WO2021143501A1 - 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法 - Google Patents

一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法 Download PDF

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WO2021143501A1
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molecular weight
calibration
peptide
protein
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余捷凯
陈锡胜
栾春燕
邬建敏
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杭州汇健科技有限公司
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/96—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood or serum control standard
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to the technical field of mass spectrometry, in particular to a molecular weight calibration standard kit for polypeptide or protein spectrum detection, and a preparation method and use method thereof.
  • MALDI-MS Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry
  • MALDI-MS is a soft ionization mass spectrometry technique suitable for the analysis of biological macromolecules and mixture samples.
  • MALDI-MS has the advantages of high sensitivity and high throughput, but the analysis results are greatly affected by system errors and fluctuations in test conditions.
  • the calibration method is divided into external standard method and internal standard method.
  • the external standard method refers to the first use of molecular weight calibration standards for instrument calibration, and then the calibrated instrument to test samples; internal standard method refers to adding molecular weight calibration standards to the test sample In the sample, the calibration of the instrument and the analysis of the sample are completed in the same test.
  • the external standard method is the main method for MALDI-MS instrument to carry out molecular weight calibration. It is simple to operate, but the calibration accuracy is low and the deviation is large. Compared with the external standard method, the internal standard method has high calibration accuracy, but it needs to add standard products to each sample, the operation is cumbersome and complicated, the cost is high, and high throughput cannot be achieved. In addition, the addition of exogenous peptides to the sample may also cause ion suppression effects, which may interfere with the characteristic peaks of the sample itself.
  • Patent CN201510246677 identified 18 characteristic peaks from E. coli protein extracts as standard substances, which improved the stability of the calibration results, but the calibration method used still belongs to the external standard method, and the calibration accuracy is low.
  • Patents CN201611062751, CN201810345905, CN201810345986, CN201810346086 disclose internal standard molecular weight correction methods suitable for microbial identification. Polypeptides less than 3000 Da or greater than 12000 Da and combinations thereof are selected as internal standards to avoid the molecular weight range (3000-13000 Da) of microorganisms. Avoid interference with the map.
  • the preparation of this standard product requires the purchase of a pure polypeptide product, which is costly, and requires the cumbersome steps of adding an internal standard substance to each sample.
  • Patent CN201010271826 discloses a serum polypeptide internal standard calibration detection method, which uses a blanking method to design the internal standard so that the molecular weight of the internal standard polypeptide is located in the non-interference area of the serum polypeptide fingerprint.
  • this method is not only difficult to design an internal standard, but also makes it difficult for the molecular weight range of the internal standard to cover the molecular weight distribution of the sample, which affects the calibration accuracy.
  • Patent CN201711053836 on the basis of improving sample crystallization conditions, further provides a calibration method for sample mass spectrometry detection, using the peptide target molecules extracted from biological samples through magnetic beads as standards for molecular weight calibration to improve the accuracy of MALDI-MS detection of protein samples Rate.
  • this method still belongs to external standard calibration in operation, and does not disclose the characteristic peaks of peptide standards extracted from biological samples. There is still a problem of parallel comparison of test results from different laboratories.
  • the commercial peptide standard products on the market have a relatively high purchase cost, and the molecular weight range is about 2000-20000Da. It cannot take into account the optimization of molecular weight correction for macromolecules below 1000Da and above 10000Da. It is only suitable for microbial identification, not suitable for the molecular weight distribution range. Broad biological sample peptide or protein spectrum detection. Both the external standard method and the internal standard method for peptide molecular weight correction have their own disadvantages. There is a lack of a molecular weight correction method that can combine the advantages of the external standard method and the internal standard method, as well as a standard substance that is suitable for the detection of peptide or protein spectra of a variety of biological samples and is easy to prepare. The present invention solves such problems.
  • the purpose of the present invention is to provide a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein spectrum detection and its preparation method and use method.
  • the kit is suitable for MALDI ion source mass spectrometer and is suitable for Microbial identification, multiple body fluid peptide biopsy and other applications; the calibration method can combine the advantages of the external standard method and the internal standard method to achieve high-precision molecular weight calibration, while avoiding the addition of exogenous internal standards to the sample to affect the peptide fingerprint The potential impact of the map.
  • a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein spectrum detection including: polypeptide or protein dry powder standard, dry powder solution, matrix solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; polypeptide or protein
  • the ratio of dry powder standard product to matrix is: 1-6 parts of polypeptide or protein dry powder correspond to 10 parts of matrix.
  • the ratio of the standard product to the matrix is: 3 parts of peptide or protein dry powder correspond to 10 parts of the matrix.
  • a method for preparing a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein profile detection includes the following steps:
  • Step two determination of peptide molecular weight in peptide or protein dry powder standard:
  • Step 3 Configure the kit according to the following formula
  • the formula includes: peptide or protein dry powder standard, dry powder dissolving solution, matrix dissolving solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; the ratio of peptide or protein dry powder standard to matrix: 1-6 peptides Or dry protein powder corresponds to 10 parts of base.
  • the aforementioned method for preparing a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein spectrum detection uses an internal standard method to determine the precise molecular weight of each mass spectrum peak in a polypeptide or protein dry powder standard, and the obtained commercial standard quality peak includes 1047.189 ,1297.486,1348.642,1620.860,2094.427,2466.681,3149.573,5734.518,8565.764, to determine the exact molecular weight list of the peptide or protein dry powder standard peaks of the sample, and its mass-to-charge ratio m/z includes: 740.794, 1261.149, 1464.466, 1546.126, 1619.143, 1866.072, 2105.486, 2932.861, 2952.661, 3956.030, 4209.784, 4282.591, 4643.866, 5004.361, 5336.789, 5904.466, 7765.637, 9288.273.
