TWI820905B - 一種氘代化合物及其製備方法、相關的檢測方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種氘代化合物及其製備方法、相關的檢測方法和用途，所述氘代化合物I的結構式如式(I)所示，其中，A為H或D，且8個A中至少有1個為D；M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根。本發明提供了氘代化合物I作為內標在檢測生物樣本中代謝產物II含量中的用途，其中，代謝產物II的結構式如式(II)所示；其中，A為H，M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根。本發明使用氘代化合物I作為內標定量分析生物樣本中低含量的代謝產物II的含量，能夠滿足低濃度情況下的定量檢測要求，適合臨床試驗中DMPK研究。
Description
本發明涉及檢測技術領域，尤其涉及一種氘代化合物及其製備方法、相關的檢測方法和用途。
在人體臨床試驗中，需要對受試者的生物樣本，如血液、尿液、組織等進行藥物和藥物代謝物的含量檢測，通過檢測得到的藥物和藥物代謝物的含量進行藥物的DMPK(Drug Metabolism and Pharmacokinetics,中文意思是藥物代謝及藥代動力學)研究。在新藥開發環節，對藥物進行DMPK研究是必須的。
常用的方法是液相色譜法，借助HPLC或UHPLC的高超分離能力和紫外吸收檢測器(UVD)、二極體陣列檢測器(PDAD)、螢光檢測器(FLD)、蒸發光散射檢測器(ELSD)、示差折光檢測器、質譜檢測器(MSD)的檢測性能可以檢測幾乎所有類型的藥物和藥物代謝物。
AST2660(又名AST-2660)是AST-3424(又名OBI-3424、TH-3424)的代謝產物(Meng,F.,Li,W.F.,Jung,D.,Wang,C.C.,Qi,T.,Shia,C.S.,Hsu,R.Y.,Hsieh,Y.C.,& Duan,J.(2021).A novel selective AKR1C3-activated prodrug AST-3424/OBI-3424exhibits broad anti-tumor activity.American journal of cancer research,11(7),3645-3659.)，也是前藥AST-3424發揮藥效的化學成分。
在臨床試驗中(美國OBI-3424藥物的臨床試驗登記號為NCT03592264，試驗階段為II期，適應症為去勢前列腺癌和肝癌，申辦方為臺灣浩鼎生技股份有限公司OBI；美國OBI-3424藥物的臨床試驗登記號為NCT04315324，試驗階段為II期，適應症為T-ALLT淋巴細胞急性白血病，申辦方為美國西南腫瘤協作組SWOG；中國AST-3424藥物的臨床試驗登記號為CTR20191399，試驗階段為II期，適應症為各種實體瘤，申辦方為深圳艾欣達偉醫藥科技有限公司；中國AST-3424藥物的臨床試驗登記號為CTR20201915，試驗階段為II期，適應症為T-ALL和B-ALL T淋巴細胞急性白血病和B淋巴細胞急性白血病，申辦方為深圳艾欣達偉醫藥科技有限公司)使用的AST-3424含量是1mg開始直至100mg。
藥物在較小的劑量下，常規的液相色譜法對應的外標法或內標法並不能滿足低給藥量情況下生物樣本中藥物代謝物的定量檢測要求。因此，需要開發一種檢測方法滿足低檢測限情況下的定量檢測要求，且能滿足上述藥物DMPK研究要求。
有鑑於此，本發明提供氘代化合物及其製備方法、相關的檢測方法和用途，經檢測並驗證氘代化合物I作為內標可用於定量檢測生物樣本中的代謝產物II的最低檢測限為0.5ng/ml，達到了藥物DMPK研究中的要求。
作為DMPK分析中的氘代內標，本發明提供的氘代化合物I具有一定的穩定性，在實驗條件下(-20℃和-70℃儲存不變質，品質穩定)能長期儲存，適合臨床試驗中DMPK實驗室中的樣本長期儲存和各種操作溫度(實驗室室溫)要求。
總體來講，本發明實際解決了上述代謝產物II在低檢測限下、DMPK研究的要求：含量低、樣本因為需要集中檢測因而儲存時間長、符合實驗室操作實際的要求，提供了一種生物樣本中低含量代謝產物II的檢測體系：氘代內標、LC-MS/MS儀器及方法、曲線擬合定量及操作規程。
本發明使用氘代化合物I用於定量檢測生物樣本中的代謝產物II，能夠滿足低檢測限情況下的定量檢測要求，適合於臨床試驗中DMPK研究。
本發明提供氘代化合物I，其結構式如式(I)所示：
其中，A為H或D，且8個A中至少有1個為D；
M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根。
氘代化合物I為氘代的二(氮丙啶-1-基)次膦酸或其鹽，成鹽的陽離子為鹼金屬如Na+、K+，或鹼土金屬離子Ca2+，或銨根離子NH4+。優選的，M為Na、K、Li或銨根。
氘代化合物根據生物樣本的情況以及後處理操作中添加的試劑不同，可能是以酸、鹽的形式而存在，對應的，氘代化合物就是酸或鹽。
優選的，氘代化合物I中的8個A中至少有3個為D。作為氘代內標，在質譜中對應的質核比m/z應該能與非氘代化合物區分。實際上，質譜峰並不是一個單一的值，而是一個圍繞主峰往兩邊下降的山峰形狀，其主峰的橫坐標值m/z即為該化合物的數值，設為x；當化合物中一個氫原子(氕)被氘取代後，其主峰的橫坐標值m/z即為x+1。顯然，由於主峰的形狀是一個山峰形狀，x與x+1會相互重疊，有可能導致兩者無法區分。根據化合物分子量的計算方式(將化合物中所有原子的相對原子品質相加)可知，原子越多、對應原子具有的不同相對原子品質的同位素原子種類越多，這個主峰的往兩邊下降的山峰形狀就會越“粗壯”，對應的與其他化合物的主峰的重疊部分就越多。為了減少重疊部分，方法之一是增加兩個主峰的距離。對於氘代化合物而言，需要增加氘代化合物中氘原子的數目。本發明結合氘代化合物I的具體情況，並通過實驗驗證和計算，氘代化合物I中有3個D(氘)原子後，非氘代化合物(代謝產物II)與氘代化合物I能較好區分，如D(氘)原子較少，則需要配製更高分辨能力的質譜。
優選的，氘代化合物I中D的個數為4或者8。
更優選的，氘代化合物I為式(I-1)或式(I-2)結構的化合物：
具體的，氘代化合物I選自以下結構的化合物：
本發明還提供製備氘代化合物I的方法，其包括以下步驟：
I-a化合物與三鹵氧磷POX3反應得I-b化合物；I-b化合物加入鹼或不加入鹼在水溶液中進行水解反應，對應得氘代化合物I；其中，I-a化合物為氘代的2-鹵代乙胺或其無機酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等，A為H或D，且在I-a化合物的4個A中至少有一個A為D，在I-b和I化合物的8個A中至少有1個為D；水解反應中鹼選自：MOH，其中M為鹼金屬、鹼土金屬或銨根；MH，其中M為鹼金屬；MOR，其中R為1-4個碳的烷基，M為鹼金屬；以及鹼金屬的碳酸鹽或碳酸氫鹽；X為鹵素。
第一步反應式是I-a化合物氘代的2-鹵代乙胺或其氫鹵酸鹽與三鹵氧磷POX3反應得I-b化合物，這個過程中發生的反應可以有一個，也可以有多個。
可以使用氘代的2-鹵代乙胺或2-鹵代乙胺無機酸酸鹽，具體根據反應使用的溶劑確定。
由於該反應為劇烈的放熱反應，因此是將2-鹵代乙胺或2-鹵代乙胺氫鹵酸鹽溶解在溶劑中降溫，然後緩慢滴加三鹵氧磷POX3或三鹵氧磷POX3的溶液，攪拌反應(滴加速度包裝反應體系溫度在-78至-20℃)。反應的溶劑為有機溶劑，如二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷或環己烷中的一種或幾種的混合。
三鹵氧磷POX3包括三溴氧磷POBr3和三氯氧磷POCl3。氘代的2-鹵代乙胺無機酸鹽包括氘代的2-鹵代乙胺的氫鹵酸(鹽酸鹽、氫溴酸鹽)、無機含氧酸鹽(硫酸鹽、磷酸鹽等)，優選的，I-a化合物為氘代的2-鹵代乙胺的鹽酸鹽、氫溴酸鹽。
第一步反應中會產生酸，因此加入鹼進行反應調節。加入的鹼包括無機鹼和有機鹼，無機鹼選擇較弱的鹼，如鹼土金屬的氫氧化物(氫氧化鈣)，鹼金屬的碳酸鹽、碳酸氫鹽(碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀)。優選地，所述有機鹼為甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、N,N-二乙胺、三乙胺、正丁胺、異丁胺、4-二甲氨基吡啶、N,N-二異丙基乙胺、1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、四甲基胍、吡啶、N-甲基二環己胺或二環己胺中的一種或幾種的混合。
這樣反應操作對應為將2-鹵代乙胺或2-鹵代乙胺氫鹵酸鹽溶解在溶劑中降溫，然後緩慢滴加三鹵氧磷POX3或三鹵氧磷POX3的溶液再降溫，降溫後，加入鹼或鹼溶液，攪拌反應。
優選地，所述有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷或環己烷、四氫呋喃中的一種或幾種的混合。
化合物I-a與三鹵氧磷POX3的反應在一定的氛圍下進行，所述氛圍是空氣、氮氣或氬氣中的一種；優選地，所述氛圍是氮氣或氬氣中的一種；更優選地，所述氛圍是氮氣。
第二步反應是I-b化合物加入鹼或不加入鹼在水溶液中進行水解反應，對應得氘代化合物I。
水解反應須加入水進行反應，因此反應是在水的參與下進行的。如僅僅加入水而不加入鹼，則反應後的氘代化合物I中M為H，對應的是酸的形式；如加入鹼則對應反應會生成鹽。水解反應中鹼選自：MOH，其中M為鹼金屬、鹼土金屬或銨根；MH，其中M為鹼金屬；MOR，其中R為1-4個碳的烷基，M為鹼金屬；以及鹼金屬的碳酸鹽或碳酸氫鹽。優選為NaOH和KOH。
本發明還提供上述氘代化合物I含量的檢測用途，即使用31P-NMR法檢測上述的氘代化合物I的含量，優選的，使用31P-NMR法檢測含有氘代化合物I的溶液中氘代化合物I的含量；或使用液相色譜法檢測上述的氘代化合物I的含量，其中，液相色譜儀條件為：氫受體型固定相色譜柱，A流動相為醋酸銨的甲醇溶液，B流動相為乙腈，A、B流動相梯度洗脫，從A流動相15%體積比逐漸升高至90%體積比，然後逐漸減少到15%體積比。
氘代化合物在製備純化後需要進行定量檢測。定量檢測的方法有很多，可以在純化後直接稱量，也可以直接使用HPLC法進行檢測。
本發明製備的氘代化合物I成品是在水溶液中，一般的HPLC法、精確稱量法都不是十分快捷，通過實驗驗證，使用31P-NMR法檢測含量具有符合要求的準確度，且快捷方便。
本發明還提供一種檢測上述氘代化合物I含量的方法，其包括：檢測氘代化合物I和已知含量的含磷化合物的31P-NMR，得到譜圖；根據31P-NMR譜圖中氘代化合物I和含磷化合物的化學位移特徵峰的峰面積比，代入已知含量的含磷化合物的含量計算得到氘代化合物I的含量。
所述含磷化合物優選為含有一個磷原子的化合物，更優選為六甲基磷醯三胺。
