合序列。通过RDP分类器针对16S rRNA数据库使用置信阈值0.7分析每个OTU代表性序列的分类。本发明采用的测序方法为配对测序，其平均测序长度为418.53。区分样本后，在门和属水平进行群落条形图分析。β-多样性通过布雷-柯蒂斯距离算法估计，并通过主坐标分析(PCoA)可视化。这些数据在免费的在线Majorbio I-Sanger云平台(www.i-sanger.com)上进行了分析。

如图4所示，通过图4中A-B所显示的Ace指数及Chao指数变化情况，可以看出怀孕期间的慢性压力会降低物种的丰富度，通过图4中C和D的Simpson和Shannon指数可以看出，怀孕期间的慢性压力会降低微生物物种的多样性，而本发明的益生菌组合物产品可以通过增加肠道微生物群物种丰富度和多样性改善肠道菌群的失衡状态，从而改善CUMS妊娠母鼠自闭抑郁行为。从图4中还可进一步发现，只有配方组b对各指数的干预效果最理想，其相比模型组有显著性差异(Ace指数：p＜0.01，Chao指数和Simpson指数：p＜0.05)，配方组a和配方组d干预效果次之。

实施例7探究产前母体应激及不同配方组组合物饲喂治疗后对后代体重变化及糖水偏好行为变化的影响

通过对体重的测量，结果如图5所示。从图5中A可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠的体重相比正常后代小鼠有明显下降，而经不同配方组的益生菌组合物饲喂治疗后的母鼠所产后代子鼠的体重有不同程度的增加，从图5中A中明显看出，配方组a和配方组b饲喂后母鼠所产后代子鼠(Ga组、Gb组)的体重相比模型组子鼠(GM组)有显著性差异(P＜0.05)，其余各配方组治疗后所产子代的小鼠的体重相比模型组小鼠变化不明显。从图5中B和C可以看出，配方组b的益生菌组合物饲喂后母鼠所产后代子鼠(Gb组)对糖水的摄入量及对糖水的偏好程度相比模型组子鼠(GM组)有显著性差异(P＜0.05)，其余各配方组治疗母鼠所产子鼠的糖水偏好行为变化程度不如配方组b的小鼠。

从实施例3-实施例7的研究结果可以看出，上述实施例1中各配方组的益生菌组合物中，只有经配方组b的益生菌组合物饲喂治疗后，CUMS母鼠及其所产后代子鼠的各种自闭抑郁样行为(包括母鼠及子鼠的SPT、OFT行为，母鼠及子鼠的血浆皮质酮变化、母鼠的肠道微生物群的丰富度和多样性的变化、子鼠的体重变化)相比未经本发明组合物干预的母鼠及子鼠来说，改善效果最为理想，因此，接下来，确定以配方组b的组合物来展开后续对子代各种身体指标的检测实验。

实施例8探究产前母体应激及不同配方组组合物饲喂治疗后对后代子鼠血浆皮质酮水平变化的影响

对子代鼠血浆皮质酮检测方法同实施例3方法。

如图6所示可以看出，CUMS母鼠所产子鼠(GM组)的血浆皮质酮相比正常母鼠所产子鼠(GC组)有明显的升高，而经配方b的益生菌组合物饲喂治疗后的母鼠所产子代小鼠(Gb组)的血浆皮质酮相比GC组子鼠有极显著性升高(P＜0.01)，说明本发明的益生菌组合物可通过母体直接干预子代的神经递质的变化，进而改善子代自闭抑郁性为。

实施例9探究产前母体应激及不同配方组组合物饲喂治疗后对后代血清代谢物水平变化(5-HT、GABA、胆囊收缩素)的影响

在PND50下腹膜内注射水合氯醛麻醉后，从心脏收集血液样品并在3000℃下以10rpm离心4分钟以提取血浆。样品储存在-80℃，然后通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)按照默认程序测定胆囊收缩素(CCK)，短链脂肪酸(SCFA)，5-羟色胺(5-HT)和γ-氨基丁酸(GABA)。

