CN102337341A - Maldi-tof质谱双内标及其定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用作质谱检测的双内标志物的寡聚核苷酸对，是利用质谱检测核酸、蛋白、小分子多肽及其它小分子样品时，引入标准样品，即用已知浓度的寡聚核苷酸双内标校正。本发明还提供该双内标质谱定量方法，其中两条寡聚核苷酸比例在1:1至1:6的区间内，其浓度比例依0.5递增，共设置11个梯度，并利用建立标准曲线的方法，分析MALDI-TOF-MS检测的样品出峰情况。本发明的产品和方法可以校准和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，提高分析结果的准确性。使得质谱检测时各个峰值更加准确，避免分子量的漂移和物质的量测量误差。
Description
技术领域
本发明涉及核酸，蛋白，小分子多肽，及其它小分子样品的定量检测，是一种利用MALDI-TOF-MS对小片段物质进行检测时，引入已知浓度和比例的寡聚核苷酸作为标准样品，建立标样拟合曲线，用于校正实验误差的方法。
背景技术
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption lionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学、基因组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高通量的分析测试手段，同时也是一种很好的筛选疾病的分子标记方法。
MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比 （M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF-MS的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。但由于系统误差等因素影响实验结果的精确定量，因此在质谱检测样品时，引入已知浓度和比例的内标，建立标样拟合曲线，可有效的校正质谱系统误差和分子量偏移。
目前曲线拟合的方法在国内外均有较为普遍的应用，Jiangyue Wu 等( Anal. Chem. 1997, 69, 3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的拟合曲线法对环孢菌素进行了定量测试；Mazarin等(Anal. Chem. 2006, 78, 2758-2764)结合脉冲梯度旋转核磁共振和MALDI-TOF-MS定量测定多聚物时，同样采用了拟合曲线进行数据校正；2009年，吕爽等人利用拟合曲线，成功开发了一种磷酸化肽的MALDI-TOF-MS定量方法。
发明内容
本发明原理是为了在使用MALDI-TOF-MS检测生物分子（如核酸、蛋白、多肽、有机小分子物质等）时，有效克服系统误差，而引入两种已知浓度的寡聚核苷酸作为实验双内标的定量检测方法。基于该原理，本发明还发明了用于该方法的三组寡核苷酸对。
本发明的第一个目的是提供用作质谱检测的双内标志物（简称双内标）的寡聚核苷酸对，其选自LbC/LbT、MbC/MbT或HbA/HbG。
在一个实施方案中，上述寡核苷酸对分别选自：
检测低分子量待检物的LbC(CTCATCATGCTGCCCC)和LbT(CTCATCATGCTGCCCT)；或
检测中分子量待检物的MbC(CCCCATCTAAGCGCATCAAAC)和MbT(CCCCATCTAAGCGCATCAAAT)；或
检测高分子量待检物的HbA(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA)和HbG(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAG)。
在一个具体实施方案中，上述LbC/LbT的分子量分别为4753.04、4768.05道尔顿，上述MbC/MbT的分子量分别为6304.08、6319.09道尔顿，上述HbA/HbG的分子量分别为7913.12、7929.12道尔顿。
本发明的第二个目的是提供一种使用上述寡核苷酸对以用于建立质谱检测的内标标准拟合曲线的方法。
在一个实施方案中，所述的方法包括：
1) 合成上述寡聚核苷酸对作为双内标标准品，备用；
2) 对寡聚核苷酸进行稀释；
3) 将寡聚核苷酸稀释到不同浓度范围，通过质谱检测得到合适的起始浓度；
4) 按不同比例将寡聚核苷酸配成混液，质谱检测，对所得到的数据进行分析，建立内标拟合曲线。
在一个实施方案中，步骤2的寡聚核苷酸稀释方法既可用常规方法进行稀释，也可使用本发明摸索确定的方法。其中，优选是选取相当于1OD260的寡核苷酸干粉加500μl水进行稀释，充分振荡溶解，其中所选取寡核苷酸干粉的量的计算方法为：
寡核苷酸干粉量的摩尔数=1单位寡核苷酸质量/MW；
MW=(A碱基数x312)+ (C碱基数x288)+ (G碱基数x328)+ (T碱基数x303)-61；且
