CN107037173B - 一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法 - Google Patents

一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，包括以下步骤：以与待测牛羊乳样品中待测蛋白质的特异肽相对应的同位素特异肽为内标物，加入蛋白酶酶解得到酶解物；对所述酶解物中验证肽进行检测，并根据检测结果鉴定待测蛋白质的酶解效果；本发明用待测蛋白质的验证肽鉴定蛋白质的酶解效果，若酶解物中含有验证肽时，则待测蛋白质样品未完全酶解释放得到特异肽，待测蛋白质样品还须优化酶解操作并重复上述验证肽的检测；反之，则待测蛋白质样品完全酶解释放得到特异肽。因此本发明中可以对于待测蛋白质是否酶解完全释放得到所对应的特异肽进行验证，以获得准确的特异肽的浓度，进而准确的换算出待测蛋白质的含量。

Description

一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法。
背景技术
定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定，并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定，是当前系统生物科学研究的重要内容。近年来，由于质谱技术和生物信息学的进步，定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就。
在种种成熟的蛋白质定量分析技术中，应用三重四极杆质谱(triplequadrupole)，在选择反应监控模式(selected reaction monitoring，SRM)中，对蛋白质中特异肽进行检测，在完全酶解的情况下，特异肽的摩尔浓度与对应蛋白质的摩尔浓度相同，故可以通过其与蛋白质分子量计算获得蛋白质的浓度。
公开号为CN103616454A的专利文献公开了一种定量检测人β-酪蛋白含量的方法以及试剂盒，该方法中利用人β-酪蛋白酶解后所获得的特异多肽序列，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法对人β-酪蛋白进行定量检测。
公开号为CN103642895A的专利文献公开了一种定量检测人α-乳白蛋白含量的方法以及试剂盒。该专利文献利用人α-乳白蛋白酶解后所获得的特异多肽序列，设计出同位素标记的特异肽和同位素标记内标物的序列，并基于内标法对人α-乳白蛋白进行定量检测。
上述方法中，通过同位素内标标记策略，提高特异肽的检测准确度，但是若蛋白质未完全将所有的特异肽酶解释放出来时，那么上述方法将不能准确的测定得到的特异肽的浓度，即不能准确的换算出蛋白质的含量。而现有技术中，对于蛋白质酶解效果的检测一直缺乏一种简单有效的方法，因此如何对蛋白质的酶解效果进行快速而且有效的检测，对于后续所有提高特异肽检测准确度的研究至关重要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，提高牛羊乳中蛋白质含量检测的准确度。
本发明的技术方案为：一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，包括以下步骤：
(1)以与待测牛羊乳样品中加入蛋白酶酶解得到酶解物；
(2)对所述酶解物中验证肽和特异肽进行检测，并根据检测结果验证待测蛋白质样品的酶解效果；若通过酶解效果验证，表示特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，则用所获得的特异肽浓度乘以待测蛋白质样品的分子量获得蛋白质的质量浓度；若未通过酶解效果验证，表示特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到，则将酶解物再次进行酶解优化处理；
所述验证肽中至少含有一个或一个以上在待测蛋白质中最后被所述酶所酶解的位点；或，所述验证肽为所述特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽。
(3)待特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到后，将所述酶解物经由质谱检测；
(4)制作待测蛋白质的特异肽标准品溶液浓度的标准曲线；
(5)将步骤(3)得到的检测结果代入步骤(4)所述标准曲线中，获得样品的特异肽摩尔浓度，然后按下式计算获得待测蛋白质的质量浓度；
待测蛋白质的质量浓度＝待测样品中待测蛋白特异肽摩尔浓度×待测蛋白质摩尔质量。
