CN114778727A - 检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，包括以下步骤：1)样本前处理：1‑1)取冻存母乳样本解冻，加入内标沉淀剂，涡旋震荡；1‑2)加入正己烷，然后加入饱和氯化钠溶液抑制乳化，涡旋混匀；1‑3)离心，取上清液，40℃氮气下吹干，再使用复溶液复溶，涡旋震荡；1‑4)离心，滤膜过滤，留上清液，得到测试样；2)采用液相色谱‑串联质谱方法对测试样进行脂溶性维生素的定量检测，通过标准曲线计算得到冻存母乳样本中的脂溶性维生素的含量。本发明采用液相色谱‑串联质谱技术能同时检测母乳中四种脂溶性维生素的水平，该方法具有灵敏度高、定量限低、分析时间短、分析速度快等优点，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，特别涉及一种检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法。
背景技术
近年来的研究表明维生素D不但发挥调节钙磷代谢，维持骨骼健康的作用，而且对骨骼外系统发挥重要作用。母乳是婴儿几乎全部的食物来源，故母乳中VitD的水平直接影响婴儿对VitD的利用。我国VD缺乏的情况很严重，孕妇及新生儿VD缺乏在40％～100％之间，VD充足不到10％，提示母乳喂养的婴儿更需要额外VitD补充剂。由于母乳中的VD水平取决于母亲体内的VD水平，通常含量较低，其数量并不足以防止软骨病。但大剂量服用维生素D可以引起中毒，甚至会出现更严重的副作用。故检测检测母乳中维生素D含量对婴儿补充维生素D起重要作用。
母乳是婴儿的最理想食物来源，母乳中的VA受母亲的膳食摄入、膳食中的脂肪含量、母亲本身的VA状态、生活习惯等多种因素影响，哺乳期妈妈和婴儿是VA缺乏的风险人群，需要提高对VA的认识；另有研究表明，母乳中维生素A含量在初乳期和牛乳的含量相近,但随着哺乳期的加长,母乳中维生素A的含量呈现逐渐减少的趋势，所以规范使用VA并加强对家长的健康科普，从而保证母亲及婴儿的健康。
研究表明，围产期口服补充维生素E能显著提高母乳中维生素E含量，这提示孕产妇近期维生素E的摄取状况对母乳中维生素E浓度影响很大。另外，母乳作为一种良好的维生素E供给源，更利于更易于婴儿吸收，成为防治新生儿维生素E缺乏的一种有效方法
所以，母乳中诸如维生素D、维生素A、维生素E等脂溶性维生素的定量检测具有重要意义，但现在未见公开可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，包括以下步骤：
1)样本前处理：
1-1)取冻存母乳样本解冻，加入内标沉淀剂，涡旋震荡；
1-2)加入正己烷，然后加入饱和氯化钠溶液抑制乳化，涡旋混匀；
1-3)离心，取上清液，40℃氮气下吹干，再使用复溶液复溶，涡旋震荡；
1-4)离心，滤膜过滤，留上清液，得到测试样；
2)采用液相色谱-串联质谱方法对测试样进行脂溶性维生素的定量检测，通过标准曲线计算得到冻存母乳样本中的脂溶性维生素的含量；
其中，所述脂溶性维生素至少包括维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E中的一种或多种。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)取冻存母乳样本解冻，加入内标沉淀剂，涡旋震荡30-120s；
1-2)加入正己烷，然后加入饱和氯化钠溶液抑制乳化，1250-5000转/分下涡旋混匀2-10min；
1-3)于4℃、7000-28000转/分离心5-20min，取上清液，40℃氮气下吹干，再使用复溶液复溶，涡旋震荡2-10min；
1-4)于4℃、7000-28000转/分离心5-20min，用0.22μm的滤膜过滤，留上清液，得到测试样。
优选的是，所述步骤1)具体包括：
1-1)取冻存母乳样本解冻，取1mL母乳样本向其中加入2mL内标沉淀剂，涡旋震荡60s；
1-2)加入5mL正己烷，然后加入2mL饱和氯化钠溶液抑制乳化，2500转/分下涡旋混匀5min；
1-3)于4℃、14000转/分离心10min，取上清液4mL，40℃氮气下吹干，再使用1mL复溶液复溶，涡旋震荡5min；
1-4)于4℃、14000转/分离心10min，用0.22μm的滤膜过滤，留上清液，取上清液100μL作为测试样。
优选的是，其中，所述内标沉淀剂为甲醇和乙腈的混合液。
优选的是，其中，所述内标沉淀剂中甲醇和乙腈的体积比为1：1。