1OD260=33μg寡核苷酸
在一个具体实施方案中，其中步骤2中，为了尽可能减少稀释时带入的误差；用起始10μl的体积配标样混液(用10μl移液器)。
在另一实施方案中，步骤3中适于质谱检测的三组寡聚核苷酸对的起始浓度为0.05-0.6μM，且各组寡核苷酸对中的HbA/HbG、LbC/LbT、MbC/MbT的浓度比分别为1：6。在一个具体实施方案中，HbAG（即HbA/HbG）寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0.3μM。在另一具体实施方案中，LbCT（即LbC/LbT）寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0.4μM。在其他具体实施方案中，MbCT（即MbC/MbT）寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0.05μM。
还在一个实施方案，其中步骤4中根据摸索上述的寡聚核苷酸对梯度稀释的起始浓度，在1：6的区间内，依0.5递增，共设置11个梯度，做标样拟合曲线。
在一个具体实施方案中，其中每种寡聚核苷酸对标准品比例设置3次重复。
在其他的实施方案中，前述任一方法中所述质谱为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。
本发明第三个目的是使用上述寡核苷酸对以用于质谱检测生物分子的方法，包括：
前述任一方法中的步骤(1)-(4)；
步骤(5)：根据所建立的内标拟合曲线，用于质谱检测生物分子。
附图说明
图1为3种不同分子量的寡聚核苷酸质谱检测结果，横坐标为分子量，纵坐标为信号强度；
图2A-2C为1：6配比的3对寡聚核苷酸质谱检测结果，横坐标为分子量，纵坐标为信号强度。
图3为内标拟合曲线，横坐标为实际比例，纵坐标为理论比例；斜线为实际比例和理论比例的相似程度。
技术效果
1. 本发明的创新点在于摸索出了适合质谱检测的寡聚核苷酸对HbA/HbG、LbC/LbT、MbC/MbT浓度（0.05-0.6μM,其中具体分别为0.4、0.3、0.05μM），并建立了拟合曲线，可作为内标用于质谱检测，有效校正系统误差，实现定量检测。
2. 本发明具有成本低（合成普通寡聚核苷酸）、灵敏度高，检测周期短等优点。
具体实施方式
现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
本例中，将寡聚核苷酸干粉经加水稀释后，配置成不同的浓度和比例，进行质谱检测。目的是在MALDI-TOF-MS采集数据时，用内标校正，使得各个峰值更加准确。由于内标分子量已知，软件分析系统利用已知的分子量对其他峰值进行自动校正。
实验材料：
(1) 寡聚核苷酸干粉由寡聚核苷酸合成公司合成
（2）384孔板（AXYGEN）
（3）枪头 （AXYGEN）
（4）EP管 （Eppendorf）
（5）芯片（Sequenom）
仪器设备：
（1）离心机（Bioyong）
（2）移液器（Eppendorf）
（3）微量紫外分光光度计：SMA1000
（4）点样机械臂：Nanodispenser RS1000
（5）质谱仪：MassARRAY Analyzer Compact( Bruker Autoflex)
（6）相关软件：数据采集 SpectroACQUIRE；分析软件Typer4.0 ；
实验步骤：
一、寡聚核苷酸选取及稀释
1、根据质检寡聚核苷酸时线性稀释公式，推出寡聚核苷酸质谱检测时的终浓度与质谱检测的峰信号值-intensity的关系。
本发明中，质谱检测时的标样终浓度在0.05-0.6μM。发明人经过摸索，发现如果6倍浓度的质谱峰信号值超出了质谱检测范围，则质谱无法准确检测峰值的信号强度。因此需考虑标样起始浓度及其6倍浓度的质谱峰信号值均在可信区间内检测。因此，本发明中的所用双内标的起始浓度均是0.05μM，按1:6的比例混合的两个标准寡聚核苷酸，在0.05-0.6μM区间共设置7种浓度（即0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μM），以摸索各种不同分子量的双内标的最适浓度。
实验选取3类分子量的寡聚核苷酸：低分子量、中分子量、高分子量，见表1；
| 编号 | 序列 | 分子量OD | |
| LbC | CTCATCATGCTGCCCC | 4753.04 | 低分子量 |
| LbT | CTCATCATGCTGCCCT | 4768.05 | 低分子量 |
| MbC | CCCCATCTAAGCGCATCAAAC | 6304.08 | 中分子量 |
| MbT | CCCCATCTAAGCGCATCAAAT | 6319.09 | 中分子量 |
| HbA | GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA | 7913.12 | 高分子量 |