優選的，將氘代化合物I和已知含量的含磷化合物加入到溶劑中一併測試31P-NMR譜圖；優選的，將氘代化合物I和已知含量的含磷化合物加入到水中溶解後一併測試31P-NMR譜圖。
使用含磷的化合物作為31P-NMR的內標對氘代化合物I進行定量，顯然選用的含磷的化合物的磷原子數目最好是1個，這樣31P-NMR的譜圖信號峰比較單一，便於進行定量。另含磷的化合物的31P-NMR的譜圖信號峰的化學位移應當與氘代化合物I的31P-NMR的譜圖信號峰的化學位移間隔足夠大，便於將信號峰區分開。
31P-NMR法檢測譜圖時，掃描的次數對含磷的化合物的31P-NMR的譜圖信號峰、氘代化合物I的31P-NMR的譜圖信號峰有一定的影響，通過實驗驗證，掃描的次數應不小於64次。
本發明還提供上述的氘代化合物I作為內標在檢測生物樣本中代謝產物II的用途，優選的，本發明提供上述氘代化合物I作為內標在檢測生物樣本中DNA烷化劑前藥的代謝產物含量的用途，其中代謝產物II的結構式如式(II)所示：
其中，A為H；M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根。
前藥，也稱前體藥物(prodrug)、藥物前體、前驅藥物等，是指經過生物體內轉化後才具有藥理作用的化合物。前體藥物本身沒有生物活性或活性很低，經過體內代謝後變為有活性的物質，這一過程的目的在於增加藥物的生物利用度，加強靶向性，降低藥物的毒性和副作用。目前前體藥物分為兩大類：載體前體藥物(carrier-prodrug)和生物前體(bioprecursor)。
本發明的DNA烷化劑前藥是指經代謝後釋放出DNA烷化劑即代謝產物II的前藥。
本發明還提供上述的氘代化合物I作為內標在LC-MS/MS分析檢測生物樣本中AKR1C3活化的DNA烷化劑前藥或乏氧活化的DNA烷化劑前藥的代謝產物含量的用途，其中代謝產物II的結構式如式(II)所示：
其中，A為H；M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根。
氘代化合物I選自
代謝產物II選自
AKR1C3活化的DNA烷化劑前藥選自以下結構式1-5的化合物：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R10的定義如專利申請PCT/CN2020/089692，公開號WO2020228685A1中的申請專利範圍所記載。具體如下：R1是C6-C10芳基或Z取代的芳基、4-15元雜環或Z取代雜環、5-15元雜芳基或Z取代雜芳基、7-15元的稠環或Z取代稠環；R2是氫、鹵素原子、氰基或異氰基、羥基、巰基、胺基、OTs、OMS、C1-C6烷基或Z取代烷基、C2-C6烯基或Z取代烯基、C2-C6炔基或Z取代炔基、C3-C8環烷基或Z取代環烷基、C6-C10芳基或Z取代芳基、4-15元雜環或Z取代雜環、5-15元雜芳基或Z取代雜芳基、1-6個碳原子的醚或Z取代的1-6個碳原子的烷氧基、-CONR6R7、-SO2NR6R7、-SO2R6、-OCOO-R6、-COOR6、-NR6COR7、-OCOR6、-NR6SO2R7、-NR6SO2NR6R7或者R2和與其所鍵結的R1基團上的原子一起形成7-15元的稠環或Z取代稠環；R3是氫、鹵素、氰基或異氰基、羥基、巰基、胺基、OTs、OLCMS、C1-C6烷基或Z取代烷基、C2-C6烯基或Z取代烯基、C2-C6炔基或Z取代炔基、C3-C8環烷基或Z取代環烷基、C6-C10芳基或Z取代芳基、4-15元
雜環或Z取代雜環、5-15元雜芳基或Z取代雜芳基、C1-C6烷氧基或Z取代的C1-C6烷氧基、-CONR6R7、-SO2NR6R7、-SO2R6、-OCO-R6、-OCOO-R6、-COOR6、-NR6COR7，-OCOR6、-NR6SO2R7；R4、R5各自獨立地是氫、鹵素原子、氰基或異氰基、羥基、巰基、胺基、OTs、OLCMS、C1-C6烷基或Z取代烷基、C2-C6烯基或Z取代烯基、C2-C6炔基或Z取代炔基、C3-C8環烷基或Z取代環烷基、C6-C10芳基或Z取代芳基、4-15元雜環或Z取代雜環、5-15元雜芳基或Z取代雜芳基、C1-C6烷氧基或Z取代的C1-C6烷氧基、-CONR6R7、-SO2NR6R7、-SO2R6、-OCOO-R6、-COOR6、-NR6COR6、-OCOR6、-NR6SO2R7或者R4、R5和與其所鍵結的苯環上的原子一起形成7-15元的稠環或Z取代稠環；R6和R7各自獨立地是氫、氰基或異氰基、C1-C6烷基或Z取代烷基、C2-C6烯基或Z取代烯基、C2-C6炔基或Z取代炔基、C3-C8環烷基或Z取代環烷基、C6-C10芳基或Z取代芳基、4-15元雜環或Z取代雜環、5-15元雜芳基或Z取代雜芳基、C1-C6烷氧基或Z取代的C1-C6烷氧基，或者R6、R7基團與其所鍵結的原子一起形成5-7元雜環基或Z取代5-7元雜環基；R8、R10各自獨立地為氫、氘、芳基或Z取代芳基、C1-C6烷基或Z取代烷基、C2-C6烯基或Z取代烯基、C2-C6炔基或Z取代炔基、C3-C8環烷基或Z取代環烷基且必有一個為氫、氘；R9為至少具有一個氟原子或硝基取代的取代C6-C10芳基、至少具有一個氟原子或硝基取代的取代4-15元雜環、至少具有一個氟原子或硝基取代的取代5-15元雜芳基。
Z取代基為鹵素原子、氰基或異氰基、羥基、巰基、胺基、OTs、OMS、C1-C3烷基或取代烷基、C1-C3烷氧基或取代烷氧基、C2-C3烯基或取代烯基、C2-C3炔基或取代炔基、C3-C8環烷基或取代環烷基、芳環、雜環、雜芳環和稠環或取代芳環、雜環、雜芳環和稠環，取代的方式為單取代或偕二取代；R9中的取代C6-C10芳基、取代4-15元雜環、取代5-15元雜芳基的取代基為鹵素原子、硝基、氰基或異氰基、羥基、胺基、C1-C3烷基或烷氧基、烯基、炔基、環烷基或苯環、取代苯環、C1-C3烷氧基或鹵原子取代烷氧基。
具體的，式(1)(2)的化合物選自：
具體定義和含義以及製備方法、波譜資料參見專利申請PCT/CN2020/089692，公開號WO2020228685A1，在此將該申請全文引入。
顯然結構式(1)及(2)的化合物與AST-342相同，都是AST-2660(酸形式)的前藥，其會在AKR1C3酶的作用下活化而產生AST-2660發揮抗癌效果：
顯然該化合物包括結構式(1)、(2)及其鹽、酯、溶劑合物、同位素異構體。
T1為-(CRcRd)m-或-(CRcRd)n-O-；m為1、2或3；n為1或2；T2為N或CH；Rc和Rd各自獨立地為H、F、C1-3烷基或C1-3烷氧基；R4、R5和R6各自獨立地為H、F、Cl、Br、I、C1-3烷基或C1-3烷氧基；T為N或CH；R7和R8各自獨立地為H、F、Cl、Br或I；R9和R10各自獨立地為H、F、Cl、Br、I、-CN或
所述4-6元雜環烷基和5-6元雜芳基各自包含1、2、3或4個獨立選自N、-O-和-S-的雜原子。
具體的，式(3)的化合物選自：
具體定義和含義以及製備方法、波譜資料參見專利申請PCT/CN2020/120281，公開號WO2021068952A1，在此將該申請全文引入。
顯然結構式(3)的化合物與AST-3424相同，都是AST-2660(酸形式)的前藥，其會在AKR1C3酶的作用下活化而產生AST-2660發揮抗癌效果：
具體如下：X10是O、S、SO或SO2；A是C6-C10芳基、5-15元雜芳基或-N=CR1R2；R1及R2各自獨立是氫、C1-C6烷基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基、4-15元雜環、醚、-CONR13R14或-NR13COR14；X、Y及Z各自獨立是氫、CN、鹵基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基、4-15元雜環、醚、-CONR13R14或-NR13COR14；
R是氫、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基、4-15元雜環、醚、-CONR13R14或-NR13COR14；R13及R14各自獨立是氫、C1-C6烷基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基、4-15元雜環或醚；T為
；且其中這些烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環、雜芳基、醚基經取代或未經取代。
具體的，式(4)的化合物選自：
具體定義和含義以及製備方法、波譜資料參見專利申請PCT/US2016/021581，公開號WO2016145092A1(對應中國申請號2016800150788，公開號CN107530556A)中的申請專利範圍所記載，在此將該申請全文引入。
顯然結構式(4)的化合物與AST-3424T類似，是胺基磷酸酯烷化劑的前藥，其會在AKR1C3酶的作用下活化而產AST-2660(酸形式)發揮抗癌效果：
基團前的“Cx-Cy”或“Cx-y”是指存在於該基團中的碳原子數目的範圍。舉例而言，C1-C6烷基是指具有至少1個且最多6個碳原子的烷基。
“烷基”是指具有1至10個碳原子且在一些實施例中具有1至6個碳原子的單價飽和脂肪族烴基。“Cx-y烷基”是指具有x至y個碳原子的烷基。此術語包括(舉例而言)直鏈及具支鏈烴基，例如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、異丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、異丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)及新戊基((CH3)3CCH2-)。
“芳基”是指具有6至14個碳原子且不含環雜原子且具有單環(例如，苯基)或多個縮合(稠合)環(例如，萘基或蒽基)的芳香族基團。對於包括不具有環雜原子的具有芳香族環及非芳香族環的稠合、橋連及螺環系統的多環系統而言，當附接點位於芳香族碳原子處時，術語“芳基”或“Ar”適用(例如，5,6,7,8四氫萘-2-基是芳基，此乃因其附接點是位於芳香族苯基環的2位處)。“伸芳基”是指具有適當氫含量的二價芳基。
“環烷基”是指具有3至14碳原子且沒有環雜原子且具有單環或包括稠合、橋連及螺環系統的多環的飽和或部分飽和環狀基團。對於不具有環雜原子的具有芳香族及非芳香族環的多環系統而言，當附接點是位於非芳香族碳原子處時，術語“環烷基”適用(例如5,6,7,8-四氫萘-5-基)。術語“環烷基”包括環烯基。環烷基的實例包括(例如)金剛烷基、環丙基、環丁基、環戊基、環辛基及環己烯基。“伸環烷基”是指具有適當氫含量的二價環烷基。
“鹵基”是指氟、氯、溴及碘中的一或多者。