优选的是，其中，所述复溶液为甲醇和水的混合液。
优选的是，其中，所述复溶液中甲醇和水的体积比为1：1。
优选的是，所述步骤2)中标准曲线的构建方法为：
2-1)制备一系列浓度的脂溶性维生素标准液；
2-2)按照步骤1)的方法对脂溶性维生素标准液进行处理，得到的标准曲线样本供液相色谱-串联质谱方法检测，得到脂溶性维生素的标准曲线。
优选的是，其中，液相色谱条件为：
色谱柱：Phenomenex的Kinetex C18柱；
流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：0-0.5min，80％B；0.5-1.5min，100％B；1.5-3.5min，100％B；3.5-3.6min，80％B；3.6-5.0min，80％B；
流速：0.6mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃。
优选的是，其中，质谱条件为：
离子源：ESI源；检测方式：多反应监测(MRM)；气帘气(CUR)25psi，喷雾器60psi，NC：5，温度350℃，碰撞气4psi。
本发明的有益效果是：本发明提供的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，采用液相色谱-串联质谱技术能同时检测母乳中四种脂溶性维生素的水平，该方法具有灵敏度高、定量限低、分析时间短、分析速度快等优点，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例中获得的脂溶性维生素的峰形图；
图2为本发明的实施例中获得的维生素A的标准曲线；
图3为本发明的实施例中获得的25-羟基维生素D2的标准曲线；
图4为本发明的实施例中获得的25-羟基维生素D3的标准曲线；
图5为本发明的实施例中获得的维生素E的标准曲线；
图6A、6B、图7A-7C为本发明的实施例中氮吹后复溶的效果验证结果；
图8A-8D为本发明的实施例中的滤膜过滤处理效果的验证结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
1、仪器说明：LC-20AXR液相色谱仪(岛津公司)，API4000三重四极杆质谱仪(ABSciex公司)，5427R离心机(Eppendorf有限公司)，VORTEX-5旋涡混合器(其林贝尔仪器公司)。
2、试剂来源说明：维生素A(美国Sigma Alrdich，99.4％)，25-羟基维生素D2(加拿大多伦多研究化学，97％)、25-羟基维生素D3(加拿大多伦多研究化学TRC，97％)、维生素E(Sigma Alrdich，99.2％)，维生素A-d6(荷兰Buchem BV，98％)、25-羟基维生素D2-d6(Medical Isotopes，99％)、25-羟基维生素D3-d6(Medical Isotopes，98％)、维生素E-d6(上海谱芬生物，95％)。甲醇、乙腈、正己烷、异丙醇均购买于康科德科技有限公司，甲酸购买于Fisher Chemical公司。牛血清白蛋白购买于Amresco公司。高纯水是符合国际GB/T6682-2008的一级水。
3、试剂配制：将标准品维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E各称取1mg，用甲醇进行稀释，得到各标准工作液，其中，维生素A浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1200ng/mL、1600ng/mL、2000ng/mL。25-羟基维生素D2浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、1.5ng/mL、2ng/mL、2.5ng/mL、3ng/mL、3.5ng/mL、4ng/mL。25-羟基维生素D3浓度分别为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、12ng/mL、16ng/mL、20ng/mL。维生素E浓度分别为1ug/mL、2ug/mL、4ug/mL、8ug/mL、10ug/mL、12ug/mL、16ug/mL、20ug/mL。维生素A-d6、25-羟基维生素D2-d6、25-羟基维生素D3-d6、维生素E-d6通过稀释得到的浓度分别为3ug/mL、2ng/mL、10ng/mL、1ug/mL，作为内标。
本实施例的一种检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，包括以下步骤：