| HbG | GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAG | 7929.12 | 高分子量 |
表1：寡聚核苷酸序列及分子量
2、寡聚核苷酸稀释时，需加水定量换算出浓度及摩尔浓度。为了尽可能减少稀释时带入的误差；用起始10μl的体积配标样混液(用10μl移液器)；
寡聚核苷酸稀释方法：
1OD260=33ug，即1OD260的引物干粉相当于33ug的寡核苷酸
MW=(A碱基数x312)+ (C碱基数x288)+ (G碱基数x328)+ (T碱基数x303)-61
摩尔数=1x33ug/MW
A的分子量：312DA（道尔顿）；C的分子量：288DA；
G的分子量：328DA； T的分子量：303DA
MW：分子量
按分装管标的nmol数，1OD寡聚核苷酸干粉加500μl水进行稀释，充分振荡溶解以后，取2μl稀释后的寡聚核苷酸溶液，用微量紫外分光光度计测量波长260nm和280nm的 OD值、实际浓度值。
表2：1OD寡聚核苷酸加500ul水时的终浓度计算结果
3、质谱检测时的标样终浓度在0.05-0.6μM。发明人经过摸索，发现如果6倍浓度的质谱峰信号值超出了质谱检测范围，则质谱无法准确检测峰值的信号强度。因此需考虑标样起始浓度及其6倍浓度的质谱峰信号值均在可信区间内检测。因此，本发明中的所用双内标的起始浓度均是0.05μM，按1:6的比例混合的两个标准寡聚核苷酸，在0.05-0.6μM区间共设置7种浓度（即0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μM），每个浓度重复3次，检测最低峰和最高峰，信号值必须落在intensity的可信区间内；计算峰面积比是否与理论比例一致；
表3：寡聚核苷酸稀释表
将稀释好的寡聚核苷酸质谱检测，按从0.05-0.6之间的起始浓度实验，得出不同分子量下每对寡聚核苷酸合适的起始浓度，见下表。
3对寡聚核苷酸均按1：6比例混合，每个比例3次重复；根据计算峰面积实际比例与理论比例是否一致，得到每对寡聚核苷酸合适的起始浓度。从中可以看出HbAG中两条寡聚核苷酸0.3μm为起始浓度，按1:6配比最接近理论值；LbCT中两条寡聚核苷酸0.4μm为起始浓度，按1:6配比最接近理论值；MbCT 中两条寡聚核苷酸0.05μm为起始浓度，按1:6配比最接近理论值。
| AssAy Id | SAmple Id | AreA | AreA 2 | AreA/AreA2 |
| HbA/HbG | 0.05 | 352.468 | 80.9324 | 4.3550914 |
| HbA/HbG | 0.1 | 590.184 | 127.371 | 4.6335822 |
| HbA/HbG | 0.2 | 1165.38 | 285.587 | 4.0806479 |
| HbA/HbG | 0.3 | 836.856 | 178.815 | 4.6804359 |
| HbA/HbG | 0.4 | 944.331 | 220.353 | 4.2855373 |
| HbA/HbG | 0.5 | 1016.61 | 285.073 | 3.5661392 |
| HbA/HbG | 0.6 | 568.381 | 192.126 | 2.9583763 |
| LbC/LbT | 0.05 | 83.1311 | 648.78 | 7.8042995 |
| LbC/LbT | 0.1 | 144.122 | 979.337 | 6.7951943 |
| LbC/LbT | 0.2 | 522.731 | 1873.81 | 3.5846544 |
| LbC/LbT | 0.3 | 204.262 | 1321.44 | 6.4693384 |
| LbC/LbT | 0.4 | 239.509 | 1401.47 | 5.8514294 |
| LbC/LbT | 0.5 | 256.674 | 1247.79 | 4.8613806 |
| LbC/LbT | 0.6 | 116.704 | 762.494 | 6.5335721 |
| MbC/MbT | 0.05 | 106.11 | 641.538 | 6.0459712 |
| MbC/MbT | 0.1 | 137.482 | 853.339 | 6.2069144 |
| MbC/MbT | 0.2 | 386.705 | 1717.74 | 4.4419907 |
| MbC/MbT | 0.3 | 237.359 | 1301.39 | 5.4827919 |
| MbC/MbT | 0.4 | 297.095 | 1474.07 | 4.9616116 |
| MbC/MbT | 0.5 | 555.453 | 1822.34 | 3.2808176 |
| MbC/MbT | 0.6 | 147.8 | 986.894 | 6.677226 |
表4：质谱检测结果