“雜芳基”是指具有1至14個碳原子及1至6個選自由氧、氮及硫組成的群的雜原子的芳香族基團且包括單環(例如咪唑基-2-基及咪唑-5-基)及多環系統(例如咪唑並吡啶基、苯並三唑基、苯並咪唑-2-基及苯並咪唑-6-基)。對於包括具有芳香族及非芳香族環的稠合、橋連及螺環系統的多環系統而言，若存在至少一個環雜原子且附接點是位於芳香族環的原子處，則應用術語“雜芳基”(例如1,2,3,4-四氫喹啉-6-基及5,6,7,8-四氫喹啉-3-基)。在一些實施例中，雜芳基的氮及/或硫環原子視情況經氧化以提供N-氧化物(N→O)、亞磺醯基或磺醯基部分。術語雜芳基包括(但不限於)吖啶基、吖辛因基(azocinyl)、苯並咪唑基、苯並呋喃基、苯並硫代呋喃基、苯並噻吩基(benzothiophenyl)、苯並惡唑基、苯並噻唑基、苯並三唑基、苯並四唑基、苯並異惡唑基、苯並異噻唑基、苯並噻吩基(benzothienyl)、苯並咪唑啉基、哢唑基、NH-哢唑基、哢啉基、苯並二氫吡喃基(chromanyl)、苯並吡喃基(chromenyl)、噌啉基(cinnolinyl)、二噻嗪基、呋喃基、呋呫基、咪唑啶基、咪唑啉基、咪唑並吡啶基、咪唑基、吲唑基、二氫吲哚基(indolenyl)、吲哚啉基、吲嗪基、吲哚基、異苯並呋喃基、異苯並二氫吡喃基(isochromanyl)、異吲唑基、異吲哚啉基、異吲哚基、異喹啉基(isoquinolinyl)、異喹啉基(isoquinolyl)、異噻唑基、異惡唑基、萘啶基、八氫異喹啉基、惡二唑基、惡唑啶基、惡唑基、嘧啶基、啡啶基、啡啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩惡噻基、吩惡嗪基、酞嗪基、六氫吡嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑啶基、吡唑啉基、吡唑基、嗒嗪基、吡啶並惡唑基、吡啶並咪唑基、吡啶並噻唑基、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喏啉基、奎寧環基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、四唑基、噻二嗪基、噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基(thienyl)、噻吩並噻唑基、噻吩並惡唑基、
噻吩並咪唑基、噻吩基(thiophenyl)、三嗪基及呫噸基。“伸雜芳基”是指具有適當氫含量的二價雜芳基。
“雜環狀”或“雜環”或“雜環烷基”或“雜環基”是指具有1至14個碳原子及1至6個選自由氮、硫或氧組成的群的雜原子的飽和或部分飽和環狀基團且包括單環及包括稠合、橋連及螺環系統的多環系統。對於具有芳香族及/或非芳香族環的多環系統而言，當存在至少一個環雜原子且附接點是位於非芳香族環的原子處時，術語“雜環狀”、“雜環”、“雜環烷基”或“雜環基”適用(例如1,2,3,4-四氫喹啉-3-基、5,6,7,8-四氫喹啉-6-基及十氫喹啉-6-基)。在一些實施例中，此處雜環基是3-15元、4-14元、5-13元、7-12或5-7元雜環。在一些其他實施例中，雜環含有4個雜原子。在一些其他實施例中，雜環含有3個雜原子。在另一實施例中，雜環含有最多2個雜原子。在一些實施例中，雜環基的氮及/或硫原子視情況經氧化以提供N-氧化物、亞磺醯基、磺醯基部分。雜環基包括(但不限於)四氫吡喃基、六氫吡啶基、N-甲基六氫吡啶-3-基、六氫吡嗪基、N-甲基吡咯啶-3-基、3-吡咯啶基、2-吡咯啶酮-1-基、嗎啉基及吡咯啶基。指示碳原子數的首碼(例如，C3-10)是指雜環基部分中除雜原子數之外的總碳原子數。二價雜環基將具有適當調整的氫含量。
“聯芳基”是指兩個芳環通過C-C單鍵相聯的結構，如聯苯、聯吡啶等。
術語“視情況經取代”是指經取代或未經取代的基團。基團可經一或多個取代基(例如1、2、3、4或5個取代基)取代。較佳地，取代基選自由以下組成的群：側氧基、鹵基、-CN、NO2、-N2+、-CO2R100、-OR100、-SR100、-SOR100、-SO2R100、-NR100SO2R100、-NR101R102、-CONR101R102、-SO2NR101R102、C1-C6烷基、
C1-C6烷氧基、-CR100=C(R100)2、-CCR100、C3-C10環烷基、C3-C10雜環基、C6-C12芳基及C2-C12雜芳基或諸如-O-(CH2)-O-、-O-(CH2)2-O-及其1-4個甲基經取代的形式等二價取代基，其中R100、R101及R102各自獨立是氫或C1-C8烷基；C3-C12環烷基；C3-C10雜環基；C6-C12芳基；或C2-C12雜芳基；或R101及R102與其附接至的氮原子一起形成5-7元雜環；其中烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基各自視情況經1-3個鹵基、1-3個C1-C6烷基、1-3個C1-C6鹵烷基或1-3個C1-C6烷氧基取代。較佳地，取代基選自由以下組成的群：氯、氟、-OCH3、甲基、乙基、異丙基、環丙基、-CO2H及其鹽及C1-C6烷基酯、CONMe2、CONHMe、CONH2、-SO2Me、-SO2NH2、-SO2NMe2、-SO2NHMe、-NHSO2Me、-NHSO2CF3、-NHSO2CH2Cl、-NH2、-OCF3、-CF3及-OCHF2。
具體的，式(5)的化合物選自：
具體定義和含義以及製備方法、波譜資料參見PCT/US2016/021581，公開號WO2016145092A1(對應中國申請號2016800150788，公開號CN107530556A)；PCT/US2020/120281，公開號WO2021068952A1；PCT/CN2020/089692，公開號WO2020228686所公開，在此將這些申請全文引入。
顯然結構式(5)的化合物與AST-3424類似，是AST-2660的前藥，其會在AKR1C3酶的作用下活化而產生AST-2660發揮抗癌效果：
乏氧活化的DNA烷化劑前藥選自選自以下結構式(6)-(12)的化合物：
其中，R1、R2、R3、Cx的定義如專利申請PCT/CN2020/114519，公開號WO2021120717A1中的申請專利範圍所記載。
具體如下：Cx為5-10元的芳環或芳雜環、脂雜環或環烷烴，其與硝基苯環共用兩個碳原子形成稠環結構；R1連接在Cx環的任意骨架原子上，選自氫、鹵素原子、氰基或異氰基、羥基、巰基、胺基、OTs、C1-C6烷基或Z取代烷基、C2-C6烯基或Z取代烯基、C2-C6炔基或Z取代炔基、C3-C8環烷基或Z取代環烷基、C6-C10芳基或Z取代芳基、4-15元雜環或Z取代雜環、5-15元雜芳基或Z取代雜芳基、1-6個碳原子的烷氧基或Z取代的1-6個碳原子的烷氧基、-CONR6R7、-SO2NR6R7、-SO2R6、-OCOO-R6、-COOR6、-NR6COR7、-OCOR6、-NR6SO2R7、-NR6SO2NR6R7，R2、R3各自獨立地是氫、C1-C6烷基或Z取代烷基、C2-C6烯基或Z取代烯基、C2-C6炔基或Z取代炔基、C3-C8環烷基或Z取代環烷基、C6-C10芳基或Z取代芳基、4-15元雜環或Z取代雜環、5-15元雜芳基或Z取代雜芳基或者R2、R3和與其所鍵結的苄位碳原子一起形成3-6元環；
基團可取代稠環碳原子上任意位置的氫原子，取代的個數為1；Z取代基為鹵素原子、氰基或異氰基、羥基、巰基、胺基、C1-C3烷基或取代烷基、C1-C3烷氧基或取代烷氧基、C2-C3烯基或取代烯基、C2-C3炔基或取代炔基、C3-C8環烷基或取代環烷基；R6、R7各自獨立地是氫、C1-C6烷基或Z取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基或Z取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或Z取代的C2-C6炔基、C3-C8環烷基或Z取代的C3-C8環烷基、C6-C10芳基或Z取代的C6-C10芳基、4-15元雜環基或Z取代的4-15元雜環基、5-15元雜芳基或Z取代的5-15元雜芳基，或者R6、R7和與其所鍵結的原子一起形成5-7元雜環基或Z取代的5-7元雜環基。
具體定義和含義以及製備方法、波譜資料參見PCT/CN2020/114519，公開號WO2021120717A1所公開內容，在此將這些申請全文引入。
具體的，式(6)的化合物選自：
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17的定義如專利申請PCT/US2016/039092，公開號WO2016210175A1(對應中國申請號2016800368985，公開號CN108024974A)中的申請專利範圍所記載。具體如下：R1為：氫、-N3、CN、鹵基、NR21R22、-OR23、-SO2(C1-C6烷基)、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基、4-15元雜環、5-15元雜芳基或醚；R21和R22各自獨立地為氫、羥基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基、4-15元雜環、5-15元雜芳基或-SO2(C1-C6烷基)；或R21和R22與其所鍵接的氮原子一起形成4-15元雜環或5-15元雜芳基；R23為氫、C1-C6烷基或C6-C10芳基；R2和R3獨立地為氫或鹵基；R4為氫、鹵基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基或C6-C10芳基，R5、R7、R9、R12和R15獨立地為氫、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8環烷基、C6-C10芳基、4-15元雜環、5-15元雜芳基；或R4和R5與其之間的介入碳原子一起形成C5-C6環烷基環；R6和R10獨立地為氫或鹵基；R8為氫、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或5-15元雜芳基；R11各自獨立地為C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C8環烷基或C6-C10芳基；
R13、R14、R16和R17獨立地為氫、鹵基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基或C1-C6烷氧基；其中所述烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環、雜芳基、烷氧基和醚基團任選地經取代。
具體定義和含義以及製備方法、波譜資料參見PCT/US2016/039092，公開號WO2016210175A1(對應中國申請號2016800368985，公開號CN108024974A)所公開內容，在此將這些申請全文引入。
具體的，式(7)-(12)的化合物選自上述專利申請中具體公開的化合物。
顯然，本說明書中上述化學式1-12中的“化合物”也當然包括化合物本身以及該化合物的溶劑合物、鹽、酯或同位素異構體等。