从图7中A中可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)的5-HT有明显的升高，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的5-HT的相比GM组子鼠有极显著性降低(P＜0.01)；从图7中B和C可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)的血清GABA和CKK含量也有明显的升高，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的GABA和CKK含量有明显的降低，相比于GM组小鼠有显著性差异(P＜0.05)。从图7中D可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)的短链脂肪酸(SCFA)含量是有极显著性降低(P＜0.01)，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的SCFA含量相比GM组子鼠有极显著性增加(P＜0.01)。以上血清代谢产物检测结果说明，压力应激的母鼠会导致子代小鼠的血清代谢物发生变化，进而通过脑-肠轴导致自闭抑郁行为，而本发明的益生菌组合物可以通过影响血清代谢物进而通过脑肠轴来起到改善自闭抑郁的作用。

实施例10探究益生菌组合物对后代肠道菌群的影响

进一步探究了本发明组合物对子代鼠肠道菌群丰富度和多样性的影响，其中实验方法同实施例6。

如图8所示，通过图8中A的Chao指数和图8中B的Chao指数可以看到，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)，肠道菌群Ace指数和Chao指数发生明显的降低(两组间有极著性差异P＜0.01)，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的肠道菌群Ace指数和Chao指数相比GM组子鼠发生明显的升高，两组间存在差异性差异(P＜0.05)，说明应激可改变母鼠肠道菌群物种丰富度，而本发明的益生菌组合物可提高肠道菌群的物种丰富度。从图8C和D可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)，肠道菌群Simpson和Shannon指数也发生明显的降低，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的肠道菌Simpson和Shannon指数相比GM组子鼠发生明显的升高，且shannon指数的两组间是存在极显著性差异的(P＜0.01)。

上述结果可以看出怀孕期间的慢性压力会导致其后代肠道菌群降低物种的丰富度，通过Simpson和Shannon指数可以看出怀孕期间的慢性压力会降低微生物物种的多样性，而本发明的益生菌组合物产品可以通过增加肠道微生物群物种丰富度和多样性改善肠道菌群的失衡状态，从而改善CUMS妊娠母鼠自闭抑郁行为。

实施例11探究益生菌组合物对后代抑郁行为影响的信号通路机制

已有文献证实海马CA1-CA3突触的功能变化和CA3锥体神经元的形态修饰与抑郁症的发生有关。同时，压力会导致海马神经元发生变化，缩小锥体神经元的树突，这可能会损害记忆。BDNF是一种主要的神经营养因子，在神经元的维持和存活中起作用，TrkB和CREB在抑郁症和抗抑郁药反应中起着至关重要的作用。

为进一步研究本发明的益生菌组合物对压力应激后代行为影响的作用机制是否涉及对海马组织的干预，对小鼠海马组织中的相关神经因子(海马体中BDNF，TrkB、CREB)的表达情况进行了检测。具体实验方法为：

(1)实时荧光定量逆转录聚合酶链反应

根据“RNAsimple总RNA”试剂盒(天根生物，中国北京)的说明。简而言之，每700mg海马体加入50μL裂解物用于匀浆；将其在室温下放置5分钟以完全分离核酸-蛋白质复合物，加入200μL氯仿，并在12℃下以10rpm离心4分钟以获得水相萃取，加入0.5倍无水乙醇混合，并在4℃和12000rpm下离心30秒，加入500μL蛋白质溶液，并在4℃和12000rpm下离心30秒，加入500μL冲洗溶液，并在4℃下以12000rpm离心30秒后孵育，最后干燥RNA沉淀，并将沉淀溶解在50mL的DEPC水中。使用核酸蛋白定量仪器对提取的RNA进行定量。使用A_260/280比值在1.8-2.0之间的样品。进行三步逆转录定量PCR(RT-qPCR)测定。逆转录(RT)和定量聚合酶链反应(qPCR)在CFX96实时荧光定量PCR仪器(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)中进行。使用的BDNF，TrkB和CREB RT-PCR引物如下：

BDNF正向，5′-TGTGGTCAGTGGCTGGCTCTC-3′，

反向，5′-ACAGGACGGAAACAGAACGAACAG-3′

TrkB：正向，5′-GGTCTATGCCGTGGTGGTGATTG-3′，

反向，5′-ATGTCTCGCCAACTTGAGCAGAAG-3′

CREB：正向，5′-GGAGCAGACAACCAGCAGAGTG-3′，

反向，5′-GGCATGGATACCTGGGCTAATGTG-3′；

β-肌动蛋白：正向，5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，

反向，5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

PCR反应的具体条件为：15℃预变性95min，10℃变性95s，20℃退火55s，30℃延伸70s，共40个循环。2^-ΔΔCt采用该方法计算靶基因的相对表达水平。