1)样本制备：
每个待测样本吸取1mL的母乳冷冻储存备用；
2)样本前处理：
1-1)取冻存母乳样本解冻(1mL)，向其中加入2mL内标沉淀剂(甲醇：乙腈＝1：1)，涡旋震荡60s；
1-2)加入5mL正己烷，然后加入2mL饱和氯化钠溶液抑制乳化，2500转/分下涡旋混匀5min；
1-3)于4℃、14000转/分离心10min，取上清液4mL，40℃氮气下吹干，再使用1mL复溶液(甲醇：水＝1:1)复溶，涡旋震荡5min；
1-4)于4℃、14000转/分离心10min，用0.22μm的滤膜过滤，留上清液，取上清液100μL作为测试样。
其中，所述脂溶性维生素包括维生素A(VA)、25-羟基维生素D2(25-OH D2)、25-羟基维生素D3(25-OH D3)和维生素E(VE)。
2)采用液相色谱-串联质谱方法对测试样进行脂溶性维生素的定量检测，通过标准曲线计算得到冻存母乳样本中的脂溶性维生素的含量。
其中，液相色谱条件为：
色谱柱：Phenomenex的Kinetex C18柱(50×3.0mm，2.6μm，100A)；
流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：0-0.5min，80％B；0.5-1.5min，100％B；1.5-3.5min，100％B；3.5-3.6min，80％B；3.6-5.0min，80％B；
流速：0.6mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃。
质谱条件为：
离子源：ESI源；检测方式：多反应监测(MRM)；气帘气(CUR)25psi，喷雾器(GS1)60psi，NC：5，温度(TEM)350℃，碰撞气(CAD)4psi。每种化合物的母离子、子离子、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。
表1质谱采集参数
其中，标准曲线的构建方法为：
2-1)制备一系列浓度的脂溶性维生素标准液，即以上各标准工作液；
2-2)按照步骤1)的方法对各标准工作液进行处理，得到的标准曲线样本供液相色谱-串联质谱方法检测，得到脂溶性维生素的标准曲线。参照图1，为脂溶性维生素的峰形图，参照图2-5，分别为维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3和维生素E的标准曲线。
实施例2
本实施例对实施例1提供的检测方法中的部分参数条件进行了优化验证，以更加充分的对本发明进行说明。
1、步骤1-3)中氮吹后复溶的效果验证
进样浓度(2.5ng/mL的25-OH D2、8ng/mL的25-OH D3、800ng/mL的VA，10μg/mL的VE)，参照图6A，为步骤1-3)中不加氮吹直接复溶的响应结果，图6B，为步骤1-3)中氮吹再复溶的响应结果；如下表2为响应对比数据：
表2响应对比
从图6A、6B以及表2的结果可以看出，加入氮吹后复溶再离心步骤可以有效提升目标物的响应，强度提升1.5倍以上、峰面积提升1.5倍以上。原因分析：加入氮吹后复溶步骤可以起到浓缩样本的作用，另外使用优化后的复溶液进样而不是直接取上清进样，可以更加完美的匹配液相流动相的配比，峰型较优化前也有了明显的改善。
进一步的，参照图7A，为初始混标出峰情况；图7B，为不加氮吹测试20针处理后样本峰型变化；图7C，为加氮吹后测试20针处理后样本峰型变化；表3为对比分析数据；
表3
通过图7A、7B、7C以及表3的结果可以看出，优化后测试20针处理后样本后响应及峰型基本一致，优化前结果VA,VD2,VD3测试20针处理后样本后响应基本一致，VE出现偏差，但VA,VD2,VD3,VE峰型变差。原因分析：优化后的前处理样本更加洁净，进色谱柱后对柱子无污染，相反优化前的前处理方法洁净度不高，进样后柱子中会有蛋白或者磷脂残留，导致柱效降低，峰型变差且响应出现偏差。
2、步骤1-4)中滤膜过滤处理效果的验证
以VE为例：加0.22μm滤膜过滤，初始VE出峰情况如图8A所示；加0.22μm滤膜过滤，测试20针处理后样本峰型变化如图8B所示；不加0.22μm滤膜过滤，初始VE出峰情况如图8C所示；不加0.22μm滤膜过滤，测试20针处理后样本峰型变化如图8D所示，对比分析数据如下表4所示：
表4
| VE峰强度 | VE峰面积 | |
| 加0.22μm滤膜过滤，初始响应 | 8.2124e6 | 2.7651e7 |