  • the preparation method of the aforementioned molecular weight calibration standard kit for peptide or protein profile detection includes: 740.794, 1261.149, 1461.466, 1546.126, 2105.486, 2952.661, 3956.030, 4209.784, 5004.361, 5336.789, 5904.466, 9288.273.
  • the molecular weight internal standard calibration list is: 740.794, 1546.126, 2105.486, 4209.784, 5904.466, 7765.637, 9288.273.
  • a method for using a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein profile detection including: two-step calibration of the sample to be tested with external standard and internal standard;
  • Step one calibration of the peptide or protein profile of the sample to be tested by the external standard method:
  • Test on the computer collect the spectrum of the peptide standard, call the molecular weight external standard calibration list on the mass spectrometer to calibrate the molecular weight of the mass spectrometer, and after the external standard calibration is completed, collect the spectrum of the sample to be tested;
  • Step two the mass spectrum data of the sample to be tested that has been calibrated and collected by the external standard method is further calibrated by the internal standard method:
  • the internal standard method calibration process is: call the molecular weight internal standard calibration list, and in the sample mass spectrum, the error between the reference molecular weight (reference mass) in the list and the current mass of the corresponding test sample (current mass) is linear or quadratic Curve fitting establishes a calibration curve and applies it to the entire spectrum data;
  • the micro/nano structure material or solid phase extraction column includes: porous silicon material, surface-modified porous silicon material with functional groups, Magnetic particles, surface-modified magnetic particles with functional groups or solid phase extraction columns.
  • the samples include: human or mammalian serum, saliva, urine, sweat, cerebrospinal fluid, bacterial lysate, tissue lysate, cell Lysis solution.
  • the mass spectrometer is a MALDI ion source mass spectrometer.
  • the preparation method of molecular weight calibration standards of the present invention is not only low-cost, but also can selectively prepare calibrators according to specific calibration purposes;
  • the molecular weight correction method of the present invention has the simplicity of operation of the external standard method and the high precision of the internal standard method, and at the same time, it can avoid the potential impact of adding an external internal standard substance to the sample on the polypeptide fingerprint map;
  • the molecular weight correction kit of the present invention can cover the molecular weight correction of peptide maps and protein maps below 1000 Da, between 1000 Da and 10000 Da, and above 10000 Da;
  • the kit of the invention can be applied to a MALDI ion source mass spectrometer, and is suitable for applications such as microbial identification, biopsy of multiple body fluid polypeptide profiles and the like.
  • FIG. 1 is a peak spectrum diagram of the commercial internal standard product and the molecular weight calibration standard product of Example 1 of the present invention after being mixed;
  • Figure 2 is a peak spectrum of the molecular weight calibration standard of Example 1 of the present invention.
  • Fig. 3 is the peak accuracy of the molecular weight calibration standard of Example 1 of the present invention.
  • Figure 4 shows the peak stability of the molecular weight calibration standard of Example 1 of the present invention.
  • a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein spectrum detection including: polypeptide or protein dry powder standard, dry powder solution, matrix solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; polypeptide or protein
  • the ratio of dry powder standard product to matrix is: 1-6 parts of polypeptide or protein dry powder correspond to 10 parts of matrix.
  • a method for preparing a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein profile detection includes the following steps:
  • the eluent is 30-60% CAN and 0.5-5% TFA;
  • Step two determination of peptide molecular weight in peptide or protein dry powder standard:
  • the internal standard method is used to determine the precise molecular weight of each mass spectrum peak in the peptide or protein dry powder standard, and the commercial standard quality peaks obtained are 1047.1189, 1297.486, 1346.642, 1620.860, 2094.427, 2466.681, 3149.573, 5734.518, 8565.764 From this, the exact molecular weight list of the peptide or protein dry powder standard peaks of the sample is determined, and the mass-to-charge ratio m/z are: 740.794, 1261.149, 1461.466, 1546.126, 1619.143, 1186. , 4643.866, 5004.361, 5336.789, 5904.646, 7765.637, 9288.273;
  • molecular weight calibration standards of the present invention is not exhaustive. As an example, it can also be 1546.126, 3956.030, 4209.784, 5904.466, 9288.273, or 740.794, 1546.126, 2105.486, 2952.661, 3956.030 , 4209.784, 4643.866, 5004.361, 5336.789, 5904.646, 7765.637, 9288.273.
  • the molecular weight external standard calibration list is: 740.794, 1261.149, 1466.466, 1546.126, 2105.486, 2952.661, 3956.030, 4209.784, 5004.361, 5336.789, 5904.466, 9288.273, a total of 12 calibration peaks;
  • the molecular weight internal standard calibration list is: 740.794, 1546.126, 2105.486, 4209.784, 5904.646, 7765.637, 9288.273, a total of 7 calibration peaks.
  • Step 3 Configure the kit according to the following formula
  • the formula includes: peptide or protein dry powder standard, dry powder dissolving solution, matrix dissolving solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; the ratio of peptide or protein dry powder standard to matrix: 1-6 peptides Or dry protein powder corresponds to 10 parts of base.
