CN101963595A - 一种血清多肽内标校正检测方法 - Google Patents
一种血清多肽内标校正检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101963595A CN101963595A CN2010102718263A CN201010271826A CN101963595A CN 101963595 A CN101963595 A CN 101963595A CN 2010102718263 A CN2010102718263 A CN 2010102718263A CN 201010271826 A CN201010271826 A CN 201010271826A CN 101963595 A CN101963595 A CN 101963595A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- serum
- polypeptide
- sample
- mass
- peak
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供了一种内标校正检测血清多肽的方法，其是在血清样本中加入已知质荷比峰的多肽，利用质谱检测样本，根据该多肽的质合比峰矫正血清色谱图。本发明方法可以校准和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，提高分析结果的准确性。在MALDI-TOF线性采集数据时，外标校正后，用内标再次校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移。
Description
技术领域
本发明涉及血清多肽的检测，具体地说是一种利用质谱对血清多肽进行校正检测的方法。
背景技术
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption lionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高同量的分析测试手段，同时也是一种很好的筛选疾病的分子标记方法。
目前的相关研究大多是多维色谱分离与电喷雾离子化源(ESI源)质谱分析联用的应用研究，而对于基质辅助激光解析电离(MALDI)源质谱而言，由于每次实验中样本分离程度、样品在靶上的结晶状况和肽段离子化效率等因素的不同导致实验结果的重现性差，限制了本技术在临床医学实验室的广泛应用。
因为不管是ESI或MALDI离子源，由于分子结构的差异，导致质谱的峰高并不和蛋白量有绝对的关系，同等量不同的蛋白分子，在质谱上的响应是不同的。
到目前为止，还没有能够有效内标校正检测血清多肽技术的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述不足提供一种内标校正检测血清多肽的方法。
本发明血清多肽内标校正检测方法是在血清样本中加入已知质荷比峰的多肽，利用质谱检测样本，根据该多肽的质合比峰矫正血清色谱图。这样可以避免血清多肽分子量的漂移。所述质谱优选为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。
尽管生物质谱具有较高的检测灵敏度，但是其检测能力受复杂环境中高丰度的干扰物质所限制。为此，本发明方法优选还包括采用SPE-C磁珠对血清进行富集。
上述内标可以加入到经SPE-C磁珠富集处理后的样本中，或者直接加入到血清中，然后在经SPE-C磁珠富集处理。前一种方式相对于后一种方式简单更容易实现，并且更容易实现内标和血肽谱峰共同存在，且强度合适。
优选加入的多肽为浓度已知的多肽，这样不仅可以校准质谱图横坐标还可以矫正纵坐标，提高蛋白质分子量和丰度检测的准确度。多肽的浓度可根据样品进行调整，通常以终浓度(50fmol)为宜。
内标的设计，可以采用如下方式进行：插空式，即在已有血肽数据基础上，查看哪些区域没有固有血肽影响，则设计该分子量区间的内标(即内标多肽位于血清多肽指纹图谱的无干扰区域)。
在本发明一个实施例中，选择分子量1964.09Da作为内标肽，进一步还可以将上述内标制备成各种检测试剂盒，以方便使用。
本发明通过在血清样本中添加已知质荷比峰的多肽作为内标，在检测血清样本时用内标进行校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移。
附图说明
图1是经标准品外标校正后的质谱图，其平均分子量偏差小于100ppm；
图2.Mr＝1964.09Da内标自检，浓度＝1fmol/μl。
图3.血清+内标，内标浓度＝100fmol/μl。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本例中，将人血清经SPE-C磁珠处理后的富集液，MALDI-TOF得到的谱图为血清多肽指纹图谱简称血肽谱。在SPE-C磁珠处理后的富集液中加入内标目的是在MALDI-TOF线性采集数据时，外标校正后，用内标再次校正，使得血肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移。
实验目的：
以1964.09作为内标进行校正，优化系统重复性和稳定性。
实验材料：
(1)真空采血管[BD Vacutainer SST(‘tiger-top’)管(Becton Dickinson cat.no.367988)]
(2)聚丙烯EP管(适用于-80℃)
(3)枪头(Eppendorf)
(4)排管(Eppendorf)
(5)分装瓶或管[Eppendorf，Biozym PCR管(#710950)]
(6)溶剂瓶[Nalgene FEP(Teflon)瓶]
(7)MTPs(Greiner PP，natural，MTP)
(8)0.1％TFA(色谱级)1μl TFA加入到1000μl纯水中，混合均匀
(9)100％丙酮(色谱级)J.K.Baker LOT NO.E32E11
(10)100％乙醇(色谱级)J.K.Baker LOT NO.E39B24
(11)100％乙腈
(12)10mM醋酸铵(色谱级)
(13)77mg醋酸铵溶解于100ml纯水中
(14)Peptide Calibration Standard(外标)Bruker Daltonik；cat.no.206195；Protein Calibration Standard Ⅰ(外标)Bruker Daltonik；cat.no.206355
(15)人血清(Sigma；cat.no.S7023)
