TWI694253B - 具有胺基團的目標分子的絕對定量方法 - Google Patents

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本發明提供一種具有胺基團的目標分子的絕對定量方法，特別是針對胜肽或蛋白質。

Description

具有胺基團的目標分子的絕對定量方法
本發明係關於一種具有胺基團的目標分子的絕對定量方法，特別是針對胜肽或蛋白質。
基於質譜法(Mass Spectrometry，MS)的定量蛋白質體學是一種用於系統性理解生物過程(biological processes)的穩健技術。目前已發展了數種基於MS的方法，利用穩定同位素標定或無標定策略，以提高蛋白質定量的通量和準確度。穩定同位素標定方法依賴於將穩定同位素標定引入蛋白質，而該標定的蛋白質可以藉由MS來區別和定量。無標定定量是透過對未標定的蛋白水解之胜肽進行光譜計數和統計分析而完成。雖然實施無標定方法不會產生額外的試劑成本，但基於同位素標定的策略可以提供更準確的定量並能夠同時處理多個樣品。這已由市售的iTRAQ(Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation，用於相對和絕對定量的同量異位素標定)試劑證明。
已知的同位素標定方法使用的試劑是以常見同位素對(包括2H/1H、13C/12C及15N/14N)編碼，以標定相同的肽或蛋白質，使其可利用 MS而被區別。
可惜的是，已知試劑昂貴，限制了其在需要處理大量樣品的基礎生物學研究和臨床應用上的使用。這些試劑的高成本的部分原因在於其是以昂貴的13C、15N或18O編碼，而不是以相對較便宜的2H編碼。另外，iTRAQ試劑的製備非常複雜而且需要昂貴的起始材料。
穩定同位素二甲基標定偶聯MS通常用於有興趣之蛋白質的絕對定量。為了量化複雜分析物中目標蛋白質的量，會使用特定的MS掃描模式--多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)--來達成目的(J.E.Melanson et al.,Rapid Commun.Mass Spectrom.2006；20：904-910)。
前驅物/產物離子對和碰撞能量(collision energy，CE)最佳化的確定是發展用於蛋白質絕對定量的MRM測定的關鍵步驟。然而，MRM轉換(transition)參數的設定各實驗室不同且CE會因個別定量目標而異(T.L.Williams et al.,Vaccine(2008)26,2510-2520)。
最近，開發了如SRMatlas、MRMer、MRMaid、MaRiMba和Skyline等電腦演算法，以根據胜肽或蛋白質序列預測MRM轉換和CE。然而，仍然需要手動檢查來確認實驗中每個預測候選者的這些設定(T.L.Williams et al.,Vaccine 30(2012)2475-2482)。
因此，仍需發展準確的方法用於多肽的絕對定量，也需要成本效益高且複雜性低的方法來製造這些試劑。
本發明提供了一種成本效益高且複雜性低的絕對定量多肽 的準確方法。
前驅物/產物離子對和碰撞能量最佳化的確定是發展使用三重四極柱式質譜儀((triple quadruple mass spectrometer)定量蛋白質的MRM測定的關鍵步驟。一般而言，MRM可以在第一四極柱選擇前驅物離子，在第二四極柱(Q2)透過碰撞誘導裂解(collision induced dissociation，CID)進行裂解，並在第三四極柱(Q3)偵測所欲的產物離子。在靈敏度和專一性方面，為了達到成功的MRM分析，選擇合適的前驅物/產物離子對(MRM轉換)並最佳化碰撞能量(CE)非常重要。然而，如先前技術中所述，MRM轉換參數的設定是複雜的，而且CE會因個別定量目標而異。
在本申請中，穩定同位素二甲基標定是用於具有預先決定的MRM轉換之胜肽或蛋白質的絕對定量。二甲基標定反應在每個含有離胺酸和胜肽N端的標定位置上加上28(甲醛-H2)或32Da(formaldehyde-D2)，其在每個胜肽對的每一標定位置上造成4Da的差異(N端脯胺酸為2Da)。在碰撞誘導裂解(CID)下，已知二甲基標定胜肽普遍產生高強度a1產物離子，其代表N端氨基酸的同一性(identities)。由於a1離子的m/z值可由胜肽序列預測，且這些在MS/MS圖譜中通常是主要的波峰，為了定量目的而使用a1離子作為固有的(intrisic)MRM轉換是有利的，尚無先前技術揭示在MRM轉換參數中使用a1離子。
本發明提供一種具有胺基團的目標分子的絕對定量方法，包含：(a)提供該目標分子；(b)以式I化合物標定該目標分子
Figure 107111944-A0202-12-0004-1
 其中X為氫或氘；(c)將該標定的目標分子裂解以產生一來自該標定的目標分子的亞胺鎓離子(immonium ion)；(d)利用質譜儀偵測並分析該的目標分子之裂解片段；以及(e)根據特徵a1離子訊號定量該目標分子。
該目標分子和該式I化合物的標定反應係快速且完全。
