CN114965827A - 一种母乳中磷脂检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷脂检测方法及应用，具体涉及一种测定母乳中5种磷脂的检测方法。该方法可以在一个色谱条件下同时测定母乳中酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM)5种磷脂，各色谱峰的分离度均较好，检测限、定量限也均符合药物的定性和定量分析要求，灵敏度高，且具有较高的回收率、精密度和稳定性，重现性好、准确性高，分析的磷脂种类多，峰型好，保留时间短，方便快捷，可靠实用。
Description
技术领域
本发明属于磷脂检测技术领域，具体涉及一种磷脂检测方法及应用。
背景技术
磷脂是乳液中一项重要的功能性营养指标，因其多种生理活性而受到广泛关注，近年来，磷脂被越来越多地挖掘成为功能性食品添加剂和婴儿配方乳粉中的营养强化剂。目前，磷脂在降低胆固醇、改善肝功能、减少心脑血管疾病方面展现了强大的功效，其它生物活性还包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等。除了针对成年人的众多医疗保健功效以外，磷脂在建立婴儿大脑神经系统、肠道免疫系统和包括胃肠消化系统等方面也起到了不可或缺的作用。
母乳磷脂主要包括磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)，磷脂酰丝氨酸(PS)，磷脂酰胆碱(PC) 和鞘磷脂(SM)5大类。磷脂中的SM和PC被认为是磷脂中最具价值的营养物质，因为婴儿生长必须的营养物质胆碱，有接近17％来源于这部分磷脂成分，这类营养素是维持婴儿快速发育及合成体内生物膜必不可少的物质。磷脂中的PS对中枢神经系统的发育有着重要意义。磷脂中的PI具有降低胆固醇的作用。而磷脂中的PE可为婴儿提供花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等不饱和脂肪酸，这类营养素能显著提高婴儿的大脑和视力发育。因此，磷脂被越来越多地挖掘成为功能性食品添加剂和婴儿配方乳粉中的营养强化剂。许多研究者也建立了多种针对母乳中磷脂检测的方法。
目前，GB 5009.272-2016阐述了使用紫外检测器测量食品中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE) 和磷脂酰肌醇(PI)的方法，GB/T 35867-2018和ISO11701：2009阐述了使用蒸发光检测器测定卵磷脂中磷脂含量的方法。然而，以上标准的适用范围为大豆磷脂、大豆油、花生油等基质，并不包含乳及乳制品。 T/GDFPT 00014-2020乳及乳制品中磷脂酰丝氨酸(PS)的测定只适用于乳及乳制品中的磷脂酰丝氨酸，具有极大局限性。但检测技术的发展日新月异，文献报道往往具有其时限性；国内就此领域发表的相关报道不多，针对乳制品基质的更是少之又少。近年来，众多婴幼儿食品企业已将磷脂作为营养强化剂添加入配方乳粉中，但磷脂成分标识缺乏完整的信息，且国内外针对乳制品中磷脂含量的相关检验标准仍未完善，其含量与标识值是否一致也无从验证。因此，本研究是建立母乳磷脂成分，检测技术与方法，实现对母乳中磷脂不同种类的定性和定量，系统性的研究母乳中功能成分组成，深度解析母乳营养成分，分析其对中国婴幼儿健康生长发育的作用，为研究适合中国婴幼儿营养需求的配方奶粉提供理论支撑，为母乳数据库奠定基础。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
本发明的目的是提供一种同时测定母乳中用于检测磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM)5种磷脂的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种磷脂检测方法，其特征在于：用A相为水/甲醇/乙腈(v:v:v,1:1:1)混合溶剂(含有2mmol/L乙酸铵)；B相为异丙醇/乙腈(v:v,1:1)混合溶剂(含有2 mmol/L乙酸铵)洗脱。
作为本发明所述磷脂检测方法的优选方案，其中，所述洗脱为梯度洗脱。
作为本发明所述磷脂检测方法的优选方案，其中，所述梯度洗脱，其为0～1.0min时用第一
体积比的流动相淋洗，1.0～6.0min时用第二体积比的流动相，6.0～10.0min时用第三体积比的流动相，10.0～12.0min时用第四体积比的流动相，12.0～12.1min时用第五体积比的流动相，12.1～15.0min时用第六体积比的流动相淋洗。
其中，所述第一体积比为20％B，所述第二体积比为20％-80％B，所述第三体积比为80％-95％ B，所述第四体积比为95％B，所述第五体积比为95％-20％B，所述第六体积比为20％B。
作为本发明所述磷脂检测方法的优选方案，其中，色谱柱的柱温为20～40℃。
作为本发明所述磷脂检测方法的优选方案，其中，所述洗脱，分流比50:1条件，进样量为5μL，流速为0.25～0.40mL/min.
