CN114509509A - 一种血清中全谱维生素的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清中全谱维生素的检测方法，涉及代谢组分析技术领域，其先向样本中加入同位素维生素作为内标，再通过固‑液萃取法分别提取样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素，使用T3色谱柱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析。相比于现有技术，不仅解决了无法一次完成全谱维生素的困难，而且大大降低了样本量，并具有效率高、准确度高、分析时间短等优点。

Description

一种血清中全谱维生素的检测方法
技术领域
本发明涉及代谢组分析技术领域，更具体地说是指一种血清中全谱维生素的检测方法。
背景技术
全谱维生素包含B族水溶性维生素和脂溶性维生素，B族水溶性维生素是推动体内所有物质转化为能量的基本物质，它参与蛋白质、碳水化合物和脂肪的代谢，还是促进人体新陈代谢的必要物质。脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K，维生素A对于维持正常视力、上皮细胞组织健康和免疫功能具有重要的作用。维生素D不仅仅影响钙磷代谢，而且具有广泛的生理作用，是维持人体健康、细胞生长和发育的必不可少的物质。维生素E的主要生理作用是抗氧化。维生素K缺乏后会凝血障碍，是促进血液正常凝固及骨骼生长的重要维生素。
目前采用LC-MS方法对全谱维生素进行定量分析常用的策略是使用不同的提取方法和检测方法对水溶性维生素和脂溶性维生素分别进行定量，若需检测全谱维生素，则需准备两份样本，采用两种方法检测，操作繁琐，效率低，耗费大。
发明内容
本发明提供的一种只需一个样本就可以完成血清中全谱维生素检测的定量检测方法，其目的在于解决现有技术中存在全谱维生素需要准备两份样本，采用两种方法进行分别检测，操作繁琐，效率低等的问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：先向血清样品加入同位素维生素作为内标；再通过固-液萃取法分别提取血清样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素；使用T3色谱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析，内标矫正标曲进行串联质谱分析。
进一步，具体包括以下步骤：
步骤S1、配制内标溶液；用水溶性维生素的同位素内标、0.3％甲酸水溶液和水制得IS-mixA混合内标溶液；用脂溶性维生素的同位素内标和纯甲醇制得IS-mixB混合内标溶液。
步骤S2、配制标准品溶液；用水溶性维生素标准品、0.3％甲酸水溶液和水制得mixA标准品溶液；用脂溶性维生素标准品和纯甲醇制得mixB标准品溶液。
步骤S3、构建标准曲线；使用人血清蛋白溶液将mixA标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixA稀释溶液；使用人血清蛋白溶液将mixB标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixB稀释溶液；将浓度相同的mixA稀释溶液和mixB稀释溶液混合，得到若干浓度不同的混合液；再对每份混合液做如下处理：加入IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加入甲醇/乙腈混合液并涡旋混合；待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A1；再加入纯甲醇并涡旋混合，再过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，并用异丙醇解吸附在Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B1；滤液A1使用真空干燥，再用0.3％甲酸水溶液复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液A1；滤液B1使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液B1；对上清液A1、上清液B1进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析，得到标准曲线。
步骤S4、样品分析；取血清样本，加入IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加甲醇/乙腈混合液并涡旋混合，待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；再用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A2；再加入纯甲醇并涡旋混合；过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，加入异丙醇解吸附OstroSPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B2；滤液A2使用真空干燥，再用0.3％甲酸水溶液复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液A2；滤液B2使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液B2；对上清液A2和上清液B2进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析；将分析结果使用步骤S3构建的标准曲线换算出对应维生素浓度。