  • a method for using a molecular weight calibration standard kit for peptide or protein profile detection including: two-step calibration of the sample to be tested with external standard and internal standard;
  • Step 1 Calibration of the peptide or protein profile of the sample to be tested by the external standard method
  • the micro/nano structure material includes: amino-modified porous silicon material, carboxyl-modified porous silicon material, metal-modified porous silicon material, amino-modified magnetic beads, carboxyl-modified magnetic beads, and metal-modified magnetic beads; :
  • the present invention does not exhaustively list the micro/nano structured materials, as long as they are applicable to the present invention, they are all within the protection scope of the present invention;
  • the sample includes: human or Mammal serum, saliva, urine, sweat, cerebrospinal fluid, bacterial lysate, tissue lysate, cell lysate; it should be noted that the present invention does not exhaustively list biological samples, as long as they are applicable to the present invention All biological samples are within the protection scope of the present invention.
  • Test on the computer collect the spectrum of the peptide standard, call the molecular weight external standard calibration list on the mass spectrometer to calibrate the molecular weight of the mass spectrometer, and after the external standard calibration is completed, collect the spectrum of the sample to be tested;
  • Step two the mass spectrum data of the sample to be tested that has been calibrated and collected by the external standard method is further calibrated by the internal standard method;
  • the internal standard method calibration process is: call the molecular weight internal standard calibration list, and in the sample mass spectrum, the error between the reference molecular weight (reference mass) in the list and the current mass of the corresponding test sample (current mass) is linear or quadratic Curve fitting establishes a calibration curve and applies it to the entire spectrum data;
  • Kit peptide or protein dry powder standard, dry powder dissolving solution, matrix dissolving solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; the ratio of peptide or protein dry powder standard to matrix is 3:10;
  • the mass spectrometer molecular weight calibration standard kit for the detection of human serum peptide or protein spectrum is used to calibrate the accurate molecular weight of the external standard and internal standard of the serum peptide spectrum:
  • Example 2 1) Take the standard serum sample prepared in Example 1.1 and the mesoporous material for incubation, centrifugation, washing and other steps to obtain a mesoporous material sample enriched with polypeptides, spot and dry. At the same time, take the molecular weight calibration standard prepared in Example 1 and mix with the matrix solution, spot and dry;
  • Algorithm internal standard correction select 740.794, 1546.126, 2105.486, 4209.784, 5904.646, 7765.637, 9288.273 as the internal standard molecular weight correction list. Import the data of multiple serum peptide maps that have been tested into the algorithm program, compare the detection value of the calibration peak in the sample with the given standard value, establish a calibration curve, and apply it to all the peaks of this sample to achieve the internal content of the sample. Standard method correction. The calibration results can be evaluated by algorithms. Table 1 lists the molecular weight deviation (ppm) of each calibration peak to evaluate the molecular weight deviation of the sample serum peptide spectrum.
  • ppm molecular weight deviation
  • Example 2 Only the formula of the kit is different from Example 1;
  • the kit includes: peptide or protein dry powder standard, dry powder solution, matrix solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; the ratio of peptide or protein dry powder standard to matrix is 1:10;
  • the mass spectrometer molecular weight calibration standard kit for the detection of human serum peptide or protein spectrum is used to calibrate the accurate molecular weight of the external standard and internal standard of the serum peptide spectrum:
  • Example 2 1) Take the standard serum sample prepared in Example 1.1 and the mesoporous material for incubation, centrifugation, washing and other steps to obtain a mesoporous material sample enriched with polypeptides, spot and dry. At the same time, take the molecular weight calibration standard prepared in Example 1 and mix with the matrix solution, spot and dry;
  • Algorithm internal standard correction select 1546.126, 2105.486, 4209.784, 5904.646, 7765.637, 9288.273 as the internal standard molecular weight correction list. Import the data of multiple serum peptide maps that have been tested into the algorithm program, compare the detection value of the calibration peak in the sample with the given standard value, establish a calibration curve, and apply it to all the peaks of this sample to achieve the internal content of the sample. Standard method correction. The calibration results can be evaluated by algorithms. Table 2 lists the molecular weight deviation (ppm) of each calibration peak to evaluate the molecular weight deviation of the sample serum peptide spectrum.
  • Example 3 Only the formula of the kit is different from Example 1;
  • the kit includes: peptide or protein dry powder standard, dry powder solution, matrix solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; the ratio of polypeptide or protein dry powder standard to matrix is 6:10;
  • the mass spectrometer molecular weight calibration standard kit for the detection of human serum peptide or protein spectrum is used to calibrate the accurate molecular weight of the external standard and internal standard of the serum peptide spectrum:
  • Example 2 1) Take the standard serum sample prepared in Example 1.1 and the mesoporous material for incubation, centrifugation, washing and other steps to obtain a mesoporous material sample enriched with polypeptides, spot and dry. At the same time, take the molecular weight calibration standard prepared in Example 1 and mix with the matrix solution, spot and dry;
  • Algorithm internal standard calibration select 740.794, 2105.486, 5004.361, 7765.637, 9288.273 as the internal standard molecular weight calibration list. Import the data of multiple serum peptide maps that have been tested into the algorithm program, compare the detection value of the calibration peak in the sample with the given standard value, establish a calibration curve, and apply it to all the peaks of this sample to achieve the internal content of the sample. Standard method correction. The calibration results can be evaluated by algorithms. Table 2 lists the molecular weight deviation (ppm) of each calibration peak to evaluate the molecular weight deviation of the sample serum peptide spectrum.