作为本发明所述磷脂检测方法的优选方案，其中，检出限在0.24～0.98μg/ml，定量限在0.96～3.33 μg/ml.
作为本发明的另一方面，为了解决上述技术问题，提供了一种磷脂检测方法的应用，其为用于检测磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM)的检测。
本发明的有益效果：
本发明所提供的分析方法，保留时间短，色谱图的质量高，分离效果好，分离所需时间短，检测种类多。
附图说明
图1为磷脂标准样品的检测色谱图；
图2为柱温分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的条件下进行检测所得峰面积；
图3为流速分别为0.25mL/min、0.30mL/min、0.35mL/min、0.40mL/min的条件下进行检测所得峰面积。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明实施例选用的试验仪器为AB SCIEX TRIPIETOF 5600四极杆飞行时间串联质谱(AB sciex 公司)。
实施例1
分别称取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM) 各1mg，溶于1mL氯仿-甲醇溶液中(2:1，v/v)都配成1mg/mL标品溶液，过0.45μm膜后，进超高效液相色谱AB SCIEX TRIPIETOF 5600四极杆飞行时间串联质谱检测。
色谱实验条件为选取C18柱，A相为水/甲醇/乙腈(1：1：1，v/v/v)(10mmol/L甲酸铵)，B相为异丙醇/乙腈(1：1，v/v)(10mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱：0-1.0min,20％B；1.0-6.0min，20％-80％B；6.0-10.0min，80％-95％B；10.0-12.0min,，95％B；12.0-12.1min，95％-20％B；12.1-15.0min，20％ B。流速为0.40mL/min，柱温为35℃；进样量正负离子各为2μL。
质谱实验条件为雾化气压GS1:60psi，雾化气压GS2:60psi，辅助气压(CUR):30psi，温度 (TEM):600oC，DP:100V，喷雾电压(ISVF):5000V(POS)/-4500(NEG)。检测的磷脂标准样品的检测色谱图见说明书附图1
实施例2
分别称取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM) 各1mg，溶于1mL氯仿-甲醇溶液中(2:1，v/v)都配成1mg/mL标品溶液，过0.45μm膜后，进超高效液相色谱AB SCIEX TRIPIETOF 5600四极杆飞行时间串联质谱检测。
色谱实验条件为选取C18柱，A相为水/甲醇/乙腈(1：1：1，v/v/v)(10mmol/L甲酸铵)，B 相为异丙醇/乙腈(1：1，v/v)(10mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱：0-1.0min,20％B；1.0-6.0min，20％- 80％B；6.0-10.0min，80％-95％B；10.0-12.0min,，95％B；12.0-12.1min，95％-20％B；12.1-15.0 min，20％B。流速为0.30mL/min；进样量正负离子各为2μL。选用实施例1的洗脱方式，在柱温分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的条件下进行检测，所得数据见说明书附图2
本发明确定最佳柱温为35℃时，有利于获得更高的灵敏度。
实施例3
分别称取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM) 各1mg，溶于1mL氯仿-甲醇溶液中(2:1，v/v)都配成1mg/mL标品溶液，过0.45μm膜后，进超高效液相色谱AB SCIEX TRIPIETOF 5600四极杆飞行时间串联质谱检测。
色谱实验条件为选取C18柱，A相为水/甲醇/乙腈(1：1：1，v/v/v)(10mmol/L甲酸铵)，B相为异丙醇/乙腈(1：1，v/v)(10mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱：0-1.0min,20％B；1.0-6.0min，20％-80％ B；6.0-10.0min，80％-95％B；10.0-12.0min,，95％B；12.0-12.1min，95％-20％B；12.1-15.0min，20％ B。柱温为35℃；进样量正负离子各为2μL。选用实施例1的洗脱方式，在流速分别为0.25mL/min、0.30 mL/min、0.35mL/min、0.40mL/min的条件下进行检测，所得数据见说明书附图3
本发明确定最佳流速为0.4mL/min时，有利于获得更高的灵敏度。
实施例4