更进一步，所述步骤S1具体是：称取水溶性维生素的同位素内标，向其中加入0.3％甲酸水溶液溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用水稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS-mixA混合内标溶液；称取脂溶性维生素的同位素内标，向其中加入纯甲醇溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS-mixB混合内标溶液。
更进一步，所述步骤S2具体是：称取水溶性维生素标准品，向其中加入0.3％甲酸水溶液溶解制成1mg/ml的水溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用水稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixA标准品溶液；称取脂溶性维生素标准品，向其中加入纯甲醇溶解制成1mg/ml的脂溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixB标准品溶液。
更进一步，所述步骤S1中，水溶性维生素的同位素内标包括Nicotinamide-13C6(C13烟酰胺)、Pyrioxine-d3(氘代吡哆醇)和Folic acid-13C5(C13叶酸)。脂溶性维生素的同位素内标包括25-OH Vitamin D2-d3(氘代25-羟基维生素D2)、25-OH Vitamin D3-d3(氘代25-羟基维生素D3)和Vitamin K1-d7(氘代维生素K1)；步骤S2中，水溶性维生素标准品包括Thiamine nitrate(具体为Vitamin B1)、Riboflavine(具体为Vitamin B2)、Nicotinamide(具体为Vitamin B3)、Niacin acid(具体为Vitamin B3)、Pyridoxine(具体为Vitamin B6)、Pyridoxal(具体为VitaminB6)、Folic acid(具体为Vitamin B9)、CyanocobalaMin(具体为Vitamin B12)，所述脂溶性维生素标准品包括Vitamin A、25-OHVitamin D2、25-OH Vitamin D3、Vitamin E、Vitamin K1。
更进一步，所述步骤S3中，mixA标准品溶液和mixB标准品溶液均分梯度稀释至2.5ng/ml；在对每份混合液的处理过程中：IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB的加入量均为10μL；甲醇/乙腈混合液的加入量为200μL，并涡旋混合30秒；金标水的加入量为250μL，并涡旋混合30秒；离心机以14000g离心10min；纯甲醇的加入量为300μL，并涡旋混合5s，异丙醇的加用量为0.5ml；复溶时，0.3％甲酸水溶液和纯甲醇的加入量均为150μL，离心机以14000g、4℃离心15min。
和现有的技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供了一种采用LC-MS方法检测样本中全谱维生素的方法，其先向样本中加入同位素维生素作为内标，再通过固-液萃取法分别提取样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素，使用T3色谱柱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析。相比于现有技术，不仅解决了无法一次完成全谱维生素的困难，而且大大降低了样本量，并具有效率高、准确度高、分析时间短等优点。
具体实施方式
下面说明本发明的具体实施方式。为了全面理解本发明，下面描述到许多细节，但对于本领域技术人员来说，无需这些细节也可实现本发明。
一种血清中全谱维生素的检测方法，包括以下步骤：
步骤S1、配制内标溶液；称取水溶性维生素的同位素内标，向其中加入0.3％甲酸水溶液溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用水稀释定容至1ml，制成400ng/ml的IS-mixA混合内标溶液；称取脂溶性维生素的同位素内标，向其中加入纯甲醇溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用纯甲醇稀释定容至1ml，制成400ng/ml的IS-mixB混合内标溶液。
其中，水溶性维生素的同位素内标包括Nicotinamide-13C6(C13烟酰胺)、Pyrioxine-d3(氘代吡哆醇)和Folic acid-13C5(C13叶酸)。脂溶性维生素的同位素内标包括25-OH Vitamin D2-d3(氘代25-羟基维生素D2)、25-OH Vitamin D3-d3(氘代25-羟基维生素D3)和Vitamin K1-d7(氘代维生素K1)。
步骤S2、配制标准品溶液；称取水溶性维生素标准品，向其中加入0.3％甲酸水溶液溶解制成1mg/ml的水溶性维生素标准品母液，再取该母液用水稀释定容至1ml，制得25μg/ml的mixA标准品溶液；称取脂溶性维生素标准品，向其中加入纯甲醇溶解制成1mg/ml的脂溶性维生素标准品母液，再取该母液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得25μg/ml的mixB标准品溶液。
其中，水溶性维生素标准品包括Thiamine nitrate(Vitamin B1)、Riboflavine(Vitamin B2)、Nicotinamide(Vitamin B3)、Niacin acid(Vitamin B3)、Pyridoxine(Vitamin B6)、Pyridoxal(Vitamin B6)、Folic acid(Vitamin B9)、CyanocobalaMin(Vitamin B12)。脂溶性维生素标准品包括Vitamin A、25-OH Vitamin D2、25-OH VitaminD3、Vitamin E、Vitamin K1；