本發明還提供一種檢測生物樣本中代謝產物含量的方法，其包括以下步驟：製備含有已知濃度的內標化合物的待測溶液供LC-MS/MS進樣分析；標準工作溶液的製備，其包括製備含有已知濃度的內標化合物、已知濃度的代謝產物II的一系列標準工作溶液，該一系列標準工作溶液中內標化合物的濃度一致，且與所述待測溶液中的內標化合物濃度相同，該一系列標準工作溶液中代謝產物II的濃度是不同的；液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)測定關係函數，其包括吸取配製好的不同濃度的代謝產物II的標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，得到關係函數y=f(x)，其中y代表代謝產物II與內標化合物峰面積的比值，x表示標準工作溶液中代謝產物II的濃度；
利用關係函數測定計算待測溶液中代謝產物II的濃度，吸取加入已知含量的內標化合物的待測溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得代謝產物II與內標化合物峰面積的比值y，代入函數y=f(x)，求得待測溶液中代謝產物II的濃度x，其中，所述待測溶液由所述生物樣本經處理或不處理而製備，所述內標化合物為氘代化合物I，其結構式如式(I)所示：
A為H或D，且8個A中至少有1個為D；M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根；代謝產物II的結構式如式(II)所示：
A為H；M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根。
一種檢測生物樣本中代謝產物含量的方法，其包括以下步驟：待測生物樣本溶液中加入定量的內標化合物，經提取處理，作為待測溶液；使用代謝產物II對照品稀釋得到一系列不同濃度的代謝產物II的溶液，加入定量的內標化合物，經提取處理，作為標準工作溶液，吸取系列標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得代謝產物II與內標化合物
的峰面積，以代謝產物II與內標化合物的峰面積比值為縱坐標，以代謝產物II濃度為橫坐標，繪製標準曲線，計算回歸方程；吸取待測溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得待測溶液中代謝產物II與氘代化合物I峰面積的比值，代入回歸方程，求得待測溶液中代謝產物II的含量，其中，內標物為氘代化合物I，結構式如式(I)所示：
A為H或D，且8個A中至少有1個為D；M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根；代謝產物II的結構式如式(II)所示：
A為H；M為H或鹼金屬、鹼土金屬、銨根。
優選的，液相色譜-串聯質譜法中液相色譜儀條件為：氫受體型固定相色譜柱，A流動相為醋酸銨的甲醇溶液，B流動相為乙腈，A、B流動相梯度洗脫，從A流動相15%體積比逐漸升高至90%體積比，然後逐漸減少到15%體積比；質譜條件為：電噴霧離子源，負離子掃描方式下
代謝產物II監測離子對為：m/z 147.0→m/z 62.9，氘代化合物I監測離子對為：m/z(147.0+氘代的數目)→m/z 62.9；或正離子掃描方式下
代謝產物II監測離子對為：m/z 149.0→m/z 64.9，氘代化合物I監測離子對為：m/z(149.0+氘代的數目)→m/z 64.9。
如使用正離子掃描方式，對應的流動相中建議添加酸，比如甲酸。
優選的，製備含有已知含量的氘代化合物I(內標化合物)的待測溶液時，優選先在生物樣本溶液中添加氘代化合物I後，再進行提取操作；對應的，製備標準工作溶液時，在含已知的不同濃度的代謝產物II的基質溶液中先添加氘代化合物I後，再進行提取操作。
優選的，所述生物樣本為尿液樣本或血液樣本，對應的，在檢測尿液樣本時，對應的基質溶液為含有添加劑的、沒有給藥的患者的尿液；在檢測血液樣本時，對應的基質溶液為含有抗凝劑的、沒有給藥的患者的血漿。
加入氘代化合物、提取操作流程為：待測溶液、標準工作溶液加入氘代化合物I溶液，加入甲醇混合均勻，離心取上清液即得；添加劑為Na2HPO4或K2HPO4，抗凝劑為K2EDTA或Na2EDTA。
對於血液樣本，如未經處理則應在採集後4小時內儲存到-20℃以下環境中，優選為-70℃環境中，-70℃條件下可儲存28天；如經過處理則應在4℃或以下溫度下冷藏且在54小時內完成進樣檢測
對於尿液樣本，如未經處理則應在採集後的24小時內，優選4小時內儲存在-70℃條件下，-70℃條件下可儲存32天；如經過處理則應在室溫或以下溫度條件下94小時內完成進樣檢測。
圖1為AST-2660-D8-鈉鹽的31P-NMR譜圖。
圖2為第一份AST-2660-D8-鈉鹽水溶液的31P-NMR譜圖，分別為掃描64、128、256、512次，分別參見a圖、b圖、c圖和d圖。
圖3為零時刻的31P-NMR譜圖，依此為AST-2660-D8鈉鹽溶液-20℃(a圖)、AST-2660-D8鈉鹽溶液-78℃(b圖)。
圖4為48小時後的31P-NMR譜圖，依此為AST-2660-D8鈉鹽溶液-20℃(a圖)、AST-2660-D8鈉鹽溶液-78℃(b圖)。
圖5為-20℃儲存6個月後AST-2660-D8鈉鹽水溶液的31P-NMR譜圖。
圖6為-78℃儲存6個月後AST-2660-D8鈉鹽水溶液的31P-NMR譜圖。
圖7為空白人血漿提取物中AST-2660(a圖)和內標AST-2660-D8(b圖)的典型LC-MS/MS譜圖。
圖8為零濃度血漿樣品提取物中AST-2660(a圖)和內標AST-2660-D8(b圖)的的典型LC-MS/MS譜圖譜圖。
圖9為標準品溶液人血漿提取物(0.50ng/ml)的AST-2660(a圖)和內標AST-2660-D8(b圖)的典型LC-MS/MS譜圖。
圖10為標準品溶液人血漿提取物(200ng/ml)的AST-2660(a圖)和內標AST-2660-D8(b圖)的典型LC-MS/MS譜圖。
圖11為空白人尿液提取物中AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
圖12為零濃度尿液樣品提取物中AST-2660和內標AST-2660-D8的的典型LC-MS/MS譜圖譜圖。
圖13為標準工作溶液人尿液提取物(0.50ng/ml)的AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
圖14為標準工作溶液人尿液提取物(200ng/ml)的AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
圖8至圖14中的座標圖中，橫坐標為時間，縱坐標為LC-MS/MS的質譜離子強度，質譜離子為選定的離子。
需要說明的是，除非另外定義，本說明書一個或多個實施例使用的技術術語或者科學術語應當為本公開所屬領域內具有一般技能的人士所理解的通常意義。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
申請人開發的AST-3424藥物是DNA烷化劑AST-2660的前藥，其特異性的被癌細胞高表達的AKR1C3酶所啟動而代謝為AST-2660發揮藥效。如背景技術部分所示，在人體臨床試驗中，需要對受試者的生物樣本，如血液、
尿液、組織等進行藥物和藥物代謝物的含量檢測，通過檢測得到的藥物和藥物代謝物的含量進行藥物的DMPK(Drug Metabolism and Pharmacokinetics,中文意思是藥物代謝及藥代動力學)研究。而臨床中使用的AST-3424含量較低，是從1mg開始直至100mg，在較小的劑量下，常規的液相色譜法對應的外標法或內標法並不能滿足低檢測限情況下的定量檢測要求。因此，需要提供一種檢測方法能夠滿足低檢測限情況下的定量檢測要求。
本發明為了解決上述技術問題，申請人嘗試採用內標定量對生物樣本中低含量的AST-2660進行定量。內標法是色譜分析中一種比較準確的定量方法，內標法是將一定重量的純物質加到一定量的被分析樣品混合物中，然後對含有內標物的樣品進行色譜分析，分別測定內標物和待測組分的峰面積，即可求出被測組分在樣品中的百分含量。內標物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內標物應當是一個能得到純樣的已知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣品中去，它應當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的化學物理性質(如化學結構、極性、揮發度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應特徵，最好是被分析物質的一個同系物。當然，在色譜條件下，內標物必須能與樣品中各組分充分分離。對於內標法定量分析來說，內標物的選擇是十分重要的。它必須滿足如下的條件：1.內標物與被分析物質的物理化學性質要相似(如沸點、極性、化學結構等)；2.內標物應是該試樣中不存在的純物質；3.它必須完全溶於被測樣品(或溶劑)中，且不與被測樣品起化學反應；並與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；4.能加入內標物的量應接近於被測組分；5.色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。且又不共溢出，目的是為了避免儀器的不穩定性所造成的靈敏度的
差異；6.選擇合適的內標物加入量，使得內標物和被分析物質二者峰面積的匹配性大於75%，以免由於它們處在不同回應值區域而導致的靈敏度偏差。
本發明對AST-2660的類似化合物進行了大量篩選，最終篩選得到氘代化合物I作為檢測代謝產物II的內標。使用氘代化合物I建立的液相-質譜/質譜聯用方法具有較低的檢測限：低至0.5ng/ml。而且，本發明使用氘代化合物I建立的液相-質譜/質譜聯用方法可用於檢測人血漿和人尿液中代謝產物AST-2660含量，該方法符合生物樣本分析要求，樣本處理方法簡便，方法靈敏度高，精密度和準確度高。
下面結合具體的實施例對本發明提供的技術方案做進一步的描述。下述實施例僅用於對本發明進行說明，並不會對本發明的保護範圍進行限制。
縮略語的一般列表
實施例1 AST-2660-D8-鈉鹽的合成
氮氣保護下，氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽(360mg，1.72mmol)，三氯氧磷(132mg，0.86mmol)加入到無水二氯甲烷中(4mL)(先加入氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽，後加入三氯氧磷)，降溫至-78℃，滴加入三乙胺(348mg，3.44mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)，在-78℃下保溫30min，自然升溫至0℃，然後在0℃下保溫4小時，然後快速抽濾掉固體，低溫濃縮母液，直接用於下一步。