| 加0.22μm滤膜过滤，20针后 | 8.2115e6 | 2.9700e7 |
| 不加0.22μm滤膜过滤，初始响应 | 8.3111e6 | 3.1751e7 |
| 不加0.22μm滤膜过滤，20针后 | 7.5002e6 | 4.3667e7 |
从以上结果可以看出，使用0.22μm滤膜过滤时VE的峰形不会出现拖尾，损害色谱柱，延长色谱柱使用寿命。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样本前处理：
1-1)取冻存母乳样本解冻，加入内标沉淀剂，涡旋震荡；
1-2)加入正己烷，然后加入饱和氯化钠溶液抑制乳化，涡旋混匀；
1-3)离心，取上清液，40℃氮气下吹干，再使用复溶液复溶，涡旋震荡；
1-4)离心，滤膜过滤，留上清液，得到测试样；
2)采用液相色谱-串联质谱方法对测试样进行脂溶性维生素的定量检测，通过标准曲线计算得到冻存母乳样本中的脂溶性维生素的含量；
其中，所述脂溶性维生素至少包括维生素A、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、维生素E中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)取冻存母乳样本解冻，加入内标沉淀剂，涡旋震荡30-120s；
1-2)加入正己烷，然后加入饱和氯化钠溶液抑制乳化，1250-5000转/分下涡旋混匀2-10min；
1-3)于4℃、7000-28000转/分离心5-20min，取上清液，40℃氮气下吹干，再使用复溶液复溶，涡旋震荡2-10min；
1-4)于4℃、7000-28000转/分离心5-20min，用0.22μm的滤膜过滤，留上清液，得到测试样。
3.根据权利要求2所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：
1-1)取冻存母乳样本解冻，取1mL母乳样本向其中加入2mL内标沉淀剂，涡旋震荡60s；
1-2)加入5mL正己烷，然后加入2mL饱和氯化钠溶液抑制乳化，2500转/分下涡旋混匀5min；
1-3)于4℃、14000转/分离心10min，取上清液4mL，40℃氮气下吹干，再使用1mL复溶液复溶，涡旋震荡5min；
1-4)于4℃、14000转/分离心10min，用0.22μm的滤膜过滤，留上清液，取上清液100μL作为测试样。
4.根据权利要求3所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，其中，所述内标沉淀剂为甲醇和乙腈的混合液。
5.根据权利要求4所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，其中，所述内标沉淀剂中甲醇和乙腈的体积比为1：1。
6.根据权利要求5所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，其中，所述复溶液为甲醇和水的混合液。
7.根据权利要求6所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，其中，所述复溶液中甲醇和水的体积比为1：1。
8.根据权利要求1所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，所述步骤2)中标准曲线的构建方法为：
2-1)制备一系列浓度的脂溶性维生素标准液；
2-2)按照步骤1)的方法对脂溶性维生素标准液进行处理，得到的标准曲线样本供液相色谱-串联质谱方法检测，得到脂溶性维生素的标准曲线。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，其中，液相色谱条件为：
色谱柱：Phenomenex的Kinetex C18柱；
流动相：A相为甲酸水溶液，B相为甲酸甲醇溶液；
梯度洗脱程序：0-0.5min，80％B；0.5-1.5min，100％B；1.5-3.5min，100％B；3.5-3.6min，80％B；3.6-5.0min，80％B；
流速：0.6mL/min；进样量：10μL；柱温：40℃。
10.根据权利要求9所述的检测冻存母乳中脂溶性维生素的方法，其特征在于，其中，质谱条件为：
离子源：ESI源；检测方式：多反应监测；气帘气25psi，喷雾器60psi，NC：5，温度350℃，碰撞气4psi。
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