步骤S3、构建标准曲线；使用人血清蛋白溶液将mixA标准品溶液分梯度稀释至2.5ng/ml，得到若干浓度不同的mixA稀释溶液；使用人血清蛋白溶液将mixB标准品溶液分梯度稀释至2.5ng/ml，得到若干浓度不同的mixB稀释溶液；将浓度相同的mixA稀释溶液和mixB稀释溶液混合，得到若干浓度不同的混合液；再对每份混合液做如下处理：加入10μL的IS-mixA混合内标溶液和10μL的IS-mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加入200μL甲醇/乙腈混合液，涡旋混合30秒；待沉淀蛋白后再加入250μL金标水，涡旋混合30秒；用离心机以14000g离心10min后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A1；再加入300μL纯甲醇，涡旋混合5s，过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，并用0.5ml异丙醇解吸附在Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B1；滤液A1使用真空干燥，再用150μL的0.3％甲酸水溶液复溶，再用离心机以14000g、4℃离心15min后取上清液，得到上清液A1；滤液B1使用氮气吹干，再用150μL纯甲醇复溶，再用离心机以14000g、4℃离心15min后取上清液，得到上清液B1；使用5500QTRAP质谱仪(SCIEX)对上清液A1、上清液B1进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析，得到标准曲线。
步骤S4、样品分析；取50μL血清样本，加入10μL的IS-mixA混合内标溶液和10μL的IS-mixB混合内标溶液，涡旋混合，再加入200μL甲醇/乙腈混合液，涡旋混合30秒，待沉淀蛋白后再加入250μL金标水，涡旋混合30秒，用离心机以14000g离心10min后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A2；再加入300μL纯甲醇，涡旋混合5s，过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，加入0.5ml异丙醇解吸附Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B2；滤液A2使用真空干燥，再用150μL的0.3％甲酸水溶液复溶，用离心机以14000g、4℃离心15min后取上清液，得到上清液A2；滤液B2使用氮气吹干，再用150μL纯甲醇复溶，用离心机以14000g、4℃离心15min后取上清液，得到上清液B2；使用5500QTRAP质谱仪(SCIEX)对上清液A2和上清液B2进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析；将分析结果使用步骤S3构建的标准曲线换算出对应维生素浓度。
上述步骤S3和步骤S4中使用的LC-MS/MS分析中的色谱洗脱方式为：
时间(min) ％A ％B 流速(ml/min)
0 100 0 0.35
2 100 0 0.35
6 50 50 0.35
8 50 50 0.35
8.5 30 70 0.6
9.5 30 70 0.6
12 2 98 0.6
14 2 98 0.6
15 100 0 0.35
19 100 0 0.35
质谱条件设置如下：
采用电喷雾电离正离子(ESI+)检测模式和多反应监测(MRM)的质谱扫描模式对；source temperature:550℃；ion Source Gas1(Gas1):55；Ion Source Gas2(Gas2):55；Curtain gas(CUR):40；ionSapary Voltage Floating(ISVF):+5500V。
同时检测目标维生素离子对以及同位素内标维生素离子对，各离子对及其对应的去簇电压、碰撞电压和碰撞池出口电压参数如下：
Figure BDA0002783848370000081
下面对本实施例的检测结果作进一步的分析，以验证本发明的可行性：采用同位素内标定量法，以维生素标准品浓度为x轴，维生素标准品峰面积与内标物峰面积比为y轴，建立标准曲线。根据该曲线计算血清中维生素的浓度。依据特征离子MRM色谱峰的信噪比大于3为检测限(LOD)，信噪比大于10为定量限(LOQ)，结果如下：
Figure BDA0002783848370000082
Figure BDA0002783848370000091
可见，13种维生素在各自浓度线性范围内呈良好的线性关系，满足定量要求，人血清中各维生素的RSD值如下：
Figure BDA0002783848370000092
Figure BDA0002783848370000101
备注：单位：ng/mL。
综上可见，本发明提供了一种采用LC-MS方法检测血清中全谱维生素的方法，其先向样本中加入同位素维生素作为内标，再通过固-液萃取法分别提取样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素，使用T3色谱柱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析。相比于现有技术，不仅解决了无法一次完成全谱维生素检测的困难，而且大大降低了样本量，并具有效率高、准确度高、分析时间短等优点。
上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (7)

1.一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：先向血清样品加入同位素维生素作为内标；再通过固-液萃取法分别提取血清样本中的水溶性维生素和脂溶性维生素；使用T3色谱将维生素分离后，采用分段两次进样一次分析，内标矫正标曲进行串联质谱分析。
2.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤S1、配制内标溶液；用水溶性维生素的同位素内标、0.3%甲酸水溶液和水制得IS-mixA混合内标溶液；用脂溶性维生素的同位素内标和纯甲醇制得IS-mixB混合内标溶液；