  • Comparative Example The selected list is different from Example 1, and everything else is the same.
  • the kit includes: peptide or protein dry powder standard, dry powder solution, matrix solution, matrix, molecular weight external standard calibration list, molecular weight internal standard calibration list; the ratio of peptide or protein dry powder standard to matrix is 3:10;
  • the mass spectrometer molecular weight calibration standard kit for the detection of human serum peptide or protein spectrum is used to calibrate the accurate molecular weight of the external standard and internal standard of the serum peptide spectrum:
  • Example 2 1) Take the standard serum sample prepared in Example 1.1 and the mesoporous material for incubation, centrifugation, washing and other steps to obtain a mesoporous material sample enriched with polypeptides, spot and dry. At the same time, take the molecular weight calibration standard prepared in Example 1 and mix with the matrix solution, spot and dry;
  • Algorithm internal standard correction select 740.794, 1546.126, 2105.486, 4209.784, 5904.646, 7765.637, 9288.273 as the internal standard molecular weight correction list. Import the data of multiple serum peptide maps that have been tested into the algorithm program, compare the detection value of the calibration peak in the sample with the given standard value, establish a calibration curve, and apply it to all the peaks of this sample to achieve the internal content of the sample. Standard method correction. The calibration results can be evaluated by algorithms. Table 1 lists the molecular weight deviation (ppm) of each calibration peak to evaluate the molecular weight deviation of the sample serum peptide spectrum.
  • ppm molecular weight deviation
  • kits in the formula range of the present invention can achieve accurate molecular weight external standard and internal standard calibration.
  • the volume ratio of peptide or protein dry powder solution to matrix solution is 3:10, which is the best formula. The reason is that the mass spectrum has the most peaks, and the molecular weight correction is more comprehensive and accurate. If the peptide concentration of other formulas is too low or too high, it will affect the peaking of the mass spectrum, thereby reducing the calibration ability.
  • the preparation method of the molecular weight calibration standard of the present invention is not only low-cost, but also can selectively prepare calibrators according to specific calibration purposes; the molecular weight calibration method has the simplicity of operation of the external standard method and the high precision of the internal standard method, and also It can avoid the potential impact of adding exogenous internal standards to the sample on the peptide fingerprint; the kit can be applied to MALDI ion source mass spectrometers, and is suitable for applications such as microbial identification and body fluid peptide spectroscopy.

Abstract

一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法，试剂盒包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质；试剂盒的制备方法不仅低成本，且可以根据具体的校准目的选择性的制备校准品，分子量校正兼顾小分子和大分子范围；分子量校正方法具有外标法的操作简便性和内标法的高精度性，同时还可避免在样本中添加外源性内标物对多肽指纹图谱的潜在性影响；试剂盒可适用于基于质谱技术的液体活检、微生物鉴定等应用场景。

Description

一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法 技术领域
本发明涉及质谱技术领域，特别是一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法。
背景技术
基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)是一种软电离质谱技术，适合于生物大分子及混合物样本的分析。与其他分析方法相比，MALDI-MS具有高灵敏度、高通量的优势，但分析结果受系统误差和测试条件波动的影响较大。为了提高分析结果的准确度，一般需要通过标准品对仪器进行分子量校正。校正方法分为外标法和内标法，外标法是指首先使用分子量校正标准品进行仪器校正，再用经过校正的仪器测试样本；内标法是指将分子量校正标准品添加到待测的样本中，在同一次测试中同时完成对仪器的校正和对样本的分析。外标法是MALDI-MS仪器进行分子量校正的主要方法，操作简单，但校正精度低，偏移大。与外标法相比，内标法校正精度高，但需要在每个样本中添加标准品，操作繁琐复杂，成本高，无法实现高通量。此外，在样本中添加外源性多肽，还可能发生离子抑制效应，干扰样本本身的特征峰。
目前MALDI-MS仪器在微生物鉴定上的应用已较为成熟，微生物鉴定用的分子量标准品通常采用菌落或其提取物。专利CN201510246677从大肠杆菌蛋白提取物中鉴定出18条特征峰作为标准物，改善了校正结果的稳定性，但其采用的校正方法仍然属于外标法，校正精度较低。专利CN201611062751、CN201810345905、CN201810345986、CN201810346086公开了适用于微生物鉴定的内标分子量校正方法，选择小于3000Da或大于12000Da的多肽及其组合作为内标物，避开微生物的分子量区间(3000-13000Da)，以避免对图谱的干扰。但该标准品的制备需要购买多肽纯品，成本较高，且需要在每个样本中添加内标物的繁琐操作步骤。