將上述所得粗品溶於水中(30.8mL)，緩慢分批加入氫氧化鈉固體(275mg，6.88mmol)，反應常溫攪拌過夜。然後於-20℃保存。31P-NMR表
徵如圖1所示：作為內標的HMPA的核磁峰29.886ppm，而AST-2660-D8-鈉鹽核磁峰24.503PPM。
圖1為AST-2660-D8-鈉鹽的31P-NMR譜圖。
顯然，在上述操作中，通過選取不同的氘代原料化合物I-a(氘代2-溴乙胺)可以合成不同的中間體I-b，進而在水解反應中添加不同的鹼(NaOH、KOH、LiOH或是氨水)得到不同的氘代二(氮丙啶-1-基)次膦酸或其鹽。
上述是I-a到I-b一個反應完成，實際上也可以採取分(兩)步反應並改變投料順序和反應物的數量，顯然如此操作與上述I-a到I-b一個反應完成是等同的，即：氮氣保護下，氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽，三氯氧磷加入到無水二氯甲烷中先加入三氯氧磷，後加入第一個氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽，兩者莫耳比三氯氧磷：氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽大於1)，降溫至-78℃，滴加入三乙胺的二氯甲烷溶液，在-78℃下保溫30min後再加入第二個氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽，滴加入三乙胺的二氯甲烷溶液，在-78℃下保溫30min後，自然升溫至0℃，然後在0℃下保溫4小時，然後快速抽濾掉固體，低溫濃縮母液，直接用於下一步。
將上述所得粗品溶於水中，緩慢分批加入氫氧化鈉固體，反應常溫攪拌過夜。然後於-20℃保存，發生的反應如下：
通過選取不同的第一個氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽和第二個氘代2-溴乙胺的氫溴酸鹽的氘代位置、氘代數目可以合成製備不同的氘代化合物I以及不同的鹽。
以下以實施例1製備的AST-2660-D8-鈉鹽為例具體說明定量檢測方法。
實施例2檢測AST-2660-D8-鈉鹽的方法
本實施例以HMPA(六甲基磷醯三胺)作為磷譜內標用於檢測實施例1製備的AST-2660-D8-鈉鹽的含量。
取HMPA(33.0mg，0.1840mmol)溶於水(2.2mL)，總品質為2612mg，HMPA的濃度為7.050×10-5(mmol/mg，31P-NMR的核磁位移為29.890ppm)
以HMPA的水溶液為內標測定磷譜，測定AST-2660-D8-鈉鹽的含量。
1、第一份樣品檢測
取實施例1製備的AST-2660-D8-鈉鹽水溶液，約0.5mL(488mg)和已精密稱量配製的HMPA水溶液(317mg)，掃描64次測定磷譜(如圖2所示)：核磁中對應的HMPA的核磁峰29.874ppm與AST-2660-D8-鈉鹽核磁峰24.491的峰積分面積比=1：0.257。
圖2為第一份AST-2660-D8-鈉鹽水溶液的31P-NMR譜圖，從上到下，從左至右分別為掃描64、128、256、512次。
已知HMPA的量為0.02235mmol，則根據核磁峰積分面積比可計算得到AST-2660-D8-鈉鹽的量應為0.005743mmol，濃度應為1.177×10-5mmol/mg，即1.177×10-2mmol/g，對應的品質含量即2.10mg/g。同樣算得，掃描次數為128次、256次、512次時磷譜如圖2所示，其峰積分面積比依次為1：0.264，1：0.268，
1：0.264，則同樣的樣品的濃度分別為1.209×10-5mmol/mg、1.227×10-5mmol/mg、1.209×10-5mmol/mg，即2.15mg/g、2.18mg/g、2.15mg/g，四份結果平均為2.1mg/g。
本實施例的核磁定量方法比較快捷簡單，在一定範圍內具有可接受的準確度，可以代替HPLC產量分析方法。如果需要進一步的提高定量的準確度，應使用HPLC方法，選用外標法定量，通過標準曲線來精確定量絕對含量。
實施例5和實施例7的LC-MS/MS方法適用於AST-2660-D8、AST-2660的低含量檢測，其對應的LC液相方法(對應的MS/MS檢測器替換為常規的示差檢測器、電噴霧檢測器、蒸發光散射檢測器)同樣適用於AST-2660，AST-2660-D8的常量(mg/ml)含量檢測。
實施例3 AST-2660-D8-鈉鹽的穩定性研究
本實施例是研究AST-2660-D8-鈉鹽水溶液含量檢測樣品溶液的穩定性：使用31P-NMR檢測，比較在48小時內作為內標的HMPA的31P峰和AST-2660-D8-鈉鹽的31P峰的面積比來表徵AST-2660-D8-鈉鹽水溶液含量檢測樣品溶液是否發生降解而品質減少。
1.分析方法
在NMR上運行樣品的31P-NMR。
HMPA(21.8mg，0.1217mmol)溶於水(2.20mL)，總品質為2127mg，HMPA的濃度為5.72×10-5mmol/mg。AST-2660-D8-鈉鹽溶液(588mg，約0.5mL)和HMPA(293mg，1.676×10-2mmol)溶液混合在一起作為樣品在-20℃儲存條件下在不同時間進行31P-NMR分析。並計算核磁中對應的HMPA的核磁峰(29.874ppm左右)與AST-2660-D8-鈉鹽核磁峰(24.491ppm左右)的峰積分面
積比，並且將HMPA的核磁峰峰積分設置為1。
同樣的操作，配製另一份濃度的樣品進行檢測，在-78℃儲存條件下在不同時間進行31P-NMR分析。
2. -20到-78℃儲存48小時穩定性結果
在-20、-78℃儲存48小時，並分別在0h、2h、4h、6h、8h、16h、24h、36h、48h分別檢測並記錄，結果如下表1。
在-20℃儲存條件下，8/16/24/36/48小時的HMPA的31P-NMR核磁峰與AST-2660-D8-鈉鹽溶液峰面積比穩定在1：0.43~1：0.47，而-78℃儲存條件下比值穩定在1：0.21~1：0.24，因此可以認為：AST-2660-D8-鈉鹽溶液，在-20到-78℃儲存48小時是穩定的。
代表性譜圖為圖3、圖4。
圖3為零時刻的31P-NMR譜圖，從左至右依此為AST-2660-D8鈉鹽溶液-20℃、AST-2660-D8鈉鹽溶液-78℃。
圖4為48小時後的31P-NMR譜圖，從左至右依此為AST-2660-D8鈉鹽溶液-20℃、AST-2660-D8鈉鹽溶液-78℃。
3.在-20℃下儲存6個月的穩定性
使用上述記載的方法測得AST-2660-D8鈉鹽的濃度在0天時為1.89mg/mL，並且-20℃儲存6個月後濃度為1.37mg/mL。AST-2660-D8鈉鹽在儲存6個月內濃度降低了27.5%。
6個月後的31P-NMR譜圖如圖6所示。
圖5為-20℃儲存6個月後AST-2660-D8鈉鹽水溶液的31P-NMR譜圖。
4.樣品在-78℃下儲存6個月的穩定性
使用上述記載的方法測得AST-2660-D8鈉鹽的濃度在0天時為1.89mg/mL，並且-78℃儲存6個月後濃度為1.71mg/mL。AST-2660-D8鈉鹽在儲存6個月內濃度降低了9.5%，相對而言，-78℃儲存比-20℃儲存更穩定，降解變化更慢。
6個月後的31P-NMR譜圖如圖7所示。
圖6為-78℃儲存6個月後AST-2660-D8鈉鹽水溶液的31P-NMR譜圖。
由上述穩定性實驗結果可知，AST-2660-D8鈉鹽水溶液含量檢測樣品溶液在-20至-78℃下放置2天是穩定的。當AST-2660-D8鈉鹽水溶液分別在-20℃和-78℃儲存6個月時，濃度分別降低27.5%和9.5%。
實施例4人血漿中AST-2660的檢測方法的建立及驗證
本實施例使用氘代內標(IS)AST-2660-D8(實施例1製備)對含有K2EDTA抗凝劑的人血漿中的代謝產物AST-2660(以鈉鹽形式存在)進行定量檢測。其中，AST-2660的結構式如下所示：
使用的氘代化合物AST-2660-D8鈉鹽的結構如下所示：
以下的AST-2660均指其鈉鹽，AST-2660-D8也是均指其鈉鹽。
1、LC-MS/MS實驗方法。
給出了LC-MS/MS實驗方法的相關參數。
2、樣品製備
2.1標準品工作溶液的製備
AST-2660(參照實施例1選用非氘代原料製備)標準品貯備溶液(濃度1.0mg/ml的甲醇溶液)：AST-2660適量，加甲醇適量稀釋並混勻，得到1.0mg/ml溶液。
取100μL AST-2660標準品貯備溶液，加9900μL甲醇稀釋並混勻，得到10.0μg/ml的校準標準品工作溶液。
2.2標準曲線製備
將標準品工作溶液(SWS)和空白基質(稀釋劑)放置至室溫。使用前對標準品工作溶液進行渦旋，其中，將與抗凝劑(K2EDTA)混合的正常人血漿用作稀釋劑和空白基質，按下表製備不同濃度的標準曲線標準品樣品溶液。
表5：標準品工作溶液(SWS)和空白基質(稀釋劑)稀釋資料
2.3內標工作溶液(標準工作溶液)的製備
AST-2660-D8貯備溶液(50μg/ml AST-2660-D8甲醇溶液)：AST-2660-D8對照品適量，加入適量甲醇適量稀釋並混勻，得到50μg/ml溶液。取20μL AST-2660-D8內標貯備溶液，加9980μL甲醇稀釋並混勻，得到100ng/ml的內標工作溶液。
2.4質控樣品的製備
AST-2660質控貯備溶液(1.0mg/ml的甲醇溶液)：AST-2660對照品適量，加入適量甲醇稀釋並混勻，得到1.0mg/ml溶液。取100μL AST-2660 QC貯備溶液和9990μL甲醇，得到10.0μg/ml的質控工作溶液；將與抗凝劑(K2EDTA)混合的正常人血漿用作稀釋劑，按下表進行稀釋，製備不同濃度的質控樣品。
3、樣品的前處理
使用蛋白質沉澱法提取樣品的步驟：1.確認標準曲線樣品、質控樣品和血漿樣品的標籤和順序；2.解凍後，將所有樣品放在多管渦旋儀上渦旋均勻；3.每份樣品取100μl加入96孔板中；4.除空白樣品外，加入20μl AST-2660-D8質控工作溶液氘代內標(即100ng/ml AST-2660-D8甲醇溶液)。在空白樣品中加入20μl甲醇；5.加入500μl甲醇；6.以中速將孔板渦旋3分鐘；7.在2143rcf(離心力)下離心96孔板10分鐘；8.將450μl上清液轉移至一新的96孔板中；9.用96孔Termovap樣品濃縮儀乾燥上清液；10.用150μl甲醇複溶；11.將平板超聲30秒；12.在4℃和2143rcf(離心力)下離心平板3分鐘；13.將120μl上清液轉移至一塊新的96孔板中。
4、實驗結果
4.1標準曲線
人血漿中AST-2660標準曲線參數：斜率：0.063846，截距：-0.003788，相關係數0.9939，則關係函數y=f(x)=0.063846x-0.003788，其中y代表代謝產物II與內標化合物峰面積的比值，x表示標準工作溶液中代謝產物II