步骤S2、配制标准品溶液；用水溶性维生素标准品、0.3%甲酸水溶液和水制得mixA标准品溶液；用脂溶性维生素标准品和纯甲醇制得mixB标准品溶液；
步骤S3、构建标准曲线；使用人血清蛋白溶液将mixA标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixA稀释溶液；使用人血清蛋白溶液将mixB标准品溶液分梯度稀释，得到若干浓度不同的mixB稀释溶液；将浓度相同的mixA稀释溶液和mixB稀释溶液混合，得到若干浓度不同的混合液；再对每份混合液做如下处理：加入IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加入甲醇/乙腈混合液并涡旋混合；待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A1；再加入纯甲醇并涡旋混合，再过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，并用异丙醇解吸附在Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B1；滤液A1使用真空干燥，再用0.3%甲酸水溶液复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液A1；滤液B1使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，再用离心机离心后取上清液，得到上清液B1；对上清液A1、上清液B1进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析，得到标准曲线；
步骤S4、样品分析；取血清样本，加入IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB混合内标溶液并涡旋混合；再加甲醇/乙腈混合液并涡旋混合，待沉淀蛋白后再加入金标水并涡旋混合；再用离心机离心后，取上清液过Ostro SPE板，收集过滤液于A离心管，得到滤液A2；再加入纯甲醇并涡旋混合；过Ostro SPE板，收集过滤液于B离心管，加入异丙醇解吸附Ostro SPE板上的脂溶性维生素，同样收集过滤液于B离心管，得到滤液B2；滤液A2使用真空干燥，再用0.3%甲酸水溶液复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液A2；滤液B2使用氮气吹干，再用纯甲醇复溶，用离心机离心后取上清液，得到上清液B2；对上清液A2和上清液B2进行分段两次进样一次LC-MS/MS分析；将分析结果使用步骤S3构建的标准曲线换算出对应维生素浓度。
3.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于，所述步骤S1具体是：称取水溶性维生素的同位素内标，向其中加入0.3%甲酸水溶液溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用水稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS-mixA混合内标溶液；称取脂溶性维生素的同位素内标，向其中加入纯甲醇溶解制成10μg/ml的溶液，再取40μL该溶液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为400ng/ml的所述IS-mixB混合内标溶液。
4.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于，所述步骤S2具体是：称取水溶性维生素标准品，向其中加入0.3%甲酸水溶液溶解制成1mg/ml的水溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用水稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixA标准品溶液；称取脂溶性维生素标准品，向其中加入纯甲醇溶解制成1mg/ml的脂溶性维生素标准品母液，再取40μL该母液用纯甲醇稀释定容至1ml，制得浓度为25μg/ml的所述mixB标准品溶液。
5.根据权利要求1-3任一所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：所述步骤S1中，水溶性维生素的同位素内标包括Nicotinamide-13C6、Pyrioxine-d3和Folicacid-13C5。
6.脂溶性维生素的同位素内标包括25-OH Vitamin D2-d3、25-OH Vitamin D3-d3和Vitamin K1-d7；所述步骤S2中，水溶性维生素标准品包括Thiamine nitrate、Riboflavine、Nicotinamide、Niacin acid、Pyridoxine、Pyridoxal、Folic acid、CyanocobalaMin，所述脂溶性维生素标准品包括Vitamin A、25-OH Vitamin D2、25-OHVitamin D3、Vitamin E、Vitamin K1。
7.根据权利要求1所述的一种血清中全谱维生素的检测方法,其特征在于：所述步骤S3中， mixA标准品溶液和mixB标准品溶液均分梯度稀释至2.5ng/ml；在对每份混合液的处理过程中：IS-mixA混合内标溶液和IS-mixB的加入量均为10μL；甲醇/乙腈混合液的加入量为200μL，并涡旋混合30秒；金标水的加入量为250μL，并涡旋混合30秒；离心机以14000g离心10min；纯甲醇的加入量为300μL，并涡旋混合5s，异丙醇的加用量为0.5ml；复溶时， 0.3%甲酸水溶液和纯甲醇的加入量均为150μL，离心机以14000g、4℃离心15min。
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