与微生物样本相比，生物样本如血清中的多肽或蛋白分子量范围更大(700-20000Da)，在设计内标物时，则更难以避开对血清多肽指纹图谱的影响。专利CN201010271826公开了一种血清多肽内标校正检测方法，使用插空法设计内标，使内标多肽的分子量位于血清多肽指纹图谱的无干扰区域。然而该方法设计内标不仅难度较大，而且使得内标分子量范围难以覆盖样本的分子量分布，影响校正精度。专利CN201711053836在改善样本结晶条件的基础上，进一步提供一种样本质谱检测的校正方法，使用生物样本经过磁珠提取的多肽靶分子作为标准品进行分子量校正，以提高MALDI-MS检测蛋白样本的准确率。然而该方法在操作上仍然 属于外标校正，且没有公开从生物样本中提取的多肽标准品的特征峰，仍然存在不同实验室检测结果的平行性对比问题。
目前市面上的商品化多肽标准品购买成本较高，且分子量范围在2000-20000Da左右，无法兼顾1000Da以下和10000Da以上大分子的分子量校正优化，仅适用于微生物鉴定，不适用于分子量分布范围较宽的生物样本肽谱或蛋白谱检测。多肽分子量校正的外标法与内标法都各有弊端。缺少一种能够结合外标法与内标法优势的分子量校正方法，以及适用于多种生物样本肽谱或蛋白谱检测、易于制备的标准品，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法，试剂盒适用于MALDI离子源质谱仪，并适用于微生物鉴定、多种体液多肽谱活检等应用场合；校正方法能够结合外标法与内标法优势，实现高精度的分子量校正，同时还可避免在样本中添加外源性内标物对多肽指纹图谱的潜在性影响。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
前述一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：3份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，多肽或蛋白干粉标准品的制备：
1)将多例样本等体积混合，制备大量标准样本；
2)使用微米/纳米结构材料或固相萃取柱处理标准样本获得含有多肽、蛋白质的溶液；
3)将含有多肽、蛋白质的溶液冷冻真空干燥，得到多肽或蛋白干粉标准品；
步骤二，多肽或蛋白干粉标准品中多肽分子量的测定：
1)用干粉溶解液溶解多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品做为内标，制备成含内标的肽标准品溶液；
2)将含内标的肽标准品溶液与基质溶液混合后点靶，干燥；
3)将靶板放入质谱仪中进行检测，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精 确分子量；
4)挑选出峰强度高、稳定的质谱峰在质谱仪控制软件内建立分子量外标校正列表和分子量内标校正列表；
步骤三，按照如下配方配置试剂盒；
配方包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量，得到的商业化标准品质谱峰包括1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此确定样本的多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z包括：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。
前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，分子量外标校正列表包括：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273。
前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，分子量内标校正列表为：740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273。
一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，包括：对待测的样本进行外标、内标两步法校正；
具体包括如下步骤：
步骤一，对待测的样本的多肽或蛋白谱的外标法校正：
1)获取多个待测的样本中的多肽、蛋白质；
2)用干粉溶解液溶解一份多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液；
3)用基质溶解液溶解基质得到基质溶液，分别加入待测样本溶液和肽标准品溶液中，点样到同一块靶板上、干燥；
4)上机测试，对肽标准品采谱，调用质谱仪器上的分子量外标校正列表对质谱仪进行分子量校正，完成外标校正后，对待测的样本进行采谱；
步骤二，对经过外标法校正并采集的待测的样本质谱数据进一步用内标法校正：
1)内标法校正过程为：调用分子量内标校正列表，在样本质谱图中将列表中的参考分子量(reference mass)与对应的检测样本当前分子量(current mass)的误差按照线性或二次方程 曲线拟合建立校正曲线，并应用到整个图谱数据中；
误差的计算方法：
(current mass-reference mass)；
2)使用相对误差ppm值对校正结果进行评估，列出每个校正峰的分子量偏移ppm值；
相对误差ppm值的计算方法：
Figure PCTCN2020140049-appb-000001
前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，微米/纳米结构材料或固相萃取柱包括：多孔硅材料、表面修饰的带有功能基团的多孔硅材料、磁性颗粒、表面修饰的带有功能基团的磁性颗粒或固相萃取柱。
前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，样本包括：人或哺乳动物的血清、唾液、尿液、汗液、脑脊液，细菌的裂解液、组织裂解液，细胞裂解液。
前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，微米/纳米结构材料富集多个待测的样本中的多肽、蛋白质时，样本、超纯水、微米/纳米结构材料的混合比例为V:V:M＝100-200uL:900-800uL:0.5-1mg。
前述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，质谱仪为MALDI离子源质谱仪。
本发明的有益之处在于：
本发明的分子量校正标准品的制备方法不仅低成本，且可以根据具体的校准目的选择性的制备校准品；
本发明的分子量校正方法具有外标法的操作简便性和内标法的高精度性，同时还可避免在样本中添加外源性内标物对多肽指纹图谱的潜在性影响；
本发明的分子量校正试剂盒可以涵盖1000Da以下，1000-10000Da之间以及10000Da以上的肽谱和蛋白谱的分子量校正；
本发明的试剂盒可适用于MALDI离子源质谱仪，并适用于微生物鉴定、多种体液多肽谱活检等应用场合。
附图说明
图1是本发明的实施例1的商业化内标品与分子量校正标准品混合后出峰谱图；
图2是本发明的实施例1的分子量校正标准品出峰图谱；
图3是本发明的实施例1的分子量校正标准品出峰精度；
图4是本发明的实施例1的分子量校正标准品出峰稳定性。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，多肽或蛋白干粉标准品的制备：
1)将多例样本等体积混合，制备大量标准样本；
2)使用纳米材料富集标准样本中的多肽、蛋白质，并用洗脱液洗脱；作为一种实施例，洗脱液为30-60％CAN和0.5-5％TFA；
3)将多肽洗脱液冷冻真空干燥，得到多肽或蛋白干粉标准品；
步骤二，多肽或蛋白干粉标准品中多肽分子量的测定：
1)用干粉溶解液溶解多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品做为内标，制备成含内标的肽标准品溶液；
2)将含内标的肽标准品溶液与基质溶液混合后点靶，干燥；
3)将靶板放入质谱仪中进行检测，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量；
作为一种优选，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量，得到的商业化标准品质谱峰为1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此确定样本的多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273；
需要说明的是：本发明的分子量校正标准品列表并未进行穷举，作为一种实施例，还可以是1546.126、3956.030、4209.784、5904.646、9288.273，还可以是740.794、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。
4)挑选出峰强度高、稳定的质谱峰在质谱仪控制软件内建立分子量外标校正列表和分子量内标校正列表；
作为一种实施例，分子量外标校正列表为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、 2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273，共12个校正峰；