(16)磁珠 SPE-C弱阳离子磁珠试剂盒 毅新兴业(北京)科技有限公司
(17)α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA)Bruker Daltonik；1g#201344，5g#203072
(18)AnchorChip 600μm #209514
仪器和设备：
(1)离心机(Bioyong)
(2)移液器(Eppendorf)
(3)磁架Robotic separation device for 96microtiter flate format Magnetseparator(Bruker Daltonik)
(4)质谱仪：autoflexTM Ⅱ(Bruker Daltonik)
(5)真空旋干机：labconco Centrivap Centrifugal Concentratots and Cold Traps
(6)相关软件：数据采集FlexControl 2.2；看图软件FlexAnalysis3.0；分析软件ClinProTools 2.1(Bruker DALTONICS公司)
实验条件：
(1)样品类型：合成多肽1964.09Da【北京中科亚光生物科技有限公司，及货号H18125601：CQEESYKEIGHSSPPSVS】
(2)质谱仪：microflex，德国Bruker
(3)分析软件：FlexAnalysis3.0，德国Bruker
(4)采集参数：采样激光在10％～20％，每50shots采一张图共累加4张图，200shots，采集范围800-10000Da
实验步骤：
(1)缓慢地上下振荡采血管5次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)垂直放置1小时，使血液凝结。(血液必须精确凝结1小时，否则，样品凝结时间不同会人为地导致肽谱不同。)
室温下，用临床离心机以1.400-2.000g离心SST管10分钟。吸取上清液(血清)到对应的已标记样品管中。立即冻存血清样品于-80℃冰箱。避免反复冻融。
(2)从4℃冰箱中取出SPE-CM磁珠悬浮液一管，反复倒置，使磁珠完全、均匀的悬浮于液相中。在200μl样品管中加入2μl SPE-CM磁珠混悬液，95μl SPE-CB、5μl血清，反复吸打数次，使磁珠与SPE-CB、血清混合均匀，室温静置5min。将样品管置于磁珠分离器上，使磁珠贴壁1min，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体。将上步中的样品管从磁珠分离器上移走，并在上述样品管中加入100μl SPE-CW，反复吸打数次，使磁珠与SPE-CW混合均匀，室温静置2min。将样品管转移到磁珠分离器上，使磁珠贴壁1min，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体。将样品管从磁珠分离器上移走，并在上述样品管中加入10μl SPE-CE(由SPE-CE1、SPE-CE2组成)，反复吸打10次之上，使磁珠与SPE-CE混合均匀，室温静置5min。(3)100fmol/μl内标加入到血清提取液中，按照步骤(4)进行点样，质谱检测。
(4)取5μl的0.4mg/ml HCCA基质于0.5μl样品管，加入0.8-1.2μl的样品洗脱液(根据样品、结晶、温湿度等适当调节洗脱液量)，用加样枪反复吸打10次以上混合均匀。取1μl上述混合液体，点在600μm Anchorchip样品位置上，室温放置至干燥无液体残留。
实验结果：目前常规检测是每8个样品中间点一个7个多肽的标准，来校正仪器，但是还是会存在一定的偏差。在不影响样品出峰的前提下，采用合成多肽分子作为内标，建立二位标准校正法来校准质谱图横坐标和纵坐标，提高蛋白分子量和丰度检测的准确度。
(一)外标校正
外标矫正结果如图1所示，通过外标校正，使平均分子量偏差小于100ppm。
(二)内标校正
内标自检的结果如图2所示，其质荷比峰与理论值相一致。
图3中上图是血清单独进行检测的结果，下图是添加了内标后检测的结果。
变异系数cv％越小，说明整个实验系统越稳定，数据误差越小，这样也就达到了内标和外标同时校正的目的。
表1对sigma人血清的检测结果
由表1可以看出，采用内标校正后可以显著降低检测变异系数，降低系统误差，从而对血清多肽的检测更加准确。
Claims (6)
1.一种血清多肽内标校正检测方法，其特征在于，在血清样本中加入已知质荷比峰的多肽，利用质谱检测样本，根据该多肽的质合比峰矫正血清色谱图。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其还包括采用SPE-C磁珠对血清进行富集。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述质谱为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多肽的浓度已知。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多肽的质荷比峰位于待检血清多肽指纹图谱无干扰区域。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在内标校正前还包括采用外标矫正的步骤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102718263A CN101963595A (zh) | 2010-09-02 | 2010-09-02 | 一种血清多肽内标校正检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102718263A CN101963595A (zh) | 2010-09-02 | 2010-09-02 | 一种血清多肽内标校正检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101963595A true CN101963595A (zh) | 2011-02-02 |
Family
ID=43516559
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102718263A Pending CN101963595A (zh) | 2010-09-02 | 2010-09-02 | 一种血清多肽内标校正检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101963595A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102331453A (zh) * | 2011-04-15 | 2012-01-25 | 毅新兴业（北京）科技有限公司 | 一种检测体液中多肽的方法 |