的濃度，LLOQ(定量下限)：0.5ng/ml，ULOQ(定量上限)：200ng/ml。由此可以看出，在0.5~200ng/ml的線性範圍內，線性關係良好。
4.2質控樣品的準確度和精密度考察結果
準確度和精密度定義如下：準確度表示為相對誤差(RE)。
RE=[(平均值-標稱值)/標稱值]×100
精密度表示為變異係數(CV)。
CV=(標準差/平均值)×100。
準確度和精密度考察結果如表7所示。由表7可以看出，批內和批間的精密度均小於8.3%，批內和批間的準確度均在±8.7之間。準確度和精密度的分析標準為：對於LLOQ QC樣品，批內和批間準確度(RE)必須在±20.0%範圍內，並且批內和批間CV必須不大於20.0%。對於低、幾何平均、中、高和稀釋QC(如適用)樣品，批內和批間準確度(RE)必須在±15.0%範圍內；批內和批間精密度(CV)必須在每個QC濃度水準處不大於15.0%。因此，質控樣品的批內和批間的精密度和準確度符合要求。內標AST-2660-D8的精密度(%CV)
40.0%，符合要求。
4.3 AST-2660和內標AST-2660-D8的提取回收率考察結果
由表8可以看出，AST-2660和內標AST-2660-D8的提取回收率的CV均小於15.0%。提取回收率的分析標準：對於提取後加標樣品，在每個濃度水準處所測得的回應率的CV必須不大於15.0%。因此，AST-2660和內標AST-2660-D8的提取回收率符合要求。
4.4基質效應考察結果
根據表9的結果可知，AST-2660基質效應的批間基質準確度和精密度(CV)均小於15%，符合要求。
4.5穩定性
由表10可以看出，AST-2660工作溶液和內標AST-2660-D8工作溶液的穩定性的準確度在±8.1%範圍內，精密度均小於5.5%。穩定性分析標準：貯藏穩定性溶液與新鮮配製的溶液之間的差異必須在±10.0%範圍內，並且每組重複實驗的CV必須不大於10.0%。因此，在各種儲存條件下，AST-2660和AST-2660-D8(內標)工作溶液均穩定性良好，符合要求。
本實施例建立的液相-質譜/質譜聯用方法檢測人血漿中AST-2660的方法符合生物樣本分析要求，樣本處理方法簡便，方法靈敏度高，精密度和準確度高。
實施例5實際人血漿中AST-2660含量的檢測
使用實施例4建立的檢測方法對待測人血漿中的AST-2660含量進行檢測。
以下為根據實施例4的方法學和驗證後建立的檢測標準操作流程SOP：
步驟一、溶液配製
基質：與抗凝劑(K2EDTA)混合的正常人血漿
a：內標工作溶液：取AST-2660-D8，加甲醇溶解並稀釋製成每1ml中約含100ng的溶液。
b：待測溶液(此時的待測溶液未添加內標化合物)：取待測血液樣品，即得。
c：標準工作溶液(此時的標準工作溶液未添加內標化合物)：取AST-2660適量，精密稱定，加甲醇溶解並稀釋製成每1ml中約含1.0mg的溶液，作為標準工作儲備液，取標準工作儲備液適量，分別加基質稀釋製成每1ml中約含200ng、160ng、100ng、50ng、10ng、2.0ng、1.0ng、0.5ng的不同濃度的標準工作溶液。(溶液貯藏在-70℃)
d：質控樣品溶液：取AST-2660適量，精密稱定，加甲醇溶解並稀釋製成每1ml中約含10μg的溶液，作為質控工作儲備液，取質控工作儲備液適量，加基質製成每1ml中約含150ng、60ng、15ng、1.5ng、0.5ng的不同濃度的質控工作溶液。(溶液貯藏在-70℃)
步驟二、樣品提取
待測溶液、標準工作溶液、質控樣品溶液，分別在室溫狀態下解凍並混合均勻，分別取100μl上述溶液，加入20μl內標，加入500μl甲醇，渦旋3分鐘混合均勻，在2143rcf下離心10分鐘，取450μl上清液乾燥，加150μl甲醇複溶，超聲，在4℃和2143rcf下離心平板3分鐘，取120μl上清液，即得。
取100μl空白血液，加入20μl甲醇，同法提取，即得空白樣品。
取100μl空白血液，加入20μl內標工作溶液，同法提取，即得零濃度樣品。
經過樣品提取、添加內標後的溶液才進行步驟四進樣到LC-MS/MS進行檢測。
步驟三、設置色譜-質譜測試條件
使用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定，並進行如下儀器測試條件設置：液相條件：用SHARC 1，3μm，2.1*50mm或性能相當的色譜柱；流動相A為含有低含量醋酸銨的甲醇溶液，流動相B為乙腈，按下表進行梯度洗脫；柱溫20℃；進樣體積5μl
質譜條件：電噴霧離子源，負離子掃描方式；噴霧電壓-4500V；離子源溫度：500℃；碰撞能(CE)為-22eV；去簇電壓(DP)為-55V；入口電壓(EP)為-10V；碰撞室出口電壓(CXP)為-16V；駐留時間為100ms；所有氣體均使用高純氮氣；AST-2660離子對：m/z 147.0→m/z 62.9；內標AST-2660-D8離子對：m/z 155.0→m/z 62.9。
步驟四、測定
分別取經提取後的不同濃度的AST-2660標準工作溶液、空白樣品、零濃度樣品、待測樣品溶液、質控樣品溶液，注入LC-MS/MS進行檢測。
接受標準：標準工作溶液測定回收濃度，質控樣品溶液的準確度以及空白樣品中AST-2660以及內標物峰殘留應符合2020年版中國藥典4部9012中要求。
吸取配製好的不同濃度的代謝產物II的標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，得到關係函數y=f(x)，其中y代表代謝產物II與內標化合物峰面積的比值，x表示標準工作溶液中代謝產物II的濃度；計算結果：由不同濃度的AST-2660標準工作溶液得到AST-2660與內標峰面積比值的關係函數y=f(x)，將提取後的供試品溶液測得AST-2660與內標峰面積比值，代入關係函數y=f(x)，計算待測溶液中代謝產物II的濃度。
利用關係函數測定計算待測溶液中代謝產物II的濃度，吸取加入已知含量的內標化合物的待測溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得代謝產物II與內標化合物峰面積的比值y，代入函數y=f(x)，求得待測溶液中代謝產物II的濃度x。
作為一種選擇，上述的SOP將相關操作步驟先後順序略作變通，得到以下的操作SOP：待測生物樣本溶液中加入定量的內標化合物，經提取處理，作為供試品溶液；使用代謝產物II對照品稀釋得到一系列不同濃度的代謝產物II的溶液，加入定量的內標化合物，經提取處理，作為標準工作溶液，吸取系列標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得代謝產物II與內標化合物的峰面積，以代謝產物II與內標化合物的峰面積比值為縱坐標，以代謝產物II濃度為橫坐標，繪製標準曲線，計算回歸方程；吸取供試品溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得供試品溶液中代謝產物II與氘代化合物I峰面積的比值，代入回歸方程，求得待測生物樣本溶液中代謝產物II的含量。
上述變通後的SOP根據實驗室操作人員習慣，使用相同容積的容器配製相同濃度的溶液，如此操作只需要保證添加的溶液體積相同，所得到的標準工作溶液依然是等濃度的。
圖7至圖10為血漿樣本中檢測過程的部分典型譜圖。
圖7為空白人血漿提取物中AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
圖8為零濃度血漿樣品提取物中AST-2660和內標AST-2660-D8的的典型LC-MS/MS譜圖譜圖。
圖9為標準品溶液人血漿提取物(0.50ng/ml)的AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
圖10為標準品溶液人血漿提取物(200ng/ml)的AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
使用本實施例提供的人血漿中的AST-2660含量檢測的操作規程對部分樣品進行檢測。結果如下表12-16所示。
很明顯，含有AST-2660的人血漿在-70℃條件下儲存28天后，含有的AST-2660幾乎沒有減少，而-20℃條件下減少較為明顯，因此應儘量將AST-2660的人血漿樣品儲存在-70℃條件下，並且在儲存28天后沒有變化。
很明顯，含有AST-2660的人血漿在-70℃到室溫的凍融過程中含有的AST-2660幾乎沒有減少，而-20℃到室溫的凍融過程中減少較為明顯：也就是說，根據表12的資料可知，將儲存在-70℃條件下的人血漿中的樣品從儲存條件轉運到室溫進行實驗過程的溫度急劇變化不會影響到人血漿樣本中AST-2660的穩定性。
很明顯，根據表14的資料可知使用和AST-2660一樣的-70℃條件下儲存26天后，AST-2660-D8的甲醇溶液具有較強的穩定性。
很明顯，根據表15的資料可知AST-2660甲醇溶液在常規的冷凍條件(實驗室常用的冰櫃)下，54小時儲存含量穩定。
很明顯，根據表16的資料含有AST-2660的人血漿樣本在室溫下不穩定，隨著存放時間的與延長，人血漿樣本中AST-2660的含量一直在減少，
這提示在進行相關臨床患者人血漿樣本採集過程中，採集到的血漿樣本應立即儲存在上述經過實驗驗證的低溫環境中：儲存在-70℃最穩妥，儲存在-20℃也可以，如條件所限也也儲存在常規的冰箱中(4℃至0℃)並且應儘量在4小時內轉移到上述低溫環境中。在樣本送往DMPK樣本檢測中心實驗室過程中應使用全程冷鏈物流(全程監控溫度)溫度選擇為-20℃以下或乾冰保溫。
根據以上實驗結果，可知：(1)含有AST-2660的人血漿樣本應在採集後立即儲存在上述經過實驗驗證的低溫環境中：儲存在-70℃最穩妥，儲存在-20℃也可以，如條件所限也也儲存在常規的冰箱中(4℃至0℃)並且應儘量在4小時內轉移到上述低溫環境中。在樣本送往DMPK樣本檢測中心實驗室過程中應使用全程冷鏈物流(全程監控溫度)溫度選擇為-20℃以下或乾冰保溫；(2)樣本應儲存在-70℃或更低溫度條件下，在此條件下儲存28天是穩定的，而且根據變化趨勢，更久的時間也許依然是穩定的；(3)在取出儲存的樣本到室溫過程中，即將儲存在-70℃條件下的人血漿中的樣品從儲存條件轉運到室溫進行實驗過程的溫度急劇變化不會影響到人血漿樣本中AST-2660的穩定性，取出後應放置在常規的冰箱中(4℃至0℃)，且常規冰箱中放置時間應不大於4小時，如放置在室溫環境下將導致AST-2660含量降低而不能使用；(4)AST-2660-D8的甲醇溶液在-70℃條件下儲存26天后含量不會發生變化，具有較強的穩定性，而且根據變化趨勢，更久的時間也許依然是穩定的。
因此，上述，對於血液樣本的操作SOP中，應在採集後4小時內
將血漿樣本儲存到-20℃以下環境中，優選為-70℃環境中，-70℃條件下可儲存28天；如血漿樣本經過上述提取處理則應在4℃或以下溫度下冷藏且在實驗室室溫環境下、54小時內完成進樣檢測；遵守這些儲存溫度和時間所檢測的結果是可靠的，否則將導致因樣本中AST-2660儲存過程中變化而結果不真實、不可靠。