作为一种实施例，分子量内标校正列表为：740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273，共7个校正峰。
步骤三，按照如下配方配置试剂盒；
配方包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，包括：对待测的样本进行外标、内标两步法校正；
具体包括如下步骤：
步骤一，对待测的样本的多肽或蛋白谱的外标法校正；
1)使用纳米材料富集多个待测的样本中的多肽、蛋白质，作为一种实施例，样本、超纯水、纳米材料的混合比例为V:V:M＝100-200uL:900-800uL:0.5-1mg。
作为一种实施例，微米/纳米结构材料包括：氨基修饰多孔硅材料、羧基修饰多孔硅材料、金属修饰多孔硅材料、氨基修饰磁珠、羧基修饰磁珠、金属修饰磁珠；需要说明的是：本发明并未对微米/纳米结构材料进行穷举，只要是能够适用于本发明的微米/纳米结构材料，都在本发明的保护范围之内；作为一种实施例，样本包括：人或哺乳动物的血清、唾液、尿液、汗液、脑脊液，细菌的裂解液、组织裂解液，细胞裂解液；需要说明的是：本发明并未对生物样本进行穷举，只要是能够适用于本发明的生物样本，都在本发明的保护范围之内。
2)用干粉溶解液溶解多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液；
3)用基质溶解液溶解基质得到基质溶液，分别加入待测-样本溶液和肽标准品溶液中，点样到同一块靶板上、干燥；
4)上机测试，对肽标准品采谱，调用质谱仪器上的分子量外标校正列表对质谱仪进行分子量校正，完成外标校正后，对待测的样本进行采谱；
步骤二，对经过外标法校正并采集的待测的样本质谱数据进一步用内标法校正；
1)内标法校正过程为：调用分子量内标校正列表，在样本质谱图中将列表中的参考分子量(reference mass)与对应的检测样本当前分子量(current mass)的误差按照线性或二次方程曲线拟合建立校正曲线，并应用到整个图谱数据中；
误差的计算方法：
(current mass-reference mass)；
2)使用相对误差ppm值对校正结果进行评估，列出每个校正峰的分子量偏移ppm值；相对误差ppm值的计算方法：
Figure PCTCN2020140049-appb-000002
以下通过实验验证本发明的效果：
实施例1：
试剂盒，多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为3：10；
一，制备人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品：
1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800uL混合均匀，并按120uL/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；
2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为V:V:M＝100-200uL:900-800uL:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；
3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％CAN、0.5-5％TFA的洗脱液1-1.2mL，振荡10-30min洗脱；
4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；
5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。
二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：
1)100-200uL超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3uL/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；
2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品Protein Calibration Standard I和Peptide Calibration Standard II(Bruker,Germany)做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入10uL基质溶液充分混合；
3)在MALDI-TOF靶板上点靶1-2uL，干燥，上机测试；
4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化校准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。
15)取肽标准品溶液与5-10uL基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、 干燥、上机测试，如附图2所示。以其中一个点样孔做为校准孔，以上文所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。如附图3、4所示，各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。
三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：
1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273，共12个校准峰。
2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；
3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；
4)算法内标校正：选取740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表1列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。
表1
序号 Sample 740.8 1546.1 2105.5 4209.8 5904.6 7765.6 9288.3
1 S_01_A_SD54_B1_From_B1_165214.txt 320 284 178 378 275 72 436
2 S_01_A_SD54_B5_From_B5_170513.txt 228 154 116 268 311 53 329
3 S_01_A_SD54_B12_From_B12_172036.txt 219 225 197 299 260 53 329
实施例2：与实施例1只有试剂盒的配方不同；
试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为1：10；
一，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品制备：
1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800uL混合均匀，并按120uL/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；
2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为V:V:M＝100-200uL:900-800uL:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；
3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％CAN、0.5-5％TFA的洗脱液1-1.2mL，振荡10-30min洗脱；
4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；
5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。
二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：
1)100-200uL超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3uL/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；
2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入布鲁克标准品做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入30uL基质溶液充分混合；
3)在MALDI-TOF靶板上点靶1-2uL，干燥，上机测试；
4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化标准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：1546.126、1619.143、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。