(2)蛋白质印迹

提取海马组织的总蛋白为了确定海马组织的总蛋白，每700mg海马体中加入50μL冷裂解缓冲液并匀浆。然后将匀浆以12000g离心5分钟，并将上清液保存用于分析。使用BCA测定法测定蛋白质浓度。

二辛可宁酸(BCA)法测定蛋白质浓度，仔细遵循试剂盒随附的说明：绘制标准曲线，制备适量的试剂A和试剂B的BCA工作溶液(50：1)。将试剂A和B充分混合，将样品稀释至合适的浓度。对于本实验，总体积为20L，因此使用200μL BCA工作溶液。然后将溶液加入到每个孔中并充分混合。将板密封并置于37℃培养箱中30分钟，之后使用酶标仪测定562nm处的吸光度。根据标准曲线计算样品蛋白浓度。

蛋白质印迹的具体步骤：以5：4的比例向样品中加入1×SDS-PAGE的蛋白质上样缓冲液。在100℃变性5分钟后，将样品储存在-20℃冰箱中直至使用。在使用时，将蛋白质提取物(50μg)在30％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在PBST缓冲液(2L ddH₂O和2mL的0.05％吐温)与5％奶粉一起孵育，并与抗BDNF抗体(Abcam生物技术；1：2，000)、TrkB抗体(细胞信号传导技术；1：1，000)、CREB抗体(CST；1：1，000)和β-管蛋白抗体(多科(联科)生物技术有限公司；1：1，000)孵育，然后在4℃下孵育过夜。然后用3×PBST冲洗印迹1次，每次10分钟。加入二抗Pierce GoatAnti-Rabbit IgG(Santa CruzBiotechnology；1：2000)，并将印迹膜在室温下在脱色摇床上孵育1小时。然后用3×PBST冲洗1次，每次10分钟。将显色溶液A和B混合，并向膜中加入1mL。使用化学镜3000化学发光仪器进行检测和拍照。计算目标蛋白的积分光密度值，然后与β-微管蛋白表达进行比较，得到目标蛋白的表达程度。

如图9所示，从图9中A和D可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)的海马体中BDNF的含量以及其mRNA表达量均有明显的降低，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的海马体中BDNF的含量及其mRNA表达量相比GM组子鼠有极显著性升高(P＜0.01)；从图9中B和E可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)的海马体中CREB的含量以及其mRNA表达量均有明显的降低，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的海马体中CREB的含量及其mRNA表达量相比GM组子鼠有显著增加(P＜0.05)。从图9中C和F可以看出，CUMS应激母鼠所产后代子鼠(GM组)相比正常母鼠所产子鼠(GC组)的海马体中TrKB的含量以及其mRNA表达量均有明显的降低，而经本发明组合物饲喂治疗后的母鼠所产子鼠(Gb组)的海马体中TrKB的含量以及其mRNA表达量相比GM组子鼠均有极显著性升高(P＜0.01)。

以上结果均说明，哺乳期母体遭受压力会影响后代的神经发育，从而增加后代行为障碍的风险，而本发明的益生菌组合物可以通过调节BDNF/CREB信号通路，进而改善母体压力应激所致的后代抑郁行为。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物由以下重量份的组分组成：动物双歧杆菌1份、鼠李糖乳杆菌0.5份、水苏糖5份、低聚果糖40份、凝结芽孢杆菌2.2份、乙酰化双淀粉己二酸酯15份和聚葡萄糖35份；

所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）DH216，保藏编号为CGMCC No.13232；

所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）DH-Lr-121，保藏编号为CGMCC No.13076；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）TBC169，保藏编号CGMCC No.1207。

2.如权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，所述动物双歧杆菌、所述鼠李糖乳杆菌和所述凝结芽孢杆菌均为冻干粉。

3.如权利要求1或2所述的益生菌组合物在制备预防和/或改善自闭抑郁症的药物中的应用，其特征在于，所述自闭抑郁症为妊娠期母体应激性抑郁症和/或由于妊娠期母体压力应激所致后代产生的自闭抑郁症。

4.一种预防和/或改善妊娠期母体应激性抑郁症和/或由于妊娠期母体压力应激所致后代产生的自闭抑郁症的药物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的益生菌组合物。