在一實施例中，該目標分子為一胜肽或一蛋白質。該蛋白質包含但不限於卵清蛋白(ovalbumin)。在另一實施例中，該蛋白質為重組蛋白。
在另一實施例中，該式I化合物係與該胜肽之N端、該蛋白質之N端及離胺酸之側鏈反應。
在又一實施例中，該目標分子係來自一抗原、一病毒或一病原體。該抗原包含但不限於血清凝集素(hemagglutinin，HA)及神經胺酸酶蛋白(neuraminidase，NA)。
在一較佳實施例中，該目標分子係以同位素甲醛標定以產生一二甲基標定分子。
本發明之方法對於絕對定量是快速且準確的，偵測靈敏度顯著提高。該方法適用於檢測微量的胜肽(或蛋白質)。
本發明的方法中的目標訊號a1離子與傳統的絕對方法不同。該方法可應用於多種蛋白質定量分析。該方法的成本相對低於傳統方法。在不使用抗體與昂貴同位素標定試劑的情況下，降低了定量分析的成 本和時間。該方法可用於同時分析數種蛋白質。
本發明的方法係應用於蛋白質定量分析、蛋白質藥物的定量分析、疫苗抗原的分析、病毒或其他病原體的快速篩選分析或新蛋白質藥物試劑的開發。
下列實施例是非限制性的，僅作為本發明各種態樣及特徵中的代表。
本發明的方法之一種態樣的步驟如下：將凍乾的樣品用醋酸鈉緩衝液重新溶解，依序加入甲醛-H2(4%水溶液，5μL)與氰基硼氫化鈉(600mM水溶液，5μL)。在室溫下30分鐘後，加入氫氧化銨(4%水溶液，5μL)終止標定反應。以一般甲醛-D2標定胜肽，也是以相同的程序進行。處理甲醛和氰基硼氫化鈉時應特別注意，包括使用手套和通風櫥。文中與甲醛-H2和甲醛-D2反應的樣品分別以輕標定(light-labeled)和重標定(heavy-labeled)標注。二甲基標定步驟也說明於Hsu et al,Anal.Chem.2003,75,6843-6852。
表1列出本發明的特徵。a1離子訊號係直接由該胜肽的序列預測，不須額外的質譜分析或軟體預測。
Figure 107111944-A0202-12-0005-5
Figure 107111944-A0202-12-0006-6
實例1：市售流感疫苗的定量分析
然後將得到的蛋白質消化物在室溫下離心，凍乾上清液用於隨後的二甲基標記。
將適當體積的疫苗產物透過與清潔劑攪拌並在高溫(>90℃)煮沸5分鐘使其變性。冷卻至室溫後，用胰蛋白酶(蛋白質：胰蛋白酶=10：1，w/w)在37℃消化變性的分析物2小時。然後將生成的蛋白質消化物在室溫下離心，並將上清液凍乾用於後續的二甲基標定。
抗原定量是以回歸分析為基礎。將凍乾的胜肽原液用緩衝液重新溶解，然後與甲醛-H2或甲醛-D2反應，分別產生輕標定的和重標定的胜肽使用溶液(working solution)。將固定量的內標準--重標定的胜肽(每種胜肽的最終濃度為250fmol/μL)--分別摻入連續稀釋的輕標定胜肽中製備校準標準，每種輕標定的胜肽最終濃度範圍分別為1000-1fmole/μL。透 過繪製峰面積比(輕/重)對輕標定胜肽濃度的圖建立每種胜肽的校準曲線。同時，將相同固定量的重標定胜肽摻入輕標定的疫苗消化物中，以基於取得的同位素MRM峰面積比來定量抗原的量，並建立校準曲線。樣品製備和定量說明於Williams et al.,Vaccine(2008)26,2510-2520。
市售流感疫苗的定量分析之結果列於表2。
Figure 107111944-A0202-12-0007-3
結果：(1)HA定量數據與WHO規範相符(HA>30μg/mL)。(2)低含量的NA抗原亦可被絕對定量(目前WHO沒有標準定量方法)。(3)微量的OVA可被偵測與定量。這些結果符合說明指示表。
實例2
步驟如實例1所述。新的基於細胞之流感疫苗製造程序列於表3。
Figure 107111944-A0202-12-0008-4
結果：(1)批量(Bulk)中HA定量數據與傳統SRID數據相符。(2)低含量的NA抗原亦可被絕對定量(目前WHO沒有標準定量方法)。(3)新的方法不含OVA，與預期結果一致。

Claims (7)

  1. 一種具有胺基團的目標分子的絕對定量方法，包含：(a)提供該目標分子；(b)以式I化合物標定該目標分子
    Figure 107111944-A0202-13-0001-2
     其中X為氫或氘；(c)將該標定的目標分子裂解以產生一來自該標定的目標分子的亞胺鎓離子(immonium ion)；(d)利用質譜儀偵測並分析該的目標分子之裂解片段；以及(e)根據特徵a 1離子訊號定量該目標分子。
  2. 如申請專利範圍1項之方法，其中該目標分子為一胜肽或一蛋白質。
  3. 如申請專利範圍2項之方法，其中該式I化合物係與該胜肽之N端、該蛋白質之N端及離胺酸之側鏈反應。
  4. 如申請專利範圍2項之方法，其中該蛋白質為卵清蛋白。
  5. 如申請專利範圍2項之方法，其中該蛋白質為重組蛋白。
  6. 如申請專利範圍1項之方法，其中該目標分子係來自一抗原、一病毒或一病原體。
  7. 如申請專利範圍6項之方法，其中該抗原為血清凝集素或神經胺酸酶蛋白。
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