4、通过第3步对不同分子量的起始浓度摸索，确定梯度稀释的起始浓度，在1:1-1：6范围内共设置11个梯度比例（每0.5递增）；配制混液，3次重复，检测质谱的定量能力和范围。
表5：寡聚核苷酸稀释表
表5中，在1:1-1:6范围内共设置11个梯度比例（每0.5递增）；配制3对寡核苷酸混液，每种比例3对寡核苷酸混液最后的总体积加水补足500μl。
二、质谱检测
1、使用NAnodispenser RS1000点样机械臂将1:6的区间内，依0.5递增，共设置11个梯度， 配好后的寡聚核苷酸标准品混液，点到芯片基质上，点样体积8-10nl。
2、将点好样的芯片放入MAssARRAY AnAlyzer CompAct( Bruker Autoflex) MALDI-TOF-MS仪中检测。
3、使用Typer4.0软件分析结果
按1：6稀释后的三种寡聚核苷酸双内标的混合质谱检测结果见图2。
三、数据分析
数据分析方法：X=(A1-A2)/(A1+A2)； Y=log(A1+A2)
根据标准品的浓度比例调整分型Plot
Sequenom提供Plot图：Yield = 1 - [PeAk AreAUnextended primer /(PeAk AreAHM AnAlyte + PeAk AreALM AnAlyte)]
Skew = PeAk AreAHM AnAlyte / PeAk AreAHM AnAlyte + PeAk AreALM AnAlyte建立标准拟合曲线，见图三：theory=0.845*reAl^(1.101) ；X轴为实际做样出来的寡聚核苷酸的比例；Y轴为按浓度比例配出来的比例；
表6：数据统计表
四、 实验结果
本实验使用寡聚核苷酸比例在1:6的区间内，共设置11个梯度，利用MALDI-TOF-MS检测，分析的寡聚核苷酸出峰情况，并建立了有效的拟合曲线。可将本次寡聚核苷酸作为内标，应用于质谱检测核酸、蛋白、多肽等物质。在MALDI-TOF-MS采集数据时，用内标进行校正，使得质谱检测的各个峰值更加准确，避免分子量的漂移和实验误差。
综合实施案例，本发明所采用双内标检测，适合多数蛋白质及核苷酸的定量分析。由于本发明利用普通寡聚核苷酸代替同位素内标，而合成普通寡聚核苷酸的时间短，并且不需要任何修饰，因此与传统方法相比，其低成本及内标订购、检测周期短的优势较为明显。
Claims (10)
1.一种用作质谱检测的双内标志物（简称双内标）的寡聚核苷酸对，其分别选自：
检测低分子量待检物的LbC(CTCATCATGCTGCCCC)和LbT(CTCATCATGCTGCCCT)；
检测中分子量待检物的MbC(CCCCATCTAAGCGCATCAAAC)和MbT(CCCCATCTAAGCGCATCAAAT)；和
检测高分子量待检物的HbA(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA)和HbG(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAG)。
2.权利要求1的寡核苷酸对，用于建立质谱检测的内标标准拟合曲线的方法。
3.权利要求2的方法，其中步骤包括：
1）合成上述寡聚核苷酸对作为双内标标准品，备用；
2）对寡聚核苷酸进行稀释；
3）将寡聚核苷酸稀释到不同浓度范围，通过质谱检测得到合适的起始浓度；
4）按不同比例将寡聚核苷酸配成混液，质谱检测，对所得到的数据进行分析，建立内标拟合曲线。
4.权利要求3的方法，其中步骤2是选取相当于1OD260的寡核苷酸干粉加500μl水进行稀释，充分振荡溶解，其中所选取寡核苷酸干粉的量的计算方法为：
寡核苷酸干粉量的摩尔数=1单位寡核苷酸质量/MW；
MW=(A碱基数x312)+ (C碱基数x288)+ (G碱基数x328)+ (T碱基数x303)-61；且1OD260=33μg寡核苷酸。
5.权利要求3或4的方法，其中步骤3中适于质谱检测的三组寡聚核苷酸对的起始浓度为0.05-0.6μM，且各组寡核苷酸对中的HbA/HbG、LbC/LbT、MbC/MbT的浓度比分别为1：6。
6.权利要求5的方法，其中HbAG（即HbA/HbG）寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0.3μM。
7.权利要求5的方法，其中LbCT（即LbC/LbT）寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0.4μM。
8.权利要求5的方法，其中MbCT（即MbC/MbT）寡聚核苷酸对的合适起始浓度为0.05μM。
9.权要求2-8中任一项的方法，其中步骤4中根据摸索上述的寡聚核苷酸对梯度稀释的起始浓度，在1：6的区间内，依0.5递增，共设置11个梯度，做标样拟合曲线。
10.权利要求1的寡核苷酸对，用于质谱检测生物分子的方法，包括：
权利要求2-9任一项中的步骤(1)-(4)；
步骤(5)：根据所建立的内标拟合曲线，用于质谱检测生物分子。
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