| CN102337341A (zh) * | 2011-10-21 | 2012-02-01 | 马庆伟 | Maldi-tof质谱双内标及其定量检测方法 |
| CN104931572A (zh) * | 2015-05-14 | 2015-09-23 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用 |
| CN107024530A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-08-08 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 通过内部标准物质谱检测微生物的方法及其产品 |
| CN110741254A (zh) * | 2017-06-12 | 2020-01-31 | 株式会社日立高新技术 | 色谱质谱分析方法及色谱质谱分析装置 |
| CN111239423A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-06-05 | 杭州汇健科技有限公司 | 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2399990A1 (en) * | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Antigene Biotech Gmbh | Container for nucleic acid analysis |
| CN1940087A (zh) * | 2006-08-18 | 2007-04-04 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒 |
| US20090090855A1 (en) * | 2007-06-14 | 2009-04-09 | Uwe Kobold | Preparation of samples for lc-ms/ms using magnetic particles |
-
2010
- 2010-09-02 CN CN2010102718263A patent/CN101963595A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2399990A1 (en) * | 2000-02-15 | 2001-08-23 | Antigene Biotech Gmbh | Container for nucleic acid analysis |
| CN1940087A (zh) * | 2006-08-18 | 2007-04-04 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒 |
| US20090090855A1 (en) * | 2007-06-14 | 2009-04-09 | Uwe Kobold | Preparation of samples for lc-ms/ms using magnetic particles |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编》 20081231 王开正等 《蛋白芯片飞行时间质谱技术二维内标法的建立和应用》 447 , * |
| 《复旦学报（医学版）》 20100731 李长煜等 《应用液体蛋白芯片飞行时间质谱技术研究原发性肝癌门静脉癌栓形成相关标志物》 459-463 第37卷, 第4期 * |
| 丁银环等: "《SELDI_TOF_MS二维内标法的建立和应用》", 《现代检验医学杂志》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102331453A (zh) * | 2011-04-15 | 2012-01-25 | 毅新兴业（北京）科技有限公司 | 一种检测体液中多肽的方法 |
| CN102337341A (zh) * | 2011-10-21 | 2012-02-01 | 马庆伟 | Maldi-tof质谱双内标及其定量检测方法 |
| CN102337341B (zh) * | 2011-10-21 | 2014-01-08 | 马庆伟 | Maldi-tof质谱双内标及其定量检测方法 |
| CN104931572A (zh) * | 2015-05-14 | 2015-09-23 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用 |
| CN104931572B (zh) * | 2015-05-14 | 2018-08-21 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 微生物鉴定用质谱仪分子量校正标准品及其制备方法与应用 |
| CN107024530A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-08-08 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 通过内部标准物质谱检测微生物的方法及其产品 |
| CN107024530B (zh) * | 2016-11-25 | 2018-06-05 | 北京毅新博创生物科技有限公司 | 通过内部标准物质谱检测微生物的方法及其产品 |
| CN110741254A (zh) * | 2017-06-12 | 2020-01-31 | 株式会社日立高新技术 | 色谱质谱分析方法及色谱质谱分析装置 |
| CN111239423A (zh) * | 2020-01-17 | 2020-06-05 | 杭州汇健科技有限公司 | 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法 |
| WO2021143501A1 (zh) * | 2020-01-17 | 2021-07-22 | 杭州汇健科技有限公司 | 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法 |