5)取2.1标准溶液与5-10uL基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、干燥、上机测试。以其中一个点样孔做为校准孔，以2.4所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。
三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：
1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273，共9个校准峰。
2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；
3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；
4)算法内标校正：选取1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正 峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表2列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。
表2
序号 Sample 1546.1 2105.5 4209.8 5904.6 7765.6 9288.3
1 A_01_A_SD54_B1_From_B1_SD54_spectrum.txt 264 12 275 2408 208 1643
2 A_01_A_SD54_B5_From_B5_SD54_spectrum.txt 363 12 45 0 42 1955
3 A_01_A_SD54_B12_From_B12_SD54_spectrum.txt 892 1396 1429 1426 1334 497
4 A_01_A_SD72_B3_From_B3_SD72_spectrum.txt 363 12 186 0 167 2059
5 A_01_A_SD72_B7_From_B7_SD72_spectrum.txt 264 12 275 0 208 1539
实施例3：与实施例1只有试剂盒的配方不同；
试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为6：10；
一，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品制备：
1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800uL混合均匀，并按120uL/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；
2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为V:V:M＝100-200uL:900-800uL:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；
3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％CAN、0.5-5％TFA的洗脱液1-1.2mL，振荡10-30min洗脱；
4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；
5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。
二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：
1)100-200uL超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3uL/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；
2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品Protein Calibration Standard I和Peptide Calibration Standard II(Bruker,Germany)做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入5uL基质溶液充分混合；
3)在MALDI-TOF靶板上点靶1-2uL，干燥，上机测试；
4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化标准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、 1466.466、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、4282.591、5004.361、5336.789、7765.637、9288.273。
5)取2.1标准溶液与5-10uL基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、干燥、上机测试。以其中一个点样孔做为校准孔，以2.4所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。
三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：
1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：740.794、1261.149、1466.466、2105.486、2952.661、5004.361、5336.789、9288.273，共8个校准峰。
2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；
3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；
4)算法内标校正：选取740.794、2105.486、5004.361、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表2列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。
表3
序号 Sample 740.8 2105.5 4209.8 5004.4 7765.6 9288.3
1 B_01_A_OG6_A2_From_A2_142031.txt 844 1032 367 712 172 176
2 B_01_A_OG6_A8_From_A8_143422.txt 844 1494 367 733 172 176
3 B_01_A_OG6_A10_From_A10_144451.txt 844 1032 598 690 172 68
对比实施例：选择的列表与实施例1不同，其他全部一样。
试剂盒，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为3：10；
一，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品制备：
1)根据年龄、性别选取健康体检血清样本50例，每个样本各取800uL混合均匀，并按120uL/管分装至离心管中，-80℃保存，做为标准血清样本；
2)将标准血清样本、超纯水、介孔材料混合,(混合比例为 V:V:M＝100-200uL:900-800uL:0.5-1mg)，进行孵育、离心、清洗等步骤；
3)向富集了多肽、蛋白的介孔材料中加入30-60％CAN、0.5-5％TFA的洗脱液1-1.2mL，振荡10-30min洗脱；
4)离心分离洗脱液与介孔材料，将洗脱液转移至试剂瓶中，-80℃冻存10-30h；
5)将含有多肽、蛋白的洗脱液于冻干机中冻干1-4h，获得多肽、蛋白干粉，即分子量校正标准品。
二，分子量校正标准品中多肽分子的精确分子量测定：
1)100-200uL超纯水加入上述制备的校正标准品试剂瓶中，振荡充分溶解，3uL/管分装，-80℃冻存，制备标准溶液；
2)用干粉溶解液溶解标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品Protein Calibration Standard I和Peptide Calibration Standard II(Bruker,Germany)做为内标得到混合液，制备成含内标分子量校正标准品，并加入10uL基质溶液充分混合；
3)在MALDI-TOF靶板上点靶1-2uL，干燥，上机测试；
4)在反射模式下，进行多肽标准品内标校准，商业化校准品质谱峰分别为：1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此可确定多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z分别为：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、7765.637、9288.273。