實施例6人尿液中AST-2660的檢測方法的建立及驗證
本實施例中人尿液中AST-2660的檢測方法的建立步驟與實施例4基本相同，區別僅在於基質不同(實施例4為人血漿，本實施例為人尿液)以及樣品提取步驟略有差異。將與添加劑Na2HPO4‧12H2O混合的正常人(不給藥)尿液用作稀釋劑和基質。
1、樣品的前處理
使用蛋白質沉澱法提取樣品的步驟：1.確認標準品、質控樣品和血漿樣品的標籤和順序；2.解凍後，將所有樣品放在多管渦旋儀上渦旋均勻；3.每份樣品取100μl加入96孔板中；4.除空白樣品外，加入20μl AST-2660質控工作溶液(100ng/ml AST-2660-D8甲醇溶液)。在空白樣品中加入20μl甲醇；5.加入500μl甲醇；6.以中速將孔板渦旋3分鐘；7.在2143rcf(離心力)下離心96孔板10分鐘；8.將450μl上清液轉移至一新的96孔板中；
9.在2143rcf(離心力)下離心96孔板10分鐘；10.將300μl上清液轉移至一塊新的96孔板中。
2.實驗結果
2.1標準曲線
人尿液中AST-2660標準曲線參數：斜率：0.001400，截距：0.000016，相關係數0.9982，關係函數y=f(x)=0.001400x+0.000016，其中y代表代謝產物II與內標化合物峰面積的比值，x表示標準工作溶液中代謝產物II的濃度，LLOQ(定量下限)：0.5ng/ml，ULOQ(定量上限)：200ng/ml。由此可以看出，在0.5~200ng/ml的線性範圍內，線性關係良好。
2.2質控樣品的準確度和精密度考察結果
準確度和精密度定義如下：準確度表示為相對誤差(RE)。
RE=[(平均值-標稱值)/標稱值]×100
精密度表示為變異係數(CV)。
CV=(標準差/平均值)×100。
準確度和精密度考察結果如表17所示。由表17可以看出，批內和批間的精密度均小於15.5%，批內和批間的準確度均在±11.4之間。準確度和精密度的分析標準為：對於LLOQ QC樣品，批內和批間準確度(RE)必須在±20.0%範圍內，並且批內和批間CV必須不大於20.0%。對於低、幾何平均、中、高和稀釋QC(如適用)樣品，批內和批間準確度(RE)必須在±15.0%範圍內；批內和批間精密度(CV)必須在每個QC濃度水準處不大於15.0%。因此，質控樣品
的批內和批間的精密度和準確度符合要求。內標AST-2660-D8的精密度(%CV)
13.4%，符合要求。
2.3基質效應考察結果
根據表18的結果可知，AST-2660基質效應的批間基質準確度和精密度(CV)均小於15%，符合要求。
2.4穩定性
由表19可以看出，AST-2660工作溶液的穩定性的準確度在±11.8%範圍內，精密度均小於11.5%。穩定性分析標準：貯藏穩定性溶液與新鮮配製的溶液之間的差異必須在±10.0%範圍內，並且每組重複實驗的CV必須不大於15.0%。因此，在各種儲存條件下，AST-2660工作溶液穩定性良好，符合要求。
本實施例建立的液相-質譜聯用方法檢測人尿液中AST-2660的方法符合生物樣本分析要求，樣本處理方法簡便，方法靈敏度高，精密度和準確度高。
實施例7實際人尿液中AST-2660含量的檢測
使用實施例6建立的檢測方法對待測人尿液中的AST-2660含量進行檢測。
以下為根據實施例6的方法學和驗證後建立的檢測標準操作流程SOP：
步驟一、溶液配製
基質：與添加劑Na2HPO4‧12H2O混合的正常人尿液。
a：內標工作溶液：取AST-2660-D8，加甲醇溶解並稀釋製成每1ml中約含100ng的溶液。
b：待測溶液(此時的待測溶液未添加內標化合物)：取待測血液樣品，即得。
c：標準工作溶液(此時的標準工作溶液未添加內標化合物)：取AST-2660適量，精密稱定，加甲醇溶解並稀釋製成每1ml中約含1.0mg的溶液，作為標準工作儲備液，取標準工作儲備液適量，分別加基質稀釋製成每1ml中約含200ng、160ng、100ng、50ng、10ng、2.0ng、1.0ng、0.5ng的不同濃度的標準工作溶液。(溶液貯藏在-70℃)
d：質控樣品溶液：取AST-2660適量，精密稱定，加甲醇溶解並稀釋製成每1ml中約含10μg的溶液，作為質控工作儲備液，取質控工作儲備液適量，加基質製成每1ml中約含150ng、60ng、15ng、1.5ng、0.5ng的不同濃度的質控工作溶液。(溶液貯藏在-70℃)
步驟二、樣品提取
供試品溶液、標準工作溶液、質控樣品溶液，在室溫狀態下解凍並混合均勻，分別取100μl上述溶液，加入20μl內標，加入500μl甲醇，渦旋3分鐘混合均勻，在2143rcf下離心30分鐘，取450μl上清液，在2143rcf下離心96孔板10分鐘，取300μl上清液，即得。
取100μl空白人尿液，加入20μl甲醇，同法提取，即得空白樣品。
取100μl空白人尿液，加入20μl內標工作溶液，同法提取，即得零濃度樣品。
經過樣品提取、添加內標後的溶液才進行步驟四進樣到LC-MS/MS進行檢測。
步驟三、設置色譜-質譜測試條件
使用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定，並進行如下儀器測試條件設置：液相條件：用SHARC 1，3μm，2.1*50mm或性能相當的色譜柱；含有低含量醋酸銨的甲醇溶液，流動相B為乙腈，按下表進行梯度洗脫；柱溫20℃；進樣體積5μl。
質譜條件：電噴霧離子源，負離子掃描方式；噴霧電壓-4500V；離子源溫度：500℃；碰撞能(CE)為-22eV；去簇電壓(DP)為-55V；入口電壓(EP)為-10V；碰撞室出口電壓(CXP)為-16V；駐留時間為100ms；所有氣體均使用高純氮氣；AST-2660離子對：m/z 147.0→m/z 62.9；內標AST-2660-D8離子對：m/z 155.0→m/z 62.9。
步驟四、測定
分別取提取後的不同濃度的AST-2660標準工作溶液、空白樣品、零濃度樣品、供試品溶液、質控工作溶液，注入LC-MS/MS進行檢測。
接受標準：標準工作溶液測定回收濃度，質控工作溶液的準確度以及空白樣品中AST-2660以及內標物峰殘留應符合2020年版中國藥典4部9012中要求。
吸取配製好的不同濃度的代謝產物II的標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，得到關係函數y=f(x)，其中y代表代謝產物II與內標化合物峰面積的比值，x表示標準工作溶液中代謝產物II的濃度；
計算結果：由不同濃度的AST-2660標準工作溶液得到AST-2660與內標峰面積比值的關係函數y=f(x)，將提取後的待測溶液測得AST-2660與內標峰面積比值，代入關係函數y=f(x)，計算待測溶液中代謝產物II的濃度。
利利用關係函數測定計算未知濃度的待測溶液中代謝產物II的濃度，吸取加入已知含量的內標化合物的待測溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得代謝產物II與內標化合物峰面積的比值y，代入函數y=f(x)，求得待測溶液中代謝產物II的濃度x。
作為一種選擇，上述的SOP將相關操作步驟先後順序略作變通，得到以下的操作SOP：待測生物樣本溶液中加入定量的內標化合物，經提取處理，作為供試品溶液；使用代謝產物II對照品稀釋得到一系列不同濃度的代謝產物II的溶液，加入定量的內標化合物，經提取處理，作為標準工作溶液，吸取系列標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得代謝產物II與內標化合物的峰面積，以代謝產物II與內標化合物的峰面積比值為縱坐標，以代謝產物II濃度為橫坐標，繪製標準曲線，計算回歸方程；吸取供試品溶液，注入LC-MS/MS系統進行檢測，測得供試品溶液溶液中代謝產物II與氘代化合物I峰面積的比值，代入回歸方程，求得待測生物樣本溶液中代謝產物II的含量。
上述變通後的SOP根據實驗室操作人員習慣，使用相同容積的容器配製相同濃度的溶液，如此操作只需要保證添加的溶液體積相同，所得到的標準工作溶液依然是等濃度的。
圖11至圖14為尿液樣本中檢測過程的部分典型譜圖。
圖11為空白人尿液提取物中AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
圖12為零濃度尿液樣品提取物中AST-2660和內標AST-2660-D8的的典型LC-MS/MS譜圖譜圖。
圖13為標準工作溶液人尿液提取物(0.50ng/ml)的AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
圖14為標準工作溶液人尿液提取物(200ng/ml)的AST-2660和內標AST-2660-D8的典型LC-MS/MS譜圖。
使用本實施例提供的人尿液中的AST-2660含量檢測的操作規程對部分樣品進行檢測。結果如下表21-24所示。
很明顯，含有AST-2660的人尿液在-70℃條件下儲存32天后，含有的AST-2660幾乎沒有減少，而-20℃條件下減少了近90%，因此必須將AST-2660的人尿液樣品儲存在-70℃條件下，在此儲存條件下儲存32天的樣品依然是穩定的。
很明顯，含有AST-2660的人尿液在-70℃到室溫的凍融過程中含有的AST-2660幾乎沒有減少，而-20℃到室溫的凍融過程減少了近90%：也就是說，根據表22的資料可知，將儲存在-70℃條件下的人血漿中的樣品從儲存條件轉運到室溫進行實驗過程的溫度急劇變化不會影響到人血漿樣本中AST-2660的穩定性。
根據表23可知，在室溫下經處理後AST-2660的人尿液樣本放置94小時是穩定的。
根據表24可知，在室溫下未處理的含AST-2660的人尿液樣本放置24小時是穩定的。根據以上實驗結果，可知：
(1)含有AST-2660的人尿液樣本應在採集後24小時內(最晚)儲存在上述經過實驗驗證的低溫環境中：儲存在-70℃。在樣本送往DMPK樣本檢測中心實驗室過程中應儘量低溫(室溫或更低)；
(2)樣本應儲存在-70℃或更低溫度條件下，在此條件下儲存32天是穩定的，而且根據變化趨勢，更久的時間也許依然是穩定的；
(3)經處理後含有AST-2660的人尿液樣本可在室溫或更低的溫度下放置94小時穩定；
(4)在取出儲存的樣本到室溫過程中，即將儲存在-70℃條件下的人尿液中的樣品從儲存條件轉運到室溫進行實驗過程的溫度急劇變化不會影響到人尿液樣本中AST-2660的穩定性，取出後應放置在常規的冰箱或室溫是容許的，放置在室溫環境下長達24小時是穩定的。
(5)對於人尿液樣本，應在採集後的24小時內，優選4小時內儲存在-70℃條件下；如經過處理則應在室溫條件下94小時內完成進樣檢測。
因此，上述，對於尿液樣本的操作SOP中，應在採集後的24小時內，優選4小時內儲存在-70℃條件下，-70℃條件下可儲存32天；如經過處理則應在室溫或以下溫度條件下94小時內完成進樣檢測；遵守這些儲存溫度和時間所檢測的結果是可靠的，否則將導致因樣本中AST-2660儲存過程中變化而結果不真實、不可靠。