分别称取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM) 各1mg，溶于1mL氯仿-甲醇溶液中(2:1，v/v)都配成1mg/mL标品溶液，过0.45μm膜后，进超高效液相色谱AB SCIEX TRIPIETOF 5600四极杆飞行时间串联质谱检测。
色谱实验条件为选取C18柱，A相为水/甲醇/乙腈(1：1：1，v/v/v)(10mmol/L甲酸铵)，B相为异丙醇/乙腈(1：1，v/v)(10mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱：0-1.0min,20％B；1.0-6.0min，20％-80％ B；6.0-10.0min，80％-95％B；10.0-12.0min,，95％B；12.0-12.1min，95％-20％B；12.1-15.0min，20％ B。流速为0.40mL/min，柱温为35℃；进样量正负离子各为2μL。
质谱实验条件为雾化气压GS1:60psi，雾化气压GS2:60psi，辅助气压(CUR):30psi，温度 (TEM):600oC，DP:100V，喷雾电压(ISVF):5000V(POS)/-4500(NEG)。
本发明检测磷脂的线性范围和检测限见表1
表1磷脂的线性范围和检测限
实施例5
分别称取磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM) 各1mg，溶于1mL氯仿-甲醇溶液中(2:1，v/v)都配成1mg/mL标品溶液，过0.45μm膜后，进超高效液相色谱AB SCIEX TRIPIETOF 5600四极杆飞行时间串联质谱检测。
色谱实验条件为选取C18柱，A相为水/甲醇/乙腈(1：1：1，v/v/v)(10mmol/L甲酸铵)，B相为异丙醇/乙腈(1：1，v/v)(10mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱：0-1.0min,20％B；1.0-6.0min，20％-80％B；6.0-10.0min，80％-95％B；10.0-12.0min,，95％B；12.0-12.1min，95％-20％B；12.1-15.0min，20％ B。流速为0.40mL/min，柱温为35℃；进样量正负离子各为2μL。
质谱实验条件为雾化气压GS1:60psi，雾化气压GS2:60psi，辅助气压(CUR):30psi，温度 (TEM):600oC，DP:100V，喷雾电压(ISVF):5000V(POS)/-4500(NEG)。
如表所示，所得加标回收率87.65～97.82％。指标说明本实施例采用的检测方法，回收率在合适的范围内，证明检测方法良好.
三种不同添加水平下，对于乳液样品中五种磷脂的平均添加回收率，相对标准偏差及所得添加回收率结果见表2
表2五种磷脂的平均添加回收率，相对标准偏差及所得添加回收率
本发明用乙腈、乙酸铵等作为流动相，可以进行复杂磷脂样品的定性定量检测，具有较好的检测准确性，相比于含有正己烷、异丙醇的流动相，不会对色谱柱填料造成损害从而加速色谱柱的老化，还不会对检测硬件造成损伤，延长检测仪器的使用寿命。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种磷脂检测方法，其特征在于：
用A相为水/甲醇/乙腈(v:v:v,1:1:1)混合溶剂(含有2mmol/L乙酸铵)；B相为异丙醇/乙腈(v:v,1:1)混合溶剂(含有2mmol/L乙酸铵)洗脱。
2.如权利要求1所述磷脂检测方法，其特征在于：所述洗脱为梯度洗脱。
3.如权利要求2所述磷脂检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱，其为0～1.0min时用第一体积比的流动相淋洗，1.0～6.0min时用第二体积比的流动相，6.0～10.0min时用第三体积比的流动相，10.0～12.0min时用第四体积比的流动相，12.0～12.1min时用第五体积比的流动相，12.1～15.0min时用第六体积比的流动相淋洗，其中，所述第一体积比为20％B，所述第二体积比为20％-80％B，所述第三体积比为80％-95％B，所述第四体积比为95％B，所述第五体积比为95％-20％B，所述第六体积比为20％B。
4.如权利要求1～3任一所述磷脂检测方法，其特征在于：所述洗脱，其色谱柱的柱温为20～40℃。
5.如权利要求1～3任一所述磷脂检测方法，其特征在于：所述洗脱，分流比50:1条件，进样量为5μL流速为0.25～0.40mL/min。
6.如权利要求1、2所述磷脂检测方法，其特征在于：检出限在0.24～0.98μg/ml，定量限在0.96～3.33μg/ml。
7.一种磷脂检测洗脱液，其特征在于：
包括，用A相为水/甲醇/乙腈(v:v:v,1:1:1)混合溶剂(含有2mmol/L乙酸铵)；B相为异丙醇/乙腈(v:v,1:1)混合溶剂(含有2mmol/L乙酸铵)。
8.一种磷脂检测方法的应用，其特征在于：用于检测酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂(SM)的检测。
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