5)取2.1标准溶液与5-10uL基质溶液混合(不含商业化标准品)，点靶(约10个点样孔)、干燥、上机测试。以其中一个点样孔做为校准孔，以2.4所列的标准品精确分子量列表进行分子量校准。测试其他点样孔样本，评估分子量列表中各峰的出峰精度及出峰稳定性。各峰出峰精度、稳定性均控制在100ppm左右。
三，人血清肽或蛋白质谱检测用质谱仪分子量校正标准品试剂盒对血清肽谱外标、内标精确分子量的校正：
1)在质谱仪上建立分子量校正标准品列表：1546.126、3956.030、4209.784、5904.646、9288.273，共5个校准峰。
2)取实施例1.1制备的标准血清样本与介孔材料进行孵育、离心、清洗等步骤，获得富集了多肽的介孔材料样本，点样、干燥。同时，取实施例1制备的分子量校正标准品与基质溶液混合，点样、干燥；
3)上机测试。对分子量校正标准品采谱，使用分子量校正标准品列表进行分子量校正，完成外标校正后，对血清样本进行采谱；
4)算法内标校正：选取740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273做为内标分子量校正列表。将已经检测完毕的多个血清肽谱数据导入算法程序中，对照校正峰在样本中的检测值和给定的标准值，建立校正曲线，并应用到此样本的所有峰中，实现样本的内标法校正。校正结果可通过算法进行评估，如表1列出了每个校正峰的分子量偏移(ppm)对样本血清肽谱的分子量偏移评估。
表4
序号 Sample 740.8 1546.1 2105.5 4209.8 5904.6 7765.6 9288.3
13 S_03_A_SG4_H6_From_H6_175010.txt 3157 2284 778 378 638 72 544
14 S_03_A_SG4_H8_From_H8_175147.txt 1841 2284 841 608 311 53 329
15 S_03_A_SG4_H11_From_H11_180312.txt 1841 2915 778 608 613 53 329
结果分析：
通过实施例1-3的结果可知，本发明的配方范围的试剂盒均能实现精准的分子量外标、内标校准。
多肽或蛋白干粉溶液与基质溶液体积配比为3：10为最佳配方，原因是质谱峰出峰最多，分子量校正更加全面，更加精准。其他配方的多肽浓度太低或太高，均会影响质谱出峰，从而降低校准能力。
通过实施例1和对比实施例可知：本发明选择的列表覆盖的分子量校准范围更广，校准精度更高。分子量校准为非线性关系，无法对校准范围外的质谱峰实现精确校准。
本发明的分子量校正标准品的制备方法不仅低成本，且可以根据具体的校准目的选择性的制备校准品；分子量校正方法具有外标法的操作简便性和内标法的高精度性，同时还可避免在样本中添加外源性内标物对多肽指纹图谱的潜在性影响；试剂盒可适用于MALDI离子源质谱仪，并适用于微生物鉴定、体液肽谱等应用场合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (11)

  1. 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，其特征在于，包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
  2. 根据权利要求1所述一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒，其特征在于，多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：3份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
  3. 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
    步骤一，多肽或蛋白干粉标准品的制备：
    1)将多例样本等体积混合，制备大量标准样本；
    2)使用微米/纳米结构材料或固相萃取柱处理标准样本获得含有多肽、蛋白质的溶液；
    3)将含有多肽、蛋白质的溶液冷冻真空干燥，得到多肽或蛋白干粉标准品；
    步骤二，多肽或蛋白干粉标准品中多肽分子量的测定：
    1)用干粉溶解液溶解多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液，在肽标准品溶液中加入商业化标准品做为内标，制备成含内标的肽标准品溶液；
    2)将含内标的肽标准品溶液与基质溶液混合后点靶，干燥；
    3)将靶板放入质谱仪中进行检测，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量；
    4)挑选出峰强度高、稳定的质谱峰在质谱仪控制软件内建立分子量外标校正列表和分子量内标校正列表；
    步骤三，按照如下配方配置试剂盒；
    配方包括：多肽或蛋白干粉标准品，干粉溶解液，基质溶解液，基质，分子量外标校正列表、分子量内标校正列表；多肽或蛋白干粉标准品与基质的配比为：1-6份多肽或蛋白干粉对应10份基质。
  4. 根据权利要求3所述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，其特征在于，用内标法确定多肽或蛋白干粉标准品中各质谱峰的精确分子量，得到的商业化标准品质谱峰包括1047.189、1297.486、1348.642、1620.860、2094.427、2466.681、3149.573、5734.518、8565.764，由此确定样本的多肽或蛋白干粉标准品峰精确分子量列表，其质荷比m/z包括：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、1619.143、1866.072、2105.486、2932.861、2952.661、3956.030、4209.784、4282.591、4643.866、5004.361、5336.789、5904.646、 7765.637、9288.273。
  5. 根据权利要求3所述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，其特征在于，分子量外标校正列表包括：740.794、1261.149、1466.466、1546.126、2105.486、2952.661、3956.030、4209.784、5004.361、5336.789、5904.646、9288.273。
  6. 根据权利要求3所述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的制备方法，其特征在于，分子量内标校正列表为：740.794、1546.126、2105.486、4209.784、5904.646、7765.637、9288.273。
  7. 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：对待测的样本进行外标、内标两步法校正；
    具体包括如下步骤：
    步骤一，对待测的样本的多肽或蛋白谱的外标法校正：
    1)获取多个待测的样本中的多肽、蛋白质；
    2)用干粉溶解液溶解一份多肽或蛋白干粉标准品得到肽标准品溶液；
    3)用基质溶解液溶解基质得到基质溶液，分别加入待测样本溶液和肽标准品溶液中，点样到同一块靶板上、干燥；
    4)上机测试，对肽标准品采谱，调用质谱仪器上的分子量外标校正列表对质谱仪进行分子量校正，完成外标校正后，对待测的样本进行采谱；
    步骤二，对经过外标法校正并采集的待测的样本质谱数据进一步用内标法校正：
    1)内标法校正过程为：调用分子量内标校正列表，在样本质谱图中将列表中的参考分子量(reference mass)与对应的检测样本当前分子量(current mass)的误差按照线性或二次方程曲线拟合建立校正曲线，并应用到整个图谱数据中；
    误差的计算方法：
    (current mass-reference mass)；
    2)使用相对误差ppm值对校正结果进行评估，列出每个校正峰的分子量偏移ppm值；
    相对误差ppm值的计算方法：
    Figure PCTCN2020140049-appb-100001
  8. 根据权利要求3或7所述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，其特征在于，所述微米/纳米结构材料或固相萃取柱包括：多孔硅材料、表面修饰的带有功能基团的多孔硅材料、磁性颗粒、表面修饰的带有功能基团的磁性颗粒或固相萃取柱。
  9. 根据权利要求3或7所述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，其特征在于，所述样本包括：人或哺乳动物的血清、唾液、尿液、汗液、脑脊液，细菌的裂解液、组织裂解液，细胞裂解液。
  10. 根据权利要求3或7所述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，其特征在于，微米/纳米结构材料富集多个待测的样本中的多肽、蛋白质时，样本、超纯水、微米/纳米结构材料的混合比例为V:V:M＝100-200uL:900-800uL:0.5-1mg。
  11. 根据权利要求3或7所述的一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒的使用方法，其特征在于，所述质谱仪为MALDI离子源质谱仪。
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