Claims (26)
- 一種氘代化合物I，其結構式如式(I)所示：
- 如請求項1所述的氘代化合物I，其中，該8個A中至少有3個為D。
- 如請求項1所述的氘代化合物I，其中，D的個數為4或者8。
- 如請求項1所述的氘代化合物I，其中，M為Na、K、Li或銨根。
- 如請求項1所述的氘代化合物I，其中，該氘代化合物I的結構式如式(I-1)或式(I-2)所示：
- 如請求項1所述的氘代化合物I，其中，該氘代化合物I選自以下結構的化合物：
- 一種製備氘代化合物I的方法，其包括以下步驟：
- 如請求項7所述的方法，其中，該I-a化合物與三鹵氧磷POX3在有機溶劑中降溫，滴加有機鹼溶液反應得該I-b化合物；其中所述降溫為降溫至-78至-20℃；其中所述有機溶劑選自二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷或環己烷、以及四氫呋喃中的一種或多種的混合；其中所述有機鹼選自甲胺、乙胺、丙胺、異丙胺、N,N-二乙胺、三乙胺、正丁胺、異丁胺、4-二甲氨基吡啶、N,N-二異丙基乙胺、1,8-二氮雜二環[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、四甲基胍、吡啶、N-甲基二環己胺及二環己胺中的一種或多種的混合；和/或 該I-a化合物與三鹵氧磷POX3的反應在一定的氛圍下進行，其中所述氛圍是選自由空氣、氮氣及氬氣所組成的群中的一種。
- 如請求項8所述的方法，其中所述氛圍選自氮氣及氬氣中的一種。
- 如請求項9所述的方法，其中所述氛圍是氮氣。
- 一種檢測請求項1-6中任意一項所述的氘代化合物I含量的方法，其包括：選擇使用31P-NMR法檢測含有該氘代化合物I的溶液中的該氘代化合物I含量，或使用液相色譜法檢測請求項1-6中任意一項所述的氘代化合物I的含量，其中，液相色譜儀條件為：氫受體型固定相色譜柱；A流動相為醋酸銨的甲醇溶液，並且B流動相為乙腈；以及該A、B流動相的梯度洗脫是從A流動相15%體積比逐漸升高至90%體積比，然後逐漸減少到15%體積比。
- 一種檢測請求項1-6中任意一項所述的氘代化合物I含量的方法，其包括：檢測該氘代化合物I和已知含量的含磷化合物的31P-NMR，得到一31P-NMR譜圖；以及根據該31P-NMR譜圖中該氘代化合物I和該含磷化合物的化學位移特徵峰的峰面積比，代入已知含量的該含磷化合物的含量進行計算得到該氘代化合物I的含量。
- 如請求項12所述的方法，其中，所述含磷化合物選自含有一個磷原子的化合物，及六甲基磷醯三胺；以及 將該氘代化合物I和已知含量的該含磷化合物加入到溶劑中一併測試31P-NMR譜圖，其包括將該氘代化合物I和已知含量的該含磷化合物加入到水中溶解後一併測試31P-NMR譜圖。
- 一種利用請求項1-6中任一項所述的氘代化合物I作為內標在檢測生物樣本中代謝產物II的用途，該代謝產物II的結構式如式(II)所示：
- 一種利用請求項1-6中任一項所述的氘代化合物I作為內標在LC-MS/MS分析檢測生物樣本中AKR1C3活化的DNA烷化劑前藥或乏氧活化的DNA烷化劑前藥的代謝產物II含量的用途，其中該代謝產物II的結構式如式(II)所示：
- 如請求項14或15所述的用途，其中，該氘代化合物I選自及
；以及該代謝產物II選自
- 如請求項16所述的用途，其中該AKR1C3活化的DNA烷化劑前藥是選自由以下結構式(1)-(5)的化合物所組成的群：
或
R1為H、C1-6烷基、C3-6環烷基、4-6元雜環烷基、5-6元雜芳基或苯基，其中所述C1-6烷基、C3-6環烷基、4-6元雜環烷基、5-6元雜芳基和苯基任選被1、2或3個Ra所取代；其中，各Ra獨立地為H、F、Cl、Br、I、-CN、-OH、C1-3烷氧基或C1-3烷基；R2為H或C1-6烷基；或者R1和R2連接在一起，與其相連的N原子一起形成4-6元雜環烷基，其中所述4-6元雜環烷基任選被1、2或3個Rb所取代；其中，各Rb獨立地為H、F、Cl、Br、I、-CN、-OH、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-CH3或-CH2CH3；R3為H、F、Cl、Br、I、-OH、-NH2、C1-3烷氧基或C1-3烷基；或者R2和R3連接在一起使結構單元
為
；且其中這些烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、雜環、雜芳基、醚基經取代或未經取代；以及
在結構式(5)中，A是取代或未經取代的C6-C10的芳基、聯芳基或取代的聯芳基、5-15元的雜芳基或-N=CR1R2，其中取代時的取代基選自由以下組成的群：鹵基、-CN、-NO2、-O-(CH2)-O-、-CO2H及其鹽、-OR100、-CO2R100、-CONR101R102、-NR101R102、-NR100SO2R100、-SO2R100、-SO2NR101R102C1-C6烷基及C3-C10雜環基；其中，R100、R101及R102各自獨立是氫、C1-C8烷基、C6-C12芳基，或R101及R102與其附接至的氮原子一起形成的5-7元雜環；烷基及芳基各自是經1-3個鹵基或1-3個C1-C6烷基取代；以及R1及R2各自獨立是苯基或甲基；X、Y及Z各自獨立是氫或鹵基；以及R是氫或C1-C6烷基或鹵素取代烷基。
- 如請求項16所述的用途，其中該乏氧活化的DNA烷化劑前藥選自由以下結構式(6)-(12)的化合物所組成的群：
基團可取代稠環碳原子上任意位置的氫原子，取代的個數為1；其中，Z取代基為鹵素原子、氰基或異氰基、羥基、巰基、胺基、C1-C3烷基或取代烷基、C1-C3烷氧基或取代烷氧基、C2-C3烯基或取代烯基、C2-C3炔基或取代炔基、C3-C8環烷基或取代環烷基；R6、R7各自獨立地是氫、C1-C6烷基或Z取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基或Z取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或Z取代的C2-C6炔基、C3-C8環烷基或Z取代的C3-C8環烷基、C6-C10芳基或Z取代的C6-C10芳基、4-15元雜環基或Z取代的4-15元雜環基、5-15元雜芳基或Z取代的5-15元雜芳基，或者R6、R7和與其所鍵結的原子一起形成5-7元雜環基或Z取代的5-7元雜環基；以及
- 一種檢測生物樣本中代謝產物含量的方法，其包括以下步驟：製備含有已知濃度的內標化合物的待測溶液供一液相色譜-串聯質譜系統(LC-MS/MS)進樣分析； 製備標準工作溶液，其包括製備含有已知濃度的該內標化合物及已知濃度的代謝產物II的一系列標準工作溶液，在該系列標準工作溶液中該內標化合物的濃度一致，且與所述待測溶液中的該內標化合物濃度相同，該一系列標準工作溶液中該代謝產物II的濃度是不同的；以該LC-MS/MS系統測定一關係函數，其包括吸取配製好的含有不同濃度的該代謝產物II的該系列標準工作溶液，注入該LC-MS/MS系統進行檢測，得到該關係函數y=f(x)，其中y代表該代謝產物II與該內標化合物峰面積的比值，x表示該系列標準工作溶液中該代謝產物II的濃度；以及利用該關係函數測定並計算該待測溶液中該代謝產物II的濃度，其包括吸取加入已知含量的該內標化合物的該待測溶液，注入該LC-MS/MS系統進行檢測，測得該代謝產物II與該內標化合物峰面積的比值y，代入該關係函數y=f(x)，求得該待測溶液中該代謝產物II的濃度x，其中，該待測溶液可選擇地由所述生物樣本經處理或不處理而製備，所述內標化合物為氘代化合物I，其結構式如式(I)所示：
- 一種檢測生物樣本中代謝產物含量的方法，其包括以下步驟：在一生物樣本溶液中加入定量的一內標化合物，經提取處理，作為一待測溶液；使用一代謝產物II對照品稀釋得到一系列不同濃度的代謝產物II的標準溶液，加入定量的該內標化合物，經提取處理，作為一系列標準工作溶液；吸取該系列標準工作溶液，分別注入一液相色譜-串聯質譜系統(LC-MS/MS)進行檢測，測得該代謝產物II與該內標化合物的峰面積，以該代謝產物II與該內標化合物的峰面積比值為縱坐標，以該代謝產物II濃度為橫坐標，繪製一標準曲線，計算一回歸方程；以及吸取該待測溶液，注入該LC-MS/MS系統進行檢測，測得該待測溶液中該代謝產物II與該內標化合物峰面積的比值，代入該回歸方程，求得該待測溶液中該代謝產物II的含量，其中，該內標化合物為氘代化合物I，其結構式如式(I)所示：
- 如請求項19或20所述的方法，其中，該LC-MS/MS系統中包括一液相色譜儀及一質譜，其中該液相色譜儀的條件為：氫受體型固定相色譜柱；A流動相為醋酸銨的甲醇溶液，B流動相為乙腈；以及所述A、B流動的相梯度洗脫，是從A流動相15%體積比逐漸升高至90%體積比，然後逐漸減少到15%體積比；以及該質譜條件為：電噴霧離子源，在選擇負離子掃描方式時，所述代謝產物II的監測離子對為：m/z 147.0→m/z 62.9，所述氘代化合物I的監測離子對為：m/z(147.0+氘代的數目)→m/z 62.9；或在選擇正離子掃描方式時，所述代謝產物II的監測離子對為：m/z 149.0→m/z 64.9，所述氘代化合物I的監測離子對為：m/z(149.0+氘代的數目)→m/z 64.9。
- 如請求項19所述的方法，其中，製備含有已知含量的該氘代化合物I的該待測溶液時，先在一生物樣本溶液中添加該氘代化合物I後，再進行提取操作；以及對應的，製備該系列標準工作溶液時，在含已知的不同濃度的該代謝產物II的一基質溶液中先添加該氘代化合物I後，再進行提取操作。
- 如請求項20或22所述的方法，其中，所述生物樣本溶液其生物樣本選自尿液樣本及血液樣本之其一，對應的，在檢測該尿液樣本時，對應的該基質溶液為含有添加劑的、沒有給藥的患者的尿液；在檢測所述血液樣本時，對應的該基質溶液為含有抗凝劑的、沒有給藥的患者的血漿。
- 如請求項23所述的方法，其中，該提取操作的流程為：該待測溶液及該系列標準工作溶液各自加入一氘代化合物I溶液，並加入甲醇混合均勻，離心取上清液即得，其中該添加劑為Na2HPO4或K2HPO4，該抗凝劑為K2EDTA或Na2EDTA。
- 如請求項23所述的方法，其中，對於該血液樣本，如未經過處理則應在採集後4小時內儲存到-20℃以下環境中；如經過處理則應在4℃或以下溫度下冷藏且在54小時內完成進樣檢測；以及對於該尿液樣本，如未經過處理則應在採集後的24小時內儲存；如經過處理則應在室溫或以下溫度條件下94小時內完成進樣檢測。
- 如請求項25所述的方法，其中，對於該血液樣本，如未經過處理則應在採集後4小時內儲存到-70℃環境，且在-70℃條件下可儲存28天；以及對於該尿液樣本，如未經過處理則應在採集後的4小時內儲存在-70℃條件下，且-70℃條件下可儲存32天。
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