本发明中对于验证肽的选择来说，能被相应酶完全酶解的待测蛋白质样品，验证肽中至少含有最后被所述酶所酶解的位点；但是对于部分蛋白质来说，难以完全酶解，因此本发明对于此类蛋白质来说，可以选择特异肽向N端或者C端延长至少一个以上酶解位点的多肽作为验证肽。
本发明中若酶解物中不含有所述验证肽时，则所述待测蛋白质样品完全酶解释放得到特异肽，可以对特异肽的浓度进行测定，再通过特异肽的浓度测定结果换算出待测蛋白质的含量；反之，若酶解物中含有所述验证肽时，则所述待测蛋白质样品未完全酶解释放得到特异肽，则所述待测蛋白质样品完全酶解释放得到特异肽，待测蛋白质样品还需再次进行酶解，并重复上述验证过程。
作为优选，所述待测蛋白质与其特异肽的对应关系为：
一般来说，为每个蛋白质只需选择一条多肽作为特异肽。在此情况下，所以无需追求蛋白质彻底水解，只要保证所选择的特异肽完全释放出来即可。因此本发明在此情况下，本发明还可以选择特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽作为验证肽。
本发明中验证肽的选择有多种，作为优选，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的N端延长至下一个酶解位点的多肽。对于位于蛋白质C端的特异肽，可以选择向N端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。
作为优选，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的C端延长至下一个酶解位点的多肽。对于位于蛋白质N端的特异肽，可以选择向C端延伸至下一个酶解位点的多肽作为验证肽。
作为优选，步骤(2)中，所述验证肽和特异肽采用液相色谱-质谱联用技术同时检测。本发明中对验证肽进行检测时，可以采用与特异肽相同的检测方法，其中预处理方法和仪器通用参数与特异肽完全一致，仅增加验证肽专属的SRM参数。因此本发明可以在不增加实验操作和成本的前提下，仅通过参数的设置即能完成本发明，从而本发明具有很高的便利性和实用性。
作为优选，在步骤(1)和步骤(4)中加入同位素标记的同位素特异肽作为内标，并且采用同位素稀释法进行检测和计算。本发明人工合成同位素内标，在样品预处理阶段和标准曲线制备阶段加入，用同位素稀释法的原理进行检测和结果计算，以提高检测准确度和精密度。
作为优选，所述待测蛋白质与所述同位素特异肽的对应关系为：
其中V*是[13C5,15N]-缬氨酸，I*是[13C6,15N]-异亮氨酸，L*是[13C6,15N]-亮氨酸，F*是[13C9,15N]-苯丙氨酸。
同位素特异肽与特异肽的序列相同，两者的区别仅在于：同位素特异肽与特异肽上的某些元素互为同位素。
本发明中采用液相色谱-质谱联用技术对验证肽进行检测时，为了降低检测误差，本发明需要合理设置验证肽的检测参数，由于仪器品牌型号、状态、信号的表达方式的差异，相同浓度的验证肽在不同设备上所产生的信号也不同。所以验证肽的阈值无法是一个绝对值，而是是一个相对值，作为优选，所述验证肽的信号强度阈值设置为所述特异肽信号强度的1％。若验证肽的信号强度小于所述验证肽的信号强度阈值时，则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，反之，特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到。
作为优选，所述验证肽的信噪比低于3。若验证肽的信号强度小于所述验证肽的信噪比时，则特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，反之，特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到。
针对蛋白质含量特别低的样品(例如乳糖)，作为优选，将所述步骤(1)中的酶解物进行富集纯化操作。通过富集纯化操作，提高样品中多肽浓度，降低基质浓度，使本发明适用于更为广泛的浓度范围。
作为优选，制备标准曲线时，所述的待测蛋白质的特异肽可由人工合成方法获得，或者通过待测蛋白质酶解的办法获得。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明中若酶解物中含有验证肽时，则待测蛋白质样品未完全酶解释放得到特异肽；反之，则待测蛋白质样品完全酶解释放得到特异肽，待测蛋白质样品还需再次进行酶解并重复上述验证肽的检测，直至酶解物中不含有验证肽。因此本发明中可以对于待测蛋白质是否酶解完全释放得到所对应的特异肽进行验证，以获得准确的特异肽的浓度，进而准确的换算出待测蛋白质的含量。
具体实施方式
实施例1
以合成的特异肽为标准品，检测牛羊奶粉中6种蛋白质的含量。
样品预处理方式：称取10g样品于100mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度。取上述溶液10μL于2mL塑料离心管中，依次加入10μL混合同位素特异肽溶液、10μL二硫苏糖醇溶液(100mmol/L)和945μL碳酸氢铵溶液(500mM)，混合均匀后在70℃水浴锅中孵育30min；再加入10μL碘代乙酰胺(300mmol/L)溶液，混合均匀后在室温环境中避光静置30min；加入胰蛋白酶溶液10μL，于37℃水浴锅中反应2h；加入5μL甲酸溶液，通过0.22μm滤膜过滤，通过用高效液相色谱串联三重四级杆质谱进样分析，其中目标多肽(特异肽)和子离子信息见表1，液相色谱条件和质谱条件高效液相色谱分离条件如下：
色谱柱为C18色谱柱，柱温为40℃；流动相A为体积百分比为0.1％的甲酸的乙腈溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3mL/min；
其中，梯度洗脱为：
流动相A的体积百分比由3％耗时10min上升至40％，对应地流动相B的体积百分比由97％耗时10min下降至60％，然后改为100％流动相A冲洗2min，最后改为流动相A体积百分比3％和流动相B体积百分比97％保留3min；
进样分析质谱条件：
毛细管电压：3.5kv，锥孔电压：35kv，脱溶剂温度：500℃，脱溶剂气流量：900L/min，锥孔反吹气流量：30L/hr，碰撞室压力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，离子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，离子能量2：1.0；离子源温度：150℃，提取器电压：3.0V，入口透镜电压：0.5V，出口电压：0.5V，碰撞梯度：1.0。
特异肽标准曲线预处理方式：将合成的特异肽用水稀释，配制成系列标准曲线溶液，取10μL标准曲线溶液，依次加入10μL混合同位素特异肽溶液、10μL二硫苏糖醇溶液(100mmol/L)和845μL碳酸氢铵溶液(500mM)，混合均匀后在70℃水浴锅中孵育30min；加入10μL碘代乙酰胺(300mmol/L)溶液，混合均匀后在室温环境中避光静置30min，加入5μL甲酸溶液，通过0.22μm滤膜过滤，进样分析，分析参数同上。
样品完全酶解的验证方式：在检测过程中为每条特异肽设置一条验证肽，验证肽是以特异肽为基础，向N端或者C端延伸到下一个胰蛋白酶酶解位点。当验证肽的信号强度小于阈值时，认为该特异肽已经完全酶解。由于仪器品牌型号、状态、信号的表达方式的差异，相同浓度的验证肽在不同设备上所产生的信号也不同。所以验证肽的阈值无法是一个绝对值，而是是一个相对值，本方法将验证肽的阈值设置为对应的特异肽的1％。若验证肽信号大于阈值，需要将样品再次酶解，并且可以适量提高酶解时间和酶浓度。验证肽的分析参数见表2。
样品计算方式：蛋白质质量浓度＝特异肽的摩尔浓度×蛋白质的分子量
结果见表3
表1特异肽和同位素特异肽的检测参数
表2验证肽检测参数
表3检测结果
实施例2
用不同来源的牛奶和羊奶按照比例(质量比)配制混合样品，冷冻干燥后，在未告知浓度的情况下，以盲样形式进行检测，检测结果，参见表4。
表4
检测结果显示，测得值与设计值具有高度相关性，证实了本发明的准确性。除此之外，样品制备单位和检测单位采用不同的羊奶和牛奶用于样品制备和检测，说明本发明所选择的多肽具有普遍性，在不同来源的样品中均能获得稳定的检测结果。
实施例3
乳糖主要是牛奶、羊奶中分离纯化得到的，在配方奶粉中需要乳糖，若乳糖引入异源蛋白质，会影响产品物种源性方面的纯度和品质。
本实施例搜集了一个乳糖样品，对其中牛源性蛋白质进行检测。首先按照实施例1的方式进行检测，结果见下表。
作为优化方法，在实施例1“加入5μL甲酸溶液”步骤之后加入纯化富集操作。具体如下：
(1)用3mL的甲醇活化C18固相萃取柱；
(2)用10mL的纯水平衡C18固相萃取柱；
(3)加入5mL酶解溶液，缓速滴干后，用10mL的纯水清洗；
(4)用5mL甲醇水溶液(70/30，v/v)洗脱，搜集洗脱液后冷冻干燥；
(5)用0.5mL纯水复溶。
上述两种方法均重复三次，结果见表5。
表5
方法 平均值 标准偏差 相对标准偏差
实施例1 17.2mg/kg 8.7mg/kg 50.6％
优化后的实施例1 22.5mg/kg 1.3mg/kg 5.8％
用上述两个方法都能得到相似的检测结果，但是单纯使用实施例1所述方法会产生非常大的相对标准偏差。主要原因是在乳糖样品中蛋白质含量偏低，未经过富集，其浓度处于仪器检测范围的下限附近，虽然可以获得浓度，但是其偏差较大，难以获得较为精准的检测结果。倘若单纯使用蒸发等浓缩方式，会使样品中大量的乳糖析出，样品无法进样。本发明优选固相萃取的方式进行浓缩，可以提高样品浓度的同时，降低基质中的杂质。

Claims (9)

1.一种定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以与待测牛羊乳样品中加入蛋白酶酶解得到酶解物；
(2)对所述酶解物中验证肽和特异肽进行检测，并根据检测结果验证待测蛋白质样品的酶解效果；若通过酶解效果验证，表示特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到，则用所获得的特异肽浓度乘以待测蛋白质样品的分子量获得蛋白质的质量浓度；若未通过酶解效果验证，表示特异肽未完全从待测蛋白质样品酶解得到，则将酶解物再次进行酶解优化处理；
所述验证肽中至少含有一个或一个以上在待测蛋白质中最后被所述酶所酶解的位点；或，所述验证肽为所述特异肽向N端或者C端延长至一个或一个以上酶解位点的多肽；
(3)待特异肽已完全从待测蛋白质样品酶解得到后，将所述酶解物经由质谱检测；
(4)制作待测蛋白质的特异肽标准品溶液浓度的标准曲线；
(5)将步骤(3)得到的检测结果代入步骤(4)所述标准曲线中，获得样品的特异肽摩尔浓度，然后按下式计算获得待测蛋白质的质量浓度；
待测蛋白质的质量浓度＝待测样品中待测蛋白特异肽摩尔浓度×待测蛋白质摩尔质量；
所述待测蛋白质与其特异肽的对应关系为：
2.如权利要求1所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，在步骤(1)和步骤(4)中加入同位素标记的同位素特异肽作为内标，并且采用同位素稀释法进行检测和计算。
3.如权利要求2所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述待测蛋白质与所述同位素特异肽的对应关系为：
其中V*是[13C5,15N]-缬氨酸，I*是[13C6,15N]-异亮氨酸，L*是[13C6,15N]-亮氨酸，F*是[13C9,15N]-苯丙氨酸。
4.如权利要求1所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的N端延长至下一个酶解位点的多肽。
5.如权利要求1所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述验证肽为所述特异肽向特异肽的C端延长至下一个酶解位点的多肽。
6.如权利要求1～5任一所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述验证肽和特异肽采用液相色谱-质谱联用技术同时检测。
7.如权利要求6所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述验证肽的信号强度阈值设置为所述特异肽信号强度阈值的1％。
8.如权利要求6所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述验证肽的信噪比低于3。
9.如权利要求1所述的定量检测牛羊乳中蛋白质含量的方法，其特征在于，将所述步骤(1)中的酶解物进行富集纯化操作。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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TA01 Transfer of patent application right
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Effective date of registration: 20181112

Address after: 310000 Room 250, Building 4, 66 Dongxin Avenue, Binjiang District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Applicant after: Hangzhou spectre Test Technology Co., Ltd.

Address before: 310002 Room 401, Unit 2, 6 Yaojiang Fucun, Shangcheng District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Applicant before: Li Senkang

GR01 Patent grant
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TR01 Transfer of patent right
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Effective date of registration: 20190814

Address after: 230601 Peach Blossom Industrial Park Development Zone, Jingkai District, Hefei City, Anhui Province

Patentee after: Anhui national flat Pharmaceutical Co., Ltd.

Address before: 310000 Room 250, Building 4, 66 Dongxin Avenue, Binjiang District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Patentee before: Hangzhou spectre Test Technology Co., Ltd.

TR01 Transfer of patent right
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Effective date of registration: 20200617

Address after: 310000 No. 80 Dangke Road, Guali Town, Xiaoshan District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Patentee after: HANGZHOU PUSHENG DETECTION TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 230601 Peach Blossom Industrial Park Development Zone, Jingkai District, Hefei City, Anhui Province

Patentee before: ANHUI GUOPING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.