| CN111239423B (zh) * | 2020-01-17 | 2023-11-03 | 杭州汇健科技有限公司 | 一种多肽或蛋白质谱检测分子量校正标准品试剂盒的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Levin et al. | Label‐free LC‐MS/MS quantitative proteomics for large‐scale biomarker discovery in complex samples | |
| CN101963595A (zh) | 一种血清多肽内标校正检测方法 | |
| US7759130B2 (en) | Mass spectrometric quantitation method for biomolecules based on metabolically labeled internal standards | |
| Magni et al. | Biomarkers discovery by peptide and protein profiling in biological fluids based on functionalized magnetic beads purification and mass spectrometry | |
| CN111239423A (zh) | 一种多肽或蛋白质谱检测用的分子量校正标准品试剂盒及其制备方法、使用方法 | |
| CN110850099A (zh) | 一种血清中c反应蛋白的定值方法 | |
| WO2014194320A1 (en) | Chromatography mass spectrometry method and system | |
| CN107941980A (zh) | 水产品中利福平残留的超高效液相色谱串联质谱快速测定方法 | |
| CN113196052A (zh) | 复杂基质中分析物的定量质谱分析中基质效应校正的方法 | |
| CN109060983A (zh) | 一种液相色谱-串联质谱检测甲氧基肾上腺素类物质的方法 | |
| CN110531015A (zh) | 一种检测血清中英夫利昔单抗浓度的方法及其应用 | |
| CN113804806A (zh) | 燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法 | |
| CN111595983B (zh) | 一种测定藜芦中化学成分含量的方法 | |
| BR112019025095A2 (pt) | Métodos para a quantificação absoluta de polipeptídeos de baixa abundância utilizando espectrometria de massa | |
| CN112345660A (zh) | 测定人血浆样本肾素活性的试剂盒和方法 | |
| Satoh et al. | Applications of mass spectrometry in clinical chemistry | |
| CN110907569A (zh) | 一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法 | |
| Li et al. | Rapid quantitation of three synthetic cathinones in urine by magnetic dispersive solid-phase extraction combined with DART-HRMS | |
| CN114674953B (zh) | 一种测定乌梅中化学成分含量的方法 | |
| CN112345680B (zh) | 一种同时检测灵芝中八个甾醇的方法 | |
| CN102331453A (zh) | 一种检测体液中多肽的方法 | |
| Staes et al. | Assessing a novel microfluidic interface for shotgun proteome analyses | |
| Eckfeldt et al. | Determination of serum cholesterol by isotope dilution mass spectrometry with a benchtop capillary gas chromatograph/mass spectrometer: comparison with the national reference system's definitive and reference methods | |
| CN110068687B (zh) | 血清中心肌肌钙蛋白i复合物的非诊断目的的定量测量方法 | |
| US20120074308A1 (en) | Immunosuppressant monitoring by maldi mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Xueji Inventor after: Tian Yaping Inventor after: Ma Qingwei Inventor after: Li Yan Inventor after: Liu Lihua Inventor after: Zhang Yan Inventor after: Ren Jing Inventor before: Tian Yaping Inventor before: Ma Qingwei Inventor before: Li Yan Inventor before: Liu Lihua Inventor before: Zhang Yan Inventor before: Ren Jing |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: TIAN YAPING MA QINGWEI LI YAN LIU LIHUA ZHANG YAN REN JING TO: ZHANG XUEJITIAN YAPING MA QINGWEI LI YAN LIU LIHUA ZHANG YAN REN JING